Strukturell karaktärisering av Mannan cellväggen polysackarider i anläggningar som använder takt

* These authors contributed equally
Biochemistry
JoVE Journal
Biochemistry
AccessviaTrial
 

Summary

Ett protokoll för den strukturella analysen av polysackarider med gelelektrofores (PACE), med mannan som exempel, beskrivs.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pidatala, V. R., Mahboubi, A., Mortimer, J. C. Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE. J. Vis. Exp. (128), e56424, doi:10.3791/56424 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Anläggningen cellväggen polysackarider är notoriskt svåra att analysera, och de flesta metoder kräver dyr utrustning, skickliga operatörer och stora mängder renat material. Här, vi beskriver en enkel metod för att få detaljerad polysackarid strukturell information, inklusive resolution av strukturella isomerer. För polysackarid analys med gelelektrofores (PACE) hydrolyseras cellväggen växtmaterial med glycosyl Hydrolaser specifika för polysackarid av intresse (t.ex. mannanases för mannan). Stora format polyakrylamidgeler används sedan för att separera de släppta oligosackarider, som har märkts fluorescently. Geler kan visualiseras med en modifierad gel som tänkbar system (se Tabell för material). Den resulterande oligosackarid fingeravtrycket kan antingen jämföras kvalitativt, eller med replikering, kvantitativt. Länkage och förgrenade information kan fastställas med hjälp av ytterligare glycosyl Hydrolaser (t.ex. mannosidases och galactosidases). Medan det här protokollet beskriver en metod för att analysera glukomannan struktur, kan det tillämpas på alla polysackarid som karakteriserade glycosyl Hydrolaser finns. Alternativt kan den användas att karakterisera roman glycosyl Hydrolaser använder definierade polysackarid substrat.

Introduction

Polysackarid analys med gelelektrofores (PACE) är en metod för detaljerad karakterisering av polysackarider1,2,3. Anläggningen cellväggen polysackarider är notoriskt svåra att analysera, och de flesta metoder kräver dyr utrustning, skickliga operatörer och stora mängder renat material. Här, vi beskriver en enkel metod för att få detaljerad polysackarid strukturell information, inklusive resolution av strukturella isomerer.

Förståelse växt cellväggen polysackarid struktur är nödvändigt för dessa forskare att utforska växt växtcellväggar eller roll växt cellväggen i växten utveckling. Nyligen har dock blivit växt cellväggen sammansättning intressanta för en bredare grupp av forskare på grund av fokus på använder växtbiomassa (i huvudsak cellväggen) som en råvara för att producera biodrivmedel och biokemikalier4. Som ett exempel kräver effektiv enzymatisk saccharification av detta material en detaljerad förståelse av de polysackarid strukturerna, så att optimerad enzymatisk cocktails kan vara valda5.

PACE har flera fördelar jämfört med alternativa metoder som gör den idealisk för snabb analys av komplexa glycan strukturer. För det första kräver det inte rening av polysackarid som är i fråga, som krävs för lösning tillstånd kärnmagnetisk resonans (NMR)6. För det andra TAKTEN kan lösa strukturella isomerer, till skillnad från masspektrometri (MS, t.ex., matrix-assisted laser desorption/jonisering (MALDI) och elektrospray jonisering (ESI)), som också kan vara svårt för att utföra genom vätskekromatografi (LC) 7. för det tredje, TEMPOT är mycket känslig, med låg-picomole upplösning, till skillnad från tunnskiktskromatografi (TK) eller papperskromatografi. Slutligen, det kräver inte några dyra utrustning eller specialist kunskap, vilket är fallet för MS, NMR och LC.

Metoden takt bygger på idrottens glycosyl hydrolas (GH) enzymer, som riktar vissa glycosidic kopplingar i en blandning av polysackarider. När GH enzymet agerar på polysackarid kedja, avslöjar det en reducerande slutet vilket kan sedan vara kemiskt derivatized, i detta fall med en fluorescerande etikett. Den unhydrolyzed delen av provet återges därför påvisas med denna metod. De märkta oligosackarider separeras sedan i ett stort format akrylamid gel genom elektrofores. Detta ger utmärkta resolution av mycket liknande molekyler, till exempel trisackarider Glc-Man-Man och Glc-mannen-Glc kommer att ha en annan Rf.

TAKTEN har använts i stor utsträckning att karakterisera olika xylan strukturer över växt arter8, för att identifiera glycosyltransferase mutanter i Arabidopsis6,9,10,11 att utföra glycosyltransferase analyser9och att karakterisera roman GH verksamhet12,13. Vi har också nyligen använt det för att karakterisera jäst cellväggen mannan (Mahboubi och Mortimer, på gång sedan). Här beskriver vi en metod för att karaktärisera cellväggen glukomannan Anläggningsstruktur, baserat på tidigare rapporter11,14.

Protocol

1. upptagning av växtmaterial

  1. skörda färska växtmaterial (~ 20 mg) och omedelbart dränka det i 96% (v/v) etanol och inkubera vid 70 ° C under 30 minuter; detta avaktiverar någon cellvägg som förnedrande enzymer som förekommer. För torrt material, börjar du med steg 2.
    FÖRSIKTIGHET: Etanol är brandfarligt.
    Obs: En enda stam eller rosett blad kommer att ge tillräckligt med material för analys. Dock färre fel uppstå om en större mängd vävnad är poolade och analyseras eftersom detta är enklare att väga och hantera.
  2. Registrera noggrant vävnadstyp och utvecklingsstadiet, som polysackarid struktur varierar med båda. Exempelvis med Arabidopsis thaliana (används här), stage vävnaden enligt metoderna från Boyes o.a. 15
    Observera: I detta protokoll, har vi använt den nedre halvan av blomställning stammen, där den första skida blir fullt utdragna men inte gulfärgning.

2. beredning av alkohol olösligt rester (AIR)

  1. Förbered luft, efter metoden i Mortimer o.a. 9 eller en annan liknande metod, för att producera ett pulver som saknar lösliga sockerarter, sackaros och stärkelse.

3. Alikvotering och förbehandling av luft

Observera: den exakta mängden luft som behövs för varje prov beror på (a) överflöd av polysackarid av intresse i materialet och (b) den genomsnittliga storleken på oligosackarider utgivet GH. Metoden lägger en enda fluorescerande molekyl till reducerande slutet av varje oligosackarid, så antalet oligosackarider bestämmer känsligheten i experimentet. Som en riktlinje för glukomannan Arabidopsis Stem rötas med GH5/GH26 (som beskrivs), 500 µg rekommenderas 11, medan för xylan i Arabidopsis stammen spjälkas med GH11, 100 µg rekommenderas liksom Mortimer ' s studie 3.

  1. väger luft (10-15 mg) i en 15 mL centrifugrör och lägga till H 2 O till en slutkoncentration av 2 mg/mL. Vortex att uppnå en jämn suspension. Om detta är problematiskt, sedan använda en glas Homogenisatorer för att bistå denna process.
  2. Alikvotens 500 µg i microfuge rör. Torka alikvoter använder en vakuum centrifug (se Tabell för material) övernattning på 30 ° C.
  3. Pre behandla luften med 1 M NaOH (20 µL) för 1 h i rumstemperatur, detta de acetylates polysackarider och sväller den cellulosa microfibrils, störa strukturen biomassa och tillåta GH åtkomst.
    Obs: Detta steg kan hoppas över för renat polysackarider. FÖRSIKTIGHET – stark syra/bas.
    1. Inkluderar en alikvot för en no-enzym AIR control (behandlas på samma sätt som alla prover, utom steg 4.1. utesluts).
  4. Tillsätt 200 µL av H 2 O och 20 µL 1 M HCl för att neutralisera. Test att pH är ~ 6-7 genom att ta bort 1 µL och spotting det på pH indikatorn pappersremsor.
  5. Lägga till 50 µL 1 M ammonium acetatbuffert, pH 6,0 (eller vilket pH är lämpliga för GHs används i studien) och H 2 O att ge en total volym av 500 µL.
    Obs: Ammoniumacetat används eftersom det sublimes vid torkning, och så det inte lägger ytterligare salt i urvalet. Ett överskott av salt kan leda till dålig band-form och upplösning på takt gel.

4. Hydrolys av luft med Glycosyl Hydrolases (GHs)

Obs: som nämnts i diskussionen, renheten av GHs är kritisk. Använd bara heterologously uttryckt, affinitet renade enzymer. Vid mottagandet av varje parti från tillverkaren, hydrolyserar definierade alikvoter av substrat (t.ex. 500 µg luft) med ökande mängder GH över natten (t.ex. 0,5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 enheter/µL). När det finns ett överskott av GH, kommer takt fingeravtrycket ser likadana ut. Ett överskott av enzym som krävs för att leverera ett reproducerbara resultat eftersom det måste vara säker på att hydrolys reaktionen närmar sig slutpunkten.

  1. Lägg till en förutbestämd mängd (se ovan) mannanases (GH5 och GH26 11) till de luft alikvoter i buffert från steg 3.5, liksom en positiv kontroll (30 µg av konjac glucomannan) och en no-AIR negativ kontroll (enzym mix i en tomma tube). Vortex, och sedan snurra för kort för att samla reaktionsblandningen i botten av röret.
  2. Inkubera över natten vid 37 ° C (eller den lämpliga temperaturen för GH val) med mild agitation (~ 100 rpm).
  3. Stoppa reaktionen genom inkubation vid 95 ° C i 20 min.
    Obs: Cap nedläggningar kan användas för att täta flip-top microfuge rör.
    1. Centrifugera med en bänk topp microfuge med maximal hastighet för 10 min, och behålla supernatanten.
  4. Återsuspendera pelleten i 250 µL H 2 O, centrifug som ovan, och behålla supernatanten.
  5. Kombinera båda supernatanterna och torka i en vakuum centrifug (se Tabell för material) vid 30 ° C (~ 3 h eller övernattning utan uppvärmning).

5. Utarbetandet av Oligosaccharide standarder

  1. Förbered 1 mM lager lösningar i H 2 O i mannos (Man), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (Man 5) och mannohexaose (Man 6), alla β, 1-4 länkade. Delprov och förvaras vid-20 ° C tills krävs.
  2. Förbereda 3 olika koncentrationer av en Man 1-6 blandning genom att kombinera 1 µL (Standard S1), 2 µL (S2) eller 5 µL (S3) alla sex.
  3. Torr i en vakuum centrifug (se Tabell för material) vid 30 ° C (~ 1 h).

6. Derivitization av oligosackarider

  1. Förbered en stamlösning av 0,2 M myror (8-Aminonaftalen-1,3,6-trisulfonic syra) i H 2 O: ättiksyra 17:3. Varma lager till 60 ° C att helt upplösa fast. Förvaras vid-20 ° C, skyddas från ljus, för 2-3 månader.
  2. Förbereda 0,2 M stamlösning av 2-pikolin Boran (2-PB) i DMSO. Detta är extremt hygroskopiskt, så omedelbart Återsuspendera allt pulver vid mottagandet i DMSO. Delprov och förvaras vid-20 ° C i 1-2 år. Tina alikvoter som krävs (store vid 4 ° C i 2 veckor och sedan kassera).
  3. Förbereda derivatisering bufferten av H 2 O: acetic acid: DMSO 17:3:20.
  4. Till varje prov, tillsätt 5 µL av myror, 5 µL 2-PB och 10 µL av derivatisering buffert. Spinn kort för att samla in i botten av röret, vortex grundligt, och sedan snurra kort igen. Se figur 1 för reaktion beskrivning.
  5. Prover Inkubera över natten vid 37 ° C, skyddas från ljus.
  6. Torr i en vakuum centrifug (se Tabell för material) vid 30 ° C (~ 2 h).
  7. Omsuspendera prover och standard i 100 µL 3 M urea. Förvaras vid-20 ° C, skyddas från ljus tills krävs.

7. Beredning av PACE geler

Obs: montering av gel gjutning utrustningen beror på märke. Här, vi uSe en vertikal elektrofores system (se Tabell för material), utrustade med 18 x 24 cm glasplåtar och 1,5 mm distanser.

  1. Montera gel gjutning utrustning per tillverkaren ' anvisningar.
  2. Gör 10 x takt buffert (1 M Tris-Borat, pH 8,2) enligt följande: lägga till 121.14 g för Tris-Base ~ 400 mL H 2 O, och blanda att upplösa. Justera pH till 8,2 genom tillsats av solid borsyra (ca 60 g) och gör sedan volym upp till 1 L.
  3. Göra en 10% (w/v) ammonium persulfatoxidation (APS) lager i H 2 O. alikvot och förvaras vid-20 ° C. blidvädret alikvoter en gång, förvaras vid 4 ° C och kassera efter 2 veckor.
  4. Gör och häll den lösa gel. För ovanstående utrustning motsvara 1 gel 50 mL. I ett 50 mL centrifugrör, blanda H 2 O (20,2 mL), 5 mL 10 x takt buffert, 24,6 mL 40% akrylamid/Bis-akrylamid (29: 1 acrylamide:Bis). (Försiktighet: giftiga).
    1. Tillsätt 200 µL APS och 20 µL av N, N, N, N´-tetrametyl-etylendiamin (TEMED). Vänd försiktigt för att blanda (Undvik att införa luftbubblor). Häll gelen med en serologisk eller andra stora volym pipett till ~ 4 cm nedanför toppen av glasplattorna. Uppmärksamma möjligheten att luftbubblor att fastna i gelen. Om de gör, sluta hälla och tilt/tap gelen för att släppa dem.
  5. Overlay gelen med isopropanol (försiktighet : brandfarlig) eller noggrant, med H 2 O. Tillåt gel att polymerisera (20-30 minuter), sedan Häll bort det översta lagret. Om isopropanol användes, sedan tvätta 2 x med H 2 O. torr överflödig vätska med hjälp av läskpapper.
  6. Gör och häll stapling gelen. Blanda 6,8 mL H 2 O, 1 mL 10 x takt buffert, 2,8 mL akrylamid/Bis-akrylamid (försiktighet: giftiga), 80 µL APS och 8 µL av TEMED i en 15 mL centrifugrör. Vänd för att blanda och överlägg ovanpå polymeriserat lösa gel. Försiktigt in kammar, undvika svällning luftbubblor under kam tänderna.
  7. Tillåt gel att polymerisera (20-30 min), wrap i fuktig vävnad och sedan i plastfolie, och förvaras vid 4 ° C tills krävs. Butik med hårkammarna plats.
    Obs: Tempo geler kan förvaras i högst 2 veckor (även om mindre än 1 vecka är perfekt), om de hålls fuktiga.

8. Kör en takt Gel

  1. använda en permanent spritpenna för att namnge de väl positionerna på glaset, som hjälper att hålla reda på ordern lastning, och i att identifiera var brunnarna när kammen tas bort.
  2. Ta bort kammen. Fyll brunnarna med 1 x takt buffert.
  3. Använda en 10 µL mikrosprutan till lasta 2 µL av standarder och prover i brunnar. Undvik att använda de yttersta köer, som tenderar att köra prover dåligt.
  4. Montera den övre kammaren av gel-kör apparaten, och placera gelen i en kyld (~ 10 ° C) kör tank (10 ° C) som innehåller 1 x takt buffert. Fyll den övre kammaren med 1 x takt buffert.
  5. Slå på strömmen, och kör gelen vid 200 V (konstant V) för 30 minuter, och sedan öka spänningen till 1000 V för 1 h 40 minuter. Ljuskänsligt geler (t.ex. genom att Linda tankar i svarta sopsäckar).
    Obs: Kontrollera på gelerna ~ 5 min efter att aktivera spänningen, och sedan en annan 5 minuter efter ökar spänningen till 1000 V. Om batteripaketet är oförmögen att hantera spänningen då finns det sannolikt en buffert läcka. Ta bort gelen från tanken. Montera den övre kammaren, noga kontrollera placeringen av alla packningar. En stor chip på överkanten på glasskivan kan förhindra att plattan bildar en god tätning med packningen. Detta kan oftast lösas tillfälligt genom att lägga en droppe av 5% (w/v) smälta agarosen till den flisa delen av glaset, innan du lägger till den övre kammaren.

9. Visualisera en takt gel

Obs: använder en gel som tänkbar system utrustade med långvågig UV lampor i transilluminator och ett utsläpp filter för kameran som är lämplig för fluorophore, här 530 nm. Alternativt en laserskanner kan också användas, som beskrivs i Goubet 2.

  1. Säkerställa gelen imaging system är dammfritt genom att torka med fuktig luddfri vävnad.
  2. Gelen från PACE tanken, och Visa kort medan gelen är fortfarande i glasplattorna (< 80 ms) att avgöra om färgämne framsidan är fortfarande på gelen.
  3. Öppna gelen med en kil verktyg och gel är fortfarande på en glasskiva, använda en pizza cutter för att gelen både stapling och om färgämne framsidan är fortfarande på gel, botten av gelen.
  4. Sätta ~ 5 mL H 2 O på ytan av transilluminator och sedan överföra gelen direkt på transilluminator. Ange filtret till UV-605, och slå på den långvåg UV-transilluminator (se Tabell för material) med hjälp av programvara.
    Obs: Myror fluorophore används här har excitation/utsläpp av 353/520 nm.
  5. Ta flera bilder med olika exponering gånger (t.ex. 100 ms till 10 s). Säkerställa att UV-ljus är avstängd mellan bilderna genom att klicka på knappen UV ljus (för att stänga av det) för att undvika förnedrande fluorescensen. Se till att minst 2 av bilderna har ingen mättade band (gelen tänkbar mjukvaran kommer att ange detta).
  6. Spara filer som hög-resolution.tif bilder.
    Obs: Bilder kan analyseras med hjälp av programvara som tillhandahålls med gelen imaging system, eller med hjälp av fritt tillgängliga bild analys programvara, såsom ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Se avsnittet resultat för en diskussion kvantifieringsmetoden.

Representative Results

Här visar vi ett exempel takt gel kör per protokollet, tillsammans med beskrivningar att bistå med tolkning av data och felsökning, och detta följs av en allmän guide till framgångsrika tempo gel tolkning13,16. En representativ gel av en standard takt haltbestämning av cellväggen mannan innehåll visas i figur 2, och beskrivs lane av lane.

Standarder
Lanes 1, 2 och 3 visar en stege av kommersiellt tillgängliga oligosackarider (Man1- Man6) 5 (S1), 10 (S2) och 50 (S3) pmol koncentration. När får en ny massa en kommersiell oligosackarid, är det viktigt att kontrollera renhet på en gel. Många oligosackarider, särskilt tetrasacccharides och längre, kan ha betydande förorening med oligosackarider av andra grader av polymerisation (DPs), som visas här för Man6 (markerade med *). Samtidigt quantitating en gel, är det viktigt att ha minst 3 koncentrationer av standarder, eftersom det är nödvändigt för beräkning av standardkurvan. Beräkning av standardkurvan kan också vara till hjälp för att derivatisering reaktionen är i huvudsak vid färdigställande. Standarder för kända koncentrationer göra jämförelser mellan geler, och är en användbar kontroll för separation kvalitet och derivatisering kvalitet.

Positiv kontroll
Lane 4 visar en mannanas matsmältning av konjac glucomannan. Konjak glukomannan är kommersiellt tillgängliga, och samtidigt som den inte har samma struktur som, till exempel i Arabidopsis, det tjänar två syften. För det första är det en viktig kontroll för enzymatisk nedbrytning. Forskaren bör fastställa vad kommersiella substrat rötas med deras GHs val ser ut när rötas till fullbordan (dvs. ett stort överskott av GH läggs till reaktionen). Om i framtiden experiment mönstret ändras, kan detta indikera antingen en förlust av aktivitet eller kontaminering av GH beståndet. För det andra, den fungerar som en kontroll för derivatisering reaktionen i närvaro av enzym och buffert salter. Om normerna ser bra ut, men den positiva kontrollen är dålig, kan då detta tyda på att en komponent av hydrolys reaktionen är hämmande på derivatisering.

Vildtyp (WT) Arabidopsis hejda luft + mannanas cocktail (GH5 + GH26)
Lane 5 visar takt fingeravtrycket av en WT Arabidopsis stam (jämför med referenser11,14).

csla9 Arabidopsis hejda luft + mannanas cocktail (GH5 + GH26)
Lane 6 visar visar takt fingeravtrycket av stammen från en Arabidopsis växt saknar stora hejda mannan syntas11. Jämföra till WT och negativ kontroll fingeravtryck. Medan majoriteten av mannan är frånvarande i denna växt, en liten kvantitet återstår, vilket framgår av de reducera bandet stödnivåerna för alla mannanas-derived oligosackarider detta syntetiseras av ytterligare mannan syntaser (CSLA2, 3)11.

Negativ kontroll - enzym endast
Lane 8 visar band på gel som inte är särskild som härrör från föroreningar i mannanas cocktail och bör undantas från analysen (markerade med *).

Negativ kontroll - endast WT-AIR
Lane 9 visar band på gel som inte är specifik och bör undantas från analysen (markerade med *).

Negativ kontroll- csla9 Endast AIR
Lane 10 visar band på gel som inte är specifik och bör undantas från analysen (markerade med *).

Pine wood luft + mannanas cocktail (GH5 + GH26)
Lane 7 visar takt fingeravtrycket av tallskog, som innehåller galactoglucomannan. Detta har tydligt olika mönster av utgivna oligosackarider till Arabidopsis, på grund av dess olika struktur.

Negativ kontroll - endast furu-AIR
Lane 11 visar band på gel som inte är specifik och bör undantas från analysen (markerade med *).

Tolka en takt gel är relativt enkelt, men kräver medvetenhet om följande punkter. För robusta data rekommenderas det för att utföra takt på minst 3 självständigt växt biologiska replikerar, och det rekommenderas att utföra minst 2 tekniska replikat på varje biologisk replikat. De kontroller som beskrivs är kritisk tolkning, som icke-specifika band behöver uteslutas. Vi rekommenderar också laddar prover i en annan ordning på replikera geler, att utesluta effekter som medföra ojämn belysning av transilluminator. Korrekt tolkning krävs analys av band som inte är mättade. Eftersom vissa oligosackarid fingeravtryck kan innehålla både mycket höga och låga överflöd polysackarider, rekommenderar vi analysera flera exponeringar av samma gel. Standarderna som kan användas för att normalisera mellan olika bilder.

För vissa typer av experiment, kan det vara önskvärt att kvantifiera mängden polysackarid i luften preparatet. Det är möjligt att kvantifiera från en takt gel, det kräver kunskap om den exakta molekylära identiteten av varje oligosackarid släpptes av GHs och där det ligger på TAKTEN gel. Detta är för närvarande inte fullt känt för mannan, men det har fastställts för andra polysackarider t.ex. xylan3. Standarder ger ett sätt att normalisera mellan geler, även när kvantitering inte utförs, och så hjälper alla kvalitativa eller semikvantitativa analyser.

Att identifiera individuella oligosackarider struktur kan uppnås med cocktails av GHs. sekventiell tillägg av ytterligare GHs kan avslöja detaljer om kopplingar och substitutioner av de släppta oligosackarider (t.ex. tillägg av β - 1,4 - glukosidas som agerar på icke-reducerande slutet kommer att avslöja vilken oligosackarider i blandningen innehåller den funktionen). Tillgängliga enzymer inkluderar galactosidases, glucuronidases och glucosidases (se CAZy databasen16 för ytterligare information); Se Hogg, D. et al. 17 som ett exempel.

Protokollet ovan kan användas för att karaktärisera aktiviteten av okänd GHs. I det här fallet bör en definierad biomassa, som Arabidopsis stammen eller konjak glucomannan, användas till skärmen den okända GHs13.

Figure 1
Figur 1 : Detta visar systemet för den fluorescerande derivatisering av oligosackarider med myror. Modifierad från Goubet2.Figure 2
Figur 2 : Representativa takt gel visar mannan fingeravtrycket från Arabidopsis, tall och en Arabidopsis mutant (csla9) som har nedsatt mannan biosyntes. AlR var hydrolyseras med en mannanas cocktail, och de släpptes oligosackarider var derivatized med en fluorophore. Oligosackarider skildes med gelelektrofores på grundval av storlek, form och kostnad. En stege av manno-oligosackarider (Man1-6) visas för att hjälpa till att identifiera relativa mobiliteter av de släppta oligosackarider, och en hydrolys av renat mannan (härlett från konjac) visas som positiv kontroll. * = ospecifika band. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

PACE är en enkel metod för att karaktärisera polysackarid struktur. Den kan användas till alla polysackarid som det finns kända GHs med kännetecknas aktivitet, se många exempel i litteratur1,6,9,11. Tt har också kopplats till karakterisering av romanen GHs12,13,18 och glykosyltransferaser9, genom att utnyttja definierade polysackarid substrat och acceptorer.

Reproducerbara, tolkningsbara resultat är beroende av tre viktiga steg. Först bör till GHs som används vara fri från kontamination med aktiviteter. Detta är bäst uppnås genom att bara använda heterologously uttryckt, affinitet renade enzymer. Andra, för de flesta experiment, det är viktigt att enzymatisk hydrolys av substratesna är vid färdigställande. Detta garanterar att samma biomassa hydrolyseras med samma GH ger samma fingeravtryck i varje experiment. Slutligen bör det finnas ett överskott av fluorophore i derivatisering reaktionen. Detta säkerställer att tillgängliga reducerande ändarna är märkta på nära 100%. Detta kommer att resultera i hög reproducerbarhet av resultat, samt data som är kvantitativa.

Gel och reagens kvalitet är avgörande för att säkerställa reproducerbara data. Dålig kvalitet buffertar, särskilt av felaktiga pH, luftbubblor i gel och prover med ett överskott av salt kan alla påverka upplösning och bibehållande faktor av oligosackarider. Införandet av de rekommenderade kontroller som beskrivs i avsnittet protokoll och resultat kommer dock aktivera felsökning.

TAKT är begränsat av dess förmåga att identifiera oligosackarider. För några experiment är en enkel fingeravtryck allt som behövs. För att verkligen kvantifiera mängden glukomannan i ett prov av luft, exempelvis identiteten hos alla de släppta oligosackarider krävs dock, som är en tidskrävande process. Detta är enklare för mindre komplexa polysackarider såsom xylan3. Eftersom det finns några oligosackarid standarder kommersiellt tillgängliga, kanske det inte alltid är möjligt eller önskvärt att identifiera alla band. I det här fallet kan tempo ge mycket berömmande data till masspektrometri (dvs MALDI-CID9 eller ESI-MS7och NMR6). För dessa metoder är det ofta användbart att göra en omfattande förberedelser, separera med storlek-utslagning kromatografi och sedan analysera varje del av både takt innan MS eller NMR. Samtidigt som det har rapporterats att band kan vara censurerade och identifieras av MALDI-CID, i praktiken har vi funnit att detta har en låg framgång (möjligen på grund av interaktioner av de märkta oligosackarider med akrylamid gelen när den utsätts för UV-ljus).

Den andra stora begränsningen av PACE är genomströmning. För att ha bra kvalitet, tolkningsbara geler med lämpliga kontroller, varje gel har bara ~ 10 experimentprover, och forskare kan räkna med att köra ~ 4 takt gel per dag. Nyligen har en version av tempo med kapillärelektrofores (CE) varit utvecklade19, vilket tillåter beredning av prover med 96 brunnar. Det har använts framgångsrikt att karakterisera glycosyltransferase Enzymaktiviteter och polysackarid strukturer6,19, även om det kräver tillgång till en CE-maskin, som kan vara dyra att köpa och underhålla.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Metoden takt utvecklades och optimerad av olika medlemmar i gruppen Dupree (universitetet i Cambridge, UK) under åren, och vi uppskattar alla sina bidrag. Detta arbete finansierades som en del av DOE gemensamma BioEnergy Institutet (http://www.jbei.org) stöds av U. S. Department of Energy, Office of Science, kontor av biologiska och miljöforskning, genom kontrakt DE-AC02-05CH11231 mellan Lawrence Berkeley National Laboratory och U. S. Department of Energy. Vi tackar också Thea plocka och Vy Ngo för hjälp med att förbereda de csla9 proverna.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligosaccaharide Standards
Mannose Sigma-Aldrich CAS 3458-28-4
Mannobiose Megazyme CAS: 14417-51-7
Mannotriose Megazyme CAS: 28173-52-6
Mannotetraose Megazyme CAS: 51327-76-5
Mannopentaose Megazyme CAS: 70281-35-5
Mannhexaose Megazyme CAS: 70281-36-6
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) Megazyme P-GLCML
Name Company Catalog Number Comments
Other specialty chemicals
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (Molecular probes) Thermo A350
2-picoline borane TCI B3018
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) Bio-rad 1610146
Name Company Catalog Number Comments
Specialty Equipment
Gel casting kit Hoefer SE660 kit 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers
Cooling recirculating water bath  Hoefer RCB20-plus 115v Needs to be able to maintain temperature at ~10 C
G:Box Chemi XRQ Imaging System Syngene 05-GBOX-CHEMI-XRQ Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs
High Voltage Power Pack Thermo EC1000XL 1000V 
Vacuum centrifuge(Speedvac) Savant SPD131
Vertical Gel electrophoresis system Hoefer SE660
Glycosyl hydrolases
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.
Name Company Catalog Number Comments
Lab supplies
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-918
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-951
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gel imaging software ( Genesys) Syngene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224, (1), 163-174 (2006).
  2. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300, (1), 53-68 (2002).
  3. Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
  4. Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, (4), 559-568 (2008).
  5. Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11, (3), 329-337 (2008).
  6. Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83, (3), 413-426 (2015).
  7. Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22, (17), 2723-2730 (2008).
  8. Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171, (4), 2418-2431 (2016).
  9. Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (40), 17409-17414 (2010).
  10. Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109, (3), 989-993 (2012).
  11. Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60, (3), 527-538 (2009).
  12. Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289, (1), 53-64 (2014).
  13. Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
  14. Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218, (1), 27-36 (2003).
  15. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13, (7), 1499-1510 (2001).
  16. The Carbohydrate Active Enzyme Database. www.cazy.org (2017).
  17. Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
  18. Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70, (6), 3609-3617 (2004).
  19. Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics