עיבוד של רקמת הלב האנושי כלפי עצמי בהרכבת הידרוג במבחנה ויישומים In Vivo מטריצה חוץ-תאית

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פרוטוקול זה מתאר את decellularization מלא של שריר הלב האנושי תוך שמירה על מרכיביו מטריצה חוץ-תאית. עיבוד נוסף של התוצאות מטריצה חוץ-תאית בייצור של microparticles ו הידרוג וההספק עצמית של cytoprotective.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Becker, M., Maring, J. A., Oberwallner, B., Kappler, B., Klein, O., Falk, V., Stamm, C. Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications. J. Vis. Exp. (130), e56419, doi:10.3791/56419 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

מטריצה חוץ-תאית acellular ההכנות שימושיים עבור לימוד אינטראקציות סלולרי-מטריקס ולהקל תא משובי טיפול יישומים. מספר מוצרים מסחריים מטריצה חוץ-תאית זמינים כמו hydrogels או ממברנות, אך אלה לא ניחנת פעילות ביולוגית רקמות ספציפיות. כי זלוף decellularization בדרך כלל לא אפשרי עם רקמת הלב האנושי, פיתחנו תהליך decellularization 3-צעד טבילה. פרוסות שריר הלב האנושי רכש במהלך הניתוח הראשון שטופלו hyperosmolar דטרגנט ללא פירוק מאגר, ואחריו הדגירה עם יונית דטרגנט, dodecyl סולפט נתרן, ואת התהליך הושלם על ידי ניצול הפעילות DNase מהותי של סרום שור בעובר. טכניקה זו התוצאה ללא תא גיליונות של מטריצה חוץ-תאית לב עם נשמר בעיקר סיבי רקמת ביופולימרים ואדריכלות הרכב, אשר הוצגו לספק רמזים סביבתיים מסוימים כדי אוכלוסיות הלב תא גזע pluripotent תאים. מטריצה חוץ-תאית לב גליונות שניתן ואז עוד יותר מעובד לאבקה microparticle ללא שינוי כימי נוסף או, באמצעות עיכול פפסין לטווח קצר, לתוך הידרוג מטריצה חוץ-תאית לב וההספק עצמית עם משומר אתריים.

Introduction

מטריצות (ECM) מספק לא רק מבנה תומך אבל חשוב גם עבור תא ביולוגי, רקמות לתפקד1. בלב, ECM משתתף בוויסות תגובות pathophysiologic כגון פיברוזיס, דלקת, אנגיוגנזה, הפונקציה כויץ cardiomyocyte ואת הכדאיות קדמון תושב גורל. בנוסף מרכיביו העיקריים - סיבי glycoproteins, glycosaminoglycans ו proteoglycans - הוא מכיל שורה של גורמי גדילה מופרשים ציטוקינים, עלי הלוואי קרומיים שלפוחית המכילה2,של חומצות גרעין וחלבונים -3.

זה הפך לאחרונה כי ההכנות ECM acellular הן לא רק שלא יסולא בפז ללמוד אינטראקציות סלולרי-מטריקס, אלא גם עבור יישומים פוטנציאליים מבוססת תא טיפולית. החשיבות של מתן סביבה נאותה התא טיפולית מוצרים או רקמות מהונדסים כעת ידוע נרחב. נעשים ניסיונות לשלב תא המתלים או חומרים פעילים עם מוגדר hydrogels biopolymeric4,5,6 או עם קוקטיילים חלבון מופרש על ידי תאי מאתר סרקומה (קרי, Matrigel, Geltrex) 7. עם זאת, לשעבר מוגבלת אתריים האחרונים הם בעייתיים בתהליכים GMP-כיתה, שניהם חסרים את אתריים רקמות ספציפיות של הלב ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.

Decellularization של שריר הלב בעבר בוצעה על ידי זלוף בלב שלם באמצעות ה-14,להערכת כלילית15. אמנם זה אפשרי בלבבות בעלי חיים, לבבות אדם שלם זמינים רק לעתים רחוקות. לפיכך, תהליך טבילה המאפשר טיפול דגימות רקמה שהושג בחדר הניתוח היה המועדף. פרוטוקול "3-צעד" שלנו מכיל 3 נפרד הדגירה שלבים כלומר פירוק, solubilization, והסרת ה-DNA. זה מניב ECM שריר הלב האנושי עם משומר בעיקר חלבון, גליקוזאמינוגליקן קומפוזיציה16,17. פרוסות cECM אלה מאפשרים מחקרים במבחנה של התא-מטריקס אינטראקציות אבל מתאים היטב עבור יישומים פוטנציאליים בקנה מידה האדם טיפולית. תהליך הייצור הוארך אז כדי לייצר lyophilized cECM microparticles או של הידרוג cECM18.

פרוטוקול זה מאפשר decellularization של שריר הלב האנושי המתקבל דגימות כירורגי, שמירה על המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ-תאית שריר הלב (ECM) ופעילותם וחיסונים. פרוטוקול זה מומלץ כאשר ECM הלב האנושי עם אתריים רקמות ספציפיות שהשתמרו נדרשת ללימודים ניסיוני של אינטראקציות סלולרי-מטריקס, או כאשר סביבה מתאימה יש צורך גישות מבוססות תא התחדשות שריר הלב. בעקרון, זה גם אפשרי להתאים פרוטוקול זה בתנאי GMP-כיתה, כך השימוש cECM מעובד צריך להיות ריאלי יישומים טיפוליים בעתיד.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול המחקר תואמת עקרונות אתיים שמתואר את הצהרת הלסינקי, שאושר על ידי סקירה מוסדיים המנהלים ואתיקה ועדת צ'אריטה הרפואי האוניברסיטאי. כל המטופלים סיפק נכתב, הסכמה מדעת לשימוש של רקמת הלב ללימודי ניסיוני.

1. הכנה של שריר הלב האנושי חלוקתה

  1. להשיג את שריר הלב הימני חדרית (גודל משתנה בהתאם לסוג הניתוח) ישירות מתוך חדר הניתוח של תחבורה PBS קר במיכל סטרילי.
  2. הסר את כל רקמת שומן עם איזמל סטרילי עם להב מספר 10 בתנאים סטריליים.
  3. חותכים שריר הלב קוביות של 1 x 1 x 1 ס מ בעזרת אזמל.
  4. מניחים את הקוביות צינורות סטרילי 50 מ.
    הערה: כדי להשהות, לבצע צעד 1.5, אחרת המשך לשלב 2.2. הימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה כדי למנוע השפלה חלבון לבין ירידה באיכות הרקמות.
  5. לאחסן הצינורות המכילים את הקוביות ב-80 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן את הרקמה במשך מספר חודשים.

2. חלוקתה של קוביות שריר הלב לפרוסות

  1. קח את צינור המכיל את קוביות מוכן מהמקפיא.
  2. תחבורה על הקרח cryostat.
  3. הגדר את הטמפרטורה אובייקט והרכבים-15 מעלות צלזיוס.
    הערה: ככל הנראה חיוני להבטחת חלוקתה מושלם.
  4. מקררים שפופרות ריק 50 מ ל, בולים בבית הבליעה או על קרח יבש.
  5. הוסיפו שכבה (כ 0.5 - 1.0 מ"ל) cryosection בינוני על גבי חותמת קר ולתת זה להקפיא עד שזה לבן ומוצק.
  6. להוסיף שכבה נוספת של cryosection בינוני, מניחים קוביית שריר הלב על גבי שכבה זו.
  7. ודא כי המדיום cryosection, שריר הלב קפואים לגמרי לפני שתמשיך.
    הערה: כאשר המדיום ולדגום cryosection שאינן מוקפאות חלוקתה יהיה פגום. Cryosection קפוא לגמרי בינוני פונה מן נוזל שקוף אחיד, לבן ו שאינם שקופים. קוביות שריר הלב צריך לפחות 30 דקות עד 1 h לקפוא לחלוטין אם ממשיך מיד מהשלב 1.4. כאשר הרקמה קפוא זה צריך עיוות כאשר נגע/מטופל עם פינצטה.
  8. להוסיף חותמת עם שריר הלב הקפוא המחזיק והדק את כל הברגים.
  9. חתוך את פני השטח של הרקמה עד השטח אפילו אופטים מתקבל.
  10. הגדר חלוקתה עובי 300 מיקרומטר.
  11. בסעיף שריר הלב הקפוא עם חלוקתה אוטומטית. זה מבטיח מקטעים חתוכים אחיד. כ- 30-40 מקטעים באפשרותך נפרס מקוביית אחד.
  12. מקם כל פרוסה אחרי חלוקתה באופן רופף צינור precooled 50 מ.
    הערה: לא לחץ את פרוסות או חבילת בחוזקה. פרוסות כ-40 יכולים להשתלב שפופרת אחת.
  13. סגור את הצינורות מלא ומניחים על קרח.
    הערה: כדי להשהות ללכת על צעד 2.14, אחרת המשך לשלב 3.2.
  14. חנות פרוסות שריר הלב ב-80 מעלות צלזיוס. ניתן לאחסן את הפרוסות במשך מספר חודשים.

3. decellularization של שריר הלב האנושי פרוסות

  1. קח את המספר הדרוש של 50 מ ל צינורות המכיל מקטעים שריר הלב המקפיא-80 ° C וגם הובלה בקירור.
  2. להעביר הסעיפים קפוא של צינורות 50 מ ל כל שלב 3.1 לתוך הספל סטרילי אחד. פרוסות כ-40 נוספים כשהספל למחזור 50 מ. הספל צריך להיות 3 פעמים את הנפח של הצינורות 50 מ; למשל, עבור decellularization של שפופרת 50 מ ל אחת להשתמש גביע 150 מ.
  3. להוסיף פתרון פירוק 50 מ ל (10 מ"מ. טריס, 0.1% w/v EDTA, pH 7.4 H2O) למחזור 50 מ עם פרוסות שריר הלב.
  4. לנער את הפרוסות שריר הלב בתוך סטרילי במהירות של 100-150 סל ד ברציפות כבר שעתיים בטמפרטורת החדר.
  5. מסננים את הנוזל עם הפרוסות רקמות דרך מסננת גסה. להעביר את הפרוסות רקמות עם פינצטה בוטה גביע סטרילית חדשה. להוסיף 50 מ של 0.5% מרחביות PBS למחזור הראשוני 50 מ של שריר הלב פרוסות (למשל, שימוש 100 מ ל מרחביות פתרון כאשר הם להיות decellularized צינורות 50 מ ל שני סעיפים שריר הלב).
  6. לנער ברציפות במשך 6-אייץ '-100-150 סל ד בטמפרטורת החדר.
  7. מסננים את הנוזל עם הפרוסות רקמות דרך מסננת גסה. להעביר את הפרוסות רקמות עם פינצטה בוטה גביע סטרילית חדשה ולשטוף 3 פעמים עם 50 מל PBS למשך 10 דקות תוך כדי טלטול-150 סל ד. לאחר מכן, לשטוף בן לילה ב- PBS עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו 1% ניסטטין (PBS-P/S-N)-100-150 סל ד ו- 4 מעלות צלזיוס תוך טלטול.
    הערה: שטיפה חיוני להסיר לחלוטין את כל מרחביות שיורית. שאריות שנותרו למען חברה דמוקרטית רעילים כאשר ה-ECM משמש בשילוב עם תאים.
  8. להסיר את הפתרון כביסה ולהוסיף 25 מ ל טרופה FBS (37 ° C) עם 1% פניצילין/סטרפטומיצין ו 1% ניסטטין לפרוסות decellularized למחזור הראשוני 50 מ של שריר הלב פרוסות.
  9. תקופת דגירה של h 3-37 מעלות צלזיוס. בשלב זה, דנ הנותרים מוסר מתוך מטריצת עקב פעילות DNase מהותי FBS.
  10. להעביר את הפרוסות גביע סטרילית חדשה ולשטוף 3 פעמים עם 50 מל PBS למשך 10 דקות תוך כדי טלטול-150 סל ד.
    הערה: הפרוסות ECM יכול להיות מאוחסן PBS-P/S-N ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר ימים. עם זאת, מומלץ להמשיך מיד.

4. עיבוד של cECM Decellularized כדי אבקה

  1. מניחים את פרוסות ECM באופן רופף בצלחת 6-ובכן סטרילית חדשה. להקפיא את ה-ECM ב-80 מעלות צלזיוס, lyophilize 2 ימים ב- איזה שהוא לופילייזר.
    הערה: ניתן להניח פרוסה אחד או יותר לכל טוב. לסדר את פרוסות לכסות לחלוטין את פני השטח של הבאר. חופפים את הפרוסות לא משפיעה על ההצלחה pulverization הבאים.
  2. עבור pulverization של הפרוסה ECM, כרסום מסוים לשימוש צינורות (ראה טבלה של חומרים) המכיל 1.4 מ מ קרמיקה חרוזים. למלא הצינורות באופן רופף lyophilized ECM באמצעות פינצטה בוטה סטרילי. לקבלת תוצאות מיטביות, מומלצת במשקל כולל של ECM בין 10-20 מ"ג.
    הערה: אם ה-ECM ארוזה חזק מדי הצינורות הטחינה תהליך pulverization שלילית יושפעו.
  3. Snap-הקפאת הצינורות של חנקן נוזלי.
    זהירות: חנקן נוזלי בטמפרטורה נמוכה מאוד, לענוד הגנה אישית המתאימה.
  4. הוספת הצינורות קפוא לתוך המכונה הטחינה, pulverize את ECM.
    1. הגדרת משך זמן של 30 s ומקסימום מהירות ולהתחיל את המכשיר.
    2. לאחר שסיים, להוציא את הצינורות, snap-להקפיא שוב בחנקן נוזלי.
    3. חזור על חמש פעמים.
  5. לשטוף את microparticles מן הצינורות על-ידי הוספת 1 מ"ל ddH2O לכל צינור, טלטול או מערבולת עבור solubilizing מלאה. לסנן את הפתרון הטרוגנית באמצעות רשת מיקרומטר 200 לתוך צינור 50 מ.
  6. להקפיא את הצינור ב- 80 ° C או נוזל חנקן.
  7. החלף את המכסה הרגיל של הצינור מסנן 0.22 מיקרומטר. זה מכסה המסנן מונע את האבקה זורם הצינור אבל מאפשר זרימת אוויר על אידוי מים.
  8. הכנס הצינורות איזה שהוא לופילייזר, lyophilize שוב כדי להסיר את המים מן השלב (שלב 4.5)
    הערה: Lyophilization בשלב זה יכול לקחת עד 3 ימים.
  9. לאחסן את האבקה ב-80 מעלות צלזיוס עד עיבוד נוסף או להמשיך עם צעד 5.1.

5. אנזים Homogenizing מבוסס על cECM מיקרו-חלקיקים

  1. להמיס פפסין חזירי ב- HCl M 0.01 (pH 2.0) על ריכוז של 1 מ"ג/מ"ל. מניחים על מטרף רוטרי בטמפרטורת החדר עד זה היא התפרקה לחלוטין.
  2. להמיס האבקה ECM האנושי lyophilized (שלב 4.8) הפתרון פפסין ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. מערבבים ביסודיות באמצעות pipetting. הנפח הכולל תלוי הכמות של פתרון ה-ECM הדרושים. לדוגמה, להמיס 10 מ ג של אבקת ECM 1 מ"ל תמיסת פפסין.
    הערה: המסת חלקיקים ניתן לתמוך דרך עדינה vortexing (1000-1500 סל ד). נשארו גושים של microparticles תהיה השפעה שלילית על העיכול.
  3. להעביר את הפתרון 2 mL צינורות עם נפח של 1 מ"ל למחזור.
  4. הצב הצינורות ב שייקר הצינור עבור 48 שעות ב 27 ° C ו- 1200 סל ד.
  5. מוציאים הצינורות ניעור ומניחים על הקרח או בעל שפופרת טרום מקורר.
  6. לערבב 1/9 נפח של פתרון ה-ECM של PBS קר x 10 (pH 7.4) עם 1/10 נפח של פתרון ה-ECM של קור 0.1M NaOH צינור precooled ובמקום על קרח. תערובת זו לנטרל את פתרון ה-ECM מעוכל, בלתי הפיך להשבית את פפסין.
  7. הוסף את פתרון ה-ECM ניטרול תערובת, לערבב ביסודיות באמצעות pipetting או vortexing.
  8. הגדר את ה-ECM לריכוז הרצוי תסיים x 1 (pH 7.4). ניתן לבדוק את ה-pH של התמיסה בנייר pH.
    הערה: חישוב לדוגמה עבור 10 מ ל מתעכל פתרון ה-ECM:
    להוסיף 10 מ ג פפסין חזירי 10 מ"ל HCl (pH 2.0).
    להוסיף אבקת 100 מ ג ECM פפסין פתרון.
    הערה: חישוב לדוגמה עבור נטרול 10 מ ל מתעכל פתרון ה-ECM והגדרת את הריכוז 8 מ"ג/מ"ל:
    Volהסופי = cלהתחיל x Volלהתחיל / cהסופי = 10 mg / mL x 10 מ"ל / 8 מ"ג/מ"ל = 12.5 מ ל
    Vol10xPBS = Volלהתחיל / 9 = 1/9 מהערוץ 10 x 10 מ"ל = 1.11 מ ל
    VolNaOH = Volלהתחיל / 10 = 1/10 מ 10 מ ל = 1 מ"ל
    Vol1xPBS = Volהסופי - Volלהתחיל - Vol10xPBS - VolNaOH = מ"ל - 10 מ ל-.11 mL-1 מ"ל = 0.39 mL

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול 3-צעד עבור decellularization של שריר הלב האנושי המובאת כאן תוצאות כמעט מוחלטת הסרת חומר הסלולר, תוך שימור המרכיבים ECM העיקריים של המבנה fibrillar של ECM. לאחר decellularization, הסרת תאים מן הרקמה ברוטו הוא ברור על-ידי שינוי צבע (איור 1 א'). ניתוח היסטולוגית עם כתמי H & E ו- Trichrome מאסון גילה העדר מוחלט של תאים שלמים שיורית (איור 1B). מבחני כמותיים עבור רכיבים בודדים ECM חשף הסרה מלאה יותר של ה-DNA ושימור טוב יותר של סה כ קולגן, אלסטין, glycosaminoglycans כפי בהשוואה decellularization על ידי מרחביות לבד (איור 2 א). ראיה פונקציונלי הפעילות וחיסונים של cECM מוצג באיור 2B. כאן, ה-RT-PCR שימש כדי לכמת את הביטוי של חלבונים מבניים cardiomyocyte (Myh6, Tnnt2), מוקדם (Mef2c, Nkx2.5) מאחר גורמי שעתוק של cardiomyogenic (Gata4) ואת תאי אנדותל סמן משטח הגנים (פון Willibrand פקטור (vWF), VE-cadherin) במאתר ESC שעברו התמיינות ספונטנית. לעומת התרבות ללא ציפוי מאכל השטח והן ציפוי Matrigel-ECM, זה ניכר כי קשר עם cECM נוהג גזע pluripotent רצוי לקראת הפנוטיפ כמו cardiomyocyte.

פרוסות ECM lyophilized ניתן לעבד עוד יותר ללא שימוש ריאגנטים כימי אנזימטי או לתוך microparticles. מכונות שיוף או כתישה באמצעות ערכות מתאימים המותר עבור הייצור של microparticles עם גודל אחיד (איור 3 א). ספקטרומטר מסה מספק סקירה כללית של כל החלבונים לזיהוי נוכח cECM. אונטולוגיה מפענוח להתרכז מרכיבי התא חשף כי הרוב המכריע של חלבונים ECM נגזרות אכן שטח חוץ-תאית, עם כמה שאריות ההמוגלובין ומספר של חלבונים תאיים בעיקר (איור 4). דפוס זה עשוי לקבוע את הפונקציה וחיסונים של רקמות ספציפיות של cECM, אך השערה זו צריך מחקר נוסף. סיכום של הרכב החלבון cECM מוצג טבלה 1- עיבוד של ה-ECM לתוך microparticles שומרת על פעילותו הביולוגית. HL-1 תאים חשופים לתנאי "אנמית" מדומה (היפוקסיה, הגלוקוזה, בסרום קיפוח) להציג עלייה חילוף החומרים (איור 3B) לבין ירידה ברמת מוות של תאים כאשר תרבותי על cECM (איור 3C).

העיכול מבוססת-פפסין מוגבלת של האבקה cECM, המבוסס על פרוטוקול ששונה שפותחו עבור טיהור קולגן19, התוצאה היא פתרון ה-ECM homogenized. שלב ניגודיות מיקרוסקופ אור תמונות (איור 5A) מדגימים את תהליך העיכול לאחר 0 h ו- 48 h. שלב homogenizing זה מקלה על יישומים ברפואה רגנרטיבית10. CECM מעובד וכתוצאה מכך מוצג באיור 5B. מטמפרטורת החדר זה נשאר נוזלי (איור 5B, משמאל) אבל ב 37 ° C היא יוצרת של הידרוג וההספק עצמית עם יציבות מתאים כיסוי עם המתלים התא ומאפשר תרבות תלת-ממד (תמונה ייצוגית, איור 5B נכון, הידרוג שכבתית עם תרבות בינוני.) חי/מת כתמים fibroblasts הלב האנושי מראה גם את ההשפעות המיטיבות של culturing על cECM (איור 5C). CECM microparticles וגם cECM הידרוג מוגברת פעילות חילוף החומרים של התאים HL1 כויץ בתנאים איסכמי לעומת תאים בתרבות סטנדרטי (איור 5C, החלונית התחתונה נכון).

Figure 1
איור 1: Decellularization של שריר הלב הלב האנושי. (א) ניתוח מאקרוסקופית של cECM על ידי מיקרוסקופ סטריאו חושף את הסרת חומר הסלולר עם פרוטוקול 3-צעד decellularization. זו ניכרת על ידי הגדלת השקיפות. (B) היסטולוגיה מכתים הפרוסות שריר הלב לפני ואחרי decellularization עם הוא-(משמאל; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר) ו Trichrome מאסון מכתים (מימין; סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר) מראה הסרה מוצלחת של תאים מן הרקמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תוכן ותוצאה של פרוסות cECM. (א) ניתוח הביוכימי כמותית של הנבחרת ECM רכיבים של ה-DNA, משווה את פרוטוקול 3-צעד decellularization 0.5% decellularization מרחביות-לבד. הנתונים מבוטאים כאחוזים של תוכן מקורי שריר הלב. עם פרוטוקול 3-צעד, התוכן DNA שיורית כמעט אפס, נמוכה יותר בצורה משמעותית מאשר כי לאחר דגירה 9 h עם תקן בשילוב 0.5% מרחביות/פירוק מאגר שילוב עם FBS (9 מרחביות h + FBS). מבחני הביוכימי בהתאמה הפגינו כמעט מוחלטת שימור של קולגן, כ-20% שימור גליקוזאמינוגליקן תוכן לעומת רקמה מקורית, ושימור של כמעט 30% תוכן אלסטין, בכולן גבוה יותר עם מרחביות הפניה הפרוטוקול הסטנדרטי (העמודות מייצגות זאת אומרת ± SEM). (B) mRNA ביטוי של גנים שנבחר בתאי גזע pluripotent המושרה המבדילים על cECM, לעומת תרבות ללא ציפוי מנות, משטח מצופה Matrigel. cECM הנתונים הם מנורמל לאלו שהושגו על החומרים המתאימים שליטה (שליטה = 1, מקווקו). הרוב המכריע של לב גנים מבוטאים משמעותית גבוהה יותר כאשר תרבותי על cECM (העמודות מייצגות זאת אומרת ± SEM). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: המראה ואת פעילות ביולוגית של cECM microparticles. (א) cECM אבקת microparticle לאחר lyophilization. (B) חילוף חומרים (MTS) ו- (ג) תא מוות (LDH שחרור) ניתוח של HL-1 תאים בתרבית עם cECM או ג'לטין. cECM משמעותית מפחית מוות של תאים, מגביר את חילוף החומרים. העמודות מייצגות זאת אומרת ± SEM, מובהקות סטטיסטית נבדק על ידי חד-כיווני אנובה, Bonferroni. איור 3B -C שונו מ. Kappler et al. 18 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: חלבון הרכב של cECM microparticles. בעקבות ספקטרומטר מסה, ניתוח מחרוזת DB מתאר של רכיבי מפתח של cECM, אשר קשורים בעיקר עם המרחב חוץ-תאית (גו: 0005615; כדורים אדומים p > 0.05). הקווים מצביעים על אינטראקציות חלבון מבוסס על נתונים ניסיוני ביוכימי (סגול), על הביטוי ושיתוף נתונים (שחור), על מסד הנתונים אינטראקציות (כחול), ועל ביטוי משותף (ירוק). מחרוזת DB נדרש אמון: ציון > 0.4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: עיבוד של cECM הידרוג לשמר את ולייעל ביולוגי. שלב ניגודיות מיקרוסקופ אור תמונות מדגימות את עיכול אנזימטי cECM עבור 48 h תוצאות בפתרון ECM יותר homogenized; סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (א) ה-ECM של פתרון נשאר נוזלי עד לטמפרטורת החדר (B, משמאל) ומכילה פוטנציאל בעצמם לכיוון הידרוג כאשר מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס (B, נכון). חי/מת כתם של הלב fibroblasts אנושית ותרבותית עם ובלי cECM מגלה calcein גבוהה יותר להכתים את האינטנסיביות של תאים חיים; סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר (C). הידרוג cECM מגביר את הפעילות המטבולית של תאים HL1 בתנאים איסכמי באותו אופן כמו חלקיקי מיקרו (C, לוח נכון התחתון, שונה. Kappler et al. ברים 18) מייצגים זאת אומרת ± SEM, מובהקות סטטיסטית נבדק על ידי חד-כיווני אנובה, Bonferroni. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

תיאור חלבון
5-hydroxytryptamine קולטן 7 OS = הומו ספיינס GN = HTR7 PE = 1 SV = 2
החלבון אקטין דמוי 6B OS = הומו ספיינס GN = ACTL6B PE = 1 SV = 1
אקטין, שריר חלק מאבי העורקים OS = הומו ספיינס GN = ACTA2 PE = 1 SV = 1
אלבומין OS = הומו ספיינס GN = ALB PE = 1 SV = 2
אנטיתרומבין-III OS = הומו ספיינס GN = SERPINC1 PE = 1 SV = 1
OS C-III אפוליפופרוטאין = הומו ספיינס GN = APOC3 PE = 1 SV = 1
אפוליפופרוטאין E OS = הומו ספיינס GN = ספקיות PE = 1 SV = 1
סליל מפותל מחשבים המכילים חלבון 47 OS = הומו ספיינס GN = CCDC47 PE = 1 SV = 1
חבר המשפחה 11 בתחום לקטין C-type A OS = הומו ספיינס GN = CLEC11A PE = 1 SV = 1
כלוריד חלבונים תאיים ערוץ 1 OS = הומו ספיינס GN = CLIC1 PE = 1 SV = 4
שרשרת הקולגן alpha-2(I) OS = הומו ספיינס GN = COL1A2 PE = 1 SV = 7
משלימים מערכת הפעלה C3 = הומו ספיינס GN = C3 PE = 1 SV = 2
שרשרת הקולגן alpha-2(IV) OS = הומו ספיינס GN = COL4A2 PE = 1 SV = 4
מחזורי AMP מגיב רכיב איגוד 3 כמו חלבון 4 OS = הומו ספיינס GN = CREB3L4 PE = 1 SV = 1
Dermatopontin OS = הומו ספיינס GN = DPT PE = 2 SV = 2
Fibronectin OS = הומו ספיינס GN = FN1 PE = 1 SV = 4
גלוטתיון peroxidase 3 OS = הומו ספיינס GN = GPX3 PE = 1 SV = 2
המוגלובין יחידה משנית אלפא OS = הומו ספיינס GN = HBA1 PE = 1 SV = 2
המוגלובין יחידה משנית בטא OS = הומו ספיינס GN = HBB PE = 1 SV = 2
איג קאפה שרשרת ג אזור מערכת ההפעלה = הומו ספיינס GN = IGKC PE = 1 SV = 1
Lumican OS = הומו ספיינס GN = לאם PE = 1 SV = 2
Mimecan OS = הומו ספיינס GN = OGN PE = 1 SV = 1
OS Nidogen-1 = הומו ספיינס GN = NID1 PE = 1 SV = 3
מועשר pseudopodium קינאז לא טיפוסי 1 OS = הומו ספיינס GN = PEAK1 PE = 1 SV = 4
פיגמנט אפיתל-derived factor OS = הומו ספיינס GN = SERPINF1 PE = 1 SV = 4
קואנזים A מיטוכונדריאלי טרנספורטר SLC25A42 OS = הומו ספיינס GN = SLC25A42 PE = 2 SV = 2
סרום עמילואיד P-רכיב OS = הומו ספיינס GN = PE נגמ שים = 1 SV = 2
תמלול חניכה הפקטור TFIID יחידת משנה 5 OS = הומו ספיינס GN = TAF5 PE = 1 SV = 3
טיודור מחשבים המכילים חלבון 3 OS = הומו ספיינס GN = TDRD3 PE = 1 SV = 1
אבץ אצבע matrin-סוג חלבון 4 OS = הומו ספיינס GN = ZMAT4 PE = 2 SV = 1
אבץ אצבע חלבונים 101 OS = הומו ספיינס GN = ZNF101 PE = 2 SV = 1

טבלה 1: חלבון ההרכב של אבקת cECM כפי שנקבע על ידי ספקטרומטר מסה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעת הכנת ECM שריר הלב האנושי, המטרה היא להשיג את הדברים הבאים: הסרת חומרים רלוונטיים הסלולר immunogenic, שמירה על שלמות ECM ו אתריים, עקרות, אי רעילות של המוצר הסופי, תאימות GMP-תהליך, ו התאמת המוצר עבור יישום נתון במונחים של טיפול. על ידי שילוב פרוטוקול 3-צעד decellularization שלנו עם עיבוד נוסף לתוך microparticles או הידרוג וההספק עצמית, מתקבל חומר ECM הלב האנושי הוא בעל פעילות ביולוגית ספציפית, הוא קל לטפל, יש את הפוטנציאל מספר יישומים במבחנה וב ויוו, הדומה מה הוכח למוצרים ECM מספר בעלי חיים מינים11,13,20,21.

במהלך העיבוד הראשוני של רקמת שריר הלב, חשוב פרוסות שריר הלב מקטע של עובי זהה, כי משך הריכוז וטיפול מורכבים, יש כבר טיטרציה לפרוסות 300 מיקרומטר. פרוסות עבה יותר יהיה שהיישום decellularized, פרוסות דק יותר יסבלו התמוטטות בלתי רצויות של רכיבי ה-ECM עם הפסד של bioactivity. דבר זה חשוב במיוחד לגבי הטיפול מרחביות, איפה רעילות יכול להשפיע לרעה ECM סגולות ו ניתוחים הסלולר16. יתר על כן, טיפול מרחביות ממושך יכול להוביל להשלמת היעדר fibronectin כפי שנראה במחקר. Godier-Fournement et al. 22, בזמן זה נשמר עם השיטה שלנו17. הסעיפים cECM מתאימים לשימוש בניסויים ללא עיבוד נוסף (קרי, תרבות תלת-ממד מודלים לניתוח תאית התמיינות או תא-ECM אינטראקציות, או גישות איכלוס הסלולר "הנדסת רקמות"). השימוש FBS להסרת ה-DNA הוא יעיל ביותר, אך שעשויה להוביל כמה חלבונים FBS שיורית בסעיפים ECM. זה יכול להשפיע על כל מבחני רגישות FBS. תרגום פרוטוקול קליני כיתה GMP צריך להיות אפשרי עם השימוש של sera מוסמך, אולם עיבוד ייתכן שיהיה צורך בהתאם לתקנות. זה גם יכול להיות המאשרת העדר FBS שאריות ECM או שינוי בפרוטוקול יהיה צורך להחליף את FBS DNase טיפול. לבסוף, מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה של רקמות, ECM מקטעים הן להימנע כדי למנוע השפלה של המטריקס.

בעת הפקת את הידרוג cECM, עיכול פפסין היא השלב הקריטי ביותר בתהליך. בניסויים הראשונית שלנו, עיכול פפסין ב- pH 1 עבור h 48-37 מעלות צלזיוס הוביל לאובדן אתריים, אשר ניתן למנוע על-ידי שינוי הדגירה כדי pH 2 במשך 48 שעות-27 oC. כמו כן, זכרו הידרוג המופק מהשעיה microparticle lyophilized cECM, לא טרי decellularized cECM רטוב פרוסות. בנוסף הטיפול כללית משופרת הידרוג לעומת cECM פרוסות, הידרוג יש יתרון כי זה יכול להיות מדולל לשימוש בריכוזים שונים, למשל-ריכוז גבוה יותר בשילוב עם חומרים אחרים, או עבור תלת-ממד תרבות, או ריכוז נמוך לציפוי של מנות התרבות התא או כתוסף תרבות לבינוני.

פרוטוקול זה הוקם להתחנף מעבדה-כיתה להכנה cECM האנושי לעזור למלא את הפערים translational רפואה רגנרטיבית שתוארו לאחרונה על ידי Saldin. et al. 10 בזמן decellularized cECM פרוסות ניתן להחיל כגליונות על פני השטח epicardial של הלב הפגוע, כפי שמתואר לאחרונה מאת שריג. et al., עם cECM חזירי במודל של עכברים של אוטם שריר הלב23, עיבוד לתוך הידרוג מאפשר ליישומים מגוונים יותר ויוו , כגון ההזרקה של cECM לתוך שריר הלב, כפי שהראה Singelyn. et al. 13 , 24 על מנת להמשיך לכיוון פעילויות translational קלינית, בפרוטוקול הנוכחי יהיה להיות מומר נהלי GMP-כיתה. בעקרון, כל החומרים שנעשה בהם שימוש הם גם חלק של תהליכי הייצור שאושר התקן רפואי/ATMP (קרי, decellularized מסתמי לב או כלי דם), אין מכשולים עיקריים הן צפויות. עם זאת, מידע על משך אחסון בטוח ועל היעדר פתוגנים בהחלט יידרש. בסופו של דבר, דרוש מקור אמין של כמויות גדולות יותר של רקמת הלב טריים וסטרילי מתורמים ללא מחלת לב. לבבות של תורמי איברים המנוח שאינן מתאימות עבור השתלת הנה התרחיש הסביר ביותר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

פרוטוקול המחקר תואמת עקרונות אתיים שמתואר את הצהרת הלסינקי. חולים שסופקו מדעת לשימוש של הרקמה למטרות מחקר, התהליך של איסוף רקמת אושרה על ידי הועד המוסדי יו ר ועדת האתיקה של צ'אריטה - Universitätsmedizin ברלין (EA4/028/12).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Balance DR Precisa, Dietikon, Switzerland Precisa XR 205SM
Blades Nr.10 Skalpell Nr.3 InstrumenteNRW, Erftstadt, Germany SK-10-004
Cell culture plates (6-well) Greiner, Frickenhausen, Germany 657160
Cryostat CM Leica, Wetzlar, Germany 3050S
EDTA Carl Roth, Karlsruhe, Germany 8043.3
Eppendorf reaction tubes (1.5 or 2 ml) Greiner, Frickenhausen, Germany 616201, 623201
Falcon 15ml, 50ml Greiner, Frickenhausen, Germany 188271, 227270
Fetal Bovine Serum (FBS) Biochrome, Berlin, Germany S 0115
Freeze Dry System Labconco, Kansas City, USA 7670520
Freezer (-80°C) Thermo Scientific, Waltham, MA, USA Forma 900 Series
HCl Carl Roth, Karlsruhe, Germany 281.1
Microtome Blades Type 819 Leica, Wetzlar, Germany 14035838925
Minilys Homogeniser PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Germany 91-PCSM
NaOH Carl Roth, Karlsruhe, Germany K021.1
Nystatin PAN Biotech, Aidenbach, Germany P06-07800
PBS Thermo Scientific, Waltham, MA, USA 14190-094
Penicillin/streptomycin Life Technologies, Darmstadt, Germany 15140122
Pepsin Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany P6887-1G
Precellys Keramik-Kit 1.4 mm Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Germany 91-PCS-CK14
Rotamax 120 Plate shaker Heidolph, Schwabach, Germany 544-41200-00
SDS Carl Roth, Karlsruhe, Germany CN30.3
Stereo microscope Leica, Wetzlar, Germany M125
Steriflip-GP, 0,22 µm Merck Millipore, Darmstadt, Germany SCGP00525
Stuart analogue rocker & roller mixers Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany Z675113-1EA
Tissue Tek O.C.T compound Hartenstein, Wurzburg, Germany TTEK
Transfusion set 200µm Sarstedt, Nümbrecht, Germany 798.200.500
TRIS Carl Roth, Karlsruhe, Germany 5429.3
vedena Skalpellgriff Fig. 3, Standard, 125 mm Medical Highlights, Rohrdorf, Germany CV102-003
Vortex-Genie2 Scientific Industry, New York, USA SI-0256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Elliott, R., Hoehn, J. Use of Commercial Porcine Skin for Wound Dressings. Plastic and reconstructive surgery. 52, (4), 401-405 (1973).
  2. Rienks, M., Papageorgiou, A. -P., Frangogiannis, N. G., Heymans, S. Myocardial Extracellular Matrix: An Ever-Changing and Diverse Entity. Circulation Research. 114, (5), 872-888 (2014).
  3. Prabhu, S. D., Frangogiannis, N. G. The Biological Basis for Cardiac Repair After Myocardial Infarction. Circulation Research. 119, (1), 91-112 (2016).
  4. Boopathy, A. V., Martinez, M. D., Smith, A. W., Brown, M. E., Garcia, A. J., Davis, M. Intramyocardial Delivery of Notch Ligand-Containing Hydrogels Improves Cardiac Function and Angiogenesis Following Infarction. Tissue Eng Part A. 21, (17-18), 2315-2322 (2015).
  5. Gaetani, R., Yin, C., et al. Cardiac derived extracellular matrix enhances cardiogenic properties of human cardiac progenitor cells. Cell Transplant. (2015).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Ferreira, L. S., et al. Human embryonic stem cell-derived microvascular grafts for cardiac tissue preservation after myocardial infarction. Biomaterials. 32, (4), 1102-1109 (2011).
  7. Zhang, J., Klos, M., et al. Extracellular matrix promotes highly efficient cardiac differentiation of human pluripotent stem cells: The matrix sandwich method. Circulation Research. 111, (9), 1125-1136 (2012).
  8. Fong, A. H., Romero-López, M., et al. Three-Dimensional Adult Cardiac Extracellular Matrix Promotes Maturation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Tissue Engineering Part A. 22, (15-16), 1016-1025 (2016).
  9. DeQuach, J. A., Mezzano, V., et al. Simple and High Yielding Method for Preparing Tissue Specific Extracellular Matrix Coatings for Cell Culture. PLoS ONE. 5, (9), e13039 (2010).
  10. Saldin, L. T., Cramer, M. C., Velankar, S. S., White, L. J., Badylak, S. F. Extracellular matrix hydrogels from decellularized tissues: Structure and function. Acta Biomaterialia. 49, 1-15 (2017).
  11. Tukmachev, D., Forostyak, S., et al. Injectable extracellular matrix hydrogels as scaffolds for spinal cord injury repair. Tissue Eng Part A. (2016).
  12. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29, (11), 1630-1637 (2008).
  13. Singelyn, J. M., Sundaramurthy, P., et al. Catheter-deliverable hydrogel derived from decellularized ventricular extracellular matrix increases endogenous cardiomyocytes and preserves cardiac function post-myocardial infarction. Journal of the American College of Cardiology. 59, (8), 751-763 (2012).
  14. Wainwright, J. M., Czajka, C. A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix from an intact porcine heart. Tissue Eng Part C Methods. 16, (3), 525-532 (2010).
  15. Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nature Medicine. 14, 213-221 (2008).
  16. Oberwallner, B., Anic, B. A., et al. Human cardiac extracellular matrix supports myocardial lineage commitment of pluripotent stem cells. Eur J Cardiothorac Surg. 47, 416-425 (2015).
  17. Oberwallner, B., Brodarac, A., et al. Preparation of cardiac extracellular matrix scaffolds by decellularization of human myocardium. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 102, (9), 3263-3272 (2014).
  18. Kappler, B., Anic, P., et al. The cytoprotective capacity of processed human cardiac extracellular matrix. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. (2016).
  19. Bashey, R. I., Martinez-Hernandez, A., Jimenez, S. A. Isolation, characterization, and localization of cardiac collagen type VI. Associations with other extracellular matrix components. Circulation Research. 70, (5), (1992).
  20. Wu, J., Ravikumar, P., Nguyen, K. T., Hsia, C. C. W., Hong, Y., Gorler, A. Lung protection by inhalation of exogenous solubilized extracellular matrix. PLOS ONE. 12, (2), e0171165 (2017).
  21. Chen, W. C. W., Wang, Z., et al. Decellularized zebrafish cardiac extracellular matrix induces mammalian heart regeneration. Science Advances. 2, (11), e1600844 (2016).
  22. Godier-Furnémont, A. F. G., Martens, T. P., et al. Composite scaffold provides a cell delivery platform for cardiovascular repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (19), 7974-7979 (2011).
  23. Sarig, U., Sarig, H., et al. Natural myocardial ECM patch drives cardiac progenitor based restoration even after scarring. Acta Biomaterialia. 44, 209-220 (2016).
  24. Singelyn, J. M., DeQuach, J. A., Seif-Naraghi, S. B., Littlefield, R. B., Schup-Magoffin, P. J., Christman, K. L. Naturally derived myocardial matrix as an injectable scaffold for cardiac tissue engineering. Biomaterials. 30, (29), 5409-5416 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics