פרוטוקולים מקיפה לדוגמה, מח עצם תהליך למדידת מחלה שיורית מדיד, לוקמיה בתאי גזע לוקמיה מיאלואידית חריפה

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

גילוי של מחלה שיורית מינימלית או מדיד (MRD) הוא סמן prognostic חשוב זיקוק הערכת סיכונים, חיזוי relapse ב לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML). אלה מקיף הנחיות והמלצות עם שיטות עבודה מומלצות עבור זיהוי עקבי ומדויק וזיהוי של MRD, עשויים לסייע בקבלת החלטות לטיפול יעיל של AML.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J., Kaspers, G. J., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

התגובה לקריטריונים לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) באחרונה הוקמה מחדש, עם בחינה מורפולוגיות מנוצל כדי לקבוע אם חולים השיגו הפוגה מלאה (CR). בערך כמחצית מהמטופלים המבוגרים שנכנסו CR הדרדר בתוך 12 חודשים עקב המוצלח תאים שיורית AML במח העצם. כימות של אלה שנותרו תאים לוקמיה, המכונה מחלה שיורית מינימלית או מדיד (MRD), יכול להיות סמן חזקים לחיזוי של הישנות האלה. יתר על כן, ניתוח רטרוספקטיבי של מספר מחקרים הראו כי הנוכחות של MRD במח העצם של AML חולים בקורלציה עם הישרדות המסכן. לא רק היא מכלל האוכלוסייה לוקמיה, בא לידי ביטוי על ידי תאים מחסה של לוקמיה הקשורים החיסון-פנוטיפ (LAIP), הקשורים עם התוצאה הקלינית, אבל אז הוא subpopulation ילדותי תדירות נמוכה של תאי גזע לוקמיה (ה-LSC), אשר שניהם יכולים להיות פיקוח באמצעות cytometry זרימה MRD או MRD כמו גישות. הזמינות של מבחני רגישות המאפשרים זיהוי של תאים לויקמיה שיורית (גזע) על סמך תכונות מחלות ספציפיות או הקשורים למחלה (סמנים מולקולריים חריגה או חריגה immunophenotypes) יש שיפור דרסטי MRD הערכה ב- AML. עם זאת, בהתחשב הטרוגניות הגלום והמורכבות של AML כמחלה, שיטות דגימה מח עצם וביצוע ניתוח MRD ואת ה-LSC צריך להיות בהרמוניה כאשר הדבר אפשרי. כתב יד זה שנתאר מתודולוגיה מפורט נאותה מח עצם וביופסיה דגימה, תחבורה, לטעום להערכת cytometry זרימה צבע רב אופטימלית, ועיבוד gating אסטרטגיות כדי להעריך MRD ואת ה-LSC כדי לסייע בקבלת החלטות טיפוליות עבור חולים AML.

Introduction

לוקמיה מיאלואידית חריפה (AML) הוא שגידול ממאיר של מח העצם מאופיין על ידי פגמים בתוכנית ההבשלה, עם התפשטות חריגה, הצטברות של תאים מיאלואידים ובתאים, עיכוב של hematopoiesis נורמלי, ולבסוף, מח עצם כישלון . המחלה היא הטרוגנית מאוד ביחס מורפולוגיה, immunophenotype, ציטוגנטיקה, שיבושים מולקולרית וחתימות ביטוי גנים, כמו גם התגובה טיפול, טיפול תוצאה1,2. ניהול הנוכחי כולל אינדוקציה כימותרפיה במטרה להשיג הפוגה מלאה (CR), ואחריו הפוגה שלאחר הטיפול, אשר במידה רבה מונחה על ידי התוצאות של מולקולרית, cytogenetic, immunophenotypic מחקרים והיא מורכבת גם מספר קורסים של כימותרפיה נוספים או השתלת תא גזע (עצמיים או allogeneic)3. למרות המחירים גבוה הפוגה לאחר כימותרפיה אינטנסיבית של עד 90%, הישרדות 5 שנים אצל מבוגרים היא רק כ 30% - 40%, בעיקר עקב ההתפתחות של ההתקפים אשר הם בדרך כלל עמידים בפני כימותרפיה ובכך מאוד קשה לטפל. התוצאה אצל ילדים הוא טוב יותר, למרות בערך שליש גם נסיגה. לכן, גילוי מוקדם של נסיגה מיידית ימלא של צורך רפואי קליניות, להנחות הפוגה שלאחר טיפול4.

מחלה שיורית לאחר טיפול עשוי לשקף את הסכום של כל האבחון, פוסט-אבחון התנגדות מנגנונים/גורמים; ומכאן המדידה שלו עשוי להיות prognostic פלייבק להדרכת טיפול. האפשרות של defining מחלה שיורית (בעבר נקרא מחלה שיורית מינימלית, המכונה עכשיו מדיד כמו מחלה שיורית או MRD) הרבה מתחת קריטריון מורפולוגי של 5% הפיצוץ תאים משתנה הנוף של הסיכון classification. נכון לעכשיו שתי השיטות המשמשים בעיקר לזיהוי MRD הם לזרום cytometry ומבוססי -מולקולרי המבוסס על, האחרון המוערך על ידי רוורס טרנסקריפטאז PCR (RT-qPCR)5 , או אף בשלב מוקדם מדי, על ידי הדור הבא רצף (הגדרות). מחקרים רבים גם במבוגרים כמו ילדים כבר הוכיחה כי מגוון גישות MRD מספקים מידע prognostic חזק ב- AML הן לאחר אינדוקציה ואיחוד טיפול6,7, הגדרה חדשה של המחלה נטל ( ממונה ההתר מורפולוגי) עכשיו מתגלה8. הדבר מצביע על כי MRD מוערך על ידי זרימה או טכניקות מולקולריות צריך להיות, למעשה כבר נעשים, תקן סטנדרטי בכל ניסוי קליני ב- AML.

כתב יד זה דן ההליך cytometry זרימה מפורט להצטייד איפיון immunophenotypic לשחזור ומדויקים של MRD דגימות מח עצם, כולל מח עצם הדגימה ועיבוד ההליכים שקדמו cytometry זרימה. הזמינות של דגימות מח עצם באיכות טובה-אבחון ומעקב חיוני להצלחה של מדידה זו על פני אתרים קליניים, ניסויים קליניים. למעשה, שיקולים אנליטי מראש אלו הם גם גישות MRD המתודולוגי מולקולרית (PCR ו המיתרים). Immunophenotypic פלואורסנציה MRD, סמנים aberrantly ביטוי בשילוב עם נורמלי מיאלואידית וסמנים קדמון, לזהות לוקמיה-הקשורים immunophenotype (LAIP)9. MRD מודד את התוצאות של גורמים רבים המשפיעים על התגובה לטיפול, כגון עמידות לתרופות לוקמיה מהותי או נרכשות, pharmacodynamics וקינטיקה של טיפול, מעקב המערכת החיסונית תאימות. לכן, MRD הוא אבחון פוסט חזק מאוד prognostic פרמטר המקושר עם התוצאה הקלינית כאשר dichotomized ברמה ניתוק נקבעים על-ידי ניתוח מאפיין הפעלה מקלט (ROC). בשביל עמיתינו AML למבוגרים של HOVON 42 א לומדים, רמת ניתוק מוגדרת ב- 0.1% של כדוריות הדם הלבנות של תאים חיוביים/סה כ LAIP. באמצעות קריטריון זה לקביעת מצב MRD חיובי לעומת שליליים, קבוצה של חולים ניתן לזהות מי יש שכיחות relapse גרוע במידה משמעותית, ללא נסיגה, הכוללת הישרדות6. בנוסף, אנו מתארים את המדידה של תאים הלוקמיה לא בוגר, עמידים בפני התרופה עם תכונות כמו תאי גזע (תאי גזע CD34 + CD38-לוקמיה, או ה-LSC), אשר מציעה מנבא חזק של המטופל התוצאה10. יחד LAIP, ה-LSC ניגש טופס הגישה MRD זרימה cytometric. הגישה LAIP מתאים בערך 90% של החולים, בעוד כ- 80% מהחולים ניתן ליישם את גישת ה-LSC. ביחד מעל 95% מהחולים ניתן להעריך עבור פרמטר אחד או שניהם.

לבסוף, פרסום זה מספק תיאור מפורט מבצעית כדי להעריך MRD מאת cytometry זרימה. זה כולל: 1) משלים ו/או סטנדרטיזציה של תהליכי דגימה מח עצם, הדרכה תחבורה 2) מדגם 3) תיאור מפורט של זיהוי תאים לוקמיה עם FACS באמצעות מספר לוחות נוגדן כולל גישות צינור תא בודד כדי לאפיין את ה-LSC, 4) ההקמה של FACS מכונות למדידות מתוקננת, 5) תוכניות אנליטי עבור MRD מדידות ו- 6) תוכניות אנליטי לצורך זיהוי ה-LSC.

אנו שואפים להראות לכל ההיבטים של ההליך כולל את הכנת הדוגמא מאז לעיתים רחוקות הנדונה עוד זה נושא חשוב עבור האיכות של התוצאה הסופית. שאיבת מח עצם ביופסיה קליניים הליכים המשמשים להערכת התאים hematopoietic בתוך מח העצם בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. אלה מבוצעות יחד עם ספירת דם (CBC) דם. השיטה אופטימלית עבור שאיבת מח עצם חיונית אבחנה מדויקת ומעקב למדידה MRD. בנוסף, וביופסיה מח העצם מוצלח צריך להכיל מספיק תאים כדי לבצע את LAIP ה-LSC זרימה וניתוח (לפחות 10 מיליון תאים קיימא). כאן, אנו מתארים את שיטת ביצוע שאיבת מח עצם ולספק הנחיות, אשר אמור לגרום נאותה תא הדגימה (והגבלת הפוטנציאל של hemodilution) צריך אבחון מדויק ומחקר נוסף. שיקולים אנליטי מראש אלו הם גם גישות MRD המתודולוגי מולקולרית (PCR ו המיתרים). כל דגימות עבור immunophenotyping תעובד מעדיפים בתוך 24 שעות של אוסף. אמנם לא recommendable, מח עצם ודגימות דם היקפיים ניתן עדיין לעבד ולעדכן ניתח כאשר המשכתי עד 72 שעות בטמפרטורת החדר. בנוסף, כל handlings עם החומר צריכה להתבצע בתנאים סטריליים, על מנת לאפשר הקפאה קריוגנית של תאים סטרילי להערכת המחקר/איכות מאוחר יותר ועוד.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר הקווים המנחים של קוד מחקר ועדת האתיקה המחקר של המרכז הרפואי של אוניברסיטת VU.

1. מח עצם השאיפה ודגימת הכנה

  1. הכנת החולה של החומר
    1. למלא מזרקים 10 מ"ל אחד או שניים עם לידוקאין 1% באמצעות מחט 16-מד. החלף את המחט מחט 21-מד.
    2. לשים שתי טיפות של EDTA 5% על השעון-זכוכית.
    3. להגדיר שקופיות זכוכית (n = 15 עם מספור החולה עקבי ותאריך) עבור ההכנות השמצות.
    4. המקום החולה במצב חימום לרוחב. לאתר את הכסל האחורי ולסמן עם עט.
      הערה: באופן כללי, הכסל האחורי הוא רוחב מצד אחד ממוקם דיסטלי האגן, יד אחת לרוחב רוחב עד האמצע. אצל נקבות, עמוד השדרה בפועל עשוי להיות קצת יותר לרוחב, גם כמה גברים מעט יותר המדיאלי.
    5. לחטא את העור עם chlorhexidine 0.5-1% אתנול מן האזור המיועד ביופסיה כלפי חוץ במעגלים.
    6. לפתוח את החבילה של כפפות סטריליות, לשים כפפות סטרילי, לשכב את החבילה על השולחן כדי ליצור שדה סטרילי. לפתוח את החבילה עם המחט השאיפה ומניחים אותו על המגרש סטרילי.
    7. לחדור את העור ואת הרקמה התת עורית, ולבסוף קרום העצם. -קרום העצם, לנהל הלידוקאין בצורה כזאת, כי יש כבר מורדם על שטח של 1 ס מ קוטר.
      הערה: ניהול נאותה של לידוקאין על קרום העצם היא אחד הגורמים החשובים ביותר עבור נוחות המטופל. בדוק קרום העצם יש כבר מורדם כראוי על-ידי הקשה את המיקום המיועד ביופסיה עם מחט הציג ושאלו אם המטופל מרגיש שום כאב. הערה: ילדים הם מורדם לחלוטין במהלך כל התהליך.
    8. . תחזיקי את המחט וביופסיה (15 Ga x 2.8") עם תום proximal דקל ואת האצבע כנגד הצד של פיר המתכת של המחט ליד הקצה; עמדה זו מאפשרת שליטה טובה יותר.
    9. להציג את המחט בתנועה מסתובב (על-ידי מתחלפים במהירות התנועה pronating/supinating) דרך העור לכיוון עמוד השדרה iliac ולהביא את המחט במגע עם השדרה iliac האחורי.
    10. להבטיח כי הוא המחט הוא הציג לאזור anesthetized של קרום העצם; המטופל צריך להרגיש רק לחץ וכאב אין. אם המטופל מרגיש כאב, למקם מחדש את המחט או להזריק לידוקאין יותר.
    11. באמצעות לחץ עדין אך המשרד, מראש את המחט תוך כדי סיבוב בתנועה בכיוון השעון לסירוגין עם כיוון השעון-מונה. הכניסה לתוך חלל מח מזוהה בדרך כלל על ידי התנגדות ירד.
    12. הסר את stylet המחט. מזרק ריק 10 מ"ל לצרף המחט.
    13. הפעילו לחץ שלילי על ידי נסיגה הבוכנה מזרק עם משיכה עדינה. להזהיר המטופל כי הם עשויים לחוש תחושות התכווצויות וכאבים כאשר הוא להיות aspirated מח. אם אין מספיק spicules מח עצם משתחררות, שאיפה נוספת צריכה להתבצע עם אחד מהיר לצייר. רוב spicules תהיה ב- mL 1-2 הראשון המתקבל המשיכה הראשונית. האחות רק 1-2 מ ל כדי למנוע דילול המדגם.
      הערה: דילול תגרום hemodilution, עשויים לבלבל את תוצאות MRD).
    14. להסיר את המזרק ולהחליף את stylet לתוך המחט השאיפה. הוצא את החלק של מח לתוך כוס השעון וכל השאר לתוך שפופרת 8 mL מצופה הפארין.
      הערה: היפוך כל שפופרת מיד לאחר הצבת את וביופסיה מח לתוך הצינור הדגימה כדי להבטיח בדיקות דם נאותה. קרישת דם במח העצם היא לעתים קרובות הגורם של חומרים בלתי הולמים. מח עצם נוספים יכולים להיות aspirated מאותה נקודה, אבל רצוי, המחט מתקדמת 5-10 מ מ לפני וביופסיה חדש הוא נלקח. רצוי לקחת לא יותר מ-2 שואבת לכל רמת ההכנסה. הקפד לסמן את הצינורות עם הגדלת מספרים המייצגים הראשון, השני ו/או ברציפות שואבת. . זה הכלל נפוצות לשימוש ההגרלה הראשונה לניתוח אבחון הרלוונטיים ביותר
    15. לחלופין, תמשוך את המחט מן המקום ההכנסה נית לתוך חלל מח מילימטרים ספורים מן המקום הכניסה המקורי, חזור על הפעולות.
      הערה: לא תשאף יותר מ 1-2 מ לכל למשוך, כדי למנוע זיהום דם משמעותית.
    16. חזור על לעתים קרובות החומר הדרוש. כאשר חומר מספיק עבור פרוטוקול מחקר קליני מסוים הוא aspirated להסיר את המחט מח עצם.
      הערה: על במקרה של שאיפות איטיות או אחרת קשה מח עצם השימוש של מזרקים שהיו סמוקות מראש עם קרישה עשוי להיות שימושי. במקרה של ברז יבש, לבצע ביופסיה trephine אשר מההיקף של כתב היד הזה.
  2. הכנת מריחות לבדיקה מורפולוגיות
    1. להערכת מורפולוגי אופטימלית, לבחור spicules (למשל באמצעות מרית פלסטיק) בין וביופסיה הזכוכית-watch ולמקם אותם על משטח זכוכית.
    2. הנח בעדינות עוד שקופיות זכוכית מעל לשקופית עם העצם והחלק בעדינות; הימנע לחץ כלשהו.
      הערה: רק במקרה של מח עצם גדול מאוד spicules קלה עשויה ללחוץ, כדי להקטין את עובי המריחה התא. היתרונות בהליך עזרה עוזרת שיכול להתמודד עם הצינורות הדגימה. Labelling מדויק של הצינורות עם המטופל ומספר של ההגרלה רציפים מח עצם היא קריטית.
    3. ייבש את השקופית ביסודיות, ולאחר מכן לבצע גרונוולד Giemsa עלול להכתים (ראה טבלה של חומרים). לבדוק תחת מיקרוסקופ אור על מורפולוגיה (ראו איור 1).
      הערה: איור 1A מציג את מריחות של מח העצם בריא המורכב של סוגי התאים פונקציונליים בעוד איור 1B חולים AML עם תקיעות בעיקר לוקמיה. כדי להגדיר טוב יותר את הנטל לוקמיה שיורית, immunophenotyping צריך להתבצע.

2. תחבורה של חומר עבור עיבוד נוסף

  1. הכנה של הדגימות תחבורה
    1. על מנת לוודא כי החומר לא ידלוף, הצינורות לא ישברו, להבטיח אריזה נכונה (ראו איור 2).
      הערה: מ שלנו אחרים חווה את הכדאיות של התאים נשמר בצורה הטובה ביותר כאשר מח העצם נשמרת בטמפרטורת החדר. להעברה לטווח ארוך זו בצורה הטובה ביותר מושגת באמצעות טמפרטורת החדר "ג'ל-חבילת" כדי לסייע יציבות טמפרטורה במהלך ההעברה.
    2. תווית חבילות ולהוסיף את הטפסים הנכונים כדי למנוע אובדן החבילה, תחבורה ממושכת או מעבר של חולים.
      הערה: זה לפחות להכיל: נתוני החולה (טופס 1). זה צריך לכלול את מספר הלימוד ואת בדרך כלל את 'תאריך לידה'. חיוני עבור עיבוד נכון של החומר לאחר ההגעה במעבדה המקבל, הוא הצהרה ברורה של במיוחד המבוקש ותעסוקתית (אבחון מולקולרי, immunophenotyping, MRD וכו) בטופס זה. (טופס 2) הכתובת ומספר הטלפון של איש קשר, בעת הצורך, ניירות מכס. כדי למנוע איבוד חבילות בדואר, המעבדה השולח יודיע תמיד את המעבדה המקבל שנשלח דגימה. מומלץ השימוש "המסלול, מעקב".
  2. קבלת דוגמיות של מוסדות אחרים
    1. ודא הלוגיסטיקה מתאימים הם במקום במכון לקבל את הדגימה במעבדה ברגע ששולחים במכון.
      הערה: עבור הארגון הלוגיסטי אופטימלי רצוי מעבדה מרכזית נדרש, אשר מקבל, אוספת את כל החומר של המרפאה המקומית ושל חולים חיצוני. בפרט, הקצאת פרוטוקולי הפצה ותקשורת ברורה עם המעבדות מנהלים חיוני.
    2. לאחר קבלת הדגימות, במדויק הערה את המספור המתאימה ב עותק קשיח טפסים מסד נתונים מאובטח המכיל שדות חשובים כגון MRD ופרוט משפט מספר קוד מסוים, מספר רישום של בית החולים, שולח המכון, תאריך לידה, חומר סוג (מח עצם או דם היקפיים), בספירת תאי הדם הלבנים (WBC), תאריך של שאיבת מח עצם, תאריך מדידה של המדגם, כל ההערות רלוונטיות עבור איכות המדידה.
      הערה: רצוי, מסד נתונים זה מצויד גם להכיל נתונים נוספים (או להיות מקושר למסדי נתונים אחרים) של תוצאות ניתוח, המטופל נתונים נוספים כגון נתוני מעקב.

3. זרימה Cytometer ההתקנה

הערה: סעיף זה מבוסס על הוראות Euroflow. 11

  1. הגדר של האופטיקה (PMT) מתח עבור FCS האס הפרמטרים ואת היעד ערוצי קרינה פלואורסצנטית
    1. פרמטרים עבור FCS האס להתניע את cytometer זרימה ולבצע את "Cytometer ההתקנה, מעקב אחר (CST)" להפעיל את cytometer זרימה עם חרוזים CST (ראה טבלה של חומרים). Lyse כדוריות דם אדומות מתורם בריא (המתוארת בסעיף 4.1).
      1. ליצור התנסות חדשה (בתפריט: ניסוי, ניסוי חדש, בחר ניסוי ריק) באמצעות התוכנה של היצרן (ראה טבלה של חומרים) עם פיזור קדמי (FSC) לעומת Sideward פיזור (האס) מגרש נקודה עבור הגדרת הפרמטרים FSC והאס. שם הניסוי הזה, PMT FSC/SCC עם התאריך. השתמש תחילה את ההגדרות הנוכחיות של cytometer (קליק ימני: "החל CST הנוכחי"). הגדרות אלה נוצרו עם ביצועים CST החשבון באמצעות חרוזים CST-כיול (ראה טבלה של חומרים). להתאים FSC האס להמחיש לימפוציטים "ניסוי עולמי הגדרות". הערה: ב- cytometer הזרימה שלנו אלו הן 285 V 400 V בהתאמה. לסמנן "הפיצוי לאפשר" ב: מפקח/כלי הגדרות/פיצוי.
      2. כדי להעריך את גודל התאים (FSC) ואת צפיפות (האס) התחל מדידה ללא תווית lysed תאי דם היקפיים על-ידי הפונקציה "לרכוש תאים". שער של לימפוציטים מתחים להתאים/fine-tune FSC ואת האס להגיע ערכי היעד הממוצע עבור האוכלוסייה לימפוציט מגודרת: FSC: 100,000 (טווח 95,000-105,000); האס: 15,000 (טווח 13,000-17,000).
      3. לרכוש והקלטה של נתונים על-ידי מדידת אירועים לפחות 10,000. ודא הממוצע FSC ולאחר האס יעד ערכי לימפוציטים מגודרת והתאם מחדש במידת הצורך.
    2. הגדרה זריחה היעד ערוצי PMT המתחים לשימוש 8-לשיא הקשת חרוזים כיול חלקיקים (ראה טבלה של חומרים).
      1. ליצור התנסות חדשה FACS עבור 7-פסגות. ליצור גליון עבודה "המטרה כלומר עוצמת פלורסנט (MFI)" עם כל נקודה הכרחי חלקות (n = 2; FSC נגד האס, FITC לעומת PE), היסטוגרמות (n = היסטוגרמה 8; אחד עבור כל גלאי קרינה פלואורסצנטית) ונתונים סטטיסטיים מציג את ההפניה השיא לערכים (MFI, המקדם של וריאציה (CV)) לכל ערוץ זריחה.
      2. להכין טרי פתרון המכיל טיפה 1 (± 60 µL) של הקשת חרוזים ב 1 מ"ל של dH2O. בעדינות מערבולת לערבב את החרוזים בפתרון.
      3. השתמש בהגדרות PMT של המתחים FSC/האס מלמעלה, התחל מדידה של זריחה של חרוזים קשת באמצעות הפונקציה "לרכוש" (ללא הקלטה) בקצב "חסכוניים" עם סף של 5000. השתמש בלחצן"שער מלבני" לשער גופיה חרוזים האוכלוסייה P1 FSC מול מגרש נקודה האס. שער 7th שיא - P2 האוכלוסייה ב- FITC לעומת PE נקודה עלילה.
      4. המשך רכישת 7-פסגות הקשת חרוז הבולם, להתאים/fine-tune PMT החשמלי ב כל הערוצים פלורסצנטיות להגיע ערכי MFI יעד על פי ערוצי היעד MFI המבואר כאמור עם החרוזים.
      5. להשתמש "שיא" כדי לאסוף נתונים של-10,000 אירועים ולבדוק את MFI 7th שיא חרוזים. תקן את המתחים PMT במידת הצורך. פעם ערכי היעד MFI הפסגהth 7 הינם נגישים, רשומה/להחליף את הקובץ עבור הערכים הסופיים PMT.
      6. שמירת הערכים הסופיים PMT, שם לקובץ ההתקנה PMT עם התאריך, אשר יהיה שמור בקטלוג של התוכנה של היצרן. השתמש תוכנית התקנה זו PMT לתיקון השפכים מעל עבור כל צבע זריחה.
  2. הגדרות פיצוי קרינה פלואורסצנטית
    1. תווית צינור עבור הפקד וללא רבב, כל נוגדן fluorochrome מצומדת (ראו טבלה S1 fluorochromes משומשים). פיפטה 100 µL מאגר לתוך כל שפופרת.
    2. מערבולת הבקבוקון של פיצוי ססגוניות חרוזים (ראה טבלה של חומרים) ביסודיות ולאחר מכן להוסיף טיפה מלאה 1 (± 60 µL) של אלה חרוזים כל שפופרת.
      הערה: להימנע מטפטפים את החרוזים למטה בצד של הצינור בעת הוספתן לרשימת כל שפופרת. זה יכול להוביל ריכוז נמוך חרוז, יכול להשפיע על התוצאות של המטריקס פיצוי.
    3. פיפטה האחסון המתאים מחושב עבור מבחן אחד של נוגדן fluorochrome מצומדת מספיקות (אשר יהיה מספיק כתם 106 תאים) לתוך צינור המקביל ו מערבולת ביסודיות. אינם מוסיפים נוגדן הצינור בקרה וללא רבב. תקופת דגירה של 15 עד 30 דקות בחושך בטמפרטורת החדר (RT).
    4. להוסיף 4 מיליליטר שטיפת מאגר (באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)/0.05% azide-0.1% האנושי אלבומין (HSA) (ראה טבלה של חומרים)) כדי כל שפופרת. Centrifuge הצינורות ב 300גרם במשך 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע resuspend בגדר חרוז על-ידי הוספת 0.2 מ של מאגר לשטוף כל שפופרת. וורטקס הצינורות ביסודיות.
    5. פתח את תוכנת ניתוח של היצרן (ראה טבלה של חומרים) ליצור התנסות חדשה (בתפריט: ניסוי, ניסוי חדש, בחר ניסוי ריק) ושנה כקובץ פיצוי עם התאריך הנוכחי.
    6. פתח את "הגדרות cytometer" ו להשתמש בהגדרה PMT מ סעיף 3.1. ודא כי הסף ב- FSC 5,000, הערכים פיצוי של כל fluorochromes משומשים הם אפס.
    7. ליצור פקדים הפיצוי, לרבות צינורות תווית ספציפי, לפי הצורך. הקפד לכלול פקד וללא רבב. בחר מתוך התפריט: ניסוי, פיצוי ההתקנה, ליצור פקדים פיצוי.
    8. לטעון את הצינור בקרה וללא רבב, להתאים את השער P1 סביב האוכלוסייה חרוז גופיה ולהבטיח כי השער P1 מכיל רק גופיה חרוזים.
    9. השער P1 באמצעות לחצן העכבר הימני ובחר "החל על כל פיצוי פקדי". נתוני הרשומה עבור כל הקברים פלורסצנטיות שכותרתו יחיד. ודא P2 שער מקיף את האוכלוסייה חיובי על כל היסטוגרמה זריחה. אם יש צורך להתאים את השער.
    10. לחשב את הפיצויים. ניסוי בחירה, פיצוי ההתקנה, חישוב פיצויים.
    11. אם בחישוב הפיצוי אינו מצליח, יציג הודעת שגיאה. בצע את ההתאמות הנחוצות, לחשב מחדש. כאשר בחישוב הפיצוי הוא מוצלח, תיבת דו-שיח מופיעה הצגת הנחיה עבור השם עבור הגדרת פיצויים.
    12. הזן שם (למשל התקנה צבע של 8 YY-MM-DD), קישור ולחץ להציל. הגדרת פיצויים יישמרו גם לקטלוג ההתקנה פיצוי.
      הערה: באותן ההגדרות יכול לשמש עבור כל הניסויים באמצעות את fluorophores אותו.

4. לזרום Cytometry הערכה (LAIP וה-LSC)

הערה: כאן אנו מתארים בצובר פירוק ההליך לפני צביעת, המאפשרת כתם ריכוז המועדפת של WBC. ברוב הפרוטוקולים MRD השתמש בגישה זו, למרות כמה משתמשים בהצלחה אפשרויות אחרות כגון צביעת לפני פירוק. כל מח עצם מכתים לפני פירוק ממזערת אובדן תא מועדף12, אבל החיסרון של ריכוזים בלתי צפוי, נמוך מדי תא.

  1. תפזורת פירוק של תאים
    הערה: לשמור את הדוגמאות unmanipulated אופקי ב RT, בעת זרימה cytrometric הרכישה לא ניתן לבצע באותו היום כדי להתחיל את כל התהליך למחרת.
    1. Resuspend את דגימת מח עצם anticoagulated עד הומוגניות על-ידי היפוך הדגימה מספר פעמים. לקבוע את הריכוז של תאים במח העצם (בספירת תאי הדם הלבנים (WBC)) באמצעות תא ספירת קאמרית עם התא מכתים פתרון Tuerk (ראה טבלה של חומרים).
    2. Pipet אמצעי האחסון הדרושים של מח העצם לתוך צינור נפרד 15 מ"ל. כמות התאים תלויה מספר צינורות מכתימים נפרד; אחד מכתים (שפופרת אחת) לשימוש בתאי הדם הלבנים של6 כ 2 x 10 עבור מדידות LAIP ו- 8 x 106 תאי דם לבנים למדידה של הצינור ה-LSC.
    3. Lyse כדוריות דם אדומות על-ידי הוספת פתרון lysing (ראה טבלה של חומרים). אחסון נדרש של lysing פתרון צריך להיות פי 10 את הנפח של התליה תא.
    4. לערבב בעדינות, על-ידי היפוך, תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT. Centrifuge עבור 7 דקות g 800-RT. להשליך את תגובת שיקוע (למשל עם משאבת ואקום או פיפטה פסטר). Resuspend בגדר תא בתוך באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS)/0.05% azide-0.1% האנושי אלבומין (HSA) (ראה טבלה של חומרים) בשימוש RT. הנפח המרבי של הצינור.
    5. צנטריפוגה עבור 7 דקות g 800-RT. למחוק את תגובת שיקוע (למשל עם משאבת ואקום או פיפטה פסטר). מחדש להשעות בגדר תא ב- PBS/0.05% azide-0.1% HSA כדי ריכוז תא של 100 x 106 WBC/mL, לחלק על פני מספר צינורות המיועד.
  2. צביעת תאים עבור cytometry זרימה
    1. פתרון קוקטייל של נוגדנים חד-שבטיים (מואב) pipet לערבב לתוך הצינורות סדרן (FACS) תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית המתאים, דגירה עם תאי מח עצם lysed למשך 15 דקות בחושך.
      הערה: זה חשוב מאוד כאשר צבעי לכה טנדם משמשים. ראו למשל את תערובות של לוחות standardly להשתמש במעבדה שלנו (טבלה S1).
    2. שטיפת התאים עם 3 מ ל PBS/0.05% azide-0.1% יש. Centrifuge את התאים עבור 5 דקות ב 400g. למחוק את תגובת שיקוע (למשל עם משאבת ואקום או פיפטה פסטר), את resuspend בגדר תא ב- 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA.
    3. למדידה ה-LSC: resuspend בגדר תא ב- 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA ולהוסיף 4 µL של חרוזים ריק (למשל Spherotech, עיין בטבלה של חומרים) לשימוש האוכלוסייה שליטה שלילי בניתוח.
    4. פתח את MRD או ה-LSC ניסוי לפרוס על FACS (ראה טבלה של חומרים), מדד MRD לפחות 100,000 WBC מגודרת אירועים למדידה של דגימות לחולה AML-עונה 1 פרק 106 WBC לדוגמאות AML-מעקב ואבחון. עבור ה-LSC ניסויים למדוד לפחות 4 x 106 WBC הן אבחון ומעקב לקבלת תוצאה אמינה ה-LSC.
    5. לשמור את הנתונים באמצעות קובץ המתאים מתוקנן עבור הניתוח של התוצאות. יצירת אינוונטר של הסמנים נמדד שונים על תאי לוקמיה מיאלואידית חריפה ועל תאי גזע AML (חיובי, שלילי, מעל ומתחת הביטוי) ולאחסן נתונים אלה בכתב העת מעבדה.
    6. למקרה שיש אין אבחנה LAIP זמין, למדוד כל 4 צינורות-מעקב כדי לוודא כי כל LAIP מדידה אפשרית עשויה להיות מזוהה בגישה שונה מן הרגיל.
    7. לבחור את LAIP(s) הכי אמין13 נוסדה ב אבחון ולרכוש אירועים רבים ככל האפשר, אבל > מספר מינימלי של משתתפים שהוגדרו.

5. זיהוי של לוקמיה הקשורים חיסונית-פנוטיפים (LAIP): ניתוח של אוכלוסיות תאים שונים

הערה: ניתן לנתח FCS הקבצים עם התוכנה מספר להמחשת אופטימלית של אוכלוסיות תאים שונים (ראה טבלה של חומרים).

  1. אוכלוסיית תאי הדם הלבנים
    1. שער התאים חיובי CD45 והתאים הופעה בת קיימא, מפספס FSC נמוך (תאים כלכלית, תאים erythroid) בתוך העלילה FSC/האס; אלה מכילים את WBC (איור 3 אאני). הצג את WBC והשתמש באחת סמני פרימיטיבי (לדוגמה CD34; איור 3 אii) כדי לסייע לוודא את המיקום הסופי של הפיצוצים באזור דה CD45dim (איור 3Aהשלישי).
    2. שער התאים CD45dim, חזרה שער התאים בחלקה FSC/האס (איור 3Bאני). להסיר את השער CD34 (איור 3Bii) בעוד דיווח בתאים % בשער הזה כמו תקיעות % עץ האוכלוסייה שלכם בתוכנית. מראים תקיעות האס/CD34 מגרש שער CD34 חיובי התאים (בילFigure3).
  2. לימפוציטים
    1. להשתמש לימפוציטים פקד פנימי: אוכלוסיות תאים מיאלואידים בתור פקד שלילי ואוכלוסיות הלימפה כפקד חיובי.
    2. להתחיל אוכלוסיית תאי הדם הלבנים (איור 4A). לימפוציטים שער כמו CD45גבוהה/SSCנמוכה האוכלוסייה (איור 4B).
    3. ודא שקיימים לא התאים מיאלואידית בשער באמצעות CD34, CD117, CD13 או CD33, שער עבור תאים שלילי שלילי/CD33 (איור 4C-E) CD13. קוראים אוכלוסייה זו 'לימפוציטים' בעץ האוכלוסייה (איור 4F).
  3. LAIP-אבחון
    1. שער הפיצוצים, לאחר מכן תאי CD34 חיובי האס/CD34 מגרש ולקרוא אלה 'סמן פרימיטיביים' בעץ האוכלוסייה.
    2. להתוות את התאים פרימיטיבי, זה מקרה CD34 החיובי, ו לימפוציטים מגרש חדש עם סמן הלימפה (CD7) נגד סמן מיאלואידית (CD33). שער לאוכלוסייה חריגה (ראה לקבלת הנחיות 1 קובץ משלים), קוראים להם 'LAIP חיובית' בעץ האוכלוסייה.
      הערה: בגמר נבחר LAIP המדווח % LAIP על האוכלוסייה הפיצוץ. הרגישות, ירידה לפרטים והיציבות של LAIPs יכול להתבסס רק על ידי אנשי צוות עם ניסיון בשפע במדידות MRD. הסכום הכולל של פרמטרים אלה קובע את איכות LAIP. דוגמאות של ארבעה הערכות LAIP שונים-אבחון מקבלים איור 5 י-ם.
    3. לקבוע את הביטוי של LAIPs (% על תקיעות) וכן לשמר את אלה נתונים במסד נתונים או קובץ excel.
    4. להפוך דוחות של הניתוחים FACS על ההערות של LAIPs זה צריך לשמש-MRD מדידות.
      הערה: ההגדרה של LAIPs רשאי צוות של מומחים כיוון שזו תכונה חיונית עבור מדידות מדויקות MRD-בצע למעלה.
  4. MRD-מעקב
    1. שער הפיצוצים כמתואר ב- 5.1 אך בהתאם את נקודת הזמן לאחר טיפול; הערכה נכונה של שער זה עשויים להיות מאתגרים. להתמקד פנוטיפ LAIP שהוקמה באבחון, שער האוכלוסייה לא בוגר.
    2. כמתואר ב- 5.1. למצוא את השער הנכון הפיצוץ מבוסס aberrancy מוגדר ולהיות מודעים רגנרציה מח עצם וביטויים רגילים על מנת שער אותם החוצה
    3. לחזור על אותו gating אסטרטגיה נקודות בכלל מעקב ולקבוע MRD כאחוז של תאים LAIP באוכלוסייה כל תא דם לבן. ראה דוגמאות איור 6A , 6B.
    4. הדו ח MRD חיוביות כאשר האחוזים של MRD ≥ 0.1% של כדוריות הדם הלבנות. הדפס ניתחו נתונים בתבנית תקנית לדון שבועי עם הקבוצה MRD. לרשום את התוצאות לאחר הסכמה מתמלאת. תן את התוצאות להיות מאושר על ידי המפקח לפני לתקשר את התוצאות רופאים.

6. ניתוח של גזע תא MRD (צינור יחיד ה-LSC)14

  1. ניתוחים של ה-LSC-אבחון ומעקב
    1. שער התאים הפיצוץ כמתואר בסעיף 5.1.
    2. כפקד שליליות פוטנציאליות עבור CD38-, שער כדוריות אדומות, שבר (קרי הנותרים כדוריות דם אדומות לאחר פירוק, כאנטי האסנמוך/FSCנמוך , CD45שלילי). במידת הצורך, תאים מתים ושברי תאים יכולים להיות מהכלל על-ידי דרך שער נוסף בעלילה זו.
    3. לקבוע בתוך השער הפיצוץ לוקמיה של subpopulation עם ביטוי CD34. בחר בתוך אוכלוסייה זו CD34+ CD38 תאים (שתשמש ניתוק: הגבול העליון של חרוזים ריק כיול לקביעת סף (ראה טבלה של חומרים), האדום, שבר או שימוש 103 כנקודת ניתוק). תתקשר אוכלוסייה זו 'אבותנמוך CD38' (איור 7).
      הערה: ראה 1 קובץ משלים פרטים נוספים על ההגדרה CD38-cut-אוף רמות.
    4. לקבוע בתוך האוכלוסיהנמוכה זה CD38 האמיתי CD34 + CD38נמוך מאוד תאי גזע האוכלוסייה, שימוש החציון של השבר אדום, לגבול התחתון של חרוזים כיול ריק או לבחור 102 כנקודת ניתוק (איור 7 ). ראה 1 קובץ משלים פרטים נוספים על הגדרת CD38-cut-אוף רמות.
    5. בתוך שתי האוכלוסיות, שער תאי גזע לוקמיה לעומת תאי גזע hematopoietic רגיל (לעומת ה-LSC HSC) על-ידי ניתוח כל סמן לוקמיה הניתנים בחלונית ' ' (קרי CD45RA, קומבי-6 (CLEC12A, טים-3, CD7, CD11b, CD22 ו- CD56 הכל ב- PE), CD123, CD33 ו- CD44).
    6. מגרש תאי גזע סמן עניין לעומת הסמן תאי הגזע השני כדי להשוות חיוביות/שליליות עם חיוביות/שליליות של סמנים אחרים ולדייק ה-LSC נגד מועדון הכדורגל מונפלייה תדר.
    7. דווח על האחוז של תקיעות ילדותי, לימפוציטים, תאי CD34 +. עבור סמני נפרדות, פרט את המספרים הכולל של CD38נמוך , CD38verylow ואת מספרי CD38נמוך , CD38verylow אשר הם סמן חיוביות (וגם אמצעים ובכך).
    8. בחר עבור דה מרקר זה הטוב מבחין בין תאי גזע hematopoietic נורמלי לעומת תאי גזע לוקמיה לניתוח נוסף. לחשב את אחוז ה-LSC ואת HSC כאחוז של WBC הכולל.
      הערה: אחוז של ה-LSC ≥ 0.004% הוא דיווח כמו ה-LSC חיובי-אבחון, בזמן שרשם 0.0001%-מעקב. תאי גזע aberrant gating בדגימות להמשך טיפול דומה ניתוח-אבחון, עם זאת, מספרי הטלפון הנייד בקרב אוכלוסיות תאי הגזע יכול להיות קטן מאוד. ומכאן הצורך לרכוש מספיק אירועים.

Representative Results

ב- 90% של חולים AML ניתן לזהות LAIP אחד לפחות. על מנת ליצור את אחוזי LAIP + תאים של תאי הפיצוץ פרימיטיבי-אבחון מדויק, ההגדרה המתאימה של השער הפיצוץ הוא קריטי ועליו אימות כמו מטמיעים באיור3. דוגמה של כל מטופל הסתרת סוג מסוים של aberrancy על CD34 + תאים פרימיטיביים הוא מדמיין באיור5. למדידה של MRD-בצע-up, מוקדם יותר מוגדרים LAIP + התאים מגודרת ומוגדר כאחוז של LAIP + תאים של WBC. ומכאן ההגדרה של שער זה חיוני להשיג את התוצאות MRD הנכון. איור 6 מראה חולה נשאר הפוגה מלאה חולה ההתקפים לאחר תוצאות חיוביות MRD (≥ 0.1%) לאחר המחזור השני של טיפול אינדוקציה.

בפרוטוקול הנוכחי מתאים רק להגדרת תאי גזע CD34 + בתאים, מאז אפיון מעמיק של תא זה הראה כי האוכלוסייה CD38 בנמלים את תאי הגזע החזק ביותר כמו שבר. על מנת להפריד מועדון הכדורגל מונפלייה בתוך השבר הזה ה-LSC, משמשים סמנים נוספים. סמני לרוב שנבחר כדי להבחין בין ה-LSC הן CD45RA את הערוץ קומבי מחסה 6 ספציפי ה-LSC הסמנים המסומנת PE. על סמך נוסף קליניים הערכות, רמה ניתוק של ≥ 0.004% הוגדר ה-LSC-חיוביות והיה מקושר עם הישרדות גרוע-אבחון בעוד רמת ניתוק 0.0001% השתמשו ב follw-up10.

Figure 1
איור 1 : מח עצם השמצות. תורם בריא א) ומטופל ב) AML (סוג של FAB 5). צביעת גימזה מוצג בהגדלה 100 x. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : תקן חומרי אריזה תמיסות ביולוגיות. פרטים נוספים על החוקים והתקנות שינוע נוזלים ביולוגיים ניתן למצוא ב אתר15 מרכזי עבור מחלות ומניעתן. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Gating אסטרטגיה עבור הגדרת התאים הפיצוץ. א) Gating CD45dim, B) Gating CD34 + תקיעות.

Figure 4
איור 4 : Gating לימפוציטים. א) תאים כחול הם WBC שמוצג בעלילה FSC/האס, תאי B) ירוק הם לימפוציטים מאופיין CD45גבוהה/SSCנמוכה, C) דוגמאות שליליות עבור CD34, ד) שליליות עבור CD117 ו- E) שליליות עבור CD13, ו) לסוגי תאים שונים מוצגים בו סקירה כללית של האוכלוסייה עץ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : LAIPs-אבחון AML. A) LAIP מבוסס על צלב השושלת aberrancy (CD7 על התאים מבטאים CD33), B) LAIP מבוסס על בידול אסינכרוני (CD11b על התאים מבטאים CD13), C) LAIP מבוסס על ביטוי לעומת תאים נורמליים (CD34גבוה מאוד על CD13 לבטא תאים), ד). LAIP מבוססת על underexpression לעומת תאים נורמליים (הלע-ד רנמוך CD33 לבטא תאים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : LAIP עקב במהלך הטיפול. הגדרת א) LAIP-אבחון (CD34 + / CD13 / CD33-) אובדן LAIP במהלך המעקב לחולה שנותרו הפוגה מלאה רציפה, ב) LAIP הגדרה-אבחון (CD117 / CD7 + CD33 +) ויכולת ההתמדה של LAIP במהלך טיפול בחולה מי הישנות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7 : תאי גזע gating. א) Gating של CD34 שונים + / אוכלוסיות CD38 מבוסס על חרוזים (הוא CD38נמוך מתחת לגבול העליון של החרוזים, בעוד CD38נמוך מאוד מוגדרים נכון התאים שלילי המייצג את ה-LSC, הממוקמים מתחת החציון של החרוזים), ב) 2 דוגמאות של חולים עם ההבחנה בין HSC ה-LSC-המשך טיפול המבוסס על CD45RAneg וביטויקופה CD45RA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלימה קובץ 1. לחץ כאן והתקן את הקובץ.

משלימה קובץ 2. לחץ כאן והתקן את הקובץ.

קובץ משלימה 3- לחץ כאן והתקן את הקובץ.

Discussion

בשפע הנתונים אינם זמינים זה להראות הוכחות חיוביות MRD להיות קשור עם הישרדות עניים, ולכן הערכת MRD עשוי לשפר את התוצאה החולה על-ידי מתן מידע prognostic נוסף שעליו קליניים יכולים לקבל החלטות. לפיכך, עקבית המתואמת שיטה להערכת חיסונית-פנוטיפי של MRD חיונית בסופו של דבר לשפר את הטיפול המטופל. זה גם חשוב בעת השוואת מחקרים קליניים על פני אתרים קליניים שונים, אולי בסופו של דבר לעזרה קלינית החלטה משמש נקודת קצה של קליניים עבור ההישרדות פונדקאית ו... הרעיון כי הנחיות מוצק הם מוצדקת למדידות MRD מדויקים ועקביים הובילה פעולה מתואמת של אירופה לוקמיה רשת (ELN) עיצוב עדכני להנחיות. מסמך מקיף זה יהיה שפורסם מאוחר-2017, וישמש כלי עבור רבים בקבוצות לימוד, מעבדות לנוע קדימה.

שלבים קריטיים בתוך פרוטוקול

היבט חשוב, ולא להתעלם לעתים קרובות של MRD ניתוח הוא ההשפעה של איכות מדגם על קביעה מדויקת של MRD. זה ברור יותר כאשר החומר צריך להיות מועבר אל מוסדות אחרים בניסויים קליניים העולמית, נתן את השיקולים מבצעיים נוספים צריכים להילקח בחשבון על הגדרה זו. כדי להפחית את הסיכון של ערבוב לחולה מידע מהירה ומדויקת של המינהל נאותה דגימות היא קריטית. שוב, בשלב זה של התחבורה הטפסים הנכונים ו/או לייבא לתוך בית החולים אלקטרוניים מערכות עם הקצאות ברורה של ניתוח המבוקש נדרש. וציין הבמה ב הטיפול של MRD הדגימה היא קריטית גם מאז זה עשוי להיות רלוונטי עבור החלטות קליניות (למשל אחרי הקורס השני של טיפול) ואם צריך ולכן להגדיר בבירור. השימוש מעושה נתונים (כמו למשל 1 בינואר בכל שנה הלידה) מגביר את הסיכון של ערבוב חולים או ניתוחים. אם נדרש על פי חוק, צריך לשמש דרך תשוחררנה חלופית של הזדהות.

כל דגימות עבור immunophenotyping תעובד מעדיפים בתוך 24 שעות של אוסף. אמנם לא recommendable, מח עצם ודגימות דם היקפיים ניתן עדיין לעבד ולעדכן ניתח כאשר המשכתי עד 72 שעות בטמפרטורת החדר. בנוסף, כל handlings עם החומר הטוב ביותר ניתן לבצע בתנאים סטריליים, אז הקפאה קריוגנית נוסף של תאים ב- biobanks (מקומי) עודנה רלוונטית: מחקרים קליניים רבים יש ניתוחים נוספים להמשיך לחקור תאים לוקמיה לכבד לתכונות מולקולרית, חיסונית-פנוטיפי ו פונקציונלי שיש לבצע בשלב מאוחר יותר. עם זאת הפרטים של biobanking אינם בתוך הטווח של כתב היד הזה.

באמצעות MRD ככלי אבחון מרמז שהוא צריך מעבדה מוכר, לא רק עבור cytometry זרימה, אלא גם לגבי בקרת איכות של MRD ההערכה. זה עשוי לדרוש חלוקת דוגמאות למעבדות ייחוס ספציפית או (מחדש) ניתוח זרימת קבצים עם המדידות MRD צוותים הפניה.

מאמר זה מתאר את הפעולות החשובות ביותר מאוסף מח עצם וביופסיה להגדרה של MRD בדגימות קליניות - דרישת צוות שלם של מומחים עם משימות מסוימות, אחריות, ועם תכופים תקשורת אפקטיבי אפיון וניתוח. מאז כל פעילות היא גורם מכריע ההליך, מומלץ שיהיה קול לוגיסטיים כולל פרוטוקולים בכל מעבדה, גיבוי כוח אדם אשר הוכשרו במיוחד עבור הפעילות. בנוסף, מאז יש כמה מדרגות סובייקטיבי יחסית בחלק מההליכים (במיוחד LAIP ואת ה-LSC aberrant סמן זיהוי), זה חיוני כדי יש דיונים על התוצאה הסופית על ידי הצוות, ויש הדו ח הסופי מורשה על ידי צוות מפקחים. המאמצים הנוכחיים במרדף אחר פיתוח תוכנה מחשב אשר יסייעו לתקנן את הניתוח MRD (LAIP וה-LSC).

השינוי ופתרון בעיות

בכל מעבדה יכולה לקבל סידרה של נוגדנים יכול לשמש כדי להגדיר את subpopulations שונים למרות שיש עמוד השדרה מתוקננת של סמנים הוא חיוני עבור תוצאות דומות, כפי שמתואר ההנחיות משוכללת ELN MRD מדידות מסמך התייחס לעיל. הממאירות של הסמנים שבחרת יש כמה בעיות זה יכול להקשות על הניתוח של התוצאות צריכים להילקח בחשבון.

מגבלות של הטכניקה

הזיהוי של הביטוי LAIP סמן סוטה ה-LSC קודם מוערך באבחון, מעקב לאורך זמן (במהלך ואחרי הטיפול) עבור אפיון מדויק של פנוטיפ MRD. בעוד מעל 95% מהחולים ניתן להעריך באמצעות LAIP או ה-LSC (או שניהם), עדיין חלק מהחולים יש LAIPs לא מוגדר או לא CD34 + CD38-LSCs או להציג עם תקיעות שלילי CD34, או שיש אבחון חסרים. במקרים אלה, היא עדיין כדאי לנסות ולמדוד MRD עם פאנל של נוגדנים רחב כמו מספר התאים הזמינים מאפשר ולאחר מכן בחר את הכי אמין (ויתור ההבחנה הכי חזק של תאים לוקמיה) LAIP. בהתחשב בעובדה כי שיעור החולים אשר בסופו של דבר נסיגה לא דומים לגמרי immunophenotype את האבחנה, בשל הטרוגניות המחלה AML, מדידת פאנל רחב של נוגדנים-MRD מומלץ בכל מקרה. אלה משמרות immunophenotypic כוללים פיצוץ התאים LSCs הוכחו להתרחש במהלך טיפול16 , המחלה measureable עשויה להתבסס על אוכלוסיות אלה צפויים כביכול. בשלב זה, אולם, לא נקבע אם כל immunophenotypic תת אוכלוסיות יוביל התדרדרות המחלה, לכן לא מקובל לדווח MRD המותאמים-טיפול המבוסס על תאים אלה בניסויים קליניים. חשוב לציין כי הסיכון של חסר ה-LSC בשל האוכלוסייה משמרות הוא מופחת על ידי הגישה שפופרת אחת שבה הם הסימנים המכונן החשוב ביותר aberrancy של cytometry זרימה אחד (PE) ערוץ14.

משמעות לגבי שיטות קיימות

השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה מסתמך על ההגדרה של LAIPs אחד או יותר, אילו תאים עוקבים במהלך הטיפול. החיסרון של שיטה זו הוא כי לאחרונה הוכח כי LAIP עשויים להשתנות במהלך הטיפול. בדרך זו שכמה אוכלוסיות הקרובה עם סמנים aberrant שונים עשויים לפספס. כדי לעקוף את זה, זה יהיה הכי טוב למדוד את כל הסמנים aberrant במקום רק לאלה שנמצאו אבחון. ואז זה יהיה דומה לגישה "שונה מן הרגיל" המשמש מעבדות מספר17.

יישומים עתידיים

לאחרונה, MRD קיבלה תשומת לב נוספת עבור עיצוב חדשניים של ניסיון קליני. בעידן של אפשרויות טיפול מיוחדים, טיפול תרופתי ממוקד, השימוש של MRD כאמצעי התוצאה יהיה להפחית את הזמן הדרוש ליצירת היעילות הקלינית של טיפולים חדשניים, בסופו של דבר המאפשר היכרות מהירה יותר של צורך דחוף טיפולית אפשרויות למרפאה. המשמעות של לוגיסטיקה המתאים וביצוע מעשי של הערכה MRD harmonized מכריעים להצלחת הטיפול העתידי AML כמו ה-FDA בודקת כעת את הכדאיות של שימוש MRD נקודת קצה של הפונדקאית במקום ההישרדות מודד18.

Disclosures

הקוקטיילים נוגדן המשמש עבור האימות של הצינור תאי גזע במוסדות עצמאיים מספר נמסרו באדיבות בידי BD. המחברים אין לחשוף ביחס כתב היד הזה.

Acknowledgments

מחקר זה היא נתמכה על ידי החברה לסרטן הולנדי (2013 הפאק הלאומי-6371) וקרן Egbers עבור VONK. אנו מודים קבוצת העבודה AML הולנדי-MRD בזכות שיתוף הפעולה ועל דיונים פוריים שיפור מתמשך, סטנדרטיזציה של AML-MRD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FACS Canto II  BD Biosciences 338962
CD7 FITC  (50µg/ml) BD Biosciences 555360
CD2 FITC (Unknow) DAKO F076701
CD36 FITC (25µg/ml) Sanquin M1613
CD15 FITC (200 µg in 200 ml) BD Biosciences 332778
CD45RA FITC (50µg/ml) BD Biosciences 335039
CD56 PE (50µg/ml) BD Biosciences 345810
CD22 PE (12,5µg/ml) BD Biosciences 337899
CD14 PE  (50µg/ml) BD Biosciences 345785
CD133 PE (16,5µg/ml) Miltenyi Biotec 130-080-801 Will be replaced soon by Miltenyi for 130-113-108 (75µg/ml) and needs to be titrated
Clec12a PE (Unknow) BD Biosciences 562566
Tim-3 PE (100µg/ml) BD Biosciences 563422
CD7 PE (25µg/ml) BD Biosciences 555361
CD11b PE  (50µg/ml) BD Biosciences 333142
CD34 PERCP-CY5.5 (12,5 µg/ml) BD Biosciences 347222
CD123 PERCP-CY5.5 (25µg/ml) BD Biosciences 558714
CD117 PC7 (12,5µg/ml) Beckman Coulter B49221
CD33 PE-CY7 (25µg/ml) BD Biosciences 333952
CD19 APC (50µg/ml) BD Biosciences 345791
CD11b APC (50µg/ml) BD Biosciences 333143
CD33 APC (12,4µg/ml) BD Biosciences 345800
CD38 APC  (25µg/ml) BD Biosciences 345807
HLA-DR APC-H7  (50µg/ml) BD Biosciences 641411
CD44 APC-H7  (800µg/ml) BD Biosciences 560532
CD13 BV421 (Unknow) BD Biosciences 562596
CD34 BV421  (50µg/ml) BD Biosciences 562577
CD45 Krome Orange (100µg/ml) Beckman Coulter B36294
CD45 HV500c  (100µg/ml) BD Biosciences 655873
CST beads  BD Biosciences 655051
Pharm lysing solution BD Biosciences 555899
Multicolor CompBeads BD Biosciences 644204
FACSDiva software BD Biosciences 659523
Infinicyt  Cytognos CYT-INFINICYT-AOM
Rainbow Calibration Particles, 8 peaks, Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Tuerk solution Brocacef No longer available but can be purchades from different companies
Blank Calibration Particles Beads Spherotech BCP-100-5
Albuman 200g/l Sanquin GTIN8717185830910
Azide Acros Organics 190381000
ddH2O Water demineralized in our institute
10*PBS Lonza BE17-517Q
May Giemsa Grünwald Merck  1.01424.2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129, (4), 424-447 (2017).
  2. Zwaan, C. M., et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 33, (27), 2949-2962 (2015).
  3. Cornelissen, J. J., et al. The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach. Nat Rev Clin Oncol. 9, (10), 579-590 (2012).
  4. Grimwade, D., Freeman, S. D. Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for "prime time"? Hematology. 2014, (1), 222-233 (2014).
  5. Krönke, J., et al. Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group. J Clin Oncol. 29, (19), 2709-2716 (2011).
  6. Terwijn, M., et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 31, (31), 3889-3897 (2013).
  7. van der Velden, V. H. J., et al. Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia. 24, (9), 1599-1606 (2010).
  8. Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. MRD in AML: time for redefinition of CR? Blood. 121, (12), 2166-2168 (2013).
  9. Feller, N., et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 18, (8), 1380-1390 (2004).
  10. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9, (9), e107587 (2014).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, (9), 1986-2010 (2012).
  12. Paietta, E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? Bone Marrow Transplant. 29, (6), 459-465 (2002).
  13. Loken, M. R., et al. Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group. Blood. 120, (8), 1581-1588 (2012).
  14. Zeijlemaker, W., et al. A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Leukemia. 30, (2), 439-446 (2015).
  15. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html (2017).
  16. Bachas, C., et al. The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse. Leukemia. 26, (6), 1313-1320 (2012).
  17. Ravandi, F., et al. Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia. Cancer. 123, (3), 426-435 (2017).
  18. Hourigan, C. S., et al. Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 31, (7), 1482-1490 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics