Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

* These authors contributed equally
Biochemistry
JoVE Journal
Biochemistry
AccessviaTrial
 

Summary

Bir iletişim kuralı tarafından mannan örnek olarak kullanarak Jel Elektroforez (AKPM), polisakkaritler yapısal analizi için tanımlanır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pidatala, V. R., Mahboubi, A., Mortimer, J. C. Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE. J. Vis. Exp. (128), e56424, doi:10.3791/56424 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bitki hücre duvarı polisakkaritler analiz Rootkitler zordur ve çoğu yöntem pahalı donanımları, vasıflı operatörler ve arıtılmış malzeme büyük miktarda gerektirir. İşte, biz basit bir tarif yöntemi kazanıyor için ayrıntılı polisakkarit yapısal bilgi, yapısal İzomerler çözünürlüğü de dahil olmak üzere. Jel Elektroforez (AKPM) tarafından polisakkarit analiz için bitki hücre duvarı malzeme ile glikosil Hidrolazlar faiz (Örneğin, mannanases için mannan) polisakkarit özgü hidrolize. Geniş format polyacrylamide jeller daha sonra fluorescently etiketli yayımlanan oligosakkaritler ayırmak için kullanılır. Jelleri görüntüleme sistemi değiştirilmiş bir jel ile görüntülenir (bkz. Tablo malzeme). Elde edilen oligosakkarit parmak izi de niteliksel veya, ile çoğaltma, kantitatif karşılaştırılabilir. Bağlantı ve dallanma bilgi ek glikosil Hidrolazlar (Örneğin, mannosidases ve galactosidases) kullanılarak oluşturulabilir. Bu iletişim kuralı glucomannan yapısı analiz etmek için bir yöntem açıklanır iken, hangi için karakterize glikosil Hidrolazlar var herhangi bir polisakkarit uygulanabilir. Alternatif olarak, tanımlanmış polisakkarit yüzeylerde kullanarak roman glikosil Hidrolazlar karakterize etmek için kullanılabilir.

Introduction

Jel Elektroforez (AKPM) göre polisakkarit analiz polisakkaritler1,2,3detaylı karakterizasyonu için bir yöntemdir. Bitki hücre duvarı polisakkaritler analiz Rootkitler zordur ve çoğu yöntem pahalı donanımları, vasıflı operatörler ve arıtılmış malzeme büyük miktarda gerektirir. İşte, biz basit bir tarif yöntemi kazanıyor için ayrıntılı polisakkarit yapısal bilgi, yapısal İzomerler çözünürlüğü de dahil olmak üzere.

Anlayış bitki hücre duvarı polisakkarit yapısı bitki hücre duvarı sentezi veya bitki hücre duvarı bitki gelişiminde rolü keşfetmek bu araştırmacılar için gereklidir. Son zamanlarda, ancak, bitki hücre duvarı kompozisyon için daha geniş bir grup araştırmacı biyoyakıt ve biochemicals4üretmek için bir hammadde bitki biyokütle (aslında hücre duvarı) kullanarak odak nedeniyle ilginç olmuştur. Böylece en iyi duruma getirilmiş enzimatik kokteyller seçilen5örnek olarak, bu malzemenin verimli enzimatik saccharification polisakkarit yapılarının ayrıntılı bir anlayış gerektirir.

HIZI karmaşık glycan yapıları hızlı analiz için ideal hale alternatif yöntemler birçok avantajı vardır. İlk olarak, çözüm Devlet Nükleer manyetik rezonans (NMR)6için gerekli olduğu gibi söz konusu, polisakkarit arıtma gerektirmez. İkinci olarak, PACE kütle spektrometresi aksine yapısal İzomerler çözümlemek için (MS, matris yoluyla Örneğin, lazer desorpsiyon/iyonlaşma (maldı) ve electrospray iyonlaşma (ESI)), hangi de zor sıvı Kromatografi (LC) gerçekleştirmek için 7. üçüncü olarak, hızı çok hassas, ince katmanlı Kromatografi (TLC) veya kağıt Kromatografi aksine düşük-picomole çözünürlük ile. Son olarak, MS, NMR ve LC için olduğu gibi pahalı ekipman veya uzman bilgi gerektirmez.

Polisakkaritler karışımı glycosidic belirli bağlantıları hedef glikosil hidrolaz (GH) enzimler özgüllük hızı yöntemi kullanır. GH enzim polisakkarit zinciri davrandığında, sonra kimyasal olarak, bu durumda bir floresan etiket ile derivatized bir azalan bakiyeli sonunda ortaya koymaktadır. Örnek unhydrolyzed bölümünü bu nedenle saptanamayan bu yöntemi tarafından işlenir. Etiketli oligosakkaritler sonra bir geniş formatlı Akrilamid Jel Elektroforez tarafından ayrılır. Bu çok benzer moleküllerin mükemmel çözünürlük verir, örneğin, farklı bir RfGlc-Man-Man ve Glc-adam-Glc trisaccharides olacaktır.

PACE kapsamlı farklı xylan yapıları arasında bitki tür8, Arabidopsis6,9,10,11 glycosyltransferase mutantlar tanımlamak için karakterize etmek için kullanılmıştır , glycosyltransferase deneyleri9gerçekleştirmek için ve roman GH faaliyetleri12,13karakterize etmek için. Biz de Geçenlerde Maya hücre duvarı mannan (Mahboubi ve Mortimer, hazırlık) karakterize etmek için kullandık. Burada bitki hücre duvarı glucomannan yapısı, önceki raporlar11,14tarihinde dayalı karakterize bir yöntem açıklanmaktadır.

Protocol

1. hasat in bitki maddi

  1. hasat taze bitki materyali (~ 20 mg) ve % 96'sı (v/v) etanol daldırın ve hemen 30 dk 70 ° C'de kuluçkaya; Bu enzimler mevcut aşağılayıcı herhangi bir hücre duvarı devre dışı bırakır. Kuru malzeme için başlamak vasıl adım 2.
    Dikkat: Etanol yanıcı.
    Not: Tek bir kök veya rozet yaprak analiz için yeterli malzeme sağlar. Ancak, daha büyük bir miktar doku havuza alınmış ve bu tartmak ve işlemek daha kolay olduğu analiz daha az sayıda hataları ortaya.
  2. Dikkatle doku türünü kaydedin ve gelişimsel sahne, polisakkarit yapısı olarak her ikisi ile değişir. Örneğin, Arabidopsis thaliana ile (kullanılan burada), doku Boyes vd metotlarından göre sahne 15
    Not: Bu protokol için biz nerede ilk silique tam olarak değil ama sararma elongated önümüzdeki kök alt yarısını kullandık.

2. hazırlık, alkol çözünmez kalıntı (Hava)

  1. hazırla hava, tabi belgili tanımlık yöntem Mortimer vd. 9 veya çözünür şekerler, sukroz ve nişasta gibi eksik bir toz üretmek için başka bir benzer yöntem.

3. Aliquoting ve hava ön arıtma

Not: tam olarak her örnek malzeme ilgi polisakkarit ve (b) tarafından yayımlanan oligosakkaritler ortalama boyutu (a) ve bereket üzerine bağlıdır için gerekli hava miktarı GH. Deneme duyarlılığını oligosakkaritler belirler yani yöntemi tek bir floresan molekül her oligosakkarit azalan bakiyeli sonuna ekler. GH11 ile sindirilmiş Arabidopsis kök içinde xylan için 100 µg Mortimer olduğu gibi tavsiye edilir, ancak bir kılavuz olarak, glucomannan Arabidopsis kök (açıklandığı gibi) GH5/GH26 ile sindirmek için 500 µg 11, tavsiye edilir ' s çalışma 3.

  1. 15 mL santrifüj tüpüne hava (10-15 mg) tartmak ve H 2 O 2 mg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hatta bir süspansiyon ulaşmak için girdap. Bu sorunlu ise, o zaman bu işlem yardımcı olmak için bir cam homogenizer kullanın.
  2. Aliquot 500 µg microfuge içine tüpler. Kuru vakum santrifüj kullanarak aliquots (Tablo reçetesi görmek) gecede 30 ° c
  3. Öncesi tedavi Hava 1 M NaOH ile (20 µL) oda sıcaklığında; 1 h için bu polisakkaritler de-acetylates ve biyokütle yapısını bozmakta ve GH erişim sağlayan selüloz microfibrils şişer.
    Not: Bu adım-ebilmek var olmak Kaptan için saflaştırılmış polisakkaritler. DİKKAT – güçlü asit/baz.
    1. Bir aliquot için bir Hayır-enzim hava kontrol dahil (aynı adım 4.1 hariç tüm örnekleri işlenir. söz konusu değildir).
  4. 200 eklemek µL H 2 O ve 20 µL 1 M HCl nötralize etmek için. PH 1 µL çıkarıp kağıt pH göstergesi şeritler lekelenme ~ 6-7 arasındadır testi.
  5. Ekle 50 µL 1 M amonyum asetat arabellek, pH 6.0 (veya hangisi pH çalışmada kullanılan GHs için uygundur) ve toplam hacmi 500 µL vermek H 2 O.
    Not: Amonyum asetat kurutma üzerine sublimes bu yana ve bu örnek için ek tuz eklemek değil bu yüzden kullanılır. Aşırı tuz PACE jel üzerinde yoksul grubu-şekli ve çözünürlük yol açabilir.

4. Hidroliz ile glikosil Hidrolazlar (GHs) hava

Not: tartışmaya belirtildiği gibi GHs Saflık önemlidir. Tek kullanım, heterologously ifade benzeşme enzimler saf. Üreticinin her yerinden aldıktan sonra bir gecede GH miktarda artan substrat (Örneğin, 500 µg hava) tanımlanmış aliquots hidrolize (Örneğin, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20 µL) (3 adet/µL). GH aşırı zaman PACE parmak izi özdeş arayacaktır. Enzim aşırı hidroliz reaksiyonu bitiş noktası yaklaşıyor emin olmalıyız çünkü bir tekrarlanabilir sonuçlar elde gereklidir.

  1. Ekle bir önceden belirlenmiş miktar (yukarı bakın) mannanases (GH5 ve GH26 11) hava aliquots arabelleği için adım 3.5, aynı zamanda olumlu bir denetim (konjac glucomannan 30 µg) ve bir no-hava negatif kontrol (enzim karışımı bir boş tüp). Girdap ve kısa bir süre tepki karışım tüp alt toplamak için sonra döndür.
  2. Kuluçkaya gecede 37 ° C (ya da seçim GH için uygun sıcaklık) nazik ajitasyon (~ 100 rpm).
  3. 20 dakika süreyle 95 ° C'de kuluçka tarafından tepki durdurmak
    Not: Cap kilitler kaldırılarak açılan microfuge tüpler mühürlemek için kullanılabilir.
    1. Bir tezgah üst microfuge maksimum hızda 10 dakikadır kullanarak santrifüj kapasitesi ve süpernatant korumak.
  4. Resuspend Pelet 250 µL H 2 O, yukarıdaki gibi santrifüj ve süpernatant korumak.
  5. Her iki supernatants birleştirmek ve bir vakum santrifüje kuru (Tablo reçetesi görmek) 30 ° c (~ 3 h ya da gece Isıtma olmadan).

5. Oligosakkarit standartların hazırlanması

  1. hazırla 1 mM hisse senedi çözümleri H 2 O mannoz (adam), mannobiose (Man 2), mannotriose (Man 3), mannotetraose (Man 4), mannopentaose (adam 5) ve mannohexaose (adam 6), tüm β, 1-4 bağlantılı. Aliquot ve mağaza-20 ° c kadar gerekli.
  2. Bir adam 3 farklı konsantrasyonlarda 1 µL (Standart S1), 2 µL (S2) birleştirerek 1-6 karışım hazırlamak veya tüm altı 5 µL (S3).
  3. Kuru vakum santrifüj (Tablo malzemeleri görmek) 30 ° C'de (~ 1 h).

6. Oligosakkaritler Derivitization

  1. hazırla 0.2 M karıncalar (8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic asit) H 2 O hisse senedi bir çözüm: Asetik asit 17:3. Katı tamamen erimesi için 60 ° c sıcak hisse senedi. Mağaza için 2-3 ay ışığı, korumalı-20 ° C'de.
  2. 2-picoline borane (2-PB) DMSO 0.2 M stok çözeltisi hazırlamak. Bu son derece higroskopik, öyle hemen DMSO içinde aldıktan sonra tüm toz resuspend. Aliquot ve mağaza-20 ° c 1-2 yıldır. Gerekli (2 hafta ve o zaman silmek için 4 ° C'de deposu) olarak aliquots çözülme.
  3. H 2 O derivatization arabellek hazırlamak: Asetik asit: DMSO 17:3:20.
  4. Karıncalar, 2-PB ve 10 µL derivatization arabelleği 5 µL 5 µL eklemek, her örnek için
  5. . Kısaca tüp alt toplamak için Döndür girdap iyice ve sonra kısa bir süre tekrar döndürün. Reaksiyon açıklaması için bkz: şekil 1.
  6. Incubate örnekleri gecede ışıktan korunan 37 ° C'de.
  7. Kuru vakum santrifüj (Tablo malzemeleri görmek) 30 ° C'de (~ 2 h).
  8. Resuspend örnekleri ve standart 100 µL 3 M üre. Gerekli kadar ışıktan korunan-20 ° C'de mağaza.

7. PACE hazırlanması jelleri

Not: jel döküm donanımları Meclisi marka bağlı olacaktır. Burada, biz use bir Dikey Elektroforez Sistemi (bakınız Tablo malzemeler), donanımlı 18 cm x 24 cm cam plakanın ve 1.5 mm boşluk ekleyiciler.

  1. Jel döküm donanımları üretici başına bir araya ' s yönergeleri.
  2. Olun 10 x hızı arabellek (1 M Tris-Bor, pH 8.2) aşağıdaki gibi: 121.14 g Tris-baz ~ 400 mL H 2 O ve çözülmeye karışımı ekleyin. PH 8.2 için buna ek olarak katı Borik asit (yaklaşık 60 g) tarafından ayarlamak ve 1 birim görünmesini sağlamak L.
  3. % 10 (w/v) amonyum persülfat (APS) hisse senedi H 2 içinde O. Aliquot olun ve saklamak-20 ° c tezcan aliquots bir kez, mağaza 4 ° C'de ve 2 hafta sonra atın.
  4. Olun ve çözme jel dökmek. Yukarıdaki donatımı 1 jel 50 mL eşit. 50 mL santrifüj tüpü H 2 O (20.2 mL), 5 mL 10 x hızı arabellek, 24.6 mL % 40 Akrilamid/Bis-Akrilamid (29:1 acrylamide:Bis) karıştırın. (Uyarı: toksik).
    1. 200 µL APS ve 20 µL N, N, N, N´-tetramethyl-ethylenediamine (TEMED) ekleyin. (Hava kabarcıkları tanıtımı önlemek için) karışımı yavaşça tersine çevirin. Dökmek bir serolojik kullanarak jel veya ~ 4 cm cam plakanın üst altındaki diğer büyük hacimli pipet. Hava kabarcıkları jel içinde kapana olasılığı dikkat edin. Onlar yapmak, dökme durdurmak ve tilt/onları serbest bırakmak için jel dokunun eğer.
  5. İsopropanol (dikkat : yanıcı) ile ya da dikkatle, H 2 (20-30 dakika) polimerize, sonra üst tabaka dökmek için O. izin ver jel ile jel kaplama. İsopropanol kullandıysanız, 2 x H 2 O. kuru ile Bloting kağıt kullanarak herhangi bir aşırı sıvı yıkayın.
  6. Yapmak ve yığın jel dökmek. Mix 6.8 mL H 2 O, 1 mL 10 x hızı arabellek, 2,8 mL Akrilamid/Bis-Akrilamid (dikkat: zehirli), 80 µL APS ve TEMED 8 µL 15 mL santrifüj tüpü içinde. Karıştırmak için ters çevir ve üstüne polimerli çözme jel yerleşimi. Yavaşça taraklar, bindirme hava kabarcıkları tarak dişleri altında kaçınarak takın.
  7. İzin ver jel (20-30 dk), polimerize şal nemli dokusu ve sonra plastik wrap ve gerekli kadar 4 ° C de saklayın. Tarak yerde mağaza.
    Not: (daha az 1 hafta ideal olsa da) jeller en fazla 2 hafta için saklanabilir, nemli tutulursa.

8. Bir hızda çalışan jel

  1. Yükleme sipariş takip içinde yardımcı olacak, cam üzerinde iyi pozisyonlar etiketlemek için kalıcı bir kalem kullanın ve tarak kaldırılır bir kez nerede teşhis etmek için kuyu vardır.
  2. Tarak kaldırın. Kuyuları ile 1 x hızı tampon doldurun.
  3. 10 µL microsyringe standartları ve örnekler 2 µL kuyu yüklemek için kullanın. Kötü örnekleri çalıştırmak eğilimindedir en dıştaki şerit kullanmaktan kaçının.
  4. Jel çalışan cihaz üst TMMOB montaj ve 1 x hızı arabellek içeren jel bir su tankında soğutmalı (~ 10 ° C) çalışan (10 ° C) yerleştirin. Üst odası ile 1 x hızı tampon doldurun.
  5. Güç ve koşmak vasıl 200 V jel (Sabit V) için açın 30 ortaçağ halk ozanı ve artış voltaj 1000 V 1 saat 40 dakika için. Işık (tanklar siyah çöp torbaları sarma tarafından Örneğin,) jeller korumak.
    Not: jelleri ~ 5 dk voltaj açma ve daha sonra başka bir 5 dakika sonra 1000 V gerilim artan sonra kontrol edin. O zaman büyük olasılıkla bir arabellek sızıntı gerilim korumak güç paketi eğer. Jel tankından kaldırın. Dikkatle tüm contalar yerleşimini kontrol üst odası yeniden monte. Büyük bir çip üst kenarına cam levha şekillendirme conta ile iyi bir mühür plaka engelleyebilir. Bu genellikle geçici olarak üst odası eklemeden önce bir damla % 5 (w/v) erimiş özel cam kırık parçası ekleyerek çözülebilir.

9. PACE jel görselleştirme

Not: görüntüleme sistemi uzun dalga UV ampul transilluminator ve fluorophore için burada 530 nm uygun kamera için bir emisyon filtre ile donatılmış bir jel kullanımı. Alternatif olarak, bir lazer tarayıcı da, Goubet 2 ' de açıklandığı gibi kullanılabilir.

  1. Görüntüleme sistemi jel nemli hav bırakmayan dokusu ile silerek toz ücretsiz olduğundan emin olun.
  2. Jel PACE tankından kaldırmak ve jel hala cam levhalar yaylıdır iken kısaca görüntüleyin (< 80 ms) boya açık hala üzerinde jel olup olmadığını belirlemek için.
  3. Jel bir kama aracını kullanarak açın ve jel hala bir cam levha üzerinde iken, bir pizza kesici her iki yığın jel kaldırmak için kullanın ve boya açık hala jel, jel dibinde ise.
  4. ~ 5 mL H 2 O transilluminator yüzeyine koymak ve sonra jel transilluminator doğrudan üzerine aktarın. UV 605 için filtre ayarlamak ve görevindeydiler UV transilluminator açın (bkz. Tablo reçetesi) yazılımını kullanarak.
    Not: Burada kullanılan KARINCALAR fluorophore uyarma/salma, 353/520 vardır nm.
  5. Çeşitli pozlama zamanlarda birkaç görüntü almak (Örneğin, 100 ms 10 s). UV ışık Floresans düşürmesini önlemek için (devre dışı bırakmak) UV ışık düğmesini tıklatarak görüntü arasında kapalı olduğundan emin olun. En az 2 görüntüleri yok doymuş bantları (jel görüntüleme yazılımı bu belirtmek) olduğundan emin olun.
  6. Yüksek resolution.tif görüntü olarak dosyaları kaydet.
    Not: Resim görüntüleme sistemi jel ile veya ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) gibi serbestçe kullanılabilir görüntü analiz yazılımı kullanarak sağlanan yazılımı kullanılarak analiz edilebilir. Nefelometri tartışılması için sonuçlar bölümüne bakın.

Representative Results

Burada, her iletişim kuralı veri yorumu ve sorun giderme yardımcı olmak için açıklamaları ile birlikte çalıştırmak bir örnek hızı jel göstermek ve bu başarılı jel yorumu13,16hızı için genel bir kılavuz tarafından takip ediyor. Temsil edici bir jel standart bir hızda tahlil hücre duvarı mannan içerik Şekil 2' de gösterilen ve lane lane tarafından tanımlanır.

Standartları
Şerit 1, 2 ve 3 ticari olarak satın alınan oligosakkaritler (adam1- adam6) 5 (S1), 10 (S2) ve 50 (S3) pmol konsantrasyon merdivenden göster. Bir ticari oligosakkarit yeni bir sürü alınırken, saflık bir jel üzerinde kontrol etmek önemlidir. Birçok oligosakkaritler, özellikle tetrasacccharides ve artık, oligosakkaritler polimerizasyon (DPs), diğer derece ile önemli kirlilik adam6 için aşağıda gösterildiği gibi olabilir (ile işaretlenmiş *). Bir jel quantitating süre, standart eğri hesaplamak için gerekli olduğundan standartları, en az 3 konsantrasyonları olması önemlidir. Standart eğri hesaplanması da derivatization reaksiyon aslında sonunda sağlamak için yardımcı olabilir. Bilinen konsantrasyonları standartlarının jelleri arasında karşılaştırmalar izin ve ayrılık kalite ve derivatization kalitesi için yararlı bir denetim vardır.

Pozitif kontrol
Lane 4 konjac glucomannan bir mannanase hazım gösterir. Konjac glucomannan ticari olarak kullanılabilir ve bu aynı yapıya sahip değil iken, örneğin, Arabidopsis içinde bulunan bu iki amaca hizmet eder. İlk olarak, Enzimatik sindirim için önemli bir denetimdir. Araştırmacı seçim onların GHs ile sindirilmiş bir ticari substrat (GH geniş bir fazlalığı için tepki eklenirYani ) tamamlanması için sindirmek zaman nasıl göründüğünü oluşturmanız gerekir. Gelecekte deneyler desen değişirse, bu etkinlik kaybı ya da kirlenme GH stok göstergesi olabilir. İkinci olarak, bir denetim için enzim ve tampon tuzları huzurunda derivatization tepki olarak hizmet vermektedir. Standartlara bakmak iyi, ama olumlu denetim kötüdür, bu bir bileşeni olan hidroliz reaksiyonu derivatization için inhibitör olduğunu gösterebilir.

Vahşi türü (WT) Arabidopsis kök hava + mannanase kokteyl (GH5 + GH26)
Lane 5 PACE parmak izi WT Arabidopsis kök (başvurular11,14ile karşılaştırın) gösterir.

csla9 Arabidopsis kök hava + mannanase kokteyl (GH5 + GH26)
Lane 6 ayak parmak izi bir Arabidopsis kök bitki Binbaşı eksik gösterir mannan synthase11kök göstermektedir. WT ve negatif kontrol için parmak izlerini karşılaştır. Mannan çoğunluğu yok iken bu bitki, küçük bir miktar bu ek mannan synthases (CSLA2, 3) tarafından sentezlenen tüm mannanase elde edilen oligosakkaritler için azaltılmış bant yoğunluklarda kanıtladığı gibi kalır,11.

Negatif kontrol - sadece enzim
Lane 8 gösterir bantları olmayan jel kirletici mannanase kokteyl olarak türetmek ve analizinden dışlanması gereken özel (ile işaretlenmiş *).

Negatif kontrol - WT hava sadece
Lane 9 bantları belirli olmayan ve analizinden çıkarılmalıdır jel üzerinde gösterir (ile işaretlenmiş *).

Negatif kontrol- csla9 Yalnızca AIR
Lane 10 belirli olmayan ve analizinden çıkarılmalıdır jel üzerinde bantları gösterir (ile işaretlenmiş *).

Çam ahşap hava + mannanase kokteyl (GH5 + GH26)
Lane 7 galactoglucomannan içeren çam ahşap ayak parmak izi gösterir. Bu açıkça farklı yapısı nedeniyle yayımlanan oligosakkaritler Arabidopsis için farklı bir model vardır.

Negatif kontrol - çam AIR sadece
Lane 11 bantları belirli olmayan ve analizinden çıkarılmalıdır jel üzerinde gösterir (ile işaretlenmiş *).

PACE jel yorumlama nispeten basit ama aşağıdaki noktaları bilinci gerektirir. Sağlam veri için yapmak en az 3 bağımsız olarak biyolojik yetiştirilen HIZINA çoğaltır ve en az 2 teknik çoğaltır biyolojik her çoğaltma gerçekleştirmek için önerilir tavsiye edilir. Dışlanacak belirsiz bantları ihtiyaç olarak açıklanan denetimleri yorumu için kritik öneme sahiptir. Ayrıca örnekleri transilluminator düzensiz aydınlatma sonucu etkileri dışlamak için farklı bir sırada Çoğalt jelleri üzerinde yükleme öneririz. Doğru yorumu değil doygun bantları analiz gerektirir. Bazı oligosakkarit parmak her iki çok yüksek ve düşük bereket polisakkaritler içeriyor olabilir beri aynı jel birden çok pozlamayı analiz öneririz. Standartları farklı görüntüler arasında normalleştirmek için kullanılabilir.

Deneyler bazı türleri için hava hazırlık polisakkarit miktarını ölçmek istenebilir. PACE jel ölçmek mümkündür GHs tarafından yayımlanan her oligosakkarit tam moleküler kimlik bilgisi gerektirir ve hızı jel nerede üzerinde yer almaktadır. Bu şu anda tam olarak mannan için bilinmemektedir, ancak diğer polisakkaritler xylan örneğin 3için belirlenmiştir. Standartları bile Nefelometri değil gerçekleştirilmekte ve herhangi bir nitel veya yarı kantitatif analiz yardımcı olacaktır bu yüzden jelleri arasında normalleştirme için bir yol sağlar.

Bireysel oligosakkaritler yapısını tanımlayan elde edilebilir kokteyller kullanarak GHs. ardıl bağlantılar ve serbest bırakılan oligosakkaritler (mesela Ayrıca β - 1,4 - oyuncu değişikliği hakkında ayrıntılı bilgi daha fazla GHs ilavesi ortaya çıkarabilir Bu özelliği hangi oligosakkaritler karışımı içeren eylemleri sigara azaltarak ucunda ortaya glucosidase). Kullanılabilir enzimler galactosidases, glucuronidases ve glucosidases (bkz. ek bilgi çıIgının veritabanı16 ) Hogg, D. ve ark. görmek 17 bir örnek olarak.

Yukarıdaki Protokolü bilinmeyen GHs etkinlik karakterize etmek için kullanılabilir. Bu durumda, Arabidopsis kök veya konjac glucomannan gibi tanımlanmış bir biyokütle bilinmeyen GHs13ekran için kullanılmalıdır.

Figure 1
Resim 1 : Bu oligosakkaritler KARINCALAR ile floresan derivatization için şeması gösterir. Goubet2' den değiştiren. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Temsilcisi PACE jel Arabidopsis, çam ve bir Arabidopsis mutant mannan parmak izi gösteren (csla9) hangi mannan biyosentezi bozukluğu olan. AlR bir mannanase kokteyl hidrolize ve yayımlanan oligosakkaritler bir fluorophore ile derivatized. Oligosakkaritler Jel Elektroforez boyutu, şekli ve ücret temelinde ayrı kaldık. Merdivenden manno-oligosakkaritler (Man1-6) yayımlanan oligosakkaritler göreli mobilities belirlenmesinde yardımcı olmak için gösterilir ve arıtılmış mannan (konjac türetilmiş) hidroliz olumlu bir denetim olarak gösterilir. * belirsiz bantları =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

PACE polisakkarit yapısı karakterize için basit bir yöntemdir. Bu uygulanabilir kendisi için orada bilinen GHs karakterize aktivite ile herhangi bir polisakkarit için edebiyat1,6,9,11' deki çok sayıda örneklere bakın. TT de uygulanmış yeni GHs12,13,18 ve glycosyltransferases9, karakterizasyonu yararlanarak tanımlanmış polisakkarit yüzeylerde ve alıcısı.

Tekrarlanabilir, yorumlanabilir sonuçları üç önemli adımlar üzerinde bağlıdır. İlk olarak, kullanılan GHs faaliyetleri kirletici özgür olmalıdır. Bu en iyisi sadece heterologously ifade kullanılarak elde, benzeşim enzimler saf. İkincisi, çoğu deneyler için bu yüzeylerde enzimatik hidroliz işlemi tamamlandığında ne önemli 's. Bu aynı biyokütle ile aynı GH hidrolize her deneyde aynı parmak izi verir garanti eder. Son olarak, fluorophore derivatization tepki aşırı olmalıdır. Bu mevcut azalan bakiyeli biter, % 100 yakın etiketli ki sağlar. Bu sonuçlar, hem de nicel veriler yüksek tekrarlanabilirlik neden olur.

Jel ve reaktif kalite tekrarlanabilir veri sağlayarak için kritik. Kalitesiz arabellekleri, özellikle yanlış pH, jel kabarcıkları hava ve aşırı tuz örnekleriyle oligosakkaritler tüm etkiler çözünürlük ve saklama faktör olabilir. Ancak, iletişim kuralı ve sonuçları bölümünde açıklanan önerilen denetimleri dahil sorun giderme sağlar.

PACE oligosakkaritler tanımlama yeteneği onun tarafından sınırlıdır. Bazı deneyler için gerekli olan basit bir parmak izi var. Ancak, gerçekten glucomannan hava bir örnek miktarı quantitate için örneğin, serbest bırakılmış oligosakkaritler kimlik gereklidir hangi zaman alan bir süreçtir. Bu daha doğru sözlü için daha az xylan3gibi karmaşık polisakkaritler. Piyasada bulunan birkaç oligosakkarit standartları olduğundan, bu her zaman mümkün veya tüm gruplar tanımlamak için uygun olmayabilir. Bu durumda, PACE kütle spektrometresi (Yani, maldı-CID9 veya ESI-MS7ve NMR6) için pek iltifat veri sağlayabilir. Bu yöntemler için büyük ölçekli bir hazırlık yapmak, boyut-dışlama Kromatografi tarafından ayırın ve her kısmı MS veya NMR önce her iki PACE tarafından çözümlemek yararlıdır. Bu bantları çıkardım ve maldı-CID tarafından tanımlanan bildirilmiştir iken, pratikte bu (muhtemelen nedeniyle etiketli oligosakkaritler etkileşimlerin UV ışığına maruz kaldığında Akrilamid jel ile) başarı oranı düşük olan biz bulduk.

Diğer büyük hızı üretilen iş kısıtlamasıdır. İyi kalite, uygun denetimleri ile yorumlanabilir jeller için her jel sadece ~ 10 deneysel örnekleri olacak ve bir araştırmacı ~ 4 PACE jelleri günlük çalıştırmak bekleyebilirsiniz. Kapiler Elektroforez (CE) kullanarak hızı bir sürümünü 96-şey levha örnekleri hazırlanması sağlayan gelişmiş19, zamanlarda. Satın alma ve korumak için pahalı olabilir bir CE makineye erişimi gerektirir, ancak başarıyla glycosyltransferase enzim aktiviteleri ve polisakkarit yapıları6,19, karakterize etmek için kullanılmıştır.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

PACE yöntem geliştirilmiş ve yıllar içinde çeşitli grubunun üyeleri, Dupree (Cambridge Üniversitesi, İngiltere) tarafından en iyi duruma getirilmiş ve onların katkıları için teşekkür ederiz. Bu eser Lawrence arasında sözleşme DE-AC02-05CH11231 aracılığıyla ABD Enerji Bakanlığı, bilim Office, Office biyolojik ve çevresel araştırma, tarafından desteklenen DOE ortak biyoenerji Enstitüsü (http://www.jbei.org) bir parçası olarak finanse edildi Berkeley Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı. Biz de Thea çekme ve Vy sivil toplum örgütü csla9 örnekleri hazırlama konusunda yardım için teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Oligosaccaharide Standards
Mannose Sigma-Aldrich CAS 3458-28-4
Mannobiose Megazyme CAS: 14417-51-7
Mannotriose Megazyme CAS: 28173-52-6
Mannotetraose Megazyme CAS: 51327-76-5
Mannopentaose Megazyme CAS: 70281-35-5
Mannhexaose Megazyme CAS: 70281-36-6
Glucomannan (Konjac; Low Viscosity) Megazyme P-GLCML
Name Company Catalog Number Comments
Other specialty chemicals
8-Aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (Molecular probes) Thermo A350
2-picoline borane TCI B3018
40 % acrylamide/Bis-acrylamide (29:1 acrylamide:Bis) Bio-rad 1610146
Name Company Catalog Number Comments
Specialty Equipment
Gel casting kit Hoefer SE660 kit 18x24 cm glass plates, 0.75 mm spacers
Cooling recirculating water bath  Hoefer RCB20-plus 115v Needs to be able to maintain temperature at ~10 C
G:Box Chemi XRQ Imaging System Syngene 05-GBOX-CHEMI-XRQ Order with filters appropriate to fluorphore, and transilluminator should be fitted with long-wave UV light bulbs
High Voltage Power Pack Thermo EC1000XL 1000V 
Vacuum centrifuge(Speedvac) Savant SPD131
Vertical Gel electrophoresis system Hoefer SE660
Glycosyl hydrolases
These can be obtained from companies e.g. Megazyme (https://www.megazyme.com/) or Prozomix (http://www.prozomix.com/), or can be expressed in house by requesting the plasmid from the relevant research group.
Name Company Catalog Number Comments
Lab supplies
15 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-918
50 ml Centrifuge tube ( Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning) VWR 21008-951
Name Company Catalog Number Comments
Software
Gel imaging software ( Genesys) Syngene

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barton, C. J., et al. Enzymatic fingerprinting of Arabidopsis pectic polysaccharides using polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE). Planta. 224, (1), 163-174 (2006).
  2. Goubet, F., Jackson, P., Deery, M. J., Dupree, P. Polysaccharide analysis using carbohydrate gel electrophoresis: A method to study plant cell wall polysaccharides and polysaccharide hydrolases. Anal Biochem. 300, (1), 53-68 (2002).
  3. Mortimer, J. C. Structural Analysis of Cell Wall Polysaccharides Using PACE. Methods Mol Biol. 1544, 223-231 (2017).
  4. Pauly, M., Keegstra, K. Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels. Plant J. 54, (4), 559-568 (2008).
  5. Lopez-Casado, G., Urbanowicz, B. R., Damasceno, C. M., Rose, J. K. Plant glycosyl hydrolases and biofuels: a natural marriage. Curr Opin Plant Biol. 11, (3), 329-337 (2008).
  6. Mortimer, J. C., et al. An unusual xylan in Arabidopsis primary cell walls is synthesised by GUX3, IRX9L, IRX10L and IRX14. Plant J. 83, (3), 413-426 (2015).
  7. Ridlova, G., Mortimer, J. C., Maslen, S. L., Dupree, P., Stephens, E. Oligosaccharide relative quantitation using isotope tagging and normal-phase liquid chromatography/mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom. 22, (17), 2723-2730 (2008).
  8. Busse-Wicher, M., et al. Evolution of Xylan Substitution Patterns in Gymnosperms and Angiosperms: Implications for Xylan Interaction with Cellulose. Plant Physiol. 171, (4), 2418-2431 (2016).
  9. Mortimer, J., et al. Absence of branches from xylan in Arabidopsis gux mutants reveals potential for simplification of lignocellulosic biomass. Proc Nat Acad Sci USA. 107, (40), 17409-17414 (2010).
  10. Anders, N., et al. Glycosyl transferases in family 61 mediate arabinofuranosyl transfer onto xylan in grasses. Proc Nat Acad Sci USA. 109, (3), 989-993 (2012).
  11. Goubet, F., et al. Cell wall glucomannan in Arabidopsis is synthesised by CSLA glycosyltransferases, and influences the progression of embryogenesis. Plant J. 60, (3), 527-538 (2009).
  12. Rogowski, A., et al. Evidence That GH115 alpha-Glucuronidase Activity, Which Is Required to Degrade Plant Biomass, Is Dependent on Conformational Flexibility. J Biol Chem. 289, (1), 53-64 (2014).
  13. Rogowski, A., et al. Glycan complexity dictates microbial resource allocation in the large intestine. Nat Commun. 6, 7481 (2015).
  14. Handford, M. G., et al. Localisation and characterisation of cell wall mannan polysaccharides in Arabidopsis thaliana. Planta. 218, (1), 27-36 (2003).
  15. Boyes, D. C., et al. Growth stage-based phenotypic analysis of Arabidopsis: a model for high throughput functional genomics in plants. Plant Cell. 13, (7), 1499-1510 (2001).
  16. The Carbohydrate Active Enzyme Database. www.cazy.org (2017).
  17. Hogg, D., et al. The modular architecture of Cellvibrio japonicus mannanases in glycoside hydrolase families 5 and 26 points to differences in their role in mannan degradation. Biochem J. 371, (Pt 3) 1027-1043 (2003).
  18. Brennan, Y., et al. Unusual microbial xylanases from insect guts. Appl Environ Microbiol. 70, (6), 3609-3617 (2004).
  19. Li, X., et al. Development and application of a high throughput carbohydrate profiling technique for analyzing plant cell wall polysaccharides and carbohydrate active enzymes. Biotechnol Biofuels. 6, (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics