Methoden zur Analyse der Auswirkungen des natürlichen Urans auf In-vitro- Osteoclastogenesis

Developmental Biology

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Summary

Uran ist bekannt, Knochenstoffwechsel beeinflussen. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Untersuchung der Wirkung von natürlichem Uranexposition auf die Lebensfähigkeit, die Differenzierung und die Funktion der Osteoklasten, die Zellen verantwortlich für Knochenabbau.

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Gritsaenko, T., Pierrefite-Carle, V., Creff, G., Vidaud, C., Carle, G., Santucci-Darmanin, S. Methods for Analyzing the Impacts of Natural Uranium on In Vitro Osteoclastogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56499, doi:10.3791/56499 (2018).

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Abstract

Uran hat gezeigt, dass Knochen Physiologie stören und es ist allgemein bekannt, dass dieses Metall in den Knochen ansammelt. Jedoch ist wenig bekannt über die Wirkung des natürlichen Urans auf das Verhalten von Knochenzellen. Insbesondere ist die Wirkung von Uran auf Osteoklasten, die Zellen verantwortlich für die Resorption der Knochenmatrix nicht dokumentiert. Um dieses Problem zu untersuchen, haben wir ein neues Protokoll mit Uranyl Acetat als Quelle des natürlichen Urans und murinen Zelllinie RAW 264,7 als Modell der Osteoklasten-Vorläufer etabliert. Hierin, detaillierte wir alle Tests erforderlich, um Uran Zytotoxizität auf Osteoklasten-Vorläufer zu testen und bewerten die Auswirkungen auf die Osteoclastogenesis und die resorbing Funktion der Reifen Osteoklasten. Die Bedingungen, die wir entwickelt haben, insbesondere für die Herstellung von Nährmedien Uranyl-haltigen und für die Aussaat des rohen 264,7 Zellen ermöglichen zuverlässige und hoch reproduktiver Ergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus haben wir den Einsatz von Software-Tools zur Erleichterung der Analysis verschiedener Parameter wie die Größe der Osteoklasten oder den Prozentsatz resorbiert Matrix optimiert.

Introduction

Uran ist ein natürlich vorkommendes radioaktives Element in Böden, Luft und Wasser vorhanden; Tiere und Menschen sind als solche Natururan in ihrer Ernährung ausgesetzt. Zusätzlich zu den natürlichen Quellen stammt Uran aus anthropogenen Aktivitäten erhöht seine Häufigkeit in der Umgebung. Uran stellt chemische und radiologische Gefahren. Jedoch weil natürliches Uran (das ist ein Isotopen Mischung mit 99.27 % 238U 0,72 % 235U und 0,006 % 234U) hat eine niedrige spezifische Aktivität (25.10.3 Bq.g-1), deren Auswirkungen auf die Gesundheit sind zurückzuführen auf seine chemische Toxizität.

Was auch immer seine Eintrag Route (Einatmen, verschlucken oder dermale Exposition), die meisten von Uran in den Körper eindringen mit Kot ausgeschieden ist und nur ein kleiner Teil erreicht den Körperkreislauf. Ca. 67 % des Urans im Blut wird wiederum durch die Nieren gefiltert und verlässt den Körper im Urin innerhalb 24 h1. Der Rest lagert sich vor allem in Nieren und Knochen, die zwei wichtigsten Zielorgane von Uran Toxizität2,3,4. Da das Skelett als der primäre Standort von Uran langfristige Aufbewahrung2,3,4,5,6identifiziert wurde, wurden mehrere Studien durchgeführt, um zu erkunden die Wirkung von Uran auf Knochen Physiologie7.

Knochen ist ein mineralisierten Gewebe, die während seiner Lebensdauer kontinuierlich umgebaut ist. Knochenaufbau ist ein komplexer Prozess, der spezialisierte Zelltypen abhängig und besteht meistens aus zwei Phasen: Resorption von bereits vorhandenen alten Matrix durch Osteoklasten gefolgt von de-Novo-Knochen-Bau von Osteoblasten. Osteoklasten sind große Multikern Zellen, die aus der Verschmelzung von Vorläuferzellen hämatopoetischen Ursprungs, die zur Resorption Seiten wandern wo sie8Knochen zu befestigen. Ihre Befestigung erfolgt gleichzeitig mit eine umfassende Reorganisation der ihre Zytoskelett-9. Diese Reorganisation ist erforderlich für die Errichtung einer isolierten Fach zwischen der Zelle und der Knochenoberfläche, in denen die Osteoklasten Protonen sondert, führt zur Auflösung der Hydroxylapatit und Proteasen, die in den Abbau von, der organische Matrix. Die entstehenden Abbauprodukte sind Endocytosed, transportiert durch die Zelle, die Membranfläche gegenüber der Knochenoberfläche und abgesondert, einen Prozess namens Transcytosis10,11.

Ergebnisse von in Vivo und in Vitro Studien zeigen, dass Uran hemmt die Knochenbildung und die Anzahl und die Aktivität der Osteoblasten7,12 verändert. Im Gegensatz dazu haben die Auswirkungen von Uran auf Knochenabbau und Osteoklasten schlecht erforscht. Mehrere in-Vivo -Studien haben eine Verbesserung der Knochenabbau nach Verabreichung Uranyl Nitrat zu Mäusen oder Ratten13,14berichtet. Darüber hinaus schlug eine epidemiologische Untersuchung, dass die Zunahme der Uran-Aufnahme über das Trinkwasser tendenziell einen Anstieg der Serumspiegel eines Knochen-Resorption-Markers in Männer15zugeordnet werden. Zusammen genommen, diese Erkenntnisse führte zu dem Schluss, dass Uran, die reichert sich in Knochen Knochenabbau fördern könnte. Allerdings bleiben die zellulären Mechanismen beteiligt diese potenzielle Wirkung von Uran eine offene Frage. Aus diesem Grund haben wir beschlossen, die Auswirkungen von Uran auf Verhalten von resorbierbarem Knochenzellen zu untersuchen.

Hier beschreiben wir das Protokoll wir haben zur Charakterisierung und Quantifizierung der Auswirkungen des natürlichen Urans auf Pre Osteoklasten Lebensfähigkeit und Osteoklasten Differenzierung und resorptiven Aktivität. Die hier beschriebenen Experimente wurden durchgeführt mit RAW 264,7 murinen transformierten Makrophagen-Zelllinie, die können leicht unterscheiden in Osteoklasten wenn in Anwesenheit der Zytokin RANKL 4 oder 5 Tage lang kultiviert, und wird klassisch zu studieren Osteoklasten Differenzierung und Funktion16. Die entwickelten Verfahren sind zuverlässig, hoch reproduzierbare Ergebnisse und gelten uneingeschränkt für primäre Osteoklasten zu geben. Aus all diesen Gründen glauben wir, dass diese Methode für ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen der Toxizität von Uran in den Knochen immer nützlich ist. Darüber hinaus denken wir, dass dieser Ansatz als Screening-Instrument zur Identifizierung von neuen Uranium Komplexbildner angepasst werden könnte.

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Protocol

1. Vorbereitung der Uranyl-Acetat-Lösung

  1. Zur Vorbereitung von 2 mL einer 100 mM-Uranyl-Acetat-Lösung fügen Sie 85 mg Uranyl-Acetat (UO2(OCOCH3)2, 2 H2O hinzu; M = 424 g.mol-1) in solid-State zu einer 5 mL-Kunststofftube.
  2. Das Kunststoffrohr 2 mL destilliertes Wasser hinzu und passen Sie es mit einem Kunststoff-Stopfen.
  3. Schütteln Sie das Rohr bis zur totalen Auflösung des Volumenkörpers kräftig. Setzen Sie die Lösung im Kühlschrank für 24 h.
    Achtung: Die Manipulation von Uranyl [U(VI)] präsentiert einige chemischen und radiologischen Gefahren. Die Proben sollten vorbereitet und geprägt mit ad-hoc-Ausrüstung in speziellen Labors. Alle U-VI-haltigen Flüssigkeiten sollten in speziell zugewiesenen Abfallbehälter gesammelt und als Sondermüll entsorgt werden. Trockenen Abfällen (Mehrkanalpipette, Rohre, etc.) könnte mit 0,1 N Druckaufschluss-3 -Lösung gewaschen werden, lösen und entfernen Sie U(VI).
  4. Überprüfen Sie den pH-Wert der Lösung unter Verwendung einer Mikroelektrode und ein pH-Meter.
    Hinweis: Der Mikroelektrode sollte zuvor kalibriert werden mit kommerziellen Pufferlösungen (pH = 4 und pH = 7).

(2) rohe 264.7 Zellkultur

  1. Wartung der Zellen.
    1. RAW 264,7 Zellen (ATCC, TIB-71) in 75 cm2 Flaschen in den folgenden Wachstumsmedium kultivieren: Dulbecco modifizierten Adlers Medium (DMEM) mit 5 % fötalen Rinderserum und Antibiotika ergänzt: 100 IE/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin. Zellen im Inkubator bei 37 ° C, 5 % CO2zu erhalten.
    2. Verändern Sie alle 2 bis 3 Tage Medium. Wenn die Zellen 85-90 % Zusammenfluss sind, mechanisch entfernen Sie sie aus der Kultur-Flasche mit einem Zelle Schaber (wie von der ATCC empfohlen) und teilen Sie sie in einem Verhältnis von 1:6.
      Hinweis: nur Zellen zwischen 3 bis 10 Passagen dienen der Differenzierung Experimente.
  2. Vorbereitung der Zellen für Experimente
    1. Verdrängen Sie Zellen aus dem Kolben Substrat zu, wie oben beschrieben, und übertragen Sie sie auf einem sterilen 50 mL-Tube. Mischen Sie Zellen durch Pipettieren rauf und runter um Klumpen zu brechen. Rechnen sie mit einer Hemocytometer. Erwarten Sie 35 Millionen Zellen pro 75 cm2 Kolben.
    2. Berechnen Sie Volumen der Zellen Aussetzung erforderlich für jedes Experiment wie folgt:
      Anzahl der experimentellen Bedingungen X 3 (Triplicates) x 1 mL/gut + 3-4 mL (Pipettier-Verluste).
      Hinweis: Seeding Dichte für alle Assays beschrieben in diesem Protokoll ist 5.000 Zelle/cm2. Daher für eine 24-Well-Platte, es bedeutet 10.000 Zellen pro Bohrloch in 1 mL des Mediums und Aussetzung Zelldichte ist somit 10.000 Zellen/mL.
    3. Bereiten Sie notwendige Volumen von 10.000 Zellen/mL Zellsuspension und Samen der Zellen in 24-Well-Platten. Verwenden Sie für Zytotoxizität Assays normales Wachstumsmedium. Für Differenzierung und Resorption Assays, Verwendung Alpha modifiziert Minimum wesentliches Medium (αMEM) ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, 5 % FBS und 50 ng/mL von GST-RANKL17.
      Hinweis: Die GST-RANKL Protein produziert im eigenen Haus kann durch jede handelsübliche Zytokin RANKL ersetzt werden. Beim Arbeiten mit einer neuen RANKL Charge kann es nützlich sein, um seine Wirksamkeit zu testen, bei der Induktion von Osteoclastogenesis durch Ausführen einer Dosis-Antwort-Experiments mit RANKL-Konzentration von 20 bis 150 ng/mL sein.

(3) Verdünnung der 100 mM-Uranyl-Acetat-Lösung in Kulturmedium

Hinweis: Uranyl Ionen [U(VI)] in Kulturmedium bilden mehrere komplexe mit anderen Medium-Komponenten, die die zelluläre Toxizität18,19,20,21ändern könnte. Aus diesem Grund sollte Uranyl-haltigen Medien aus dem Stegreif ohne weglassen oder Verkürzung Gleichgewichtherstellung Schritte vorbereitet werden.

  1. Wählte Uranyl Exposition Konzentrationen und Mengen von Nährmedien erforderlich für das Experiment (unter Berücksichtigung, dass jede Bedingung in dreifacher Ausfertigung erfolgt) zu berechnen.
  2. Ausgehend von der sterilen Zellkultur getestet 7,5 % Natriumbicarbonat wässrige Lösung ([HCO3] = 893 mM), bereiten Sie eine 100 mM HCO3 Lösung im Wasser und auf Eis abkühlen.
  3. 9 Bände der eiskalten 100 mM HCO3 Lösung, sanft schütteln das Mischrohr fügen Sie Tropfen für Tropfen 1 Volumen von Uranyl Acetat 100 mM Stammlösung hinzu. Dieser Vorgang wird verdünnen Uranyl-Acetat-Stammlösung ([UO22 +] = 100 mM, pH 4) bis 10 mM und den pH-Wert auf etwa 7 zu bringen.
  4. 9 Bände der eiskalten 100 mM HCO3 Lösung für 90 mM HCO3 (gleichbedeutend mit HCO3 -Konzentration in der 10 mM-Uranyl-Lösung) zu erreichen, die dazu dienen wird, bereiten Sie das Steuerelement fügen Sie 1 Volumen von sterilem Wasser hinzu Medium.
  5. Lassen Sie vorbereitete Lösungen für 3 h bei Raumtemperatur (RT) für Gleichgewichtherstellung stehen.
  6. In der Zwischenzeit bereiten Sie die grundlegenden Exposition Medium: αMEM mit 2 mM L-Glutamin und 5 % FBS.
    Hinweis: Für Differenzierung und Resorption Assays, fügen Sie 50 ng/mL von GST-RANKL zu den grundlegenden Exposition Medium hinzu.
  7. Verdünnen Sie nach 3 h entsprechende Mengen an die 10 mM-Uranyl-Lösung tropfenweise in die Exposition Medium um die gewünschte Uranyl arbeiten Konzentrationen zu erreichen. Bereiten Sie sich gleichzeitig das Steuermedium indem man die Menge an Bicarbonat in der konzentriertesten Uranyl-behandelten Zustand auf das Medium Ausstellung verwendet.
  8. Erlauben Sie vorbereitete Medien stehen für 3 h bei RT für Gleichgewichtherstellung.
  9. Entfernen Sie Wachstumsmedium aus dem Brunnen zu und ersetzen Sie es mit der Kontrolle und Uranyl-haltigen Medien.

4. Analyse der rohen 264,7 Vorstufen Lebensfähigkeit in Anwesenheit von U(VI) (MTT zytotoxischen Assays)

Achtung: Beide MTT und DMSO könnte dazu führen, dass Haut und Augenreizung. Tragen Sie Handschuhe und Augenschutz beim Umgang mit ihnen. Abfallprodukte im speziell zugewiesenen Abfallbehältern zu sammeln.

  1. Auflösen einer entsprechenden Menge an 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium Bromid (MTT) Pulver in PBS eine Stammlösung 10 X 5 mg/ml zu erhalten. Mit einem 0,22 µm-Filter durch Filtration zu sterilisieren Sie und speichern Sie Aliquote bei-20 ° C.
  2. Platte Zellen auf 24-Well-Platten (3 Brunnen pro Versuchsbedingung pro Platte). Vergessen Sie nicht, 3 leere Brunnen pro Platte für die Spektralphotometer Rohlinge zu reservieren.
  3. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C für 22-24 h vor Uranexposition Zellen anbringen zu lassen.
  4. Bereiten Sie Uranyl-haltigen Medien, wie in Abschnitt 3 beschrieben.
  5. Ersetzen Sie Wachstumsmedium in die Zelle ausgesät Platten mit Uranyl-haltigen Medien. 24 h inkubieren.
  6. Berechnen Sie das benötigte Volumen 1 X MTT Lösung wie folgt:
    (Anzahl der experimentellen Bedingungen + leer) X 3 (Triplicates) x 0,4 mL/gut + 10 % Volumen für Pipettier Verluste.
  7. Bereiten Sie die erforderliche Menge 1 X MTT Lösung durch Verdünnung der 10-fach MTT-Stammlösung in Adlers Minimum wesentliches Medium (EMEM) ohne Phenol rot.
    Hinweis: für eine erfolgreiche kolorimetrischen Probe MTT sollte vor Licht geschützt werden. Es wird empfohlen, MTT in EMEM anstatt DMEM zu verdünnen, um das Hintergrundsignal zu begrenzen.
  8. Uranyl-haltigen Medien aus dem Brunnen zu entfernen, waschen mit PBS und 400 µL MTT-Lösung in jede Vertiefung (einschließlich 3 leere Brunnen für Zuschnitte) hinzufügen. Inkubieren Sie 2,5 h bei 37 ° C im Dunkeln. Überprüfen Sie unter Mikroskop dunkel violette Formazan-Kristalle innerhalb der lebensfähigen Zellen gebildet haben.
  9. Verwerfen Sie die MTT-Lösung zu, und fügen Sie 220 µL Dimethyl Sulfoxid (DMSO) pro Bohrloch. Wickeln Sie Platten in Alufolie um sie vor Licht zu schützen und für 10 min bis zum Formazan-Kristalle lösen sich sanft schütteln.
  10. Benutzen Sie einen Mikrotestplatte Spektrometer Reader um zu bestimmen, die optische Dichte (OD) bei 570 nm (Formazan spezifisch) und 690 nm (Hintergrund). Subtrahieren Sie für jedes gut 690 nm OD von 570 nm OD für mögliche unspezifische OD Wertschwankung durch Kratzer oder Trübung22anpassen.
  11. Berechnen Sie die Blank-korrigierte OD für jedes gut durch Subtrahieren mittlere OD des Rohlings aus der OD erhalten im vorherigen Schritt. Den Mittelwert OD-Wert für jede experimentelle Bedingung zu bestimmen.
  12. Mittlere OD der Kontrollbedingung festgelegt ([UO22 +] = 0 mM), 100 % Lebensfähigkeit und berechnen den entsprechenden Prozentsatz der Zellviabilität für andere getestete Uranyl-Konzentrationen. Plotten Sie eine Dosis-Wirkungs-Kurve. Die Zytotoxizität Index 50 (CI-50), definiert als die Uranyl-Konzentration führt zu 50 % Zelltod nach 24 h Exposition zu bewerten.

5. Analyse der Osteoklasten Differenzierung in Anwesenheit von U(VI)

  1. Differenzierung der rohen 264,7 Zellen in Anwesenheit von Uranyl und TRAP (Tartrat-resistente Acid Phosphatase) Färbung.
    1. Teller roh 264,7 Zellen auf einer 24-Well-Platte 3 Brunnen pro Versuchsbedingung. Inkubation bei 37 ° C für ca. 6 h, die Zeit zur Vorbereitung und equilibrate Exposition Uranyl-haltigen Medien.
    2. Bereiten Sie Differenzierung Medien mit gewünschten Uranyl-Konzentrationen wie in Abschnitt 3 beschrieben (vergessen nicht, GST-RANKL Medien hinzufügen).
    3. Ersetzen Sie sanft Basismedium in Brunnen mit Uranyl-haltigen Medium. Dieser Tag gilt als Tag 0 der osteoclastic Differenzierung.
    4. Ändern Sie das Medium an Tag 2 oder 3 der osteoclastic Differenzierung durch Wiederholen der Schritte 5.1.2 und 5.1.3. Mehrkernigen Osteoklasten sollte zwischen 3 und 4 Tag angezeigt werden.
    5. Führen Sie die Falle Färbung mit dem im Handel erhältlichen Leukozyten saure Phosphatase Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
      Hinweis: Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) auch als saure Phosphatase 5, Tartrat resistente (ACP5) ist stark in Reifen Osteoklasten ausgedrückt und weitgehend als Marker für die Osteoklasten Differenzierung verwendet. Daher wird TRAP Färbung durchgeführt, um die Osteoklasten zu visualisieren. Je nach experimentellen Bedingungen und die Rate der Osteoclastogenesis könnte es am Tag 4 oder 5 den Differenzierungsprozess erfolgen.
    6. Halten Sie TRAP-gefärbten Brunnen mit PBS-Puffer bei 4 ° C für weitere Analysen (sie können unter diesen Bedingungen bis zu 3 oder 4 Wochen gepflegt werden).
  2. Osteoklasten Größe/Morphologie-Analyse.
    1. Erwerben Sie ein Bild von der gesamten Oberfläche des jedes gut. Die Auflösung des Bildes sollte ausreichen, um die Zellkerne zu unterscheiden. Betrachten Sie TRAP-positiven Zellen mit 3 oder mehr Kerne als Osteoklasten.
    2. Öffnen Sie ein Bild von einem Brunnen in der ImageJ-Software: "Datei" → "Öffnen".
    3. Überprüfen Sie die Maßeinheiten in der oberen linken Ecke des Bildes. Für die relative Quantifizierung kann jede Einheit verwendet werden. Wenn der Absolute Wert der Osteoklasten Größe notwendig ist, konvertieren Sie Maßeinheiten in µm: "Image" → "Eigenschaften". Aktivieren Sie das Kontrollkästchen "global" im Popup-Fenster um neue Maßeinheiten angewendet auf alle Bilder, die später geöffnet haben.
      Hinweis: Wenn ein Mikroskop für die Bildaufnahme verwendet wurde, wird für jedes Ziel in der imaging-Software die Pixelgröße in µm angegeben.
    4. Messparameter zu analysierenden angeben: "Analysieren" → "Set Messungen". Im Fenster Set Messungen "Area" und "Display Label" Kontrollkästchen, und deaktivieren Sie alle anderen Kontrollkästchen.
    5. Öffnen Sie den ROI (Region von Interesse) Manager: "Analysieren" → "Extras" → "ROI-Manager".
    6. Wählen Sie im Hauptfenster das rechteckige Auswahlwerkzeug. Verwenden Sie es überall im Bild einen Bereich von ca. 1.000 x 1.000 µm zu skizzieren. Diese Auswahl jetzt definiert die erste Region, in denen, die Osteoklasten Größe analysiert werden.
    7. Das ROI-Manager-Fenster klicken Sie auf "Hinzufügen"-Taste, um den ROI-Manager dieser Region des Interesses hinzu und speichern Sie sie durch einen Klick auf "Mehr" → "Speichern". Der gespeicherte ROI kann jetzt mit dem ROI-Manager jederzeit nachgeladen werden durch einen Klick auf "Mehr" → "Öffnen".
    8. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.5 - 5.2.6 4 zusätzliche Regionen für die Osteoklasten Größe Analyse definieren (Abbildung 2A und 2D).
      Hinweis: Die definierten Regionen werden zur Osteoklasten Größen in allen Bildern zu analysieren.
    9. Erstellen Sie eine Kopie von einer der 5 Regionen analysiert werden: wählte dieses ROI in der Hauptsache die ROI-Manager (die entsprechende Auswahl erscheint auf dem Hauptbild) → Rechtsklick innerhalb der Auswahl → "Duplikat". Verwenden Sie diese doppelte zur weiteren Analyse.
    10. Überprüfen Sie im Fenster ROI Manager Boxen "Zeigen Al" l und "Labels".
    11. Wählen Sie im Hauptfenster die Polygon-Auswahl-Werkzeug, eines der Osteoklasten in der Auswahl manuell zu skizzieren. Der ROI-Manager fügen Sie diese Gliederung durch Klicken auf "Hinzufügen" in das ROI-Manager-Fenster hinzu. Fahren Sie in ähnlicher Weise für alle Osteoklasten, die vollständig innerhalb des ausgewählten Bereichs liegen (Abb. 2 b und 2E).
    12. Wählen Sie im ROI-Manager-Fenster die Umrisse und Messen Sie ihre Oberfläche zu, indem Sie auf "Messen". Übertragen Sie die Messungen, die in einem neuen Fenster (Ergebnisse Fenster, Abbildung 2 und 2F) erschienen auf ein Arbeitsblatt.
      Hinweis: An dieser Stelle die Region der Analyse die Osteoklasten Umrisse konnte gerettet werden als ein unabhängiges Bild: "Datei" → "Speichern unter" Format der Wahl.
    13. Wiederholen Sie die Schritte 5.2.8 - 5.2.12 für die übrigen Regionen der Analyse des aktuellen Bildes. Wiederholen Sie den Vorgang für alle anderen Bilder.
  3. Osteoklasten Zahlenanalyse mit ImageJ-Software.
    Hinweis: Als Osteoklasten Verteilung im Brunnen nur selten homogen ist, führen Sie die Zählung im großen und ganzen gut anstatt auf einigen ausgewählten Zonen. Da die Osteoklasten sind heterogen in Form und Größe, nicht automatisierten Zelle Zählmethode ist praktikabel.
    1. Öffnen Sie eine Bild ganz gut in die ImageJ-Software (für diese Analyse, Bilder von vorherigen Unterabschnitt).
    2. Öffnen Sie das Fenster Zelle Zähler: "Plugins" → "analysieren" → "Cell Counter". Klicken Sie auf "Initialisieren" und aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Typ 1" (oder was auch immer Anzahl geben Sie bevorzugen). Überprüfen Sie, ob "Show-Nummer" aktiviert und "Löschen-Modus" Feld deaktiviert ist.
    3. Klicken Sie auf das Bild auf einem Osteoklasten: farbiger Punkt und eine Reihe erscheinen wo geklickt haben. Fahren Sie in ähnlicher Weise für alle Osteoklasten. Speichern Sie die Markierungen regelmäßig durch Klicken auf "Markierungen speichern" im Fenster "Zelle-Zähler"
      Hinweis: Wenn der letzte Punkt hat der Graf entfernt werden, klicken Sie auf "Löschen" im Fenster "Zelle-Zähler". Wenn es mehr als einen Punkt zu entfernen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen "Löschen-Modus" und geben alle ungültigen Punkte indem Sie darauf klicken. Deaktivieren Sie das "Löschen-Modus" Kontrollkästchen, um die Anzahl der weiter.
    4. Zeigen Sie das Ergebnis des Zählens durch Ergebnisse in der Zelle-Zähler-Fenster anklicken. Übertragen Sie die endgültige Zählergebnisse auf ein Arbeitsblatt.

6. Analyse der Funktion der Osteoklasten in Anwesenheit von U(VI)

  1. Grube Resorption Assay.
    1. Teller roh 264,7 Zellen auf eine 24-Well Osteo-Assay-Platte, die eine synthetische anorganische Osteomimetic Oberfläche bietet, die durch Osteoklasten resorbiert werden kann.
      Hinweis: um Zellen auf die biomimetische Oberfläche befestigen lassen, ist es oft besser, sie am Tag vor dem Hinzufügen der Differenzierung Medium Platte.
    2. RAW 246,7 Zellen in Osteoklasten zu unterscheiden, wie beschrieben in Abschnitt 5 (Schritte 5.1.2 - 5.1.4)
    3. Am Tag 5 des Osteoclastogenesis entfernen Sie Osteoklasten aus der mimetischen Knochenoberfläche Uranyl-haltigen Medium mit 10 % Bleichmittel-Lösung zu ersetzen. 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie Brunnen zweimal mit entionisiertem Wasser und lassen Sie sie an der Luft trocknen.
    4. Hinzufügen einer 1 % Alizarin Rot S Natrium Salzlösung in die Vertiefungen, Calciumsalze im Bereich nicht resorbiert zu beflecken. Alizarin-Lösung nach 10-15 s der Inkubation entfernen und vorsichtig die Brunnen 3-4 Mal mit Wasser waschen. Lassen Sie die Brunnen an der Luft trocknen.
      Hinweis: Die oben beschriebenen Färbeverfahren soll Kontrast zwischen der resorbiert und nicht resorbiert Bereichen zu verbessern, um aufeinander folgende Analyse zu erleichtern. Dieses Verfahren muss sorgfältig durchgeführt werden, denn wenn der Brunnen nicht vollständig trocken sind, bevor Färbung, Teile der übrigen Knochen-mimetischen Oberfläche versehentlich entfernt werden konnte. Darüber hinaus Wenn Alizarin Lösung zu lange in den Vertiefungen zurückbleibt, wird eine anhaltende unspezifische Färbung angezeigt. Es sei darauf hingewiesen, dass die in diesem Abschnitt beschriebenen Test bezieht sich auf die Wirkung von Uran auf osteoclastic Differenzierung und Funktion. Um die Wirkung von Uran auf Resorption unabhängig von Osteoklasten Bildung zu untersuchen, RAW 264,7 Zellen behandelt werden können, mit Uranyl-haltigen Mittel für 24 Stunden nur einmal Reifen Osteoklasten (an Tag 4 oder 5 von den Differenzierungsprozess) ausgebildet sind 23.
  2. Grube Resorption Analyse.
    1. Erwerben Sie ein Bild von der gesamten Oberfläche des jede Vertiefung der Osteo-Assay-Platte.
      Hinweis: Bild Akquisemethoden können variieren sollte jedoch konstant wiederholte Experimente. Sie können ein Bild mit einem Makro-Ziel einer festen Kamera, einen hochauflösenden Scan oder ein Mosaikbild, die mit einem automatisierten Hochdurchsatz-Mikroskop enthalten.
    2. Beginnen Sie Analyse durch Wiederholen der Schritte aus dem vorherigen Abschnitt 5.2.2, 5.2.4.
    3. Ein RGB-Bild in ein Graustufenbild 8-Bit-Format zu konvertieren: "Image" → "Typ" → "8-Bit".
    4. Wählen Sie im Hauptfenster das ovale Auswahlwerkzeug. Verwenden sie zum Zeichnen eines Kreises, die über die Oberfläche des Brunnens für die Resorption analysiert werden.
    5. Speichern Sie diese neue ROI wie in Schritt 5.2.6.
    6. Zur Erleichterung der Schwelle Auswahl deaktivieren Sie alle Funktionen außerhalb der definierten ROI: "Bearbeiten" → "Klar vor".
      Hinweis: An dieser Stelle ist es oft besser, ein paar Kopien des Bildes zu machen: ROI zu deaktivieren, klicken Sie außerhalb der gewählten Zone → Rechtsklick auf das Bild → "Duplikat". Dadurch vermeiden Sie eine Wiederholung der oben beschriebenen, wenn der Schwellenwert im nächsten Schritt gewählt unbefriedigend ist Bild-Behandlung.
    7. Wählen Sie "Bild" → "Adjust" → "Threshold". Verwenden Sie im Fenster "Schwelle" den Schieberegler, um einen angemessener Schwellenwert zu wählen. Wachsene überall sollte unterhalb des Schwellenwerts (weiß) und nicht resorbiert, oben (rot). Um die Schwelle Auswahl abgeschlossen haben, klicken Sie auf "Übernehmen" im Fenster "Schwelle".
    8. Speichern Sie die endgültige binäre Bild: "Datei" → "Speichern unter" → Format Ihrer Wahl.
    9. Messungen in der Region von Interesse zu definieren: "Analysieren" → "Set Messungen". Überprüfen Sie im Fenster Set Messungen "Area", "Bereich Bruchteil" und "Limit-Schwellenwert" Boxen und deaktivieren Sie alle anderen.
    10. Um den Bruch des "resorbiert" Bereich direkt im Fenster Ergebnisse zu erhalten, invertieren Sie das binäre Bild ("Bearbeiten" → "Invert"). Sicherzustellen, dass die wichtigsten ROI auf binäre Endbild ausgewählt ist (ansonsten wachsene Bereich Bruchteil berechnet werden basierend auf der Oberfläche des Fensters Gesamtbild). Maßnahme wachsene Bereich Bruch entweder durch Klick auf "Maßnahme" im ROI-Manager-Fenster oder auf "analysieren" → "Messen". Speichern Sie das Ergebnis.

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Representative Results

Tartrat-resistente saure Phosphatase Färbung wurde verwendet, um die Osteoklasten als große lila Zellen mit 3 oder mehr Kerne zu visualisieren. Repräsentative Bilder von Osteoklasten aus rohen 264,7 Zellen kultiviert in Anwesenheit von RANKL und Uranyl Ionen sind in Abbildung 1dargestellt. Änderungen in der Anzahl und Größe der Osteoklasten in Reaktion auf Uran sind gut sichtbar in zusammengesetzte Bilder von ganzen Brunnen und vergrößerte Bilder.

Größe von Osteoklasten wurde analysiert, mithilfe von ImageJ Software (Abbildung 2). Zu diesem Zweck ganz gut Bilder von TRAP gebeizt Osteoklasten dienten und die gleichen Regionen in jede Vertiefung jeder Kultur Bedingung behandelt wurden (Abbildung 2A und 2D). Alle Osteoklasten vorhanden in jeder Region wurden beschrieben (Abb. 2 b und 2E) ermöglichte die Bestimmung ihrer Fläche (ausgedrückt in µm2) (Abbildung 2 und 2F). In Abbildung 2 gezeigten Beispiele illustrieren die starke Wirkung von Uran auf Osteoklasten Größe.

Um die Auswirkungen von Uran auf Osteoklasten Resorption Aktivität zu untersuchen, wurden roh 264,7 Zellen überzogen und auf Osteomimetic Oberfläche Teller unterschieden. Am Ende des Tests wurden Osteoklasten entfernt. Dann mimetischen Knochenoberfläche in jedem gut wurde von Alizarin Rot S Natriumsalz um nicht resorbiert Bereich Fleck behandelt und Bilder von jedem ganz gut erworben wurden (Abbildung 3A und 3D). Die daraus resultierenden Bilder wurden mit Bild J Software verarbeitet. Sie wurden in 8-Bit-Graustufen-Bilder umgewandelt (Abb. 3 b und 3E), Schnittstellenüberwachung unterzogen (Abbildung 3 und 3F) und Bereich resorbiert (weiße Regionen) wurde automatisch berechnet.

Figure 1
Abbildung 1: Darstellung der Auswirkung von U(VI) auf Osteoklasten Bildung. RAW 264,7 Zellen wurden in Anwesenheit der angegebenen Konzentration von Uranyl differenziert. Am Tag 4 wurde die Tartrat-resistente saure Phosphatase (TRAP) Färbung durchgeführt. Repräsentative ganz gut Mikrographen (oberen Platten) zeigen TRAP-gefärbten Osteoklasten in diesen Bedingungen erhalten. Beispiele von mehrkernigen Osteoklasten in geschachtelte Bereiche sind bei einer höheren Vergrößerung (Pfeile im unteren Verkleidungen) dargestellt. Diese Bilder illustrieren die dosisabhängige Wirkung von U(VI) auf Osteoklasten Bildung. Schwarzer Kopf Pfeile zeigen Beispiele der Osteoklasten Kerne. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Analyse der Auswirkungen von U(VI) auf Osteoklasten Größe. (A und D): ganz gut Bilder von Osteoklasten mit Box Bereich entsprechend den Regionen in denen Osteoklasten, Größe analysiert wurde angezeigt werden. Die rote Kästen in Bereich (A und D) entsprechen den hier gezeigten in (B) und (E), beziehungsweise. (B und E): das manuelle Zeichnen von Osteoklasten Kanten in den zwei Uranyl-Konzentration ist in blau dargestellt. (C und F): Windows von ImageJ-Software zeigt die Messwerte der (B und E) Analyse bzw. zur Folge. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Analyse der Auswirkungen von U(VI) auf Osteoklasten Funktion. Bilder von Alizarin gebeizt Osteomimetic Oberfläche nach osteoclastic Resorption, die in der Abwesenheit (A) oder in Gegenwart von 25 µM Uranyl (D) stattfand. Bilder (A und D) wurden zunächst in 8-Bit-Graustufen-Bilder umgewandelt, wie in (B und E) dargestellt und anschließend in binäre Abbilder (C und F) durch die Anwendung geeigneter Schwellwert. Diese binäre Bilder dienten zur Berechnung des Anteils des Bereichs in jedem Zustand resorbiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Soweit wir wissen, ist dies das erste Mal, das ein detailliertes Verfahren mit dem Ziel, die Wirkung des natürlichen Urans auf Knochen resorbing Zellen untersuchen beschrieben wird. Dieser Ansatz wird nützlich sein, um ein besseres Verständnis der Uran-Auswirkungen auf die Physiologie des Knochens zu erreichen und bieten ein interessantes neues Tool für das Screening von Uran Chelatoren. Darüber hinaus glauben wir, dass das hier beschriebene Protokoll angewendet werden könnte, um die Auswirkungen von anderen Schwermetallen auf Osteoclatogenesis zu untersuchen.

Es ist bekannt, dass das Uranyl komplexiert mit anorganischen und organischen Komponenten in Kulturmedien18,19,20,21ist. Diese Complexations beeinflussen die Speziation von Uran und auf diese Weise seine Zytotoxizität. Aus diesem Grund ist ein entscheidender Schritt in das Protokoll der Vorbereitung der Uran-haltigen Nährmedien. Wir haben bisher23 gezeigt, die die Anwesenheit von 5 % fötalen Rinderserum in das Kulturmedium RAW 264,7 Zellen keinen signifikanten Einfluss auf die Zytotoxizität von Uranyl wenn in Konzentrationen von 0 bis 400 µM eingesetzt hatte. Dies ist ein wichtiger Punkt, da das Vorhandensein von Serum im Medium erforderlich ist, um die Wirkung von Uranexposition während des gesamten Prozesses der osteoclastic Differenzierung zu analysieren. Wir möchten jedoch betonen, dass die lange Zweischrittverfahren beschrieben für die Vorbereitung der Exposition Medien (6 Stunden) sorgfältig befolgt werden muss. In der Tat Inkubationsschritt von 3 Stunden nach jeder Verdünnung Uranyl Salze die Stabilisierung der Uranyl komplexe potenziell ermöglicht in Lösung vor weiteren Verdünnung oder Zelle Exposition gebildet. Dies ist unbedingt erforderlich, um zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Ein weiterer wichtiger Parameter für die Reproduzierbarkeit der Osteoklasten Differenzierung und Resorption Assays ist die Aussaatdichte der RAW 264.7 Zellen. In der Tat hat sich gezeigt, dass mononukleären Vorläufer Dichte ein kritischer Faktor für Osteoklasten Bildung, wahrscheinlich weil Zell-Zell-Nähe zelluläre Verschmelzung Veranstaltungen24beeinflusst. Daher muss ein besonderes Augenmerk geschenkt, Zell-Zählung, Zellsuspension Vorbereitung und Homogenität der Aussaat in jede Vertiefung, um Fehlinterpretationen zu vermeiden.

Die Schwellwerte Tool ist nützlich für die Automatisierung der Quantifizierung der Resorption. Es lohnt sich, darauf hinzuweisen, dass diese Analyse erfordert richtig beleuchtete Bilder. Allerdings ist ein häufiges Problem unabhängig von der Art der Kamera und Bild Erwerbsmethode ungleichmäßige Beleuchtung an den Rändern des Bildes. In diesem Fall kann eine mehrstufige Schnittstellenüberwachung Methode notwendig sein.

Zusammenfassend lässt sich sagen haben wir ein robustes Protokoll ermöglicht die Untersuchung der Uran-Auswirkungen auf die Osteoklasten Bildung, Wirtschaftlichkeit und Funktion etabliert. Dieses Verfahren wurde durch die Verwendung der RAW 264,7 Zell-Linie entwickelt aber gilt uneingeschränkt für primäre Knochenmark Osteoklasten-Vorläufer wie wir23gezeigt haben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben

Acknowledgments

Die Autoren möchten Chantal Cros für hilfreiche technische Unterstützung zu danken.
Diese Forschung wurde finanziert durch Zuschüsse aus den "Commissariat À Hang Atomique et Aux alternativen Energien" (URANOs - Programm transversale de Toxicologie du CEA und CPRR CEA-AREVA), und von ANR (Toxizität von Uran: Multi-level-Ansatz der Biomineralisation Prozess in Knochen, ANR-16-CE34-0003). Diese Arbeit wurde auch von der Universität Nizza Sophia-Antipolis und CNRS unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Lonza BE12-604F
α-MEM Lonza BE12-169F
EMEM without phenol red Lonza 12-668E
Water for cell culture Lonza BE17-724F
PBS Sigma-Aldrich D8537
Penicillin-Streptomycin solution Sigma-Aldrich P4333
 L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Trypan Blue Solution 0.4% Sigma-Aldrich T8154
HyClone fetal bovine serum GE Life Sciences SH30071.03
7.5% sodium bicarbonate aqueous solution Sigma-Aldrich S8761
Acid Phosphatase, Lekocyte (TRAP) kit Sigma-Aldrich 387A
Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT) powder Sigma-Aldrich M5655
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879
Alizarin Red S sodium salt, 1% w/v aq. sol. Alfa Aeros 42746
Osteoassay bone resorption plates, 24 well plates Corning Life Sciences 3987
Multiwell 24 well plates Falcon 353504
Flask 75 cm2 Falcon 353133
Polypropylene Conical Tubes 50 ml Falcon 352070
Cell scrapers 30 cm TPP 90003

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References

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