שיטות ניתוח ההשפעות של אורניום טבעי על במבחנה Osteoclastogenesis

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

אורניום ידוע להשפיע על מטבוליזם העצם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול שמטרתו לחקור את ההשפעה של חשיפה אורניום טבעי על הכדאיות את הבידול, את הפונקציה של osteoclasts, התאים האחראי על ספיגת עצם.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אורניום הוכח להתערב עם עצם פיזיולוגיה, היא מבוססת היטב כי המתכת שמצטבר העצם. עם זאת, מעט מאוד ידוע על ההשפעה של אורניום טבעי על ההתנהגות של תאי עצם. בפרט, ההשפעה של אורניום על osteoclasts, האחראי ספיגת המטריקס העצם, התאים לא מתועדים. לחקור בנושא, הקמנו פרוטוקול חדש באמצעות uranyl אצטט כמו מקור של אורניום טבעי לבין הקו תא 264.7 גלם מאתר כמודל של אוסטאוקלסט סימנים מקדימים. במסמך זה, אנחנו מפורט כל מבחני נדרש לבחון את האורניום cytotoxicity על סימנים מקדימים אוסטאוקלסט וכדי להעריך את ההשפעה שלו על osteoclastogenesis ועל הפונקציה resorbing של osteoclasts בוגרת. התנאים פיתחנו, בפרט עבור הכנת המכילות uranyl תרבות המדיה, זריעה של RAW 264.7 תאים לאפשר להשיג תוצאות הרבייה מאוד ואמין. יתר על כן, לנו יש אופטימיזציה השימוש של כלי תוכנה כדי להקל על הניתוח של פרמטרים שונים כגון הגודל של osteoclasts או האחוז של מטריקס resorbed.

Introduction

אורניום הוא יסוד רדיואקטיבי טבעי נוכח קרקעות, אוויר ומים; ככזה, בבעלי חיים ובבני אדם חשופים אורניום טבעי בדיאטה שלהם. בנוסף למקורות טבעיים, אורניום מקורו של פעילויות אנתרופוגניים, אשר יגבירו את השפע שלה בסביבה. אורניום מהווה סיכונים כימיים והן רדיולוגית. עם זאת, מכיוון אורניום טבעי (אשר הוא איזוטרופי תערובת המכילה 99.27% 238U, 0.72% 235U, ו 0.006% 234U) יש פעילות ספציפית נמוכה (25.103 Bq.g-1), שלה השפעות על בריאות מיוחסות שלה כמות רעילה.

מה תוואי כניסה (שאיפה, בליעה או חשיפה עורי), רובם של אורניום הנכנסים לגוף חוסלה עם צואה ומגיע רק חלק קטן של מחזור מערכתי. כ- 67% אורניום בדם בתורו מסוננת על-ידי הכליות, עוזבת את הגוף בשתן בתוך 24 שעות1. השארית מופקד בעיקר כליות, עצמות, את שני איברי המטרה העיקרית של אורניום רעילות2,3,4. כי השלד זוהה כאתר העיקרי של אורניום לטווח ארוך שמירה2,3,4,5,6, מספר מחקרים נערכו על מנת לחקור ההשפעה של אורניום על עצם פיזיולוגיה7.

העצם היא רקמה mineralized זה הוא השתקם באופן רציף לאורך כל תקופת חייו. שיפוץ העצם הוא תהליך מורכב זה תלוי סוגי תאים מיוחדים והיא מורכבת בעיקר בשני שלבים: ספיגת המטריקס ישן הקיימת מראש על ידי osteoclasts ואחריו de novo עצם הבנייה על ידי תאי העצם. Osteoclasts הם תאים גדולים multinuclear הנובע הפיוז'ן של תאים קודמן ממוצא hematopoietic נודדים לאתרים resorption שבו הם לצרף העצם8. ההחזקה שלהם מתרחשת בו זמנית עם רה-ארגון נרחב של שלד התא שלהם9. הארגון מחדש נדרש להקמת תא מבודד בין התא לבין השטח העצם אשר לתוכו אוסטאוקלסט מפריש פרוטונים, שמוביל פירוק היידרוקסיאפטיט, פרוטאזות מעורב מהשפלת מטריקס אורגני. המוצרים השפלה וכתוצאה מכך endocytosed, מועבר דרך התא אל אזור ממברנה מול פני העצם, מופרש, תהליך הנקרא transcytosis10,11.

תוצאות ממחקרים ב- vivo ו- in vitro לקשרי מצביעים על כך אורניום מעכב היווצרות העצם הפיצולים המספר וכן את פעילותם של תאי העצם7,12. לעומת זאת, ההשפעות של אורניום על ספיגת עצם של osteoclasts נחקרו בצורה גרועה מספר ויוו מחקרים דיווחו על שיפור של ספיגת עצם לאחר מתן של חנקת uranyl13,של עכברים או חולדות-14. יתר על כן, חקירה אפידמיולוגיים הציע כי הגדלת צריכת אורניום באמצעות שתיית מים נטו להיות מזוהה עם עלייה ברמת סרום של סמן ספיגת עצם גברים15. יחדיו, ממצאים אלה הובילו למסקנה כי אורניום, אשר צוברת בתוך עצם יכולים לקדם את ספיגת עצם. עם זאת, המנגנונים התאיים מעורב הזה אפקט פוטנציאליים האורניום של עדיין שאלה פתוחה. מסיבה זו, החלטנו לבחון את ההשפעה של אורניום על אופן הפעולה של resorbing תאים עצם.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול הקמנו כדי לאפיין ולכמת את ההשפעה של אורניום טבעי על הכדאיות osteoclasts מראש ועל בידול osteoclasts ופעילות resorptive. הניסויים המתוארים בזאת נעשו עם קו תא מקרופאג טרנספורמציה מאתר 264.7 גולמי, אשר בקלות יכולים להתמיין osteoclasts כאשר תרבותי בנוכחות ציטוקין רנקל 4 או 5 ימים, והוא אשר משמש בסגנון קלאסי ללמוד אוסטאוקלסט בידול ותפקוד16. ההליכים פיתח אמין, נותן תוצאות מאוד לשחזור והם החלים לחלוטין osteoclasts העיקרי. מכל הסיבות האלה, אנו מאמינים כי מתודולוגיה זו שימושית לקבלת הבנה טובה יותר של המנגנונים המולקולריים המעורבים אורניום רעילות בתוך עצם. יתר על כן, אנחנו חושבים כי גישה זו יכול להיות מותאם ככלי מיון לזיהוי אורניום חדש chelating סוכנים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת Uranyl אצטט פתרון

  1. כדי להכין 2 מ ל 100 מ מ uranyl אצטט פתרון, להוסיף 85 מ"ג של uranyl אצטט (אז פרט להתמחות2(OCOCH3)2, 2 H2O; M = 424 g.mol-1) במצב מוצק צינור פלסטיק מ ל.
  2. להוסיף 2 מ ל מים מזוקקים צינור פלסטיק ולהתאים אותו עם פקק מפלסטיק.
  3. לנער את הצינור נמרצות עד התפרקות מוחלטת של המוצק. מכניסים את הפתרון במקרר במשך 24 שעות ביממה.
    התראה: המניפולציה של uranyl [U(VI)] מציג כמה סיכונים כימיים, רדיולוגית. כל הדגימות צריך להיות מוכן והוא מאופיין עם ציוד אד הוק במעבדות ספציפיים. נוזלים המכילות U השישי כל צריך להיות שליקט במיוחד שהוקצו פסולת מכולות, מסולק כפסולת רעילים. פסולת יבשה (pipets, צינורות, וכו ') יכולים להישטף עם 0.1 N עב ס3 פתרון, אשר solubilize, להסיר את U(VI).
  4. בדוק את ה-pH של הפתרון באמצעות microelectrode ו- pH-מטר.
    הערה: microelectrode צריך להיות בעבר מכויל שימוש בפתרונות מאגר מסחרי (ה-pH = 4 ו- pH = 7).

2. RAW תרבית תאים 264.7

  1. תחזוקה של התאים.
    1. מטפחים את התאים RAW 264.7 (בקרת האוויר, טיב-71) 75 ס מ2 מבחנות במצע הגידול הבאים: בינוני הנשר (DMEM) בתוספת 5% סרום שור עוברי ואנטיביוטיקה המתואמת של Dulbecco: 100 IU/mL פניצילין, סטרפטומיצין µg/mL 100. לשמור על תאים חממה ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    2. שינוי בינוני כל 2-3 ימים. כאשר התאים הם 85-90% confluent, מכנית להסיר אותם מן הבקבוק תרבות באמצעות המגרד של התא (כפי שהומלץ על ידי בקרת האוויר), לפצל אותם ביחס של 1:6.
      הערה: רק תאים בין פסוקים 3-10 משמשים לניסויים בידול.
  2. הכנה של התאים לניסויים
    1. לסלק תאים מן המצע הבקבוק כפי שתואר לעיל, להעביר אותם ל צינור סטרילי 50 מ. מערבבים תאים על-ידי pipetting למעלה ולמטה כדי לשבור את הגושים. . נספור hemocytometer מצפה 35-40 מיליון תאים לכל 75 ס מ2 הבקבוק.
    2. חישוב נפח של תאים ההשעיה הכרחי עבור ניסוי כדלקמן:
      מספר ניסיוני תנאים x 3 (triplicates) x 1 mL/טוב + 3-4 מ"ל (pipetting הפסדים).
      הערה: זריעה הצפיפות של כל מבחני שמתואר פרוטוקול זה הוא תא/ס מ 5,0002. לכן, על צלחת 24-. ובכן, זה אומר 10,000 תאים לכל באר 1 מ"ל של מדיום, והוא תא ההשעיה צפיפות לכן תאים למ"ל 10,000.
    3. להכין אמצעי הכרחי של 10,000 תאים למ"ל תא השעיה, זרע את התאים לוחות 24-. טוב. לשימוש מבחני cytotoxicity, מדיום הגידול נורמלי. בידול, ספיגת מבחני, שימוש אלפא שונה מינימום הכרחי בינוני (αMEM) בתוספת 2 מ מגלוטמין, 5% FBS ו- 50 ננוגרם למ"ל של GST-רנקל17.
      הערה: GST-רנקל חלבון המיוצר בחברה יכול להיות מוחלף על ידי ציטוקינים רנקל זמינים מסחרית כלשהי. בעת עבודה עם אוסף רנקל חדש, זה עשוי להיות שימושי כדי לבדוק את היעילות שלו ב גרימת osteoclastogenesis על-ידי ביצוע ניסוי תגובה מינון עם ריכוז רנקל הנעים בין 20 ל 150 ng/mL.

3. דילול של הפתרון אצטט Uranyl 100 מ מ תרבות בינוני

הערה: יונים Uranyl [U(VI)] תרבות בינוני בצורת מתחמי מרובים עם רכיבים אחרים בינוני יכול לשנות שלה רעילות הסלולר18,19,20,21. מסיבה זו, כדאי להיערך מדיה המכילים uranyl extemporaneously ללא השמטת או קיצור equilibration צעדים.

  1. בחר uranyl חשיפה ריכוזים, לחשב כמויות של תרבות התקשורת הדרושות עבור הניסוי (לקחת בחשבון כי כל תנאי מבוצעת שהפקידים).
  2. החל מהתרבות התא סטרילי נבדק 7.5% תמיסה מימית של סודיום ביקרבונט ([HCO3] = מ מ 893), להכין פתרון 100 מ מ3 HCO במים, לצנן את זה על קרח.
  3. להוסיף נפח 1 טיפה-מאת-שחרור של uranyl אצטט פתרון מניות 100 מ מ 9 כרכים של 100 מ מ קרה כקרח HCO3 פתרון, מנענע בעדינות את הצינור ערבוב. פעולה זו לדלל uranyl אצטט פתרון מניות ([אז פרט להתמחות22 +] = 100 מ מ, pH 4) עד 10 מ"מ ולהביא את ה-pH בסביבות 7.
  4. להוסיף 1 נפח המים סטרילי 9 כרכים של 100 מ מ קרה כקרח HCO3 פתרון כדי להגיע 90 מ מ HCO3 (שווה לריכוז3 HCO בפתרון uranyl 10 מ מ), אשר ישמש כדי להכין את הפקד בינוני.
  5. לאפשר פתרונות מוכנים לעמוד במשך 3 שעות בטמפרטורת החדר (RT) עבור equilibration.
  6. בינתיים, מכינים המדיום חשיפה בסיסיים: αMEM עם 2 מ מגלוטמין ו-5% FBS.
    הערה: עבור בידול ומבחני resorption, להוסיף 50 ננוגרם למ"ל של GST-רנקל המדיום חשיפה בסיסי.
  7. לאחר 3 שעות, לדלל כמויות מתאימות של הפתרון uranyl 10 מ מ טיפה על ידי ירידה המדיום חשיפה כדי להשיג את uranyl הרצוי עובד ריכוזים. להכין בו זמנית המדיום שליטה על-ידי הוספת כמות ביקרבונט משמש בתנאי שטופל uranyl מרוכז ביותר, למדיום חשיפה.
  8. לאפשר מדיה מוכן לעמוד במשך 3 שעות ב- RT עבור equilibration.
  9. להסיר את הצמיחה מדיה מן הבארות ולהחליף אותו עם הפקד ואמצעי התקשורת המכילות uranyl.

4. ניתוח של הקיום RAW מבשרי 264.7 בנוכחות U(VI) (מבחני ציטוטוקסיות MTT)

התראה: שניהם MTT, דימתיל סולפוקסיד יכול לגרום לעור, עין גירוי. ללבוש כפפות והגנה העין בעת הטיפול בהם. לאסוף את הפסולת ב במיוחד שהוקצו פסולת מכולות.

  1. להמיס כמות מספקת של אבקת 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium ברומיד (MTT) ב- PBS להשגת פתרון מניות 10 x-5 מ"ג/מ"ל. לעקר אותה על-ידי סינון עם מסנן מיקרומטר 0.22 ולאחסן aliquots ב-20 ° C.
  2. צלחת תאים על צלחות. ובכן 24 (3 בארות לכל תנאי הניסוי לכל צלחת). אל תשכחו להזמין 3 בארות ריק לכל לוח עבור החסר ספקטרופוטומטרים.
  3. דגירה תאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 22-24 שעןת לפני חשיפה אורניום לתת תאים לצרף.
  4. להכין מדיה המכילים uranyl כמתואר בסעיף 3.
  5. החלף את מדיום הגידול לוחית נזרע תא המכיל uranyl מדיה. תקופת דגירה של 24 שעות.
  6. חישוב הנפח של פתרון x MTT 1 כדלקמן:
    (מספר תנאים ניסיוני + ריק) x 3 (triplicates) x 0.4 מ ל/טוב + 10% נפח עבור הפסדים pipetting.
  7. הכן את אמצעי האחסון הדרושים של פתרון x MTT 1 על ידי דילול של 10 x MTT מניות פתרון ב המינימום חיוני בינוני (EMEM רשנה) ללא פנול אדום.
    הערה: עבור assay ערכי צבע מוחלטים, מוצלח MTT צריכים להיות מוגנים מפני אור. מומלץ לדלל MTT לתוך EMEM ולא DMEM על מנת להגביל את האות רקע.
  8. להסיר מדיה המכילים uranyl מן הבארות, לשטוף אותם עם PBS ולהוסיף 400 µL MTT פתרון כל טוב (כולל 3 בארות ריק עבור תאים ריקים). דגירה h 2.5 ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. ודא במיקרוסקופ formazan סגול כהה הקריסטלים נוצרו בתוך התאים קיימא.
  9. לבטל את הפתרון MTT ולהוסיף µL 220 של דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) לכל טוב. לעטוף צלחות בנייר אלומיניום כדי להגן עליהם מפני האור בעדינות להתסיס 10 דקות להמיס גבישים formazan.
  10. להשתמש בקורא ספקטרומטר microplate לקביעת הצפיפות האופטית (OD)-570 nm (formazan ספציפי) ו 690 nm (רקע). עבור כל טוב, להחסיר OD nm 690 מ OD nm 570 להתאמת עבור התנודות ערך OD שאינם ספציפיים אפשריים עקב שריטות או עכירות22.
  11. חישוב OD מתוקן-ריק במשך כל על-ידי חיסור OD אכזרי של הריק מ OD שהושג בשלב הקודם. לקבוע את הממוצע OD ערך עבור כל תנאי הניסוי.
  12. להגדיר רשע OD של המצב שליטה ([אז פרט להתמחות22 +] = 0 מ מ) ל 100% הכדאיות לחשב אחוז תא הכדאיות על ריכוזי uranyl נבדק אחרים המתאימים. התווה את עקומת מנה-תגובה. להעריך את 50 אינדקס Cytotoxicity (CI50), הגדיר את הריכוז uranyl המובילה למוות תא 50% לאחר 24 שעות חשיפה.

5. ניתוח של בידול אוסטאוקלסט בנוכחות U(VI)

  1. הבידול של RAW 264.7 תאים בנוכחות uranyl מלכודת (Tartrate-פוספטאז חומצה עמיד) מכתים.
    1. צלחת 264.7 גלם תאים על צלחת 24-ובכן, בארות 3 לכל תנאי הניסוי. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך כ- 6 שעות, הזמן כדי להכין, equilibrate התקשורת חשיפה המכילות uranyl.
    2. להכין בידול מדיה עם ריכוזים uranyl הרצוי כמתואר בסעיף 3 (אל תשכח להוסיף GST-רנקל מדיה).
    3. בעדינות להחליף בינוני בסיסי בבארות המכילות uranyl בינונית. היום הזה נחשב היום 0 של בידול osteoclastic.
    4. לשנות המדיום ביום 2 או 3 של בידול osteoclastic על ידי חזרה על שלבים 5.1.2 ו- 5.1.3. Multinucleated osteoclasts אמור להופיע בין יום 3 ו- 4.
    5. לבצע ההכתמה השמנה עם ערכת פוספטאז חומצה ליקוציט זמינים מסחרית ההוראות של היצרן.
      הערה: Tartrate-עמיד פוספטאז חומצה (השמנה) המכונה גם חומצה פוספטאז 5, עמיד tartrate (ACP5) הוא מאוד שבאה לידי ביטוי osteoclasts בוגרת ומשמש בהרחבה סמן אוסטאוקלסט בידול. לכן, מלכודת מכתים מתבצע כדי להמחיש osteoclasts. בהתאם לתנאי הניסוי הקצב של osteoclastogenesis, זה יכול להעשות על יום 4 או יום 5 של תהליך התמיינות.
    6. שמור בארות שהוכתמו מלכודת PBS ב 4 ° C לניתוח נוסף (הם יכולים להישמר בתנאים אלו עד 3 או 4 שבועות).
  2. אוסטאוקלסט גודל/מורפולוגיה ניתוח.
    1. רוכשים תמונה של פני כל טוב. הרזולוציה של התמונה אמורה להספיק להבחין בין גרעין התא. שקול השמנה-חיוביות תאים עם גרעינים 3 או יותר, כמו osteoclasts.
    2. פתיחת תמונה של באר אחת בהתוכנה ImageJ: "קובץ" ← "פתוח".
    3. ודא את יחידות מידה בפינה השמאלית העליונה של התמונה. עבור כימות יחסית, כל יחידה יכולה לשמש. אם הערך המוחלט של גודל אוסטאוקלסט הוא הכרחי, להמיר יחידות מידה מיקרומטר: "תמונה" ← "מאפיינים". סמן את התיבה "גלובל" בחלון המוקפץ כדי לקבל יחידות מידה חדשות מוחל על כל התמונות נפתח מאוחר יותר.
      הערה: אם מיקרוסקופ שימש עבור רכישת התמונה, גודל פיקסלים מיקרומטר מסומן עבור כל מטרה בתוכנת הדמיה.
    4. לציין מדידת פרמטרים כדי להיות מנותח: "לנתח" ← "הגדרת המידות". בחלון המידות להגדיר, "אזור" ו- "הצג תווית" תיבות הסימון ובטל כל האחרים תיבות.
    5. פתח את מנהל רועי (אזור בעל עניין): "לנתח" ← "כלים" ← "רועי מנהל".
    6. בחלון הראשי של, בחר את הכלי בחירה מלבנית. להשתמש בו בכל מקום בתמונה כדי לחלק לרמות מגזר של-1,000 x 1000 מיקרומטר. בחירה זו עכשיו מגדיר את האזור הראשון ב אוסטאוקלסט אשר ינותחו גודל.
    7. בחלון מנהל רועי, לחץ על "להוסיף" כפתור כדי להוסיף את אזור זה עניין אל מנהל רועי ולשמור אותו על ידי לחיצה על "עוד" ← "שמור". רועי שמורה יכול עכשיו להיות-נטען מחדש אל מנהל רועי בכל עת על ידי לחיצה על "עוד" ← "פתוח".
    8. חזור על שלבים 5.2.5 - 5.2.6 להגדרת 4 אזורים נוספים לצורך אוסטאוקלסט גודל ניתוח (איור 2 א ו- 2D).
      הערה: האזורים המוגדרים ישמש כדי לנתח אוסטאוקלסט מידות. כל התמונות.
    9. ליצור עותק של אחד האזורים 5 כדי להיות מנותח: בחרה את רועי הראשי של המנהל ROI (הבחירה המתאימה תופיע על התמונה הראשית) ← לחץ בתוך ה ← בחירת "כפילות". השתמש כפילות זו לצורך ניתוח נוסף.
    10. בחלון מנהל רועי, בדוק תיבות "להראות על" l "תוויות".
    11. בחלון הראשי של, בחרו בכלי בחירה מצולע לרמות באופן ידני אחת osteoclasts בבחירה. להוסיף חלוקה לרמות זו מנהל רועי על ידי לחיצה על "הוסף" בחלון מנהל רועי. המשך באופן דומה עבור osteoclasts כל זה שקר לחלוטין בתוך האזור שנבחר (איור 2B , 2E).
    12. בחלון מנהל רועי, בחר כל קווי המתאר ולמדוד את פני השטח שלהם על ידי לחיצה על "מידה". להעביר את המידות שהופיעו בחלון חדש (תוצאות חלון, איור 2C ו- 2F) גיליון אלקטרוני.
      הערה: בשלב זה, האזור של ניתוח עם כל קווי המיתאר osteoclasts היתה אפשרות לשמור כתמונה עצמאית: "קובץ" ← "שמירה בשם" תבנית של בחירה.
    13. חזור על שלבים 5.2.8 - 5.2.12 עבור האזורים הנותרים של ניתוח של התמונה הנוכחית. . אז, חזור על כל התהליך עבור כל התמונות האחרות.
  3. אוסטאוקלסט ניתוח מספר עם תוכנת ImageJ.
    הערה: כמו אוסטאוקלסט הפצה בתוך הבאר הוא לעיתים רחוקות הומוגנית, לבצע את הספירה על כל טוב במקום על מספר אזורים שנבחרו. בהתחשב בכך osteoclasts הם הטרוגנית צורה וגודל, לא אוטומטית ספירת תאים שיטה היא מעשית.
    1. פתחו תמונה כל-טוב בתוכנה ImageJ (לניתוח זה, שימוש תמונות מהסעיף הקודם משנה).
    2. פתח את החלון מונה תא: "תוספים" ← "לנתח" ← "תא מונה". לחץ על תיבת הסימון "סוג 1" ו- "אתחול" (או מה הקלד מספר אתה מעדיף). ודא "הצג מספר" תיבה מסומנת בתיבת "מחיקת מצב" אינה מסומנת.
    3. על התמונה, לחץ על אחד אוסטאוקלסט: נקודה בצבע ומספר יופיעו בו לחצת. המשך באופן דומה עבור כל osteoclasts. להציל את סמני באופן קבוע על ידי לחיצה על "שמור סמני" בחלון מונה תא
      הערה: אם הנקודה האחרונה יש להסיר הרוזן, לחץ על "מחק" בחלון מונה התא. אם יש נקודה אחת יותר כדי להסיר, סמן את התיבה "מחיקת מצב" ולציין את כל הנקודות לא חוקי על ידי לחיצה עליהם. . אז בטל את סימון התיבה "מחיקת מצב" כדי להמשיך את הספירה.
    4. להציג את התוצאה של ספירת על ידי לחיצה על תוצאות בחלון מונה התא. להעביר את התוצאות הסופיות הספירה גיליון אלקטרוני.

6. ניתוח של הפונקציה אוסטאוקלסט בנוכחות U(VI)

  1. בור resorption וזמינותו.
    1. צלחת 264.7 גלם תאים על צלחת assay osteo 24-ובכן, אשר מספק משטח osteomimetic אורגניים סינטטיים יכול להיות resorbed על ידי osteoclasts.
      הערה: כדי לתת תאים לצרף אל פני השטח ביונים, עדיף לעיתים קרובות צלחת אותם היום לפני הוספת המדיום בידול.
    2. להבדיל 246.7 גלם תאים לתוך osteoclasts כמתואר בסעיף 5 (שלבים 5.1.2 - 5.1.4)
    3. ביום 5 של osteoclastogenesis, להסיר osteoclasts מהמשטח מימטי של עצם על-ידי החלפת בינוני uranyl המכילים מלבין 10% הפתרון. תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. לשטוף בארות פעמיים עם מים יונים ולתת להם מילה נהדרת...
    4. להוסיף Alizarin אדום S 1% פתרון מלח נתרן הבארות כתם מלחי סידן באזורים שאינם resorbed. הסרת פתרון Alizarin לאחר 10-15 s של דגירה ולשטוף בעדינות את הבארות 3 - 4 פעמים עם מים. תן שמילה נהדרת הבארות.
      הערה: ההליך מכתימים שתוארו לעיל נועד לשפר את הניגודיות בין resorbed את האזורים שאינם resorbed כדי להקל על ניתוח רצופים. הליך זה חייב להיעשות בזהירות כי אם בארות אינם יבש לחלוטין לפני צביעת, היתה אפשרות להסיר בטעות חלקי עצם-מימטי השטח הנותר. יתר על כן, אם הפתרון Alizarin נותר זמן רב מדי הבארות, צביעת שאינם ספציפיים מתמיד מופיע. יצוין, כי הבדיקה המתוארת בסעיף זה מתייחס ההשפעה של אורניום על בידול osteoclastic ו- function. לחקור את ההשפעה של אורניום על ספיגת ללא תלות אוסטאוקלסט היווצרות, תאים RAW 264.7 יכולים להיות מטופלים עם uranyl המכילות בינוני למשך 24 שעות, רק לאחר osteoclasts בוגרת נוצרות (ב יום 4 או 5 של תהליך התמיינות) 23.
  2. בור resorption ניתוח.
    1. רוכשים תמונה של פני כל טוב של osteo assay צלחת.
      הערה: התמונה שיטות רכישה יכול להשתנות אך צריך להיות עקבי לאורך כל הניסויים שכפל. הם יכולים לכלול תמונה שצולמה עם יעד מאקרו של מצלמה קבועה, סריקה ברזולוציה גבוהה או תמונת פסיפס שנעשו עם מיקרוסקופ אוטומטיות תפוקה גבוהה.
    2. להתחיל ניתוח חוזר צעדים 5.2.2 כדי 5.2.4 מהסעיף הקודם.
    3. המרת תמונת RGB בתבנית 8-bit סולם גוני אפור: "תמונה" ← "הקלד" ← "8 סיביות".
    4. בחלון הראשי של, בחר את הכלי בחירה אליפטית. השתמש בו כדי לצייר עיגול חלוקה לרמות כל השטח של הבאר כדי להיות מנותח על ספיגת.
    5. לחסוך זה רועי חדש כמו שלב 5.2.6.
    6. כדי להקל על הבחירה הסף, נקה את כל התכונות מחוץ רועי מוגדר: "עריכה" ← "נקה מבחוץ".
      הערה: בשלב זה, עדיף בדרך כלל ליצור כמה עותקים של התמונה: בטלו את הסימון רועי על-ידי לחיצה החוצה האזור שנבחר ← לחץ לחיצה ימנית על ה ← תמונה "כפילות". פעולה זו תסייע למנוע הישנות של הטיפול התמונה שתוארה לעיל, אם הסף שבחרת בשלב הבא אינה משביעת רצון.
    7. בחר "תמונה" ← "להתאים" ← "סף". בחלון ' סף ', השתמש את פס המחוון כדי לבחור את הסף המתאים. כל האזורים resorbed צריך להיות מתחת לסף (לבן) ואת הלא-resorbed, מעל (אדום). כדי לסיים את הבחירה הסף, לחץ על "החל" בחלון הסף.
    8. שמור את התמונה הסופית בינארי: "קובץ" ← "שמירה בשם" → עיצוב על פי בחירתך.
    9. הגדרת המידות להילקח באזור של עניין: "לנתח" ← "הגדרת המידות". בחלון המידות להגדיר, לבדוק את "אזור", "אזור השבר" ותיבות "מגבלת לסף" ולהוריד את כל האחרים.
    10. על מנת לקבל את השבר של אזור "resorbed" ישירות בחלון תוצאות, היפוך התמונה בינארי ("עריכה" ← "Invert"). ודא כי רועי הראשי נבחרה על התמונה הסופית בינארי (אחרת resorbed אזור השבר יחושב בהתבסס על פני השטח של החלון התמונה כולה). מדד resorbed אזור שבר הכתיב לחיצה על "מידה" בחלון מנהל ROI או על "לנתח" ← "למדוד". לשמור את התוצאה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

עמידים tartrate פוספטאז חומצה מכתים שימש כדי להמחיש osteoclasts כתאי סגול גדול יש 3 או יותר גרעינים. להחליפן בתמונות של osteoclasts מתקבל מתאי 264.7 גלם תרבותי בנוכחות רנקל, uranyl יונים מוצגים באיור1. שינוי המספר והגודל של osteoclasts בתגובה אורניום גלויים בקלות תמונות ללא הפרדות צבע של כל בארות, בתמונות מוגדלות.

הגודל של osteoclasts נותחו באמצעות תוכנת ImageJ (איור 2). לענין זה, שימשו כל-טוב תמונות של מלכודת צבעונית osteoclasts, האזורים זהה טופלו כל טוב של כל תנאי התרבות (איור 2 א ו- 2D). נוכח בכל אזור כל osteoclasts היו בקווים כלליים (איור 2B , 2E) אשר אפשרה קביעת אזור שלהם (המתבטא מיקרומטר2) (איור 2C ו- 2F). הדוגמאות המוצגות באיור 2 להדגים את ההשפעה חזקה של אורניום על גודל אוסטאוקלסט.

לחקור את ההשפעה של אורניום על פעילות resorption אוסטאוקלסט, RAW 264.7 התאים היו מצופים, הבדיל בצלחת משטח osteomimetic. בסוף וזמינותו, הוסרו osteoclasts. לאחר מכן, עצם משטח מימטי בכל טוב טופלה ע י מלח נתרן Alizarin אדום S כדי כתם שאינו resorbed באזור, תמונות של כל כל טוב נרכשו (איור 3 א ותלת מימד). התמונות המתקבלת עובדו עם התמונה J תוכנה. הם התגיירו. בתמונות בגווני אפור של 8 סיביות (איור 3B ו- 3E), כלפיהן סף (איור 3C ו- 3F) אזור resorbed (אזורים לבנים) היה מחושב באופן אוטומטי.

Figure 1
איור 1: ויזואליזציה של השפעת U(VI) על היווצרות אוסטאוקלסט. תאים 264.7 גלם היו הבדיל בנוכחות הריכוז המצוין של uranyl. יום 4, צביעת פוספטאז tartrate חסיני חומצה (השמנה) בוצעה. ובכן כל נציג micrographs (לוחות העליון) מראים שהוכתמו מלכודת osteoclasts שהושגו בתנאים אלו. דוגמאות של osteoclasts multinucleated באזורים מסגרת מוצגים בהגדלה גדולה יותר (חיצים בחלוניות התחתון). תמונות אלה ממחישים את ההשפעה תלוי במינון של U(VI) על היווצרות אוסטאוקלסט. חיצים ראש שחור מציינים דוגמאות אוסטאוקלסט גרעינים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: ניתוח של השפעת U(VI) על גודל אוסטאוקלסט. (A ו- D): כל-טוב תמונות של osteoclasts באזור ממוסגר המתאימים לאזורים ב אוסטאוקלסט אשר נותחו גודל מוצגים. האדום בתיבות אזור (A ו- D) מתאימות את אלה המוצגות ב (B) ו- (ה), בהתאמה. (B ו- E): בציור ידני של קצוות אוסטאוקלסט בתנאים uranyl-ריכוז שני מוצג בצבע כחול. (C ו- F): לגרום windows מתוכנות ImageJ מציג את המידות מניתוח (הפריצה) בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ניתוח של השפעת U(VI) על הפונקציה אוסטאוקלסט. תמונות של Alizarin מוכתם osteomimetic השטח לאחר ספיגת osteoclastic שהתקיים בהיעדרו (A) או בנוכחות מיקרומטר 25 של uranyl (D). תמונות (A ו- D) היו להמיר תחילה בתמונות בגווני אפור של 8 סיביות כפי שמוצג (B ו- E), לאחר מכן, תמונות בינאריות (C ו- F) על-ידי החלת הגדרה הסף המתאים. אלה תמונות בינאריות שימשו לחישוב האחוז של אזור resorbed בכל מצב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

עד כמה שידוע לנו, זו הפעם הראשונה המתואר הליך מפורט במטרה לחקור את ההשפעה של אורניום טבעי על עצם resorbing תאים. גישה זו יהיה שימושי להשיג הבנה טובה יותר של אורניום השפעה על עצם פיזיולוגיה, עשוי לספק כלי חדש מעניין להקרנה של אורניום chelators. יתר על כן, אנו מאמינים כי יכול להיות מיושם הפרוטוקול המתואר כאן לחקור את ההשפעה של מתכות כבדות אחרות ב- osteoclatogenesis.

זה ידוע ש-uranyl הזה הוא ומורכבת עם רכיבים אורגניים ואורגניים תרבות המדיה18,19,20,21. Complexations אלה משפיעים על היווצרות המינים של אורניום, בדרך זו, cytotoxicity שלה. מסיבה זו, שלב קריטי בפרוטוקול זה הכנת המכילים אורניום תרבות המדיה. בעבר הראו לנו23 שיש הנוכחות של 5% סרום שור עוברית במדיום התרבות של תאים 264.7 גלם אין השפעה משמעותית על cytotoxicity של uranyl בעת שימוש בריכוזים הנע בין 0 מיקרומטר 400. זו נקודה חשובה, כמו הנוכחות של סרום במדיום נדרשת כדי לנתח את השפעת החשיפה אורניום במהלך כל התהליך של בידול osteoclastic. למרות זאת, אנו רוצים להדגיש כי המהלך המתואר שני שלבים ארוכים עבור הכנת חשיפה בתקשורת (6 שעות) חייב להיות במעקב בקפידה. אכן, לשלב הדגירה של 3 שעות אחרי כל דילול של מלחי uranyl מאפשר ייצוב מתחמי uranyl פוטנציאלי היוו פתרון לפני דילול נוסף או חשיפה תא. זה בהחלט נדרש כדי להשיג תוצאות לשחזור ואמין.

פרמטר חשוב נוסף עבור הפארמצבטית של מבחני הבידול והיתרון resorption אוסטאוקלסט היא צפיפות זריעה של גם מגזין. ה"ראו 264 תאים.7. אכן, הוכח כי צפיפות קודמן תאי היא דטרמיננטה קריטי עבור אוסטאוקלסט היווצרות, סביר להניח כי קרבה לתא השפעות באיחוי אירועי24. לכן, תשומת לב מיוחדת ישולם לתא ספירה, ההשעיה הסלולר הכנה והומוגניות זריעה כל היטב, על מנת למנוע פירוש מוטעה.

הכלי קביעת סף שימושית עבור אוטומציה של כימות של ספיגת. זה שווה הצבעה כי ניתוח זה דורש תמונות מוארות כהלכה. עם זאת, בעיה נפוצה ללא התחשבות בסוג של שיטת רכישת מצלמה ותמונה הוא תאורה לא אחידה בקצוות התמונה. במקרה זה, שיטה רב שלבי קביעת סף ייתכן שיהיה צורך.

לסיכום, הקמנו חזקים פרוטוקול המאפשר המחקר של אורניום השפעה על היווצרות אוסטאוקלסט, הכדאיות של הפונקציה. הליך זה פותחה באמצעות הקו תא RAW 264.7 אבל ישימה באופן מלא על מח העצם העיקרי אוסטאוקלסט מבשרי כפי שהראתי23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף

Acknowledgments

המחברים רוצה להודות קרו שנטל לסיוע טכני מועיל.
מחקר זה מומן על ידי מענקים "במשרד à l'Energie Atomique et aux אנרגיות חלופות" (URANOs - תוכנית ואלכסוני דה Toxicologie du CEA ו- CEA CPRR-AREVA), וממנו ANR (רעילות של אורניום: רב ברמת הגישה של ביומינרליזציה תהליך בתוך עצם, ANR-16-CE34-0003.) עבודה זו גם נתמך על ידי אוניברסיטת סופיה נחמד-אנטיפוליס ואת ה-CNRS.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Keith, S., Faroon, O., Roney, N., Scinicariello, F., Wilbur, S., Ingerman, L., et al. Toxicological profile for uranium. Agency for Toxic Substances and Disease Registry. Atlanta, GA. (2013).
  2. Ballou, J. E., Gies, R. A., Case, A. C., Haggard, D. L., Buschbom, R. L., Ryan, J. L. Deposition and early disposition of inhaled 233UO2(NO3)2 and 232UO2(NO3)2 in the rat. Health Phys. 51, (6), 755-771 (1986).
  3. Kathren, R. L., McInroy, J. F., Moore, R. H., Dietert, S. E. Uranium in the tissues of an occupationally exposed individual. Health Phys. 57, (1), 17-21 (1989).
  4. Kurttio, P., et al. Renal effects of uranium in drinking water. Environ.Health Perspect. 110, (4), 337-342 (2002).
  5. Leggett, R. W. Basis for the ICRP's age-specific biokinetic model for uranium. Health Phys. 67, (6), 589-610 (1994).
  6. Vidaud, C., Bourgeois, D., Meyer, D. Bone as target organ for metals: the case of f-elements. Chem. Res. Toxicol. 25, (6), 1161-1175 (2012).
  7. Arzuaga, X., Gehlhaus, M., Strong, J. Modes of action associated with uranium induced adverse effects in bone function and development. Toxicol. Lett. 236, (2), 123-130 (2015).
  8. Ikeda, K., Takeshita, S. The role of osteoclast differentiation and function in skeletal homeostasis. J. Biochem. 159, (1), 1-8 (2016).
  9. Teiltelbaum, S. L. The osteoclast and its unique cytoskeleton. Ann N Y Acad Sci. 1240, 14-17 (2011).
  10. Nesbitt, S. A., Horton, M. A. Trafficking of matrix collagens through bone-resorbing osteoclasts. Science. 276, (5310), 266-269 (1997).
  11. Salo, J., Lehenkari, P., Mulari, M., Metsikko, K., Vaananen, H. K. Removal of osteoclast bone resorption products by transcytosis. Science. 276, (5310), 270-273 (1997).
  12. Pierrefite-Carle, V., et al. Effect of natural uranium on the UMR-106 osteoblastic cell line: impairment of the autophagic process as an underlying mechanism of uranium toxicity. Arch. Toxicol. 91, (4), 1903-1914 (2017).
  13. Ubios, A. M., Guglielmotti, M. B., Steimetz, T., Cabrini, R. L. Uranium inhibits bone formation in physiologic alveolar bone modeling and remodeling. Environ. Res. 54, (1), 17-23 (1991).
  14. Bozal, C. B., Martinez, A. B., Cabrini, R. L., Ubios, A. M. Effect of ethane-1- hydroxy-1,1-bisphosphonate (EHBP) on endochondral ossification lesions induced by a lethal oral dose of uranyl nitrate. Arch. Toxicol. 79, (8), 475-481 (2005).
  15. Kurttio, P., et al. Bone as a possible target of chemical toxicity of natural uranium in drinking water. Environ. Health Perspect. 113, (1), 68-72 (2005).
  16. Collin-Osdoby, P., Osdoby, P. RANKL-mediated osteoclast formation from murine RAW 264.7 cells. Methods Mol. Biol. 816, 187-202 (2012).
  17. Beranger, G. E., et al. Differential binding of poly(ADP-Ribose) polymerase-1 and JunD/Fra2 accounts for RANKL-induced Tcirg1 gene expression during osteoclastogenesis. J. Bone Miner. Res. 22, (7), 975-983 (2007).
  18. Mirto, H., et al. Influence of uranium(VI) speciation for the evaluation of in vitro uranium cytotoxicity on LLC-PK1 cells. Hum. Exp. Toxicol. 18, (3), 180-187 (1999).
  19. Carrière, M., et al. Influence of uranium speciation on normal rat kidney (NRK-52E) proximal cell cytotoxicity. Chem. Res. Toxicol. 17, (3), 446-452 (2004).
  20. Milgram, S., Carrière, M., Malaval, L., Gouget, B. Cellular accumulation and distribution of uranium and lead in osteoblastic cells as a function of their speciation. Toxicology. 252, (1-3), 26-32 (2008).
  21. Milgram, S., Carrière, M., Thiebault, C., Malaval, L., Gouget, B. Cytotoxic and phenotypic effects of uranium and lead on osteoblastic cells are highly dependent on metal speciation. Toxicology. 250, (1), 62-69 (2008).
  22. Studzinski, G. P. Cell Growth, Differentiation and Senescence A Practical Approach. Oxford University Press. Oxford. (1999).
  23. Gritsaenko, T., et al. Natural uranium impairs the differentiation and the resorbing function of osteoclasts. Biochim Biophys Acta. 1861, (4), 715-726 (2017).
  24. Motiur Rahman, M., et al. Proliferation-coupled osteoclast differentiation by RANKL: Cell density as a determinant of osteoclast formation. Bone. 81, 392-399 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics