Örnek ve işlem kemik iliği ölçülebilir artık hastalık ve akut Myeloid lösemi lösemik kök hücre ölçmek için kapsamlı iletişim kuralı

* These authors contributed equally
Cancer Research
 

Summary

En küçük veya ölçülebilir rezidüel hastalığı (MRD) tespiti risk değerlendirme rafine ve Relaps Akut Miyeloid Lösemi (AML) içinde tahmin için önemli bir prognostik biyomarker olduğunu. Bu sõnõrlar ve önerileri ile tutarlı ve doğru kimlik ve MRD, tespiti için en iyi yöntemler yardımcı etkili AML tedavi karar verme.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Cloos, J., Harris, J. R., Janssen, J. J. W. M., Kelder, A., Huang, F., Sijm, G., Vonk, M., Snel, A. N., Scheick, J. R., Scholten, W. J., Carbaat-Ham, J., Veldhuizen, D., Hanekamp, D., Oussoren-Brockhoff, Y. J. M., Kaspers, G. J. L., Schuurhuis, G. J., Sasser, A. K., Ossenkoppele, G. Comprehensive Protocol to Sample and Process Bone Marrow for Measuring Measurable Residual Disease and Leukemic Stem Cells in Acute Myeloid Leukemia. J. Vis. Exp. (133), e56386, doi:10.3791/56386 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Akut Miyeloid Lösemi (AML) yanıt kriterleri son zamanlarda yeniden kurulmuş, hastaların tam remisyon (CR) elde etmiş olup olmadığını belirlemek için kullanılan morfolojik muayene ile. Yaklaşık yarısı CR giren erişkin hastaların kemik iliği artık AML hücrelerinde akıbet nedeniyle 12 ay içinde Relaps. Bu lösemi hücreleri, en küçük veya ölçülebilir rezidüel hastalığı olarak (MRD), bilinen kalan Nefelometri bu çabaladıkça tahmin için sağlam bir biyomarker olabilir. Ayrıca, çeşitli çalışmalarda retrospektif analizi MRD huzurunda kemik iliği AML hastalarının zavallı hayatta kalma ile karşılıklı olarak ilişkilendirir göstermiştir. Sadece toplam lösemik nüfus, yansıyan hücreleri tarafından bir lösemi yataklık bağışıklık-fenotip (LAIP), klinik sonuçlar ile ilişkili ilişkili ama böylece olgunlaşmamış düşük frekanslı subpopulation lösemi kök hücre (LSC), bunların her ikisi de olabilir Akış Sitometresi MRD veya MRD benzeri yaklaşımlar üzerinden izlenir. Rezidüel Lösemi (kök) hücre hastalığa özgü veya hastalık ilişkili özelliklerini (anormal moleküler işaretleyiciler veya anormal immunophenotypes) temelinde algılanabilmesi hassas deneyleri kullanılabilirliğini büyük ölçüde geliştirilmiş MRD değerlendirme var AML içinde. Ancak, doğal heterojenite ve AML karmaşıklığı bir hastalık olarak göz önüne alındığında, kemik iliği örnekleme ve MRD ve LSC analizi gerçekleştirmek için yöntemleri mümkün olduğunda uyumlu. Bu el yazması yeterli kemik iliği aspiratı örnekleme için detaylı bir metodoloji açıklayan, taşıma, örnek en iyi çok renkli Akış Sitometresi değerlendirmesi için işleme ve stratejileri MRD ve LSC tedavi karar vermede yardımcı olmak için değerlendirmek için geçişi AML hastalar için.

Introduction

Kemik iliği malignite kusurları olgunlaşma programında anormal proliferasyonu ve birikimi Miyeloid progenitör hücrelerinin normal hematopoiesis ve sonuçta kemik iliği yetmezliği inhibisyonu ile karakterize Akut Miyeloid Lösemi (AML) olduğunu . Morfoloji, immunophenotype, sitogenetik, moleküler anomalileri ve gen ifade imzaları ile ilgili olarak, hem de tedaviye yanıt ve tedavi sonucu1,2için son derece heterojen bir hastalıktır. İndüksiyon kemoterapi tam remisyon (CR), büyük ölçüde moleküler, sitogenetik sonuçlarını tarafından yönlendirilir sonrası iyileşme tedavi ardından elde etmek amacı ile geçerli yönetimi içerir ve immunophenotypic çalışmaları ve aşağıdakilerden oluşur çeşitli kurslar ek kemoterapi veya (Otolog veya allojenik) kök hücre nakli3. Sonra 90 %'e kadar 5 yıllık sağkalım erişkinlerde yoğun kemoterapi sadece yaklaşık % 30-% 40, ağırlıklı olarak gelişimi nedeniyle yüksek remisyon oranları rağmen Genellikle kemoterapi için dayanıklı ve tedavi etmek böylece çok zor olan relapses. Her ne kadar yaklaşık üçte biri de Relaps sonucu çocuklarda iyidir. Bu nedenle, erken teşhis yakın nüks karşılanmamış bir tıbbi ihtiyaç doldurur ve sonrası iyileşme terapi4Kılavuzu.

Terapi tüm tanı ve sonrası tanı direnç mekanizmaları/faktörler toplamına yansıtabilir sonra kalan hastalığı; Bu nedenle onun ölçüm prognostik ve tedavi rehberlik için vesile olabilir. Defining rezidüel hastalığı (minimal rezidüel hastalık ve şimdi da adlandırılır olarak ölçülebilir artık hastalık veya MRD adı) %5 blast hücre morfolojik ölçütü altında olasılığı risk classification manzara değişiyor. Şu anda Akış Sitometresi ve moleküler tabanlı, ikinci çoğunlukla MRD algılamak için kullanılan iki yöntem vardır transkriptaz PCR (RT-qPCR)5 tarafından değerlendirildi veya bir erken aşamada rağmen nesil tarafından (NGS) sıralama. Erişkinlerde de çocuk gibi birçok çalışma zaten çeşitli MRD yaklaşımlar AML hem indüksiyon ve Konsolidasyon terapi6,7ve hastalık yükü () yeni bir tanımı sonra güçlü prognostik bilgileri sağlar gösterdi Şimdi8üstün morfolojik CR) ortaya çıkıyor. Bu MRD akış tarafından değerlendirildi ve/veya moleküler teknikleri olması gerektiğini ve aslında zaten, her klinik AML içinde standart hale gelmektedir olduğunu göstermektedir.

Bu el yazması MRD bir doğru ve tekrarlanabilir immunophenotypic karakterizasyonu yapılan kemik iliği örnekleme dahil olmak üzere ve Akış Sitometresi önceki yordamları işleme kemik iliği elde etmek için ayrıntılı Akış Sitometresi yordamı anlatılmaktadır. Kaliteli kemik iliği örnekleri tanı ve takip kullanılabilirliğini klinik siteleri ve klinik çalışmalar arasında bu ölçüm başarısı için çok önemlidir. Aslında, önceden analitik bu hususlar da moleküler (PCR ve NGS) için hayati önem MRD yaklaşımlar vardır. MRD immunophenotypic karakterizasyonu için aberrantly ifade işaretleri normal myeloid ve lösemi ilişkili immunophenotype (LAIP)9tanımlamak için yaratıcı işaretleri ile birleştirilir. MRD içsel veya alınan lösemi ilaç direnci, özellikler ve Kinetik terapi, immün gözetim ve uyum gibi tedaviye yanıt etkileyen pek çok faktör sonuç ölçer. Bu nedenle, MRD klinik sonuç alıcı işletim karakteristik (ROC) analiz tarafından belirlenen bir kesme düzeyde dichotomized ile ilgili bir çok güçlü sonrası tanı prognostik parametresidir. HOVON 42a için bizim yetişkin AML kohort çalışma, cut-off düzeyi %0,1 LAIP pozitif hücreler/toplam beyaz kan hücreleri olarak ayarlanır. Bu ölçüt kullanarak negatif vs olumlu MRD durumu belirlemek için bir grup hastaların önemli ölçüde daha kötü nüks insidansı, nüks-Alerjik ve genel yaşam6olan tespit edilebilir. Buna ek olarak, hasta sonuç10güçlü bir tahmin sunan ölçüm kök hücre gibi özelliklerle (CD34 + CD38-lösemi kök hücre veya LSC), olgunlaşmamış, ilaca dirençli lösemi hücrelerinin açıklar. Birlikte LAIP ve LSC form akış sitometrik MRD yaklaşım yaklaşıyor. LSC yaklaşım hastaların yaklaşık % 80 uygulanabilir iken LAIP hastaların yaklaşık % 90'uygun yaklaşımdır. Hastaların % 95'i değerlendirilen bir parametre veya her ikisi için birlikte bitti.

Son olarak, bu yayın Akış Sitometresi tarafından MRD değerlendirmek için ayrıntılı bir operasyonel açıklama sağlar. Bu içerir: 1) uyum ve/veya kemik iliği örnekleme prosedürleri standardizasyon, 2) örnek ulaşım rehberlik 3) ayrıntılı açıklama lösemik hücre algılama tek hücre tüp yaklaşımlar da dahil olmak üzere çeşitli antikor paneller kullanarak FACS ile LSC'yi 4 karakterize etmek için) FACS up makineleri standart ölçüleri, 5) MRD ölçümleri ve 6 için analitik programları) LSC algılama için analitik programları.

Biz nihai sonuç kalitesi için önemli bir konu ise bu nadiren anlatılan bu yana numune hazırlama dahil yordamı tüm yönleriyle göstermeyi hedefliyoruz. Kemik iliği aspirasyon ve biyopsi hematopoetik hücrelerin kemik iliği içinde değerlendirmek için kullanılan klinik işlemlerdir. Bunlar bir tam kan sayımı (CBC) ve kan yayması ile birlikte gerçekleştirilir. Kemik iliği aspirasyon için en uygun yöntemi doğru tanı ve takip MRD ölçüm için önemlidir. Buna ek olarak, başarılı kemik iliği aspiratı LAIP ve LSC akışı analizi (en az 10 milyon hücrelerin) gerçekleştirmek için yeterince hücre içermesi gerekir. Burada, kemik iliği yerine getirmek için kullanılan yöntemi açıklamak ve yeterli hücre örnekleme (ve sınırı hemodilution için potansiyel) gerekli doğru teşhis ve ek araştırma için neden yönergeleri sağlar. Önceden analitik bu hususlar da moleküler (PCR ve NGS) için hayati önem MRD yaklaşımlar vardır. İmmunophenotyping için tüm örnekler koleksiyon tercihen 24 h içinde işlenip. Her ne kadar değil tavsiye, kemik iliği ve periferik kan örnekleri hala işlenen ve analiz en fazla 72 saat ortam sıcaklığında tutulur. Buna ek olarak, tüm handlings malzeme ile steril koşullarda, daha sonra araştırma/kalite değerlendirmesi vb için steril hücre dondurma etkinleştirmek için yapılmalıdır.

Protocol

Protokol kuralları araştırma kod ve araştırma Etik Komitesi VU Üniversitesi Tıp merkezinin izler.

1. kemik iliği aspirasyon ve örnek hazırlama

  1. Hasta ve malzeme hazırlığı
    1. Bir ya da iki 10 mL şırınga 16 lik bir iğne kullanılarak %1 lidokain ile doldurun. 21'lik iğne iğne değiştirin.
    2. İki damla % 5 EDTA izle cama koy.
    3. Cam slaytları ayarla (n = 15 tutarlı hasta numaralandırma ve tarihi ile) smear hazırlıkları için.
    4. Hasta yanal dekübitus bulunduğu yer. Üstün posterior iliyak omurga bulun ve kalemle işaretlemek.
      Not: genel olarak, posterior superior İliak omurga bulunduğu bir yandan iliyak sorguç ve bir yandan genişliği lateral orta hat için distal genişliğidir. Kadın, gerçek omurga biraz daha bazı erkeklerde biraz daha medial lateral olabilir.
    5. Cilt klorheksidin 0.5-1 ile dezenfekte % alanından amaçlanan biyopsi dışa çevrelerde etanol içinde.
    6. Steril eldiven paketi açın, steril eldiven takmışım ve paket steril bir alan oluşturmak için tablonun üzerinde aşağı yattı. Paket aspirasyon iğne ile açın ve steril alan üzerine yerleştirin.
    7. Deri ve subkutan doku ve nihayet kapaklarini sızmak. Kapaklarini lidokain 1 cm çapında bir alanı anestezi şekilde yönetmek.
      Not: Lidocaine kapaklarini için yeterli yönetim hasta konforu için en önemli faktörlerden biridir. Kapaklarini-var yeterli anestezi tanıtılan iğne ile amaçlanan biyopsi konuma dokunarak sınamak ve hasta herhangi bir ağrı hissettiğini sordun. Not: çocuk tam olarak tüm prosedürü sırasında anestezi.
    8. Aspiratı iğne tutun (15 Ga x 2.8") proksimal sonunda palm ve iğne metal şaft ucuna; yakın tarafına işaret parmağı ile Bu konumu daha iyi kontrol sağlar.
    9. Dönen bir hareketi ile iğne (hızlı bir şekilde hareket pronating/supinating değişen) iliyak omurga doğru deri yoluyla tanıtmak ve posterior iliyak omurga temas iğne getir.
    10. Bu iğne kapaklarini imzalat alanına giriliyor sağlamak; hasta sadece baskı ve hiçbir ağrı hissetmeniz gerekir. Eğer hasta ağrı hisseder, iğne yeniden konumlandırmak veya daha fazla lidokain yönetmek.
    11. Nazik ama sert basınç kullanarak, iğne bir alternatif saat yönünde-counter saat yönünde hareket halinde iken döner ilerlemek. İliği kavite içine giriş genellikle düşük direnç tarafından algılanır.
    12. Stylet iğneden kaldırın. 10 mL boş Şırıngayı iğneye takın.
    13. Negatif basınç şırınga pistonu nazik bir çekme ile çekilerek uygulanır. Hastanın kemik iliği emişli ne zaman onlar bir kramp hissi ve ağrı hissedebilirsiniz uyarmak. Eğer yeterli kemik iliği spicules serbest, başka bir aspirasyon ile bir hızlı çizmek yapılmalıdır. Çoğu spicules ilk çekin arasında elde edilen ilk 1-2 mL olacak. Sadece 1-2 mL örnek sulandrarak önlemek için Aspire edin.
      Not: Seyreltme içinde hemodilution neden olur ve MRD sonuçları yıkmak).
    14. Şırınga kaldırıp stylet aspirasyon iğne yerleştirmek. İlik parçası izle cam ve geri kalanı ile heparin kaplı bir 8 mL tüp içine içine dışarı atmak.
      Not: her tüpün iliği aspiratı yeterli anticoagulation emin olmak için numune tüpüne getirdikten hemen sonra tersine çevirin. Kemik iliği koagülasyon kez uygunsuz malzeme nedenidir. Ek kemik iliği aynı noktadan emişli, ama tercihen, yeni Aspire edin çekilmeden önce iğne 5-10 mm ileri düzeydedir. Tercihen ekleme level başına 2'den fazla berabere alınmalıdır. İlk temsil eden sayıları artan ile tüpler işaretlemek emin olun, ikinci ve/veya üst üste çekiyor. İlk çizmek için en uygun tanılama analiz kullanmak için genel bir kuraldır.
    15. Alternatif olarak, iğne ekleme yerden geri çekmek ve iliği boşluğuna özgün ekleme Place birkaç milimetre içine reintroduce ve yordamı yineleyin.
      Not: birden fazla 1-2 mL başına çekme önemli kan kirlenmesini önlemek için Aspire değil.
    16. Malzeme gerektiğinde kez tekrarlayın. Kemik iliği iğne belirli klinik çalışma protokolü için yeterli malzeme emişli kaldırdığınızda.
      Not: yavaş veya aksi takdirde zor kemik iliği durumunda önceden antikoagülan ile kızarmış şırınga kullanımı yararlı olabilir. Kuru bir musluk durumunda, bu yazının kapsamı dışında olan bir trephine biyopsi yapın.
  2. Morfolojik muayene smear hazırlanması
    1. En iyi morfolojik değerlendirmesi için (örneğin bir plastik spatula kullanarak) spicules izle-cam aspiratı üzerinden ortaya çıkarmak ve onlara bir cam slayt üzerinde yer.
    2. Yavaşça iliği ile slayt üzerine başka bir cam slayt getirin ve yavaşça kaydırın; herhangi bir baskı kaçının.
      Not: Yalnızca çok büyük kemik iliği spicules durumunda hafif basınç, hücre yayılma kalınlığı azaltmak için sarf. Yordam yarar--dan numune tüpleri işleyebilir bir yardımcıya yardım. Tüpler numaralı hasta ve sıralı kemik iliği beraberlik sayısı ile doğru etiketleme çok önemlidir.
    3. Slayt iyice kurulayın ve Giemsa Grünwald olabilir (malzemelerin tabloya bakın) Boyama gerçekleştirin. Morfoloji için ışık mikroskop altında incelemek (bkz. şekil 1).
      Not: Şekil 1A sağlıklı kemik iliği ağırlıklı olarak lösemik patlamaların AML hastayla farklı işlevsel hücre tipleri şekil 1B sırasında oluşan smear gösterir. Artık lösemik yükü daha iyi tanımlamak için immunophenotyping yapılması gerekiyor.

2. taşıma için daha fazla alay malzemesi

  1. Taşıma için örnek hazırlanması
    1. Malzeme değil sızıntısı olacak ve tüpler kırmayacak emin olmak için doğru ambalaj emin olun (bkz. Şekil 2).
      Not: Gelen bizim ve diğer hücrelerin canlılık deneyimleri kemik iliği oda sıcaklığında tutulur en iyi korunur. Uzun vadeli taşıma için bu en iyi iletim sırasında sıcaklık kararlılığı içinde yardım etmek için bir oda sıcaklığında 'jel-paketi' kullanarak elde edilir.
    2. Etiket paketleri ve paket, uzun süreli taşıma kayıplarını önlemek için doğru form eklemek veya hastaların geçiş.
      Not: Bu en az içermelidir: (Form 1) hasta veri. Bu çalışma numarası ve yaygın olarak 'Doğum tarihi' içermelidir. Açık bir ifade bu form üzerinde özellikle analiz (Moleküler Diagnostik, immunophenotyping, MRD vb) istenen laboratuvar malzeme doğru işlenmesi alıcı laboratuarındaki geldikten sonra gereklidir. (Form 2) Adres ve telefon numarası bir ilgili kişi, ve ne zaman gerekli, kağıtları gümrük için. Gönderen laboratuvar posta paketlerinde kaybını önlemek için her zaman gönderilen bir örnek alıcı laboratuvar bildirir. "Parça ve izleme" kullanılması önerilir.
  2. Diğer kurumları alıcı örnekleri
    1. Uygun lojistik Enstitüsü Enstitü'de teslim olarak Laboratuvarı örnek almak için yerinde olduğundan emin olun.
      Not: en iyi lojistik organizasyon tercihen bir Merkez Laboratuvarı için hangi alır ve yerel klinik ve dış hastaneleri tüm malzeme toplar. Özellikle, dağıtım ve yönetim Laboratuvarları ile açık iletişim protokolleri atama esastır.
    2. Örnekleri aldıktan sonra doğru bir şekilde basılı form ve MRD Sicil no, deneme belirli kimlik numarası, hastane kayıt numarası, gönderme Enstitüsü, doğum tarihiniz, malzeme gibi önemli alanlar içeren güvenli bir veritabanını uygun numaralandırma Not türü (kemik iliği veya periferik kan), beyaz küre sayısı (WBC), kemik iliği aspirasyon tarihi, ölçüm kalitesi için örnek ve herhangi bir açıklaması ilgili ölçüm tarihi.
      Not: Tercihen, bu veritabanı de ek veriler içerir (veya diğer veritabanlarına bağlanacak) donatılmış analiz sonuçları ve daha fazla hasta veri izleme verileri gibi.

3. Akış Sitometresi Kur

Not: Bu bölümde Euroflow yönergeler temel alır. 11

  1. FCS SSC parametreleri ve hedef Floresans kanalları photomultiplier (PMT) gerilimleri set
    1. FCS SSC için parametreleri Akış Sitometresi başlatın ve "sitometresi kurulum ve izleme (Akış Sitometresi (malzemelerin tabloya bakın) CST boncuk ile çalıştırmak CST)" gerçekleştirmek. Kırmızı kan hücreleri (4.1 bölümünde açıklanan) sağlıklı bir donörden parçalayıcı.
      1. Yeni bir deneme oluşturun (menüde: deney, yeni deneme, boş deneme seçin) üreticinin yazılımını kullanarak (malzemelerin tabloya bakın) karşı yana dağılım (SSC) nokta çizim FSC ve SSC parametreleri ayarlamaya yönelik ileri bir dağılım (FSC) ile. Bu deney FSC/SCC Devresel ödeme tarihi ile ad. İlk geçerli sitometresi ayarları kullanmak (sağ tıklayın: "Şu anki CST uygulamak"). Bu ayarları CST performans onay CST-kalibrasyon boncuk (malzemelerin tabloya bakın) kullanarak üretilmedi. FSC ve SSC lenfositler "küresel deney ayarlarında" görselleştirmek için ayarlayın. Not: bizim Akış Sitometresi 285 V ve 400 V sırasıyla bunlar. "Etkinleştirmek tazminat" check-in: Müfettiş/araç ayarları/tazminat.
      2. Hücreleri (FSC) ve parçalı yapı (SSC) boyutunu değerlendirmek için etiketlenmemiş ölçme başlangıç periferik kan hücreleri "hücreleri elde etmek" işlev tarafından lysed. Kapı lenfositler ve aşağıdaki ortalama hedef değerleri için geçişli lenfosit nüfusun ulaşmak için ayarlamak/fine-tune FSC ve SSC voltaj: FSC: 100.000 (Aralık 95.000 105,000); SSC: 15.000 (Aralık 13.000-17.000).
      3. Elde ve en az 10,000 olayları ölçerek verileri kaydetmek. Demek FSC doğrulayın ve SSC Kapı lenfositler için değerleri hedef ve gerekirse yeniden ayarlayın.
    2. Hedef Floresans kurmak için kanal Devresel_ödeme voltaj (malzemelerin tabloya bakın) 8-tepe gökkuşağı boncuk kalibrasyon parçacıkları kullanın.
      1. 7-tepeler için FACS üzerinde yeni bir deneme oluşturun. Tüm gerekli nokta araziler ile "Hedef ortalama floresan yoğunluğu (MFI)" bir çalışma sayfası oluşturmak (n = 2; FSC SSC, FITC PE karşı karşı), çubuk grafikler (n her Floresans Dedektör için 8; bir çubuk =) ve her Floresans kanal için en yüksek değer (MFI ve varyasyon (CV) katsayısı) referans gösterilen istatistikleri.
      2. Taze gökkuşağı boncuk boncuk çözümde karıştırmak için dH2O. yavaşça girdap 1 ml 1 damla (± 60 µL) içeren bir çözüm hazırlamak.
      3. FSC/SSC gerilim yukarıdan ve gökkuşağı boncuk floresan bir eşik 5.000 ile "Düşük" akış hızında (olmadan kayıt) "elde" işlevini kullanarak ölçüm Başlat, devresel_ödeme ayarlarını kullanın. "Dikdörtgen kapısı düğmesini" Gate singlet boncuk kalabalıkta P1 FSC SSC nokta arsa karşı kullanın. 7inci tepe - FITC PE nokta arsa karşı nüfus P2 kapı.
      4. 7-tepeler gökkuşağı boncuk süspansiyon ve ayarlamak/fine-tune Devresel_ödeme gerilimleri edinimi boncuk ile sağlanan hedef MFI değerlerine göre ek açıklama eklenen MFI hedef kanalları ulaşmak için tüm Floresans kanallarda devam edin.
      5. Yaklaşık 10.000 olayların veri toplamak ve MFI 7th için kontrol etmek için "Kayıt" kullanmak en yüksek boncuk. Devresel_ödeme gerilimleri gerekirse düzeltin. Bir kez hedef MFI değerleri için 7th en yüksek ulaştı, kayıt/son Devresel_ödeme değerleri için dosyanın üzerine.
      6. Son Devresel_ödeme değerleri kaydetmek ve Devresel_ödeme kurulum olacak tarihi kaydetmek üreticinin yazılım Kataloğu'nda dosya adı. Bu Devresel_ödeme kurulum yayılım üzerinde her Floresans boya için düzeltmek için kullanın.
  2. Floresans telafisi ayarları
    1. Bir tüp günahı kontrol ve her fluorochrome konjuge antikor etiket (tablo S1 için kullanılan fluorochromes bakınız). 100 µL arabelleği her tüpün içine pipet.
    2. Girdap çok renkli tazminat boncuk şişe (tabloya malzemelerin iyice bakın) ve 1 tam damla (± 60 µL) her tüpün bu boncuk ekleyin.
      Not: her tüpün eklerken boncuk tüp tarafı aşağı damlayan kaçının. Bu düşük boncuk konsantrasyon için yol açabilir ve tazminat matris sonuçlarını etkileyebilir.
    3. (Ki 106 hücre leke için yeterli olacaktır) uygun birim antikor yeterli fluorochrome Birleşik bir test için hesaplanan pipet karşılık gelen tüp ve girdap içine iyice. Antikor günahı denetim tüp eklemeyin. 15-30 dakika içinde belgili tanımlık karanlık oda sıcaklığında (RT) için kuluçkaya.
    4. Yıkama arabellek 4 mL ekleyin (fosfat tamponlu tuz (PBS)/0.05% azide-0.1% insan serum albumin (HSA) (malzemelerin tabloya bakın)) her tüp için. 10 dk. süpernatant kaldırmak ve boncuk Pelet her tüpün 0.2 mL yıkama arabelleği ekleyerek resuspend 300g de tüpler santrifüj kapasitesi. Girdap tüpler iyice.
    5. Üreticinin analiz yazılımı açın (malzemelerin tabloya bakın) ve yeni bir deneme oluşturun (menüde: deney, yeni deneme, boş deneme seçin) ve tazminat dosyasını içeren geçerli olarak yeniden adlandırın.
    6. "Sitometresi ayarları" gidin ve 3.1 bölümünden Devresel_ödeme ayarını kullanın. FSC eşik 5.000 olduğundan ve sıfır kullanılan fluorochromes tazminat değerleri emin olun.
    7. Etiket özel tüpler, gerektiği gibi dahil tazminat denetimler oluşturun. Bir günahı denetimi eklemeyi unutmayın. Menü arasından seçim: deney, tazminat Kur, tazminat denetimleri oluşturmak.
    8. Günahı denetim tüp yüklemek ve P1 kapısı singlet boncuk nüfus etrafında ayarlamak ve P1 kapı sadece singlet boncuk içerdiğinden emin olun.
    9. P1 kapı sağ tıklatıp "Uygulamak için tüm tazminat kontrol eder". Tek etiketli floresan tüpler için kayıt verileri. P2 kapısı her Floresans histogramı olumlu nüfusu kapsar doğrulayın. Eğer geçidi ayarlamak gerek.
    10. Tazminat hesaplayın. Seçme deney, tazminat Kur, tazminat hesaplayın.
    11. Tazminat hesaplama başarılı değilse, bir hata iletisi görüntüler. Gerekli ayarlamaları yapın ve yeniden hesaplayın. Tazminat hesaplama başarılı olduğunda, adı tazminat kurulum için isteyen bir iletişim kutusu görüntülenir.
    12. Bir ad (örneğin YY-AA-GG 8 renk ayarı) girin ve'ı tıklatın, bağlantı ve kaydedebilirsiniz. Tazminat Kur aynı zamanda tazminat Kur katalog için kaydedilir.
      Not: Aynı ayarları aynı fluorophores kullanan tüm deneyler için kullanılabilir.

4. Akış Sitometresi değerlendirmesi (LAIP ve LSC)

Not: Burada biz WBC tercih edilen bir konsantrasyon leke sağlayan boyama önce toplu lizis açıklayınız. Bazı başarıyla lizis önce boyama gibi başka seçenekler kullanılmışsa, ancak çoğu MRD protokolleri bu yaklaşımı kullanın. Bütün kemik iliği lizis önce boyama tercihli hücre kaybı12en aza indirir ama öngörülemeyen, çok düşük hücre konsantrasyonları dezavantajı vardır.

  1. Toplu lizis hücre
    Not: akış cytrometric edinme ertesi gün tüm prosedürü başlatmak için aynı gün gerçekleştirilemediğinde unmanipulated örnekleri RT, yatay tutun.
    1. Anticoagulated kemik iliği örnek homojenliği için örnek birkaç kez ters çevirme tarafından resuspend. Bir hücre odası ile öngördüğümüz çözüm boyama Hücre sayımı kullanarak konsantrasyonu (beyaz küre sayısı (WBC)) kemik iliği hücrelerinin belirlemek (malzemelerin tabloya bakın).
    2. Damlalıklı ayrı 15 mL tüp içine kemik iliği gerekli hacmi. Hücre ayrı boyama tüpler sayısına bağlıdır; bir (tek tüp) boyama için yaklaşık 2 x 106 beyaz kan hücreleri LAIP ölçümleri ve 8 x 106 beyaz kan hücreleri LSC tüp ölçümü için kullanın.
    3. Lysing çözüm ekleyerek kırmızı kan hücreleri Parçalayıcı (malzemelerin tabloya bakın). Çözüm lysing gerekli birim hücre süspansiyon hacmi 10 kat olmalıdır.
    4. INVERSION tarafından karışımı yavaşça ve 10 dk RT. az için kuluçkaya RT atma de 7 dk 800 g için (örneğin bir vakum pompası veya ile Pasteur pipet) süpernatant santrifüj kapasitesi. Hücre Pelet fosfat tamponlu tuz resuspend (PBS)/0.05% azide-0.1% insan serum albumin (HSA) (malzemelerin tabloya bakın) RT. kullanım tüp maksimum hacmi itibariyle.
    5. Dik de 7 dk 800g için santrifüj süpernatant (örneğin ile bir vakum pompası veya Pasteur pipet) atmak. Hücre Pelet PBS/0.05% azide-0.1% HSA hücre konsantrasyonu 100 x 106 WBC/mL içinde yeniden askıya alma ve amaçlanan tüpler sayısı üzerinden bölün.
  2. Akış Sitometresi için hücre boyama
    1. Damlalıklı Monoklonal antikor (MoAb) kokteyl çözüm uygun floresan aktif hücre sıralayıcısı (FACS) tüpler içine karıştırın ve 15 dakika içinde belgili tanımlık karanlık lysed kemik iliği hücreleriyle kuluçkaya.
      Not: tandem-boyalar kullanılır bu zaman çok önemlidir. Örneğin, size bizim laboratuvar (tablo S1) kullanılan panellerin karışımları görürsünüz.
    2. Yıkama 3 mL PBS/0.05% azide-0.1% hücrelerle vardır. Hücreler için 400gde 5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant (örneğin ile bir vakum pompası veya Pasteur pipet) ve resuspend hücre Pelet 300 µL PBS/0.05% azide-0.1%HSA içinde atmak.
    3. LSC ölçüm için: hücre Pelet 400 µL PBS/0.05% azide-0.1% HSA resuspend ve 4 µL boş boncuk ekleyin (örneğin Spherotech, malzemelerin tabloya bakın) negatif kontrol nüfus analiz olarak kullanmak için.
    4. MRD veya LSC deney lay-out FACS üzerinde açın (malzemelerin tabloya bakın) ve ölçü MRD en az 100.000 WBC için geçişli AML hasta numuneleri tanı ve 1 X 106 WBC AML örnekleri takip, ölçümü için olayları. LSC'yi için en az 4 x 106 WBC hem tanı ve takip için güvenilir bir LSC sonuç deneyler ölçmek.
    5. Verileri sonuçları analiz için bir standart uygun dosya adı kullanarak kaydedin. Farklı ölçülen işaretleri AML hücreleri ve AML kök hücreleri (pozitif, negatif ifade/üstü) bir envanterini yapmak ve laboratuvar günlüğünde bu verileri depolamak.
    6. Hiçbir tanı LAIP kullanılabilir durumda, olası herhangi bir ölçülebilir LAIP üzerinden normal farklı yaklaşımda tespit emin olmak için takip, tüm 4 tüpler ölçmek.
    7. Teşhisi en güvenilir LAIP(s)13 seçin ve mümkün olduğunca çok etkinliğinde elde ama > en az numaraları tanımlı.

5. kimlik lösemi ilişkili IMMUNO-fenotipleri (LAIP) in: farklı hücre popülasyonlarının analizleri

Not: FCS dosyaları (malzemelerin tabloya bakın) farklı hücre nüfusun en iyi görüntüleme için birçok yazılım programı ile analiz edilebilir.

  1. Beyaz küre nüfus
    1. Kapı CD45 pozitif hücrelerinin ve düşük FSC (non-hücrelerin, erythroid hücreleri) FSC/SSC arsa içinde dışarıda bırakarak görünen hücrelerin, Bunlar WBC (şekil 3Aben) içerir. WBC göstermek ve bir ilkel işaretleri (örneğin CD34; kullanın Şekil 3AII) de CD45dim alan (şekil 3AIII) son pozisyonda, patlamaların tespit etmek için yardım etmek.
    2. CD45dim hücre kapısı ve geri FSC/SSC Arsa (şekil 3Bben) hücrelerde kapısı. CD34 kapısı (3Bii rakam) bu kapıyı % hücrelerde % patlamaların nüfus ağacında programı olarak raporlama kaldırın. SSC/CD34 patlamaların arsa ve CD34 pozitif hücrelerinin (Figure3Bill) kapı göster.
  2. Lenfositler
    1. Lenfositler bir iç denetimi kullanın: myeloid nüfus bir negatif kontrol ve pozitif kontrol olarak lenfoid nüfus olarak.
    2. Beyaz kan hücresi popülasyon (şekil 4A) başlatın. Kapı lenfositler CD45yüksek/SSCdüşük nüfus olarak (şekil 4B).
    3. CD34, CD117, CD13 veya CD33 ve kapı CD13 negatif/CD33 negatif hücreler (şekil 4C-E) için kullanma kapısı hiçbir myeloid hücre olduğundan emin olun. Bu nüfus nüfus ağacında (şekil 4F) 'lenfositler' diyoruz.
  3. LAIP tanı
    1. Patlamaların kapı ve daha sonra bir SSC/CD34 CD34 olumlu hücrelerde arsa ve bu 'ilkel marker' nüfus ağaç denilebilir.
    2. Myeloid işaretleyici (CD33) karşı bir lenfoid marker (CD7) ile bu durumda CD34 olumlu ve yeni bir komplo içinde lenfositler ilkel hücreleri çiz. Anormal nüfus (referanslara ek dosya 1 bakınız) kapı ve onları 'LAIP pozitif' nüfus ağacında arayın.
      Not: LAIP seçilen final % LAIP patlama nüfus olarak bildirilmektedir. Duyarlılık, özgüllük ve LAIPs kararlılığını geniş deneyime sahip personel tarafından sadece MRD ölçümlerde kurulabilir. Bu parametreler toplam LAIP kalitesini belirler. Tanı, dört farklı LAIP değerlendirmelerin örnek şekil 5 A-Dolarak verilmiştir.
    3. LAIPs (% patlamaların) ifadesini belirleyin ve bu verileri bir veritabanında korumak veya excel dosyası.
    4. FACS analiz raporlarının ve MRD ölçülerde kullanılması gerekir LAIPs notlar olun.
      Not: o kadar takip, doğru MRD ölçümler için temel bir özelliği olduğu LAIPs tanımını uzmanlardan oluşan bir ekip yetkilidir.
  4. MRD takibi
    1. Patlamaların 5.1 ama zaman noktası bağlı olarak tedavi sonrası açıklandığı gibi kapı; Bu kapı doğru değerlendirilmesi zor olabilir. Tanıyı kurulmuştur LAIP fenotip odaklanmak ve olgunlaşmamış nüfus kapısı.
    2. 5. 1'açıklandığı gibi. doğru patlama kapısı üzerinde tanımlanmış aberrancy dayalı ve onları dışarı kapı için kemik iliği ve normal ifadeleri yeniden oluşturuluyor farkında olmak bulmak
    3. Aynı strateji hiç takip Puan geçişi tekrarlayın ve LAIP hücreleri bütün beyaz küre nüfus yüzdesi olarak MRD belirlemek. Şekil 6A ve 6Börnekler için bkz.
    4. Rapor MRD pozitifliği MRD % ≥ olduğunda beyaz kan hücrelerinin % 0.1. Haftalık MRD ekibi ile görüşmek üzere standart bir biçimde analiz verileri Yazdır. Fikir birliği ulaşıldıktan sonra sonuçlar kaydedin. Let sonuçları klinisyenler için iletişim kurmadan önce Danışmanı tarafından yetkilendirilecek sonuçları.

6. analiz kök hücre MRD (LSC tek tüp)14

  1. LSC'yi tanı ve takip analiz
    1. Blast hücre 5.1 bölümünde açıklandığı gibi kapı.
    2. İçin CD38-potansiyel negatif kontrol kırmızı hücreleri-kesir (yani kalan kırmızı kan hücreleri lizis SSCdüşük/FSCdüşük ve CD45olumsuzkarakterize sonra) kapı. Gerekirse, bu arsa bir ilave bir geçit tarafından ölü hücreleri ve hücre parçaları dışlanabilir.
    3. Lösemik blast kapı CD34 ifadesi ile subpopulation belirler. Seçin+ CD38 CD34 bu nüfus içinde- hücreleri (cut-off kullanın: boş kalibrasyon boncuk eşik tayini için üst sınır (malzemelerin tabloya bakın), kırmızı-kesir veya kullanım 103 kesme noktası olarak). Bu nüfus 'CD38düşük ataları' ara (Şekil 7).
      Not: See ek dosya 1 ayarı hakkında daha fazla ayrıntı için CD38-cut sakin düzeyleri.
    4. Bu CD38düşük nüfus içinde boş kalibrasyon boncuk alt kenarını kırmızı kesir sayılarının kullanarak doğru CD34 + CD38çok düşük kök hücre nüfus, belirlemek veya 10 seçin2 kesme noktası (Şekil 7 ). Ek dosya 1 CD38-cut sakin düzeyleri ayarlama hakkında daha fazla bilgi için bkz:.
    5. Masası'nda sağlanan her lösemik işaretçisi analiz ederek her iki nüfus içinde lösemik kök hücreler normal hematopoetik kök hücre (LSC vs HSC) vs kapı (yani CD45RA, Kombi-6 (CLEC12A, TIM-3, CD7, CD11b, CD22 ve PE'deki tüm CD56), CD123, CD33 ve CD44).
    6. Kök hücre işaretçisi pozitif/negatif pozitif/negatif diğer işaretleri ile karşılaştırmak için ve LSC karşı HSC frekans ince ayarını yapmak için diğer kök hücre marker karşı ilgi arsa.
    7. Olgunlaşmamış patlamaların, lenfositler, CD34 + hücre yüzdesi rapor. Hepsi ayrı işaretler için toplam sayıda CD38düşük ve CD38verylow ve marker pozitif (ve böylece neoplastik) olan numaraları CD38düşük ve CD38verylow listelenmektedir.
    8. Seçme işaretçisi için bu en iyi normal hematopoetik kök hücre lösemik kök hücreleri daha fazla çözümleme için vs ayırt eder. LSC ve HSC yüzdesi toplam WBC yüzdesi olarak hesaplayın.
      Not: kesme takip %0,0001 iken LSC ≥ %0,004 yüzdesi LSC tanı, pozitif olarak bildirilmektedir. Anormal kök hücre takip örnekleri çoğunluğuna analiz için benzer tanı, ancak, kök hücre popülasyonlarının hücre sayıları çok küçük olabilir gibi. Bu nedenle yeterli olaylar edinme gerekliliği.

Representative Results

AML hastalarının % 90 en az bir LAIP tespit edilebilir. LAIP + hücre tanı, ilkel blast hücrelerinin doğru oranlarda oluşturmak için patlama geçidi uygun ayarı çok önemlidir ve doğrulama olarak görüntülenmeyecektir şekil 3' te ihtiyacı var. Aberrancy CD34 + ilkel hücreler üzerinde belirli bir türünü barındıran her hasta örneği şekil 5' te görüntülenir. MRD takip-up, ölçüm için daha önce tanımlanmış LAIP + hücrelere Geçişli ve LAIP + WBC hücrelerin yüzdesi olarak tanımlanan. Bu nedenle bu kapı ayarı doğru MRD sonuçlar elde etmek önemlidir. Şekil 6 tam iyileşme döneminde kalan hasta ve MRD olumlu sonuçlar (≥ % 0.1) yaptıktan sonra relapses bir hasta sonra indüksiyon tedavisinin döngüsünün ikinci gösterir.

Geçerli protokol sadece bu bölümü ayrıntılı karakterizasyonu CD38-nüfus en güçlü kök hücre kesir gibi limanlar göstermiştir bu yana CD34 + hücre, kök hücre tanımlamak uygundur. LSC'yi HSC bu kesir içinde ayırmak için ek işaretleri kullanılır. LSC ayırt etmek için en sık seçilen işaretleri CD45RA ve PE ile etiketli 6 belirli LSC işaretleyicileri saklandığından Kombi kanal'dır. Daha fazla klinik değerlendirme üzerinde bağlı olarak, ≥ %0,004 kesme düzeyini LSC-pozitif tanımlanmıştır ve %0,0001 kesme düzeyini mağaza-up10, kullanılan süre tanı, daha kötü hayatta kalma ile ilişkili olduğu.

Figure 1
Resim 1 : Kemik iliği smear. A) sağlıklı donör ve B) AML hasta (FAB 5 alt türü). 100 x büyütme oranında gösterilen Giemsa leke. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Düzeltmek biyolojik sıvılar için ambalaj malzemesi. Ve biyolojik sıvı taşıma kuralları hakkında daha fazla bilgi Web sitesi15 merkezleri hastalık kontrol ve Önleme için bulunabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Blast hücre tanımlamak için strateji geçişi. A) CD45dim, B geçişi) çoğunluğuna CD34 + patlamalar.

Figure 4
Şekil 4 : Lenfositler geçişi. A) mavi hücrelerdir gösterilir FSC/SSC mezarlığına B) yeşil hücreleri lenfositler CD45yüksek/SSCdüşüktarafından C ile karakterize WBC) CD34, D) olumsuzluk CD117 ve olumsuzluk E) CD13 için için için olumsuzluk örnekleri F) farklı hücre tipleri içinde gösterilir bir genel nüfus ağaç. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : AML tanı, LAIPs. A) LAIP dayanan soy aberrancy (CD7 CD33 ifade hücreleri üzerinde), B) LAIP dayalı zaman uyumsuz farklılaşma (CD11b CD13 ifade hücreleri üzerinde), C) LAIP overexpression (hücreleri ifade CD34çok yüksek CD13 üzerinde), normal hücrelere kıyasla dayalı D). LAIP (hücreleri ifade HLA-DRdüşük CD33) normal hücrelere kıyasla underexpression temel. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : LAIP takip tedavisi sırasında uyuşukluk görülebilir. Tanı A) LAIP tanımı (CD34 + / CD13 + / CD33-) ve LAIP kaybı sırasında sürekli tam remisyon, tanı B) LAIP tanımı kaldı bir hastada takip (CD117 +/ CD7 +/ CD33 +) ve LAIP sürdürme sırasında bir hastada takip kim kötüleşmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7 : Kök hücre geçişi. a) Gating farklı CD34 + / CD38 nüfus tabanlı (CD38düşük 's boncuklar,çok düşük LSC'yi temsil eden gerçek negatif hücreleri tanımlanan ve boncuk medyan yer alan CD38 süre üst kenarının aşağıda) boncuk üzerinde B) iki hastalar CD45RAnegatif ve CD45RApos ifade dayalı takip, HSC ve LSC arasında ayrım ile örnekleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Ek dosya 1. Downoad için Resimi Tıklayınız.

Ek dosya 2. Downoad için Resimi Tıklayınız.

Ek dosya 3. Downoad için Resimi Tıklayınız.

Discussion

Yeterli veri kullanılabilir MRD pozitifliği ile yoksul hayatta kalma ilişkili olan kanıt gösterin ve bu nedenle MRD değerlendirmesi üzerine klinik kararlar yapılabilir ek prognostik bilgiler sağlayarak hasta sonuç geliştirmek. Dolayısıyla, tutarlı ve uyumlu yöntemi MRD IMMUNO fenotipik değerlendirilmesi için sonuçta hasta tedavi geliştirmek için esastır. Bu da klinik çalışmalar farklı klinik sitelerin karşılaştırırken önemlidir ve sonuçta klinik yardımında yapma ve genel sağkalım için bir vekil klinik uç noktası olarak hizmet veren karar. Katı kurallar doğru ve tutarlı MRD ölçülerini garanti altındadır kavramı uyumlu eylem tasarım teknoloji yönergeleri için Avrupa lösemi ağ (ELN) yol açmıştır. Kapsamlı bu belgenin yayımlanmış geç 2017 olacak ve birçok çalışma grupları ve ilerlemeye laboratuvarlar için vesile olacak.

Protokol içindeki kritik adımlar

MRD analiz önemli ve sık sık gözden kaçan bir yönünü örnek kalite MRD doğru belirlenmesi üzerinde etkisi var. Bu daha belirgin olduğunda bu ayarı dikkate alınması gereken ek operasyonel konuları göz önüne alındığında genel klinik diğer kurumları için taşınması malzeme vardır. Hasta kadar karıştırma riskini azaltmak için bilgi ve örnekleri yeterli yönetim zamanında teslim önemlidir. Yine, aktarım bu aşamada doğru formları ve/veya elektronik hastane sistemleri istenen analiz açık atamalarda içe aktarma işlemi gereklidir. Terapi MRD örnekleme aşamada klinik karar verme (örneğin ikinci ders Terapi sonra) için uygun olmayabilir bu yana da çok önemlidir ve bu nedenle açıkça tanımlanmalıdır. (Örneğin, örneğin 1 Ocak doğum yılı başı) sahte veri kullanımı hasta veya analizler kadar karıştırma riskini artırır. Yasa gereği, alternatif bir anonim yöntem kimlik kullanılmalıdır.

İmmunophenotyping için tüm örnekler koleksiyon tercihen 24 h içinde işlenip. Her ne kadar değil tavsiye, kemik iliği ve periferik kan örnekleri hala işlenen ve analiz en fazla 72 saat ortam sıcaklığında tutulur. (Yerel) biobanks hücrelerinin daha fazla dondurma alakalı kalır bu yüzden buna ek olarak, tüm handlings malzeme ile en iyi steril koşullarda yapılabilir: birçok klinik çalışma ile lösemi hücreleri daha ayrıntılı araştırmaya ek Değerlendirmeler var Moleküler, immün fenotipik ve fonksiyonel özellikleri daha sonraki bir aşamada yapılması için saygı duyuyorum. Ancak biobanking ayrıntılarını bu makale kapsamında değildir.

MRD bir tanı aracı kullanarak bir akredite edilmiş laboratuvara Akış Sitometresi değil sadece, aynı zamanda kalite kontrol MRD değerlendirilmesi ile ilgili olarak ihtiyacı olduğu anlamına gelir. Bu örnekleri belirli referans laboratuvarlar için veya (yeniden) referans takım MRD ölçümleri ile akış dosyalarını çözümleme dağıtmak gerektirebilir.

Bu makalede, kemik iliği aspiratı koleksiyonundan en önemli eylemleri MRD belirlenmesi için etkili uzmanlar özel görevler, sorumluluklar ve sık sık iletişim ile tüm bir ekip gerektiren klinik örneklerinde - için karakterizasyonu ve analiz. Her görev için yordam çok önemli olduğu için bu iletişim kuralları, her bir laboratuvar ve görev için özel olarak eğitilmiş yeterli destek personeli de dahil olmak üzere ses lojistik için tavsiye edilir. Buna ek olarak, nihai sonucu hakkında tartışmalar ekibi tarafından var ve bir ekip tarafından yetkili nihai rapor için gerekli yordamlar (özellikle LAIP ve LSC anormal marker tanıma) nispeten öznel bazı adımlardan kısmen olduğundan, Denetçiler. Şimdiki çabalar (LAIP ve LSC) MRD analiz standartlaştırmak yardımcı olacak bilgisayar yazılım geliştirme devam ediyor.

Değiştirme ve sorun giderme

Her laboratuar kendi işaretleri standartlaştırılmış bir omurgası olan ELN sanatın devlet yönergeler MRD ölçümler belge için belirtildiği gibi benzer sonuçları elde etmek için gerekli olmasına rağmen farklı altgrupları tanımlamak için kullanılan antikorlar olabilir Yukarıda anılan. Sonuçları analiz yapmak zor ve dikkate alınması gereken bazı sorunlar seçilen veri işaretleyicilerini bakılmaksızın.

Teknik sınırlamaları

LAIP ve LSC anormal marker ifade tanımlaması ilk tanı değerlendirildi ve zaman (sırasında ve tedavi sonrasında) içinde MRD fenotip doğru karakterizasyonu için izlenir. Hastaların % 95'i LAIP veya LSC (veya her ikisi ile) üzerinde değerlendirilebilir, ancak hala bazı hastalar tanımlanmış hiçbir LAIPs veya yok CD34 + CD38 LSCs var veya CD34 negatif patlama ile mevcut veya eksik bir tanı örnek alabilir. Bu gibi durumlarda, deneyin ve MRD antikorlar sağlar ve lösemik hücrelerin en güçlü ayrım en güvenilir (vererek) seçin kullanılabilir hücre sayısı gibi geniş bir panel ile ölçmek için hala değerli LAIP. Dikkate alınarak sonuçta Relaps hastaların bir kısmı tamamen AML hastalığı, heterojen nedeniyle tanı immunophenotype benziyorum değil geniş bir panel MRD, antikorların ölçümü nasıl olsa önerilir. Bu immunophenotypic vardiya blast hücreler ve LSCs ve terapi16 sırasında gerçekleşmesi için göstermiştir ve ölçülebilir hastalığı bu sözde yaklaşan nüfus üzerinde temel alıyor olabilir. Şu anda ancak, bu tüm immunophenotypic alt nüfus hastalık nüks için yol açacak ve bu nedenle MRD özel terapi bildirmek için değil yaygın bir uygulama klinik çalışmalarda bu hücreler dayalı olup olmadığını tespit edilmiştir değil. LSC nüfus vardiya nedeniyle kayıp riski en önemli aberrancy belirleyici işaretler bir Akış Sitometresi (PE) kanal14olan bir tüp yaklaşım tarafından düşürülmüştür unutmamak gerekir.

Mevcut yöntemler açısından önemi

Bu protokol için açıklanan yöntemi bir veya daha fazla LAIPs, hangi hücrelerin tedavisi sırasında uyuşukluk görülebilir takip edilmektedir tanımını kullanır. Bu yöntemin bir dezavantajı bu son zamanlarda LAIP tedavisi sırasında değişebilir gösterilmiştir olduğunu olmasıdır. Bu şekilde bazı yaklaşan nüfusu ile farklı anormal işaretleri özledim. Bu sorunu çözecek, yerine sadece bu tanıyı bulunan tüm anormal işaretleri ölçmek iyi olurdu. Bu daha sonra birkaç laboratuar17tarafından kullanılan "farklı normal" yaklaşımı benzer olacaktır.

Gelecek uygulamaları

Son zamanlarda, MRD roman klinik deneme tasarım için ekstra dikkat aldı. Özel tedavi seçenekleri ve hedeflenen ilaç tedavisi çağında, bir sonuç ölçü olarak MRD kullanımı yeni tedaviler, sonuçta daha hızlı giriş acilen tedavi gerekli izin klinik etkinlik oluşturmak için gereken süreyi azaltır Klinik seçenekleri. Uygun lojistik önemi ve pratik bir uygulayabileceğiniz MRD değerlendirme yürütülmesi gibi FDA şu anda MRD genel sağkalım yerine bir vekil bitiş noktası olarak kullanarak fizibilite araştırmaktadır gelecekteki AML tedavi başarısı için çok önemli 18ölçer.

Disclosures

Birkaç bağımsız kurumları kök hücre tüpte doğrulama için kullanılan antikor kokteyl lütfen BD tarafından temin edilmiştir. Yazarlar bu makale ile ilgili olarak ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu araştırma için VONK Hollanda Kanser Derneği (ALPE 2013-6371) ve Egbers Vakfı tarafından desteklenmiştir. Hollandalı AML-MRD çalışma grubu işbirliği için ve verimli tartışmalar sürekli iyileştirme ve AML-MRD standardizasyonu için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FACS Canto II  BD Biosciences 338962
CD7 FITC  (50µg/ml) BD Biosciences 555360
CD2 FITC (Unknow) DAKO F076701
CD36 FITC (25µg/ml) Sanquin M1613
CD15 FITC (200 µg in 200 ml) BD Biosciences 332778
CD45RA FITC (50µg/ml) BD Biosciences 335039
CD56 PE (50µg/ml) BD Biosciences 345810
CD22 PE (12,5µg/ml) BD Biosciences 337899
CD14 PE  (50µg/ml) BD Biosciences 345785
CD133 PE (16,5µg/ml) Miltenyi Biotec 130-080-801 Will be replaced soon by Miltenyi for 130-113-108 (75µg/ml) and needs to be titrated
Clec12a PE (Unknow) BD Biosciences 562566
Tim-3 PE (100µg/ml) BD Biosciences 563422
CD7 PE (25µg/ml) BD Biosciences 555361
CD11b PE  (50µg/ml) BD Biosciences 333142
CD34 PERCP-CY5.5 (12,5 µg/ml) BD Biosciences 347222
CD123 PERCP-CY5.5 (25µg/ml) BD Biosciences 558714
CD117 PC7 (12,5µg/ml) Beckman Coulter B49221
CD33 PE-CY7 (25µg/ml) BD Biosciences 333952
CD19 APC (50µg/ml) BD Biosciences 345791
CD11b APC (50µg/ml) BD Biosciences 333143
CD33 APC (12,4µg/ml) BD Biosciences 345800
CD38 APC  (25µg/ml) BD Biosciences 345807
HLA-DR APC-H7  (50µg/ml) BD Biosciences 641411
CD44 APC-H7  (800µg/ml) BD Biosciences 560532
CD13 BV421 (Unknow) BD Biosciences 562596
CD34 BV421  (50µg/ml) BD Biosciences 562577
CD45 Krome Orange (100µg/ml) Beckman Coulter B36294
CD45 HV500c  (100µg/ml) BD Biosciences 655873
CST beads  BD Biosciences 655051
Pharm lysing solution BD Biosciences 555899
Multicolor CompBeads BD Biosciences 644204
FACSDiva software BD Biosciences 659523
Infinicyt  Cytognos CYT-INFINICYT-AOM
Rainbow Calibration Particles, 8 peaks, Spherotech Euroflow RCP-30-5a
Tuerk solution Brocacef No longer available but can be purchades from different companies
Blank Calibration Particles Beads Spherotech BCP-100-5
Albuman 200g/l Sanquin GTIN8717185830910
Azide Acros Organics 190381000
ddH2O Water demineralized in our institute
10*PBS Lonza BE17-517Q
May Giemsa Grünwald Merck  1.01424.2500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Döhner, H., et al. Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel. Blood. 129, (4), 424-447 (2017).
  2. Zwaan, C. M., et al. Collaborative Efforts Driving Progress in Pediatric Acute Myeloid Leukemia. J Clin Oncol. 33, (27), 2949-2962 (2015).
  3. Cornelissen, J. J., et al. The European LeukemiaNet AML Working Party consensus statement on allogeneic HSCT for patients with AML in remission: an integrated-risk adapted approach. Nat Rev Clin Oncol. 9, (10), 579-590 (2012).
  4. Grimwade, D., Freeman, S. D. Defining minimal residual disease in acute myeloid leukemia: which platforms are ready for "prime time"? Hematology. 2014, (1), 222-233 (2014).
  5. Krönke, J., et al. Monitoring of minimal residual disease in NPM1-mutated acute myeloid leukemia: a study from the German-Austrian acute myeloid leukemia study group. J Clin Oncol. 29, (19), 2709-2716 (2011).
  6. Terwijn, M., et al. High prognostic impact of flow cytometric minimal residual disease detection in acute myeloid leukemia: data from the HOVON/SAKK AML 42A study. J Clin Oncol. 31, (31), 3889-3897 (2013).
  7. van der Velden, V. H. J., et al. Clinical significance of flowcytometric minimal residual disease detection in pediatric acute myeloid leukemia patients treated according to the DCOG ANLL97/MRC AML12 protocol. Leukemia. 24, (9), 1599-1606 (2010).
  8. Ossenkoppele, G., Schuurhuis, G. J. MRD in AML: time for redefinition of CR? Blood. 121, (12), 2166-2168 (2013).
  9. Feller, N., et al. MRD parameters using immunophenotypic detection methods are highly reliable in predicting survival in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 18, (8), 1380-1390 (2004).
  10. Terwijn, M., et al. Leukemic stem cell frequency: a strong biomarker for clinical outcome in acute myeloid leukemia. PLoS One. 9, (9), e107587 (2014).
  11. Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26, (9), 1986-2010 (2012).
  12. Paietta, E. Assessing minimal residual disease (MRD) in leukemia: a changing definition and concept? Bone Marrow Transplant. 29, (6), 459-465 (2002).
  13. Loken, M. R., et al. Residual disease detected by multidimensional flow cytometry signifies high relapse risk in patients with de novo acute myeloid leukemia: a report from Children's Oncology Group. Blood. 120, (8), 1581-1588 (2012).
  14. Zeijlemaker, W., et al. A simple one-tube assay for immunophenotypical quantification of leukemic stem cells in acute myeloid leukemia. Leukemia. 30, (2), 439-446 (2015).
  15. Guidance for Collection, Transport and Submission of Specimens for Ebola Virus Testing. https://www.cdc.gov/vhf/ebola/healthcare-us/laboratories/specimens.html (2017).
  16. Bachas, C., et al. The role of minor subpopulations within the leukemic blast compartment of AML patients at initial diagnosis in the development of relapse. Leukemia. 26, (6), 1313-1320 (2012).
  17. Ravandi, F., et al. Persistence of minimal residual disease assessed by multiparameter flow cytometry is highly prognostic in younger patients with acute myeloid leukemia. Cancer. 123, (3), 426-435 (2017).
  18. Hourigan, C. S., et al. Measurable residual disease testing in acute myeloid leukaemia. Leukemia. 31, (7), 1482-1490 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics