Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Immunology and Infection

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Summary

Nous décrivons ici une méthode simple et rapide pour l’isolement de Salmonella typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec biotine et streptavidine.

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Gutiérrez, S., Wolke, M., Plum, G., Robinson, N. Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages. J. Vis. Exp. (128), e56514, doi:10.3791/56514 (2017).

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Abstract

Salmonella typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les vésicules appelés phagosomes afin d’être dégradée. Isolement de S. Typhimurium-phagosomes contenant ont été largement utilisées pour étudier comment S. Typhimurium infection modifie le processus de maturation du phagosome pour empêcher la dégradation bactérienne. Classiquement, l’isolement des bactéries contenant les phagosomes a été réalisée par centrifugation en gradient de saccharose. Toutefois, ce processus prend du temps et nécessite un équipement spécialisé et une certaine dextérité. Décrite ici est une méthode simple et rapide pour l’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes des macrophages en enduisant les bactéries avec des billes magnétiques conjugué streptavidine-biotine. Les phagosomes obtenus par cette méthode peuvent être suspendus dans un buffer quelconque de choix, ce qui permet l’utilisation des phagosomes isolés pour un large éventail de tests, tels que l’analyse de protéines, lipides et métabolite. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est précis, efficace, rapide, nécessite l’équipement minimal et est plus souple que la méthode classique d’isolement par gradient de saccharose-ultracentrifugation.

Introduction

Macrophages circulent des cellules phagocytaires spécialisées qui détectent, engloutissent et dégradent toute particule étrangère présente dans les tissus périphériques, allant des cellules apoptotiques à envahir les micro-organismes comme les bactéries. Dès la surface médiée par les récepteurs de reconnaissance de marqueurs spécifiques pathogène communément présentes à la surface des microorganismes (appelés profils moléculaires de micro-organismes pathogènes associés ou PAMPs), macrophages initier une réorganisation complexe de la membrane cellulaire en afin d’entourer et de phagocyter l' agent pathogène1.

L’agent pathogène phagocytée figure ensuite par les macrophages dans une vésicule intracellulaire appelé phagosome. Grâce à une série de fusion et d’événements de fission avec autres vésicules comme endosomes et les lysosomes, le phagosome contenant des agents pathogènes acquiert un ensemble de protéines nécessaires à l’élimination du contenu phagosome. Par conséquent, la composition enzymatique du phagosome est très variable au cours de ce processus, appelé phagosome maturation2.

Peu de temps après la phagocytose, les multimères complexe ATPase vacuolaire (v-ATPase) est incorporé dans la membrane du phagosome par fusion avec les endosomes3. Ce complexe utilise l’ATP aux protons de la pompe du cytosol vers la lumière du phagosome4. L’acidification du phagosome est essentielle pour les événements de fusion avec d’autres vésicules5 et pour l’activation d’un grand nombre d’enzymes de dégradation dépend du pH6. Un autre complexe enzymatique multimériques qui est rapidement monté sur la membrane du phagosome est le complexe NADPH oxydase (NOX). NOX complexe oxyde NADPH afin de produire des espèces réactives de l’oxygène (ROS) qui sont sécrétés dans la lumière du phagosome et qui contribuent significativement à la mise à mort des micro-organismes ingérés7.

Pendant les premières étapes de maturation, phagosomes présentent marqueurs généralement comme Rab5 et Rab7 des endosomes précoces et tardifs respectivement avec la sous-unité de0 V de la v-ATPase8. Fusion des phagosomes avec les lysosomes et endosomes fin se traduit par l’exposition de l’agent pathogène phagocyté à une grande variété d’enzymes hydrolytiques telles que la cathepsine protéases, lipases et9de la β-galactosidase. L’acidification de la lumière est également nécessaire pour l’activation de ces enzymes. Par exemple, le clivage de la cathepsine D pour produire la forme abrégée active est dépendante du pH10. Ces enzymes dégradent l’agent pathogène et agir comme médiateur de la production de peptides courts pathogène dérivées qui sont présentés par les macrophages majeur d’histocompatibilité (MHC) classe II des molécules complexes de lymphocytes T pour déclencher une réponse immunitaire adaptative11.

Par conséquent, maturation phagosome est cruciale pour la réponse immunitaire innée et relie les bras innées et adaptatives du système immunitaire. C’est sans surprise que les pathogènes ont évolué des stratégies pour surmonter l’élimination par les macrophages à travers le processus décrit ci-dessus de la maturation du phagosome. Par exemple, la bactérie intracellulaire, Mycobacterium tuberculosis et Legionella pneumophila empêche la maturation phagosome par Assemblée de v-ATPase inhibiteur et lumen conséquente l’acidification12,13 . D’autres bactéries, comme Listeria monocytogenes ou Shigella flexneri induisent la formation de pores dans la membrane du phagosome s’échapper dans le cytosol14,15. En revanche, Salmonella enterica serovar typhimurium (S. typhimurium) est capable de modifier les propriétés du phagosome dans la vacuole pour le transformer en un endroit approprié pour sa réplication16. Cette capacité en fait S. typhimurium un modèle très intéressant pour étudier les interférences induite par l’agent pathogène de la maturation du phagosome.

S. typhimurium est une bactérie intracellulaire facultative qui provoque la gastro-entérite chez les humains. Après l’invasion de la lamina propria, S. Typhimurium bactéries sont rapidement détectés et phagocytose par les macrophages et contenues dans les phagosomes17. Certains rapports ont décrit précédemment S. Typhimurium-phagosomes contenant présentent à thé pour les endosomes et les lysosomes18, et autres études ont révélé la fusion phagosome-lysosome empêchée sur S. Typhimurium infection19.

Au départ, phagosome maturation sur S. Typhimurium infection a été étudiée par microscopie d’immunofluorescence. Le développement des techniques d’isolement de bactéries contenant les phagosomes a permis une étude plus précise du contenu en termes de marqueurs endosome et lysosome phagosome. À ce jour, la principale méthode utilisée pour l’isolement des bactéries contenant les phagosomes est le fractionnement subcellulaire le saccharose étape dégradés18,20. Toutefois, cette méthode nécessite plusieurs étapes de centrifugation qui peuvent causer des dommages mécaniques aux phagosomes, peuvent influer sur la stabilité des composants phagosome (protéines et lipides) et prend du temps. En outre, il nécessite l’utilisation d’une ultracentrifugeuse : une pièce d’équipement spécialisé qui n’est pas accessible pour tous les laboratoires.

Récemment, une nouvelle approche a été appliquée à l’isolement bactérien contenant des phagosomes, dans lequel les bactéries pathogènes sont étiquetés avec lipopetide biotinylé (Lipobiotin) et plus tard extraite à l’aide de billes magnétiques conjugué streptavidine21 . Nous vous proposons une méthode alternative complémentaire par marquage bactériennes surfaces contenant des amines macromolécules avec NHS-biotine suivie de billes magnétiques conjugué streptavidine. Les phagosomes obtenus par cette méthode sont fortement enrichis en marqueurs endosome et lysosome et peuvent être utilisés pour un large éventail de tests, de l’analyse de la protéine à omics analyse. En outre, il ne nécessite pas d’équipement spécialisé comme ultracentrifugeuses. De plus, en éliminant les étapes de centrifugation, les dommages mécaniques aux phagosomes tant la quantité de temps employé sont réduites considérablement. Cette méthode peut être facilement adaptée pour l’isolement des phagosomes contenant d’autres bactéries telles que les Gram positif Staphylococcus aureus, également inclus dans ce manuscrit. En résumé, cette méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes est un simple, rentable, et moins de temps que l’isolation classique de saccharose gradient-ultracentrifugation, rendu hautement enrichi phagosomes contenant des bactéries.

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Protocol

toutes les étapes impliquant l’utilisation de pathogènes S. Typhimurium doit être effectué dans un BSL-2 ou supérieure installation de niveau de sécurité biologique. La culture et le revêtement de l’art. Typhimurium, ainsi que l’infection des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs) doit être effectuée sous une hotte à flux laminaire pour éviter la contamination. L’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes peut être exécutée sur n’importe quel banc de laboratoire BSL-2.

l’extraction de la moelle osseuse de souris pour sa différenciation en macrophages a été réalisée conformément aux lignes directrices sur le bien-être animal et approuvée par l’Agence d’Etat de Rhénanie du Nord-Westphalie pour la Nature, Environnement et Protection des consommateurs [Landesamt für Natur, Umwelt et Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen ; N° du greffe : 84-02.05.40.14.082 et 84-02.04.2015.A443] et l’Université de Cologne.

1. Culturing S. typhimurium

  1. ensemencer S. Typhimurium (Souche SL1344) d’une seule colonie bactérienne dans 5 mL de bouillon de cerveau coeur cervelle (BHI) en utilisant une boucle bactérienne.
  2. Incuber la suspension bactérienne dans un incubateur à 37 ° C durant la nuit, avec agitation.
  3. Le lendemain, transvaser 1 mL de la suspension bactérienne dans 19 mL de bouillon BHI dans une fiole conique et incuber à 37 ° C dans un incubateur avec agitation.
  4. Surveiller l' S. croissance de Typhimurium en mesurant la densité optique (do) à 600 nm (OD 600) avec un spectrophotomètre. Mesures environ chaque 30 min.
  5. OD lorsque 600 atteint 1,0, retirer une suspension bactérienne de l’incubateur et le transfert en tube de 50 mL. Centrifuger les bactéries à 5 400 g pendant 15 min à 4 ° C.
  6. Supprimer le surnageant et remettre en suspension dans 10 mL de sérum physiologique tamponnée au phosphate (PBS).
  7. Centrifuger à 5 400 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  8. Enlever le surnageant et remettre en suspension les bactéries en 4,9 mL de PBS stérile.

2. Revêtement de S. typhimurium avec billes magnétiques conjugué NHS-biotine/streptavidine

  1. Ajouter 100 µL de 10 mg/mL de biotine reliant solution (NHS-biotine dissous dans le diméthylsulfoxyde, DMSO) fraîchement préparée, à la suspension bactérienne préparé à l’étape précédente. Par exemple, diluer de 5 mg de NHS-biotine dans 0,5 mL de DMSO stérile. Mélanger correctement en pipettant également monter et descendre plusieurs fois.
  2. Diviser le mélange en cinq tubes de 1,5 mL.
  3. Laisser incuber pendant 2 h à température ambiante (RT) sur un thermoblock avec agitation constante à 350 tr/min.
  4. Centrifuger les tubes à 15 000 x g pendant 10 min à RT et éliminer le surnageant.
  5. Remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile, centrifuger à 15 000 x g pendant 10 min à RT et éliminer le surnageant.
  6. Répéter l’étape 2.5 deux fois plus pour supprimer complètement la biotine excès reliant solution.
  7. Après le dernier lavage, resuspendre le culot dans 1 mL de PBS stérile.
  8. Transférer 100 µL de solution de billes magnétiques conjugué streptavidine 10 mg/mL dans un tube de 1,5 mL et laissez-le sur le support magnétique pendant 5 min.
  9. Supprimer le solvant avec une pipette, prendre la solution de billes magnétiques conjugué streptavidine-de la grille magnétique et il resuspendre avec 1 mL de suspension bactérienne enduite de biotine préparée à l’étape 2.7.
  10. Laisser incuber pendant 1 h à RT sur un thermoblock avec agitation constante à 350 tr/min.
  11. Placer la solution sur la grille magnétique ; attendre 5 min et puis retirez avec une pipette les bactéries qui n’adhèrent pas au mur (Gardez-le dans un tube étiqueté comme " non couché bactéries "). La fraction adhérant à la paroi du tube en contact avec l’aimant est la bactérie biotine-streptavidine.
  12. Enlever le tube contenant la bactérie étiquetée de la grille magnétique et remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile.
  13. Placer à nouveau sur le support magnétique, attendre 5 min et utilisez une pipette pour supprimer le PBS.
  14. Répéter les étapes 2.13 et 2.14 deux fois plus pour éliminer toutes les bactéries qui ne sont pas recouvertes de billes magnétiques conjugué streptavidine.
  15. Après le dernier lavage, remettre en suspension les bactéries recouvertes dans 500 µL de PBS stérile et le tube sous l’étiquette " enduit bactéries ".
  16. Compter la colonie (UFC) d’unités des deux formant " bactéries non couché " et " enduit bactéries " solutions en ensemençant des dilutions en série sur plaques de gélose BHI. Environ la 2 x 10 8 UFC/mL de bactéries recouvertes sont obtenus à partir de 20 mL de la suspension bactérienne avec OD 600 de 1.0. Garder la suspension bactérienne couché à 4 ° C à utiliser le jour suivant pour infecter les macrophages.

3. Infection de BDMDs

  1. le jour même où les bactéries sont recouvertes de biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine, plaque entièrement différenciés BMDMs 22 dans les plats de 6 cm à une densité de 5 x 10 6 cellules / plat.
  2. Le lendemain, centrifuger la suspension bactérienne enduit à 15 000 x g pendant 5 min à 4 ° C.
  3. Enlever le surnageant et remettre en suspension dans un milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF) à une concentration de 10 x 10 6 UFC/mL.
  4. Pour infecter les macrophages à une multiplicité d’infection (MOI) de 10, retirer le support des BMDMs et ajouter 5 mL de suspension bactérienne enduit préparée. MOI optimale peut être évalué pour chaque type de cellule ou but expérimental des phagosomes isolés.
  5. Incuber à ta pendant 10 min pour synchroniser phagocytose.
  6. Incuber à 37 ° C dans une étuve à 2 CO 5 % pendant 30 min à ouvrir la phagocytose. Autres types de cellules peuvent nécessiter des temps d’incubation différents afin d’assurer l’internalisation des bactéries.
  7. Enlever le support contenant des bactéries de la vaisselle et laver les cellules avec RPMI trois fois pour éliminer les bactéries non intériorisé.
  8. Enfin ajouter 10 mL de milieu RPMI contenant 10 % de SVF et 50 µg/mL de gentamycine pour tuer toutes les bactéries non-phagocytose.
  9. Incuber les BMDMs infectés à 37 ° C, avec 5 % de CO 2 jusqu'à ce que le point de la durée désirée. Le point de la durée souhaitée doit être déterminé expérimentalement selon les bactéries et cellules du type utilisé et le but de l’analyse. Pour l’étude des événements de fusion phagosome-endosome précoce en S. Typhimurium infectés par BMDMs, il est recommandée d’une incubation de 30 min. Pour l’analyse des événements ultérieurs, les phagosomes peuvent être extraites après 2 h ou 4 h d’incubation. Incubation prolongée des macrophages avec S. Typhimurium au-delà de 24h entraîne la mort des macrophages. Avant l’extraction du phagosome pourrait probablement mener à la dégradation des molécules de biotine a étendu l’infection intracellulaire. Cependant, nous n’avons pas observé perte de biotine sur enduit-bactéries jusqu'à 24 h.

4. Isolement de S. Typhimurium-contenant des Phagosomes

tampon d’isolement
  1. Prepare le volume du phagosome requis un (50 mM tuyaux, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA) en ajoutant le dithiothréitol (DTT) à une concentration finale de 1 mM, la cytochalasine B vers une finale concentration de 10 µM et protéase et phosphatase des inhibiteurs tel que recommandé par le fabricant.
    NOTE : TNT et cytochalasine B doivent être ajoutés pour les tampons d’isolement phagosome A toujours immédiatement avant leur utilisation. Cytochalasine B perturbe le cytosquelette, faciliter la rupture de la membrane cellulaire.
  2. Au moment voulu pointer, retirer le support des cellules infectées et laver avec du PBS stérile réchauffée à RT.
  3. Ajouter 750 µL de phagosome isolation tampons A par plat et incuber 20 min sur la glace. Lorsque vous utilisez le nombre de cellules différentes, le volume des tampons d’isolement A doit être ajusté proportionnellement.
  4. Ajouter 250 µL de tampon d’isolement phagosome B (tubes de 50 mM, pH.7, 50 mM MgCl 2, 5 mM EGTA, 220 mM de Mannitol et saccharose 68 mM). Roche la plaque pour faire en sorte que la mémoire tampon atteint la surface complète du plat. Lorsque vous utilisez le nombre de cellules différentes, le volume de tampon isolation B doit être ajusté proportionnellement.
  5. Enlever les cellules de la capsule en grattant doucement à l’aide d’une spatule en caoutchouc et transférez-les sur un tube préalablement réfrigérées 1,5 mL.
  6. Passer la suspension cellulaire à travers une aiguille 26G à l’aide d’une seringue de 1 mL au moins 15 fois (une aspiration plus une éjection des suspension de globules en une seule fois). C’est assez pour libérer le contenu cytosolique de BMDMs. Le nombre de passes par l’intermédiaire de l’aiguille doit être optimisé pour chaque type de cellule.
  7. Placer la suspension cellulaire sur la grille magnétique et attendre 5 min. Les particules attachées à l’aimant sont les phagosomes contenant couché - S. Typhimurium. La suspension contient le reste des composants cellulaires.
  8. Transférer la suspension dans un tube de 1,5 mL étiqueté comme " cytosol ".
  9. Retirer le tube avec les phagosomes isolés de la grille magnétique et les remettre en suspension dans 1 mL de PBS stérile.
  10. Placer la suspension phagosome sur la grille magnétique, attendre 5 min et retirer le PBS.
  11. Répéter les étapes 4.9 et 4.10 pour laver l' isolé S. Typhimurium-contenant des phagosomes.
  12. Enfin supprimer les PBS et remettre en suspension les phagosomes dans la mémoire tampon requise, par exemple, dans une immunoprécipitation (RIPA) tampon pour l’analyse des protéines. Environ 50-200 µg de protéine est obtenue par l’échantillon suivant ce protocole, selon le montant initial des cellules et le ministère de l’intérieur de l’infection.

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Representative Results

Isolement des bactéries contenant les phagosomes par ce protocole requiert la biotinylation des bactéries dans un premier temps. Nous avons donc évalué l’efficacité de l’art. Typhimurium biotinylation par analyse de microscopie confocale de BMDMs infecté par biotinylé mCherry -S. typhimurium marquées avec la Streptavidine-Cy5. Brièvement, les BMDMs étaient infectés comme décrit dans le présent protocole avec mCherry -S. Typhimurium biotinylés précédemment mais non incubés avec billes magnétiques conjugué streptavidine. Après 30 min d’incubation à 37 ° C, les cellules ont été lavés avec du PBS chaud et fixés avec 4 % de formaldéhyde pour 20 min à RT. Fixation a été arrêté par un lavage avec du PBS. Les cellules ont été ensuite perméabilisées avec 3 % Triton en PBS pendant 5 min à RT. infectés BMDMs sont ensuite incubées avec Cy5 streptavidine-pendant 20 min à 4 ° C. Après un lavage, les échantillons ont été préparés pour l’analyse en microscopie confocale (Figure 1). Pas de biotinylé mCherry -S. Typhimurium a été utilisé comme contrôle négatif. Un signal fluorescent de streptavidine-Cy5 observa exclusivement chez biotinylé mCherry -S. typhimurium, confirmant que biotinylation des bactéries a été réussie. Analyse microscopique a été réalisée sur un microscope confocal à l’aide de « 60 X O2 NA : 1.40 » objectif. Ondes d’excitation pour les fluorochromes étaient 405 nm (DAPI), 559 nm (mCherry) et 635 nm (Cy5) et PMT tension a été fixée à 574v, 565v et 443v, respectivement.

Depuis la réponse immunitaire déclenchée dans les macrophages par S. Typhimurium est largement tributaire de l’activation de récepteur de surface de macrophages par des ligands bactériennes, ensuite, nous avons testé si le revêtement de S. typhimurium avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine pourrait altérer la réponse immunitaire innée dans BMDMs infectés. Tout d’abord, nous avons évalué si revêtement de S. Typhimurium pourrait altérer la capacité phagocytaire des BMDMs par microscopie confocale. BMDMs ont été infectés, comme décrit dans le présent protocole avec mCherry -S. Typhimurium enduit avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine ou non couché mCherry -S. typhimurium. Après 30 min d’incubation à 37 ° C, les cellules ont été lavées avec du PBS chaud et fixés avec 4 % de formaldéhyde pendant 20 min à température ambiante. Après un lavage avec du PBS, les échantillons ont été préparés pour l’analyse par microscopie confocale. Comme illustré à la Figure 2, macrophages phagocytose couché et non couché mCherry -S. Typhimurium également.

Ensuite, nous avons analysé la réponse inflammatoire déclenchée par S. typhimurium enrobées de biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine (Figure 3). Surnageants des BMDMs infectés par couché et non couché S. Typhimurium ont été prélevés après 24 h d’infection pour dosage immuno-enzymatique (ELISA) sécrètent l’interleukine-6 (IL-6). Le revêtement de S. typhimurium avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine n’altère pas significativement la réponse inflammatoire des macrophages.

Pour évaluer la pureté des phagosomes contenant des bactéries obtenues en utilisant ce protocole, nous avons analysé isolé mCherry -S. Typhimurium-contenant des phagosomes par immunoblotting. En utilisant des anticorps spécifiques contre la balise mCherry, nous avons trouvé l’enrichissement significatif d’exprimant le mCherry S. typhimurium dans les phagosomes isolés par rapport à la fraction cytosolique obtenu à partir du même échantillon (Figure 4). Isolé des phagosomes contenant des mCherry - S. typhimurium qui n’était pas préalablement revêtu avec la biotine ont été utilisés comme contrôle négatif. Ces résultats démontrent que ce protocole permet à la purification des phagosomes qui sont hautement enrichis en bactéries.

Nous avons ensuite effectué immunobuvardage de marqueurs endosome et lysosome dans les phagosomes isolés contenant S. Typhimurium (Figure 5). La plupart des marqueurs endosome et lysosome était clairement observée dans les phagosomes isolés à 4 h après une infection par rapport à 30 min. L’enrichissement des marqueurs endosomale Rab5 et Rab7, ainsi que le lysosome marqueurs v-ATPase (sous-unités de1 V et V0 ) et la cathepsine D, ont été observés. Fait intéressant, seulement la forme clivée de la cathepsine D dans les phagosomes isolés à l’infection après 4 h a été observée. Le clivage de la Pro-cathepsine D (48 kDa) pour produire le formulaire actif court (33 kDa) se produit uniquement dans les phagosomes mais pas dans le cytosol, démontrant la spécificité de ce protocole pour l’isolement du phagosome.

Étant donné que les marqueurs d’organites comme les mitochondries ou réticulum endoplasmique (re) sont souvent détectés dans les préparations des phagosomes isolés contenant des bactéries, le S. Typhimurium-contenant des phagosomes isolés ont été hybridés avec des anticorps spécifiques contre le transporteur mitochondrial Tomm20 et la calnexine de protéine ER (Figure 6). Nous avons aussi testé les avec un anticorps dirigé contre l’enzyme de la glycolyse GAPDH pour évaluer la contamination cytosolique dans les phagosomes isolés. Nous avons trouvé les mitochondries et les marqueurs ER S. Typhimurium-isolé des phagosomes mais aucune contamination cytosolique.

Pour étudier la polyvalence du protocole pour l’isolement des phagosomes contenant des bactéries, la biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine, revêtement procédure a été appliquée à la bactérie Gram-positive de S. aureus. En employant la même fixation et souillant le protocole comme pour le mCherry -S. Typhimurium (Figure 1), nous avons confirmé biotinylation réussie de la protéine fluorescente verte (GFP) exprimant -S. aureus (Figure 7). En outre, nous avons détecté l’enrichissement de l’endosome marqueur Rab7 et la v-ATPase de marqueurs du lysosome (sous-unité de0 V) et isolé de la cathepsine D par immunobuvardage de GFP -S. aureus-contenant des phagosomes (Figure 8). Le clivage de la cathepsine D en sa forme mature n’était décelable après 4 h d’infection dans les échantillons du phagosome isolé, mais pas dans les fractions cytosoliques. Isolé de S. aureus-phagosomes contenant étaient exempts de contamination cytosolique, comme en témoigne l’immunodétection de GAPDH.

En résumé, nous avons démontré que notre protocole d’isolement phagosome permet l’isolement de hautement enrichis phagosomes contenant des bactéries, exempts de contamination cytosolique. Les préparatifs du phagosome isolé peuvent être utilisés pour l’analyse des marqueurs de l’endosome et lysosome pour étudier les phagosome maturation. En outre, il a été démontré que ce protocole peut être utilisé pour les bactéries Gram-négatives et Gram-positives et que la procédure d’étiquetage n’altère pas la réponse immunitaire des macrophages.

Figure 1
Figure 1 : Analyse de microscopie de Fluorescence de biotinylé S. Typhimurium à l’aide de streptavidine-Cy5. BMDMs ont été infectés pendant 30 min avec mCherry -S. typhimurium qui était biotinylé (« biotinylé S. T.«), comme décrit dans le présent protocole. Pas de biotinylé mCherry -S. Typhimurium (« Pas biotinylé S. T.«) a été utilisé comme contrôle négatif. Après fixation et perméabilisation des cellules, des échantillons ont été incubés avec la Streptavidine-Cy5 pendant 20 min à 4 ° C. Signal de fluorescence du noyau (DAPI), mCherry -S. Typhimuriumet Cy5 streptavidine-ont été analysées à l’aide de la microscopie confocale. Signal de la Streptavidine-Cy5 pourrait seulement être détecté chez les bactéries précédemment marqués à la biotine, confirmant ainsi la biotinylation efficace. Echelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Analyse microscopique de BMDMs infecté par mCherry -S. typhimurium recouvertes de biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine. BMDMs abritaient des mCherry -s. typhimurium étiqueté avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine tel que décrit dans le présent protocole. Après avoir laissé les macrophages à phagocyter les bactéries pendant 30 min, les cellules ont été fixées avec 4 % de formaldéhyde pendant 20 min à température ambiante. Les bactéries enrobées phagocytose par les macrophages ont ensuite étaient analysés par microscopie confocale. L’analyse a montré que l’ingestion de bactéries enrobées ("couché S. T.») est comparable à l’ingestion de bactéries mCherry sans étiquette (« pas couché S. T.»), démontrant que l’étiquetage avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine n’altère pas la phagocytose de S. typhimurium par les macrophages. Les noyaux ont été colorés au DAPI pour la visualisation de la microscopie. Les données apparaissent comme moyenne ± S.E.M., et la signification statistique calculée à l’aide de student t-test est représenté comme * = p < 0,05 ; ** = p < 0,01 ; = p < 0,001. Echelle = 40 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Sécrétion d’IL-6 par BMDMs infectés par la biotine et-streptavidine-conjugué des billes magnétiques, étiquetés S. typhimurium par rapport à sans étiquette S. Typhimurium . BMDMs ont été infectées par S. typhimurium enrobées de biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine tel que décrit dans le présent protocole. Après 24 h d’infection, les surnageants sont prélevés pour une analyse plus approfondie de la sécrétion d’IL-6 par ELISA. Les surnageants forment BMDMs infectés non couché S. Typhimurium étaient utilisés comme un contrôle. L’induction de la sécrétion d’IL-6 par couché S. Typhimurium n’était pas significativement différent par rapport à celle des non couché S. typhimurium. Les données apparaissent comme moyenne ± S.E.M., et la signification statistique calculée à l’aide du test t de student est représentée comme * = p < 0,05 ; ** = p < 0,01 ; = p < 0,001. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : enrichissement bactérien dans les phagosomes isolés. Enrichissement de le mCherry-tag S. typhimurium dans les phagosomes isolés recueillis après 30 min et 4 h d’infection a été comparée à la fraction cytosolique. Β-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement. Le contrôle négatif veut dire phagosomes isolées à l’aide non couché S. typhimurium , à 30 min après l’infection. Comme prévue, la sortie finale d’isolement phagosome utilisant sans étiquette S. Typhimurium ne présente pas de quantités significatives de mCherry ou de β-actine, ce qui démontre la spécificité du protocole. 20 µg de protéines a été chargé par échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Analyse des marqueurs endosome et lysosome chez isolé S. typhimurium-contenant des phagosomes. L’enrichissement de l’endosome marqueurs Rab5 et Rab7 et le lysosome marqueurs v-ATPase (V0 et V1 sous-unités) et cathepsine D a été analysée dans isolé S. Typhimurium-contenant des phagosomes extraites après 30 min et 4 h d’infection. Β-actine a été utilisé comme un contrôle de chargement. 20 µg de protéines a été chargé par échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : Analyse des marqueurs cytosoliques dans isolé S, ER et mitochondries. typhimurium-contenant des phagosomes. Le marqueur cytosolique GAPDH et la calnexine de marqueur ER le marqueur mitochondrial Tomm20 dans S. les phagosomes Typhimurium isolées à 30 min et infection après 4 h ont été analysés par immunotransfert et par rapport aux fractions cytosoliques correspondantes. 20 µg de protéines ont été chargés par échantillon. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : Analyse microscopique de GFP -S. aureus infectés macrophages. BMDMs ont été infectés par S. aureus exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) étiqueté wibiotine th comme décrit dans la méthode d’étiquetage S. typhimurium. Après avoir laissé à phagocyter les bactéries pendant 30 min, les macrophages, les cellules ont été fixées. Non couché S. aureus (« pas biotinylé S. A.«) ont été utilisés comme contrôle négatif. Après fixation et perméabilisation des cellules, des échantillons ont été incubés avec la Streptavidine-Cy5 pendant 20 min à 4 ° C. Le signal fluorescent du noyau (DAPI), GFP -S. aureuset Cy5 streptavidine-ont été analysés par microscopie confocale. Le signal de streptavidine-Cy5 ne pouvait être vu dans les bactéries précédemment marqués avec de la biotine, confirmant la biotinylation efficace. Barreaux de l’échelle = 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : Analyse des marqueurs endosome et lysosome chez isolé S. aureus-contenant des phagosomes. S. aureus-contenant des phagosomes isolés à 30 min et 2 h après l’infection 4 h, ont été analysés par immunoblotting pour marqueurs phagosome Rab5 et Rab7 v-ATPase par rapport aux fractions cytosoliques correspondantes. 20 µg de protéines ont été chargés par échantillon. Les échantillons ont aussi été testés avec un anticorps spécifique contre GAPDH, démontrant qu’isolé S. aureus-phagosomes contenant sont exempts de contamination cytosolique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Une nouvelle méthode d’isolement de S. Typhimurium-contenant des phagosomes en enduisant les bactéries avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine est décrite ici. Après perturbation douce de la membrane cellulaire, phagosomes contenant des bactéries peuvent être facilement extraites à l’aide d’un support magnétique. Nous montrons que l’étiquetage des bactéries conserve la capacité de l’agent pathogène d’induire une inflammation et n’altère pas la propriété phagocytaire de la cellule hôte. Ce qui est important, les phagosomes obtenus par cette méthode sont enrichis en bactéries et endosome/lysosome marqueurs et dépourvu de contamination cytosolique.

Cette méthode présente plusieurs avantages par rapport à la méthode d’isolement phagosome traditionnelle qui utilise la séparation gradient de saccharose. Il élimine les temps multiples étapes de centrifugation, ce qui permet au chercheur de gérer plus d’échantillons en moins de temps et obtenir des échantillons de phagosome plus purs par facilement augmenter le nombre d’étapes de lavage. L’utilisation de ce protocole élimine le besoin d’équipement spécialisé et sensible, telles que l’ultracentrifugation. Centrifugation à haute vitesse pourrait altérer les caractéristiques de vésicules et de réduire le rendement final22, qui est à éviter dans le présent protocole. Nous avons également démontré que le revêtement de l’art. typhimurium avec biotine et billes magnétiques conjugué streptavidine n’altère pas la capacité phagocytaire des macrophages. De plus, l’induction de l’IL-6 par les macrophages infectés étiquetés S. Typhimurium était inchangée par rapport aux macrophages infectés par des bactéries non étiquetés. Par conséquent, revêtement de S. Typhimurium n’induit pas de changements importants dans leur pouvoir pathogène. À notre connaissance, revêtement de S. Typhimurium ne représente pas un obstacle à l’utilisation des phagosomes isolés pour toutes les techniques d’analyse laboratoire commun.

S. typhimurium-phagosomes contenant isolés par cette méthode sont enrichis en bactéries et endosomale typique présent et marqueurs lysosomales, tels que la v-ATPase sous-unités V0 et V1 et la protéase mature clivée cathepsine D, qui peut être détectée que dans les fractions isolées phagosome. En outre, nous avons trouvé des mitochondries et marqueurs ER isolé S. Typhimurium-contenant des phagosomes. Interaction des phagosomes avec l’ER a été largement étudiée, bien que la quantité de protéines de l’ER présente dans les phagosomes contenant de l’agent pathogène peuvent varier avec l’agent pathogène a étudié et le type de cellule. Par exemple, les phagosomes contenant Brucella abortus isolées de phagocytes non professionnels sont riches en ER marqueurs23 mais pas ceux isolés de macrophages24. La calnexine a été précédemment détectée dans S. Phagosomes contenant Typhimurium isolées par gradient de saccharose18. Une interaction étroite des inertes phagosomes contenant des perles et des mitochondries a également été rapporté précédemment25, expliquant la présence de Tomm20 dans les phagosomes isolés. Protéines mitochondriales ont été trouvés dans les phagosomes isolés contenant de L. pneumophila26 ou27de la Mycobacterium. Cependant, la détection de composants de mitochondries dans les préparations des phagosomes de contenant de l’agent pathogène isolés en utilisant la méthode de centrifugation en gradient de saccharose a souvent crue à cause de sa densité similaire de cet organite et le phagosome contenant des agents pathogènes et, par conséquent, non-spécifique28. Notre méthode permet d’éviter un tel problème de contamination et fournit des informations plus fiables, ce qui suggère que les membranes mitochondriales pourraient se mêler à la membrane du phagosome. En résumé, il sera difficile d’éviter les ER et marqueurs mitochondriales en contenant de l’agent pathogène isolé préparations phagosomes, selon le type de cellule hôte et l’agent pathogène. La méthode recommandée pour la vérification de la pureté des phagosomes isolés est d’utiliser le tag-bactéries et anticorps balise spécifique pour la détection des bactéries par Western Blot. Nous montrons aussi que cette méthode d’isolation peut être adaptée pour les autres micro-organismes avec groupes amine surface disponible qui peuvent être biotinylé. À titre d’exemple, nous avons appliqué avec succès notre protocole pour isoler S. aureus-contenant des phagosomes. Phagosomes contenant S. aureus isolées à l’aide de ce protocole sont enrichis dans le lysosome et endosome marqueurs tels que v-ATPase (sous-unité de0 V) et Rab7, respectivement, mais ne présentent pas de marqueurs cytosoliques comme GAPDH.

Vésicules endosomal/phagosome offrent un environnement unique pour la dégradation d’agents pathogènes, mais préserver les antigènes pour la signalisation du système immunitaire adaptatif. Bien que, les phagosomes et le processus de maturation ont été étudiées, le microenvironnement dans le phagosome sur hébergement divers pathogènes reste insaisissable. On ignore également comment des changements métaboliques dans les cellules modifient la maturation phagosome et son contenu. Par conséquent, le protocole détaillé ici donne plus de possibilités pour étudier la biogenèse phagosome et sa fonction dans le cadre de diverses pathologies.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Recherche au laboratoire de la Robinson est financée par Cologne Cluster d’Excellence sur les réactions de Stress cellulaire dans les maladies Aging-Associated, Université de Cologne, Allemagne (CECAD ; subventionné par la DFG au sein de l’Initiative d’Excellence de la fédérale et gouvernements des États) et les subventions accordées par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 670), Köln Fortune et Maria-Pesch Fondation de l’Université de Cologne (Allemagne).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EZ-Link NHS Biotin Thermo Fisher Scientific 20217
FluidMag Streptavidin Chemicell 4205
PIPES Carl Roth 9156.2
MgCl2 Carl Roth A537.4
EGTA Carl Roth 3054.3
Sucrose Carl Roth 4621.1
Mannitol Carl Roth 4175.1
DTT Sigma 43816
Halt Protease and Phosphatase inhibitor cocktail Thermo Fisher Scientific 1861280
Cytochalasin B Sigma C6762
DYNAL or DynaMag Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
SmartSpec 3000 Spectrophotometer Bio-Rad 170-2501
Bacterial loop (10µl) Sarstedt 86.1562.010
Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 Leibniz Institute DSMZ-German collection of Microorganisms and Cell Cultures
RPMI Biochrom FG1415
PBS Biochrom L1825
Cy5-streptavidin Invitrogen SA1011
anti-beta-actin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-47778
anti-mCherry antibody Thermo Fisher Scientific PA5-34974
anti-Rab5 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46692
anti-Rab7 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-10764
anti-v-ATPase (V0) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-28801
anti-v-ATPase (V1) antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20943
anti-cathepsin D antibody Santa Cruz Biotechnology sc-6486
anti-Tomm20 antibody Santa Cruz Biotechnology sc-17764
anti-calnexin antibody Santa Cruz Biotechnology sc-46669
anti-GAPDH antibody Santa Cruz Biotechnology sc-20357

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