זרימת עבודה מקיפה עבור הביטוי מטא אנליזה ATL E3 אוביקוויטין ליגאז ג'ין משפחת גפן וזיהוי הגנום כולו

* These authors contributed equally
Published 12/22/2017
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

מאמר זה מתאר הליך זיהוי ואפיון של משפחה ג'ין הגפן חלה על משפחתו של תודרנית Tóxicos ב Levadura (ATL) E3 אוביקוויטין ligases.

Cite this Article

Copy Citation

Ariani, P., Vandelle, E., Wong, D., Giorgetti, A., Porceddu, A., Camiolo, S., et al. Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine. J. Vis. Exp. (130), e56626, doi:10.3791/56626 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

סיווג ובמינוח של הגנים במשפחה יכול באופן משמעותי לתרום את התיאור של המגוון של מקודדים חלבונים וכדי נבואתו של פונקציות משפחתי המבוסס על מספר תכונות, כגון הנוכחות של רצף מוטיבים או במיוחד אתרים עבור שינוי post-translational והפרופיל הביטוי של בני המשפחה בתנאים שונים. עבודה זו מתאר פרוטוקול מפורט עבור ג'ין אפיון משפחה. כאן, ההליך חלה על אפיון משפחת ליגאז אוביקוויטין של E3 תודרנית Tóxicos ב Levadura (ATL) בהגפן. השיטות כוללות זיהוי ברמת הגנום של בני המשפחה, אפיון גנים לוקליזציה, מבנה, שכפול, הניתוח של חלבון שנשמרת מוטיבים, התחזית של לוקליזציה חלבון אתרי זירחון וכן ג'ין ביטוי פרופיל על פני המשפחה נתונים (datasets) שונות. הליך כזה, אשר יכול להרחיב עליו ניתוחים נוספים בהתאם למטרות ניסיוני, יכול לחול על משפחה ג'ין כל מיני צמחים אשר זמינים גנומית נתונים, והוא מספק מידע חשוב לזהות את המועמדים מעניין ללימודים פונקציונלי, נותן תובנות המנגנונים המולקולריים של הצמח ההסתגלות לסביבה שלהם.

Introduction

במהלך העשור האחרון, מחקרים רבים בהגפן גנומיקה התבצע. הגפן הוא יבול כלכלית הרלוונטיים המוכרים, אשר הפך מודל למחקר על פרי פיתוח ועל התגובות של צמחים וודי מדגיש ביוטיים, והאביוטיים. בהקשר זה, שחרורו של הגנום cv. PN40024 vinifera גפן 20071 וגירסה מעודכנת שלה 20112 הוביל הצטברות מהירה של "טכנולוגיות" סרגל נתונים וכדי פרץ של מחקרים תפוקה גבוהה. בהתבסס על הנתונים שפורסמו רצף, ניתוח מקיף של משפחה גן מסוים (בדרך כלל מורכב של חלבונים שיתוף מוטיבים שנשמרת, הדמיון המבני ו/או פונקציונלי ויחסים אבולוציונית), ניתן כעת לבצע כדי לחשוף את פונקציות מולקולרית, אבולוציה, וכן ביטוי גנים פרופילים. ניתוחים אלה יכול לתרום להבנה כיצד משפחות גנים לשלוט תהליכים פיזיולוגיים ברמת הגנום כולו.

היבטים רבים של מחזור החיים של צמחים מוסדרים על ידי בתיווך אוביקוויטין השפלה של חלבונים מפתח, אשר דורשים מחזור מכויל כדי להבטיח תהליכים תאיים רגיל. חשוב על מרכיבי התהליך בתיווך אוביקוויטין השפלה הם ligases אוביקוויטין E3, אשר אחראים על גמישות מערכת, בזכות הגיוס של מטרות מוגדרות3. בהתאם לכך, אנזימים אלה מייצגים משפחה גן ענק, עם בסביבות 1,400 E3 ליגאז קידוד הגנים לחזות את הגנום תודרנית לבנה 4, כל ליגאז אוביקוויטין E3 הוא ייצג ubiquitination של חלבונים יעד ספציפיות. למרות החשיבות של המצע ספציפי ubiquitination בתקנה התאית בצמחים, מעט מאוד ידוע על איך מוסדר השביל ubiquitination, חלבונים היעד זוהו רק במקרים מעטים. פיענוח של מנגנונים אלה ירידה לפרטים ורגולציה מסתמך קודם על זיהוי ואפיון של הרכיבים השונים של המערכת, במיוחד את ligases E3. בין ligases אוביקוויטין, תת ATL מאופיין על ידי חברי 91 ב לבנה א הצגת טבעת-H2 האצבע תחום5,6, חלקם תפקיד ההגנה, הורמון תגובות7.

הצעד הראשון מכרעת להגדרת חברי משפחה חדשה ג'ין הוא ההגדרה המדויקת של התכונות משפחה, כגון קונצנזוס במוטיבים, תחומים מרכזיים המאפיינים רצף החלבון. אכן, אמין לאחזור של כל גן בני המשפחה מבוסס על ניתוח הפיצוץ דורש מספר מאפיינים רצף חובה, בתחומים חלבון מסוים, אחראי על חלבון פונקציה/פעילות, הגשה חתימת חלבון. זה ניתן בהנחייתם של אפיון הקודם מאותה משפחה ג'ין מיני צמחים אחרים או מושגת על-ידי ניתוח גנים שונים השייכים putatively מאותה משפחה, מינים שונים כדי לבודד רצפים נפוצות. בני המשפחה ואז ניתן בנפרד בשם בעקבות כללים משותפים מיושב על ידי קונסורציומים בינלאומי עבור זן צמחים נתון. בהגפן, למשל, הליך כזה הוא נתון ההמלצות של ועדת המינוח סופר ענבים ג'ין ביאור (sNCGGa), הקמת הבנייה של עץ פילוגנטי כולל נ' vinifera ו- לבנה א גנים בני המשפחה כדי לאפשר ג'ין ביאור בהתבסס על נוקלאוטיד רצפים8.

כרומוזום לוקליזציה של בני המשפחה וסקר שכפול גנטי לאפשר סימון הנוכחות של הגנום כולו או טנדם גנים המשוכפלת. מידע כזה מופיע שימושי לפענח פונקציות בשם ג'ין, מאז עלול להראות יתירות תפקודית או לחשוף למצבים שונים, כלומר, ללא-functionalization, ניאו-functionalization או תת functionalization9. שני ניאו - ולא משנה - functionalization הם אירועים חשובים יוצר חידוש גנטי, מתן רכיבים סלולר חדשים עבור הצמח ההסתגלות שינוי סביבות10. בפרט, כפילויות של אב קדמון גנים וייצור של גנים חדשים היו תכופים מאוד במהלך האבולוציה של הגנום הגפן, שהוקם גנים שמקורם הפרוקסימלית ואת טנדם כפילויות בהגפן היו בסבירות גבוהה יותר לייצר חדש פונקציות11.

פרופיל transcriptomic זה גורם מפתח נוסף לפענח את ג'ין תפקוד המשפחה. הזמינות של מסדי נתונים הציבור נותן גישה כמות עצומה של נתונים transcriptomic אפשר לנצל ולכן כדי להקצות פונקציות בשם ג'ין משפחתם באמצעות בקנה מידה גדול סיליקו ביטוי ניתוחים. ואכן, הביטוי המיוחד של כמה גנים באיברים צמח מסוים או בתגובה לחצים מסוימים יכול לתת כמה רמזים לגבי התפקידים בשם של החלבונים המתאים בתנאים מוגדרים, ולתת תמיכה היפותזות על האפשר functionalization המשנה של גנים המשוכפלת להגיב על אתגרים שונים. למטרה זו, חשוב לקחת בחשבון מספר נתונים (datasets): אלה יכול להיות זמין כבר גנים ביטוי מטריצות, כגון הרי האטלס הגנום כולו transcriptomic של הגפן איברים ושלבים התפתחותיים12, או יכול להיות בנוי אד הוק על ידי מאחזר datasets transcriptomic עבור המין הצמח המסויים נתון מדגיש מוגדרים. יתר על כן, בגישה פשוטה באמצעות שתי מטריצות, אחד עם נתוני הדמיון pairwise והשני עם המקדמים של pairwise ביטוי משותף ניתן להחיל כדי להעריך את קשרי הגומלין בין תבניות דמיון וביטוי רצף בתוך משפחה ג'ין.

מטרת עבודה זו היא לספק גישה גלובלית, הגדרת מבנה הגן, חלבון שנשמרת מוטיבים, מיקום כרומוזומלית, ג'ין כפילויות ותבניות הביטוי, כמו גם נבואתו של אתרי לוקליזציה, זרחון החלבון, להשיג אפיון ממצה של משפחה גנטי בצמחים. גישה כזו כוללת חל כאן אפיון משפחת ATL E3 ליגאז אוביקוויטין בבית הגפן. על פי תפקידם המתרחב של חברי תת ATL בוויסות תהליכים תאיים מפתח7, עבודה זו יכול גם לסייע הזיהוי של מועמדים ללימודים פונקציונלי, ולפצח בסופו של דבר את המנגנונים המולקולריים המסדירים הסתגלות של היבול חשוב על סביבתו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. זיהוי של ATL בשם ג'ין משפחה חברים

  1. גירסת האינטרנט PSI-הפיצוץ
    1. פתח את דף האינטרנט של הפיצוץ13 ולחץ על המקטע הפיצוץ חלבון.
    2. בשדה "Enter שאילתה רצף", להזין את רצף חומצות אמיניות של החלבון (VIT_05s0077g01970 כאן) שישמש כמו החללית כדי לזהות את בני המשפחה.
      הערה: חלבון נציג טוב צריך להיות בשימוש (חלבון הצגת כל התכונות החשובות המאפיינות את המשפחה).
    3. בשדה 'בחר חיפוש ערכת', בחר 'חלבון הפניות' במסד הנתונים (refseq_protein) ובין האורגניזם עניין (נ' vinifera - taxid:29760).
    4. בבחירה שדה"תוכנית", בחר באלגוריתם PSI-הפיצוץ ולחץ על לחצן הפיצוץ כדי להפעיל את הניתוח.
      הערה: על ידי לחיצה על הפרמטרים"אלגוריתם" זה ניתן לשנות כמה פרמטרים מתקדמים (מקס היעד רצפים, רישום נקודות מטריקס, סף PSI-הפיצוץ, וכו ').
    5. הפיצוץ הראשון עגול מאחזר את כל רצפי הצגת התאמות הרלוונטיים עם השאילתה (e-ערך מעל הסף הנבחר - כברירת מחדל 0.005; 0.001 בניסוי זה). בטל את בחירת כל הערכים, אשר בבירור לא שייך למשפחת תחת בדיקה על-ידי לחיצה על השניה בעמודה "בחר עבור PSI-הפיצוץ" ולהפעיל האיטראציה PSI-הפיצוץ השני על ידי לחיצה על לחצן הפיצוץ כמו שלב 1.1.4.
    6. רצפים שזוהה מסומנים בצהוב. בטל בחירת הלהיטים שאוחזרו קשוחה, לחשוף עוד חזרות כפי שמתואר בשלב 1.1.5.
    7. המשך איטראציות עד האלגוריתם אינו מוצא כל ערך רלוונטי או שיגיע התכנסות (אין ערכים חדשים נמצאים). להוריד את הרשימה של גן בשם בני משפחתה עוד ניתוחים. מבחינה ויזואלית לבדוק את הלהיטים שאוחזרו בכל עותק חוזר כדי למנוע הנוכחות של תוצאות חיוביות שגויות.
  2. הגירסה העצמאית PSI-הפיצוץ
    1. להוריד את הגירסה העצמאית של הפיצוץ על ידי לחיצה על לחצן 'הורד הפיצוץ' ב- דף הבית הפיצוץ13.
      הערה: התוכנה הפיצוץ עצמאי היא גירסה שורת הפקודה של ממשק אינטרנט שתואר קודם. היא מאפשרת לבצע את החיפוש PSI-הפיצוץ מול מסד נתונים מותאמים אישית מקומיים או מרוחקים. יתר על כן, היא מאפשרת חיפוש עם מוגדרים מראש מיקום ספציפי הציון מטריקס (PSSM).

2. ידני פיקוח מבני המשפחה PSI-הפיצוץ-מזוהה

  1. יישור מרובים
    1. לאסוף את רצפי חומצי אמינו זוהו בעבר קובץ בתבנית FASTA ולהעלות את זה לתוך התוכנה מגה14 כדי להמשיך ביישור מרובים.
    2. לפתוח את התוכנה מגה, לחץ על לחצן "יישור", לחץ על "יישור עריכה/בנייה", לחץ על "צור זווית חדשה", לחץ על "חלבון".
    3. לחץ על "ערוך" מן התפריט יישור ו "הוספת רצף מתוך קובץ". אתר קובץ FASTA שנוצרו לפני ואשר ההעלאה של כל הרצף הנסקר.
    4. לחץ על "יישור" מן התפריט יישור ו "ליישר על ידי שרירים". השתמש בפרמטרים ברירת המחדל, לחץ על כפתור "חשב" והמתן להשלמת ההיערכות מרובים.
    5. מבחינה ויזואלית לבדוק את היישור מרובים כדי לא לכלול את בני המשפחה באופן שגוי החזוי. קנוניקל CxxC (13 x) PxCxHxxHxxCxxxW (7 x) CxxCW מוטיב, (ובמיוחד הנוכחות של השאריות פרולין לפני ציסטאין השלישי) הוא תכונת המפתח הנדרשים להגדרת בני המשפחה ATL.
  2. ניתוח של לוגו מסוים
    1. להגיש רשימה סופית של בני משפחה (רצפים הגפן 96 למלא את דרישות כדי להיחשב ATL) אל Em מרובים עבור מוטיב ההתמחרות (מם)15 להגדרת מוטיבים שנשמרת על פני המשפחה.
    2. מדף הבית מם, לחץ על לחצן "מם", ולהשלים "הגשת טופס הנתונים" עם מידע מסוים באשר למשפחתו של עניין.
    3. השתמש מם ניתוח כדי לאשר הנוכחות של שני המוטיבים הצפויה בתוך בני המשפחה של ATL הגפן, קרי, את הטבעת-H2, המוטיבים GLD.
  3. לחלופין, לבצע שלבים 2.1 ו- 2.2 בו זמנית באמצעות חבילת התוכנות לביואינפורמטיקה (ראה טבלה של חומרים).
    1. העלאת קובץ FASTA (ראה שלב 2.1.1) לסוויטה. בחר 'קובץ' התפריט, ולאחר מכן "יבא" ולחץ על "מתוך קובץ". אתר את הקובץ FASTA ולחץ על 'פתח'.
    2. בחר את כל רצפי מיובאים ברשימה, לחץ על הלחצן "יישור/להרכיב" בסרגל הכלים ולאחר מכן לחץ על "של Pairwise יישור מרובים". בחר "יישור שריר" ולחץ על "אישור" כדי להפעיל את היישור באמצעות פרמטרים ברירת המחדל.
    3. כדי להמחיש את הלוגו של היישור, לחץ על "גרפים" ← "אפשרויות" ובחר "לוגו רצף".

3. ניתוח של פרמטרים פיזיים חלבון ותחומים

  1. כמו ההגדרה של פרמטרים פיזיים שונים של בני המשפחה הנסקר חשוב יש תיאור מקיף של המשפחה, להגיש הרשימה של בני משפחה על כלי אינטרנט מסוימים.
    1. נקודה איזואלקטרית (pI), משקל מולקולרי (kDa), להשתמש ProtParam ה-כלי16 באתר האינטרנט של Expasy עם פרמטרים ברירת המחדל.
    2. בלוקאליזציה subcellular חלבון, להשתמש בכלים השונים כדי להשיג חיזוי אמין יותר כגון ngLOC v 1.017 עם הגדרות ברירת המחדל, targetP v 1.118 עם הגדרות ברירת מחדל, חלבון גנבים לוקליזציה subcellular גרסה 1.2 של19 עם ניתוק ההסתברות של 0.5. אתרי זירחון, להשתמש בכלי20 אינטרנט v 1.0 MUsite עם פרמטרים ברירת המחדל.
  2. לחקור תחומים נוספים חלבון קרובי משפחה.
    1. פתח את דף האינטרנט מסד הנתונים Pfam21, בחר הכלי "חיפוש רצף", שלח רצפי חלבונים בתיבת שאילתה ולאחר לחץ על "לך" כדי להפעיל את הניתוח.
      הערה: כל רצף החלבון הוא ניתח באופן אינדיבידואלי. E-ערך של 1.0 ב הגדרת ברירת המחדל מאפשרת האפליה בין הלהיטים-שממצאים ומשמעותית.
    2. לפתוח שרת TMHMM22 מהמרכז לניתוח רצף ביולוגי לחקור את הנוכחות של אזורים transmembrane בשם.
הדבקת כל חלבון רצפים בו-זמנית בתיבת שאילתה (או לחילופין להעלות קובץ הטקסט כולל כל רצפי חלבונים בתבנית FASTA) ולחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.
  • לנתח חלבונים חסר החזוי תחומים transmembrane, לפי TMHMM (שלב 3.2.2), בכלי ProtScale כדי לזהות אזורים הידרופובי בשם. פתח את דף האינטרנט ProtScale23. הדבקת כל רצף החלבון בתיבת שאילתה ובחר "Hphob. / קייט & דוליטל "כמו חומצת אמינו סולם. לחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.
  • 4. כרומוזומלית הפצה, כפילויות, וארגון אקסון-אינטרון

    1. מפת בני המשפחה ATL על הכרומוזומים בהתבסס על המידע מאוחזר באתר מרכז ביוטכנולוגיה הגפן הגנום CRIBI24.
      1. אתר את דף הבית באתר האינטרנט PhenoGram25. לכתוב את "קלט הקובץ" בתור קובץ טקסט מופרד באמצעות טאב עם תכונות מסוימות של הגנים למפות על הכרומוזומים, על פי הנחיות ממצה דוגמאות לגבי ההידור של הקובץ שסופק הבאה בנתיב "Phenogram" ← " תיעוד"←"אפשרויות"←"קלט קובץ".
      2. כתוב את "כותרת" של העבודה. בחר את הגנום להיגרר. הגנום לא מיושם בתוכנה, כמו הגנום הגפן, בחר "אחר" בתפריט הנפתח. לכתוב את הקובץ הגנום על פי הנחיות דוגמאות סיפק, בעקבות השביל "Phenogram" ← "תיעוד" ← "אפשרויות" ← "גנום", ולהעלות אותו.
      3. השתמש בפרמטרים ברירת המחדל של "פנוטיפ מרווח", "פנוטיפ צבע", "פורמט התמונה" או חלופות בחירה בתפריטים המתאימים ולחץ על "מגרש" לקבל את הפריט החזותי של הגנים על כרומוזום.
    2. הגדרת המדינה שכפול של בני המשפחה באמצעות תוכנת MCScanX26.
      1. הורד, לפתוח עותק של MCscanX במחשב המקומי פועל שורות פקודה 1 (1 קובץ משלים). הזן את התיקייה MCscanX וליצור את קבצי הפעלה נדרשת הפעלת הפקודה קווי 2 (1 קובץ משלים).
        הערה: התקנה של MCscanX ידוע להיכשל על כמה מכונות לינוקס 64 סיביות בעקבות בעיה בנוגע chdir הפונקציה. אם הודעת שגיאה מוחזרת הקשורים פונקציה זו על הפוך, ביצוע הפקודה הפקודה קווי 3 (1 קובץ משלים) צריכה לפעול, הפקודה "להפוך" ואמורים לאחר מכן.
      2. הורד את החלבונים נ' vinifera ואת קובץ ה-ביאור הפעלת הפקודה קווי 4 (1 קובץ משלים).
        הערה: את הגפן ביאור הקובץ צריך להיות רוכסן מכנסיו והחתול כרומוזום יחיד מידע בקובץ ייחודי על-ידי הפעלת הפקודה שורות 5 (1 קובץ משלים).
      3. הפעלה "הכל מול כולם" blastp חיפוש באמצעות הקובץ חלבון vinifera (פ') השאילתה והן את הנושא.
      4. צור מסד נתונים של הפיצוץ לחיפוש באמצעות נ' vinifera חלבון הקובץ מריצים שורות הפקודה 6 (1 קובץ משלים). לבצע את החיפוש blastp באמצעות הקובץ חלבונים נ' vinifera בתור שאילתה במסד הנתונים שיצרת קודם לכן על-ידי הפעלת הפקודה שורות 7 (1 קובץ משלים).
      5. המר את קובץ ביאור בתבנית מתאימה עבור MCScanX. הפעל את הפקודה שורות 8 (1 קובץ משלים) כדי להוריד את parseMSCanXgff.pl קובץ script מותאם אישית perl. בצע הניתוח של הפעלת קווי הפקודה 9 (1 קובץ משלים).
        הערה: vitis.gff קובץ נוצרת המכיל קואורדינטות ג'ין בתבנית הבאה:
        sp # ג'ין החל עמדה התנוחה המסיימת
        ". sp" שבו הוא קוד שתי אותיות עבור המין (Vv על הגפן) ואילו "#" הוא שמו של לגרדום. שימו לב כי הסקריפט perl מותאם אישית שסופק מתאים המרה ביותר, למרות שינוי קוד מסוימים עשויים להידרש בכמה מקרים ספציפיים בשל המגוון של המידע בקובץ ה-ביאור זמינים.
      6. השקת MCScanX מריצים שורות הפקודה 10 (1 קובץ משלים).
        הערה: "גפן" זה הקידומת של הביאור והן בקובץ הפלט הפיצוץ. זה מייצג דרישה חובה לתוכנה לפעול.
      7. לנתח את תוצאות MCScanX. MCScanX מייצרת קובץ טקסט אחד "vitis.collinearity", אשר מכיל בלוקים קוליניאריות. קובץ כזה יכול ניתנים לעיון בכל עורך טקסט (ראה דוגמה לפלט 1 1 קובץ משלים).
        הערה: ספריה "mcscaxOutput.html" נוצר המכילה קבצי html שמציעות היישורים מרובים של בלוקים קוליניאריות נגד כל כרומוזום הפניה. קבצים אלה יכולים להיבדק באמצעות דפדפן אינטרנט.
      8. לסווג את הגנים paralogous מבוססת על המיקום היחסי שלהם כרומוזומים מריצים שורות הפקודה 11 (1 קובץ משלים).
        הערה: ג'ין Paralogous סיווג המתואר משלים טבלה II. קובץ הפלט שנוצר "vitis.gene_type" מכיל את כל המידע מקורו באמצעות תבנית פשוטה מופרד בטאבים.
      9. לבצע ניתוח העשרת להעריך משפחת הגן יש prevalently נוצרה על-ידי מנגנון ספציפי מריצים שורות הפקודה 12 (1 קובץ משלים).
        הערה: "vitis.gene_type" נוצר קובץ זה צעד 4.2.8, ואילו קובץ "gene_family_file" מייצג קובץ טקסט בשורה אחת שבה השם של המשפחה (למשל, ATL_genes) ואחריו את שמות לוקוס על כל הגנים השייכים למשפחה מופרדים באמצעות טאב. המבחן הסטטיסטי שימושית עבור העשרה הוא מבחן המדויק פישר ו p-ערכי של מקורות שונים מאוחסנים בקובץ ה-"outputFile.txt".
    3. דמיינו הארגון אקסון-אינטרון של גנים באמצעות עץ החיים אינטראקטיבי (מבצעים)27, כלי ופשוט עבור התצוגה, ביאור, ניהול של עצים פילוגנטי.
      1. להעלות עץ פילוגנטי בסעיף "להעלות" של אתר האינטרנט של מבצעים. העץ נבנה לפי סעיף 5 להלן. עבור כל בן משפחה ג'ין, לאחזר חיזוי מבנה הגן הביאור V1 של הגנום הגפן (אתר CRIBI שפורטו לעיל). לחשב את האורך (ב- bp) בשם exons, אינטרונים ואזורי לא מתורגם (UTRs).
      2. השתמש את ערכת הנתונים "חלבון תחומים" עבור הדמיה גרפית של התבנית אקסון-אינטרון.
    לכתוב קובץ טקסט רגיל כולל אורכי מחושב בהתאם למפרטים הניתנים בעקבות נתיב "עזרה" ← "דפי עזרה" ← "סוגי הנתונים (dataset)" ← "חלבון תחומים" האתר מבצעים27. באמצעות ערכת נתונים "חלבון תחומים", את "המלבן (RE)" ואת הצורות "מלבן הפער (GP)" מייצגים את אקסון, את UTRs, בהתאמה.

    5. ניתוח פילוגנטי ובמינוח

    1. לנתח את קשרי הגומלין בין ATL בני המשפחה באמצעות הבנייה של עץ פילוגנטי באיכות גבוהה, ההגדרה של נומנקלטורה המשפחה.
      1. עבור משפחה ג'ין הגפן, בצע את הכללים שנקבעו על ידי ועדת המינוח הגפן סופר8.
      2. אחזר רצפים לבנה א ATL, נדרש התייחסות במינוח גנים הגפן8, ה מסד הנתונים UniProt28 .
      3. לכתוב קובץ FASTA כולל כל רצפי הגפן, בני משפחה של ג'ין לבנה א לכלול ניתוח פילוגנטי. רצפי לאפשר המרבי של השתנות בין בני משפחה (לעומת רצפי חלבונים).
    2. עץ פילוגנטי
      הערה: השימוש של הצינור 29 Phylogeny.fr הוא מומלץ להביא עץ פילוגנטי באיכות גבוהה, אבל לא חובה.
      1. אתר הבית Phylogeny.fr29ובחר את הצינור "ניתוח טקסונומי".
        הערה: "לחץ אחד" מתאימה ברוב המקרים, אך אם יש צורך זה אפשרי לבחור הגדרות מתקדמות ספציפי ("מתקדם") או אפילו ניתוח מותאמים אישית באופן מלא ("א-לה קארט"; ראה שלב 5.2.5).
      2. כתיבה "שמו של הניתוח," להעלות את FASTA הקובץ שיצרת קודם לכן (שלב 5.2.1 ולחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.
      3. לחלופין, אם ההליך המתואר לעיל (שלבים 5.2.1, 5.2.2) תוצאות בהודעת שגיאה, להשלים כל שלב של הצינור סוויטת האמיניות בנפרד, כדלקמן.
        1. שריר תוכנה דף הבית30, בחר להעלות הקובץ FASTA ב "שלב 1", "פירסון/FASTA" "פורמט פלט" ב "שלב 2" ולחצו על "שלח" "בשלב 3" יישור רצפים של השאילתה.
        2. לחץ על 'הורד קובץ יישור' ולשמור כקובץ FASTA עבור עוד צעדים.
        3. תהליך הקובץ FASTA יישור לחסל לקוי ליישר עמדות באמצעות כלי שרת Gblocks31. להעלות את הקובץ FASTA יישור, בחר "DNA" "סוג של רצף" ובחרת את הפיכת האפשרות של לכתחילה המתאימה ביותר עם הניתוח (למשל, עבור הגפן ATL ג'ין המשפחה בחר כל שלושת האפשרויות המוצע לבחירה"פחות מחמירים" כי של רצף גבוהה גאוס). לחץ על "Get רחובות" כדי להפעיל את הניתוח.
        4. לחץ על "יישור Resulting" בתחתית הדף פלט, לשמור את התוצאות כקובץ FASTA חדש.
        5. מן הבית ' Phylogeny.fr '29, בחר "A la Carte" צינור "האמיניות ניתוח". לאחר מכן, בטלו את הבחירה "יישור מרובים" ואוצרות "יישור". לחץ על "צור זרימת עבודה", להעלות את הקובץ FASTA מספר פעמים Gblocks (שלב 5.2.5.4), בחר "Bootstrapping נוהל" עם פרמטרים של ברירת המחדל ב- "הגדרות" ולאחר לחץ על "שלח" כדי להפעיל את הניתוח.
      4. התמוטטות גרוע נתמך סניפים (קרי, ערכי האתחול < 70%) על ידי לחיצה על "לכווץ סניפים" במדור "בחירה ופעולה" ולהוריד את התוצאות הסופיות בתבנית Newick כדי ניתוחים נוספים.
    3. להקצות שם הגן על טקסונומי בסיס.
      1. סקור את עץ פילוגנטי כדי להעריך את המהימנות של מבנה עץ העלאתו לסוויטה מבצעים שפורטו לעיל (סעיף 4.3).
      2. להקצות באופן ידני שם הגן כל בן משפחה. במקרה של orthologues ליחיד, להקצות את תודרנית-כמו שם (למשל, AtATL3 ← VviATL3). להבדיל גנים הגפן (שניים או יותר) הנובע homolog תודרנית יחיד עם מרחק פילוגנטי אותו באמצעות מספרים או אותיות, אם הגן תודרנית מסתיים עם מספר (למשל, AtATL23 ← VviATL23a, VviATL23b).
      3. במקרה של אחד-לרבים או רבים orthologues, להקצות שם גן חדש המורכב תודרנית-כמו שם (כאן, "ATL") יחד עם מספר גבוה יותר מאשר המספר הגבוה ביותר כבר בשימוש עבור נ' vinifera והן תודרנית (למשל., VviATL83).
      4. להשלים את המינוח של המשפחה החדשה שהוגדרה היורד מן החלק העליון לחלק התחתון של עץ פילוגנטי.

    6. הגפן עוגב ו הבמה ביטוי פרופיל

    1. ליצור עבודה נתונים מטריצה המכילה ביטוי הנתונים עבור בני המשפחה.
      1. הורד את נ' vinifera cv. דג קורבינה ג'ין ביטוי אטלס datamatrix מהקישור מופץ על פלטפורמה ResearchGate32. קובץ זה מכיל את הערכים בביטוי RMA מנורמל כדי לשמש בעקבות צעדים.
      2. לחלץ את הערכים ביטוי עבור כל משפחה ג'ין datamatrix אטלס ולכתוב "datamatrix עבודה" המכיל באותה שורה עליונה עם datamatrix אטלס. שמור את "datamatrix עבודה" בתור קובץ טקסט מופרד באמצעות טאבים.
    2. לבצע הניתוח מקובצים באשכולות bi היררכי באמצעות תוכנה מציג ניסוי רב (תהליך).
      1. להוריד ולהתקין תוכנה תהליך33.
      2. להעלות את "datamatrix עבודה" (שלב 6.1.2) בעקבות השביל "קובץ" ← "נתוני עומס" ← "עיון", לבחור את קובץ הטקסט. בחר "מערך חד-צבעי" ולהסיר את תקתוק "טען ביאור" בעת ביאור אוטומטי לא מסופק. בחר את ערך הביטוי העליון והשמאלי ביותר לביטוי טבלה בתצוגה המקדימה של ולחץ על כפתור "טען".
      3. להתאים את הנתונים החלת השינוי Log2 ("להתאים את נתוני" ← "יומן המרות" ← "Log2 להמיר") ונורמליזציה הגן/שורה ("להתאים את נתוני" ← "הגן/שורה התאמות" ← "חציון במרכז הגן/שורה"). להגדיר את מגבלת מידה נאותה ("הצג" ← "להגדיר צבע סולם גבולות").
      4. לחשב התקבצות ההיררכית הבאה בנתיב "ניתוח" ← "התקבצות" ← "HCL".
    בחר "לייעל את ג'ין עלה סדר" ואת "לייעל את המדגם עלה סדר" בשדה"אופטימיזציה ההזמנות", "מתאם פירסון" השטח "בחירת מטריקס מרחק", "ממוצע הצמדה קיבוץ באשכולות" בשטח "בחירת שיטת הצמדה". לאחר מכן, לחץ על "אישור" כדי להפעיל את הניתוח.
  • להציג את התוצאות בתפריט "HCL" ← 'תוצאות ניתוח' בלוח השמאלי של החלון. לייצא את המפה חום על ידי לחיצה על 'שמור תמונה' בתפריט 'קובץ'.
  • 7. ביטוי פרופיל בתגובה מדגיש ביוטיים, והאביוטיים

    1. חזור על שלב 6.1 עם מזהה ההצטרפות בריוני המגרש המתקבל בהתאמה פרסומים ומחקרים חוקרים ללחץ ביוטיים, והאביוטיים על הגפן. לדוגמה, יכול להיות עיינת ניסויים מתן לפרופיל transcriptome של הגפן גרגרים נגועים עם המחלה פטרייתי Botrytis cinerea באמצעות microarray NimbleGen ענבים כל הגנום של בריוני המגרש המזהה GSE52586. חזור על שלבים 6.1.1 ו 6.1.2.
    2. חפש בארכיון קורא רצף NCBI34 עם ההזמנות/BioProject מזהה (למשל, SRP055458 או PRJNA275778 לניסויים "הצללה פרח הגפן") ולהוריד את כל קריאות רצף raw. RNA-seq datasets ממחקרים שונים רבים מעובדים באמצעות צינור בודד עבור עקביות.
      1. בקצרה, לקצץ רצף raw FASTQ קריאות (יחיד - ו זוג-end), לסנן איכות עם Trimmomatic35. שימוש, AVGQUAL ו MINLEN סינון של 20 ו- 40, בהתאמה, הכל פרמטרים ברירת המחדל.
      2. אינדקס 12 X הגפן הפניה הגנום1 באמצעות Bowtie236. הורד 12 X הגפן הפניה הגנום (למשל, bowtie2-לבנות) לפני הפעלת הפקודה bowtie2 .
      3. להשיג טבלאות מטריקס ספירה עם htseq-לספור37 באמצעות הקובץ ביאור (מנכ ל החברה/GTF) הגפן דגם ג'ין V1.
    3. ביצוע דיפרנציאלית של הביטוי (re-) מפענוח R38 עם ספריות39 limma עבור מטריצות מנורמל-RMA וספריות40 DESeq2 עבור טבלאות מטריקס ספירת המתקבל שלבים 7.1.1 ו 7.2.1, בהתאמה.
      1. לבצע השוואת "שתי קבוצות" רגיל (כלומר, "טיפול" / "לשלוט"). ודא כי עיצוב המטריקס/הקיבוצים תנאי "שולט" ו- "טיפול" מוגדרים כראוי.
        הערה: טיפוסי עיצוב לניתוח microarray ביטוי דיפרנציאלי (GSE52586) כדי להשוות EL-33 גרגרים נגועים Botrytis cinerea נגד פירות יער (בריא) שליטה בשלב פיתוח זהה עם limma מריצים שורות פקודה 13 מוצג 1 קובץ משלים. עיצוב אופייני לניתוח ביטוי דיפרנציאלי RNA-seq (SRP055458 או PRJNA275778) כדי להשוות בין פרח (ב 7 ימים לאחר קאפ-בסתיו) תחת צל טיפול נגד הפקד עם DESeq2 מריצים שורות הפקודה 14 מוצג 1 קובץ משלים .
      2. לקבל את הרשימות של גנים ביטוי באופן שונה (מעלות) בניגוד לכל, עבור limma, השתמש את פונקציות lmFit(), ואחריו eBayes(), ולאחר מכן על-ידי פונקציות () topTable, בעוד שלגבי DESeq2, השתמש DESeqDataSetFromMatrix(), DESeq(), פונקציות results() . להלן, רצף עבודה אופייני להיות אחריו.
        1. ראו microarray ביטוי דיפרנציאלי לניתוח, שורות פקודה 15 (1 קובץ משלים). ניתוח ביטוי דיפרנציאלי RNA-seq ראה שורות פקודה 16 (1 קובץ משלים). חזור על השלבים שלעיל עבור כל שאר ניגודים סכימה עיצוב המתאים שונה (ראה דוגמאות בשלב 7.3.1)
    4. מתוך הרשימות של DEGs שנוצר, לחלץ את כל השורות לא מתאימות את הצטרפותן ATL V1, לשמר עמודות המכילות log2 מקפלים השינוי (טיפול/פקד) > | 0.5 | מותאמות p-ערכים (פד) < 0.05, מיזוג אותם בהתאם לטבלה מטריקס, אם מחקר נופל לתוך "והאביוטיים" או "ביוטי/פתוגן אינטראקציה" compendia.
    5. לבנות את heatmaps באשכולות היררכי (compendia והאביוטיים וביוטי) ב- R באמצעות ספריות של gplots.
      הערה: קורא את הפונקציה heatmap.2 בונה את heatmap יחד עם שורה dendrograms מהטבלאות מטריצה בהתאמה. טיעונים נוספים באמצעות cellnote לתפקד מסייעת להבחין באופן שונה ביטוי (log2FC > רוזוולט 0.5, < 0.05) ATL גנים כל השוואה על פני מגוון גדול של תנאי הניסוי על-ידי * סמל. החלת זרימת העבודה אופייני ב- R מריצים שורות הפקודה 17 (1 קובץ משלים) או לחלופין, חזור על שלבים 6.2.2 כדי 6.2.5 לבנות את heatmaps באמצעות תהליך תוכנה.

    8. ניתוח היחסים בין התבדרות Paralogous רצף גנים שיתוף

    1. לבנות מטריקס המכיל pairwise דמיון. האלמנטים של המטריקס. הדמיון הם הערכים של דמיון רצף שמחושבים על היישורים pairwise חלבון.
      1. השתמש בשרת41 אינטרנט המחט הבלטה עם הגדרות ברירת מחדל כדי ליצור רצף pairwise היישורים ולשמור כקובץ טקסט. פתח את קובץ הטקסט פלט ולהסיר את כל השורות ההערה, יחד עם שמות עמודות ושורות כדי להפיק קובץ בשם "similarityTable.txt".
        הערה: טבלה כזו כולל שורה עבור כל ג'ין ATL דיווח הערכים דמיון מחושב בכל אחד היישור pairwise. סדר לוקוסים בשורות ובעמודות הוא זהה כך מטריצה סימטרית נוצרת עם כל הכבוד של הערכים האלכסוניים.
    2. לבנות את המטריקס. עם ביטוי שיתוף נתונים על-ידי חישוב מקדם המתאם של פירסון. ההליך הבא דורש R ומודול perl PDL.
      1. הורד את הערכים בביטוי עבור הגנים ATL 96 הפעלת הפקודה שורות 18 (1 קובץ משלים) בתוך מסוף. ביצוע ניתוח ביטוי שיתוף באמצעות קובץ script מותאם אישית perl הניתנים להורדה על-ידי הפעלת הפקודה שורות 19 (1 קובץ משלים). Script כזה יחשב את מקדם המתאם של פירסון בין זוגות של לוקוסים ATL דיווח כאמור.
      2. השקת ה-script פועל שורות פקודה 20 (1 קובץ משלים) ובצע את ההוראות פלט.
    קובץ ה-script תיצור קובץ הפלט (כלומר "coexpressionTable.txt") המכיל מטריצה ביטוי משותף ובו שמות לוקוס באותו הסדר של מטריקס שהושג בשלב 8.1 (מצווה זו היא חיונית כדי להפעיל את המבחן האח, ראה להלן).
  • לבצע מבחן מדף בין מטריצות נתונים שהתקבלו בשלבים 8.1 ו- 8.2. לאחר הזנת הסביבה R (להפעיל פקודה "R" מתוך מסוף), לטעון את ספריית ade4 באמצעות הפקודה הבאה: library(ade4)
    1. הפעל את בדיקת האח על-ידי טעינת הנתונים שתי מטריצות וביצוע הסטטיסטיקה מריצים שורות הפקודה 21 (1 קובץ משלים), עם "nrep", המייצג את מספר התמורות. הבדיקה כוללת חישוב המתאם בין האלמנטים של מטריצות אלה, permuting מטריצות, ואז לחשב את סטטיסטיקת המבחן אותו שוב.
      הערה: כל הערכים שהושג של המבחן הסטטיסטי משמשים לבניית בהתפלגות הפניה של המבחן הסטטיסטי, אשר ישמש לחישוב p-הערך לבדיקה מובהקות. מספר התמורות מגדיר את מידת הדיוק שבה p-ניתן לקבל ערך.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    הגן VIT_05s0077g01970, זיהתה. הכי דומה לבנה א ATL2 (At3g16720) דרך חיפוש BLASTp, שימש בדיקה סקר בני המשפחה ATL הגנום הגפן (cvנ' vinifera פינו נואר PN40024). הניתוח PSI-הפיצוץ נפגשות לאחר כמה מחזורים חשיפת רשימת הגנים בשם משפחה ג'ין ATL של הגפן (איור 1 א'). הנוכחות של התחום טבעת-H2 הקנוני עבור כל מועמד הוערך על ידי בדיקה חזותית של היישור שרירים של כל הערכים שזוהו בניתוח (איור 1B). המכיל חומצות האמינו שנשמרת המרווחות כראוי את, משקעי היסטידין שני, כמו גם את שאריות פרולין לפני ציסטאין השלישי רק את הגנים האלה נחשבו לעתירה את הגדרתו ATL המקורי תודרנית5. סך של גנים הגפן 96 הגשים את הדרישות, נחשבו על אפיון נוסף. כל בן משפחה ATL נותחו להגדרת המאפיינים הספציפיים של הגן המתאים החלבונים המקודדים, קרי, הנוכחות של אחרים מוכרים לתחום/מים בנוסף הטבעת-H2, transmembrane או הידרופובי עשיר אזורים, subcellular לוקליזציה, אתרי זירחון בשם (טבלה 1 ו לטבלה 2).

    Figure 1
    איור 1: סקר PSI-הפיצוץ והיישור של בשם grapevine לעתירה. (א) מסך של עשרת הלהיטים של PSI-הפיצוץ הראשון איטראציה החיפוש באמצעות הרצף חלבון VIT_05s0077g01970 כפיתיון. (B) חלק היישור של הגפן שנבחר 96 בשם לעתירה מציג תחום טבעת-H2 שלהם, בלוגו התואם שהושג באמצעות חבילת ביולוגיה מולקולרית (ראה טבלה של חומרים). מרובה מן Ariani ואח . בעל רישיון Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון42.אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    שם זיהוי גנטי אורך הגנים (bp) אינטרון מספר מזהה UniProt אורך החלבון (aa) מוטיב הטבעת-H2 מספר המחשבים TM/H תחומים אחרים
    VviATL3 VIT_09s0002g00220 1245 0 F6HXK6 304 PxC 1
    VviATL4 [VviRHX1A] VIT_15s0021g00890 1827 3 D7SM36 203 PxC 0
    VviATL18 VIT_11s0118g00780 1113 2 F6HCI8 193 PC 0
    VviATL23a VIT_18s0001g01060 935 0 F6H0E4 114 PxC 0.5
    VviATL23b VIT_18s0001g01050 399 0 E0CQX3 132 PxC 1
    VviATL24 VIT_17s0000g06460 4466 4 D7SI89 217 PxC 1
    VviATL27 VIT_00s0264g00020 2554 4 D7T1R5 235 PxC 1
    VviATL43 VIT_11s0052g00530 1576 2 D7SQD9 457 PxC 3
    VviATL54a VIT_18s0001g06640 3221 1 F6H0Y5 405 PxC 1
    VviATL54b VIT_03s0017g00670 2774 1 F6HTI0 427 PxC 1
    VviATL55 [VviRING1] VIT_07s0191g00230 1844 0 F6HRP9 372 PxC 1
    VviATL63 VIT_06s0004g06930 804 0 D7SJU6 267 PxC 1
    VviATL65 VIT_03s0063g01890 2068 0 F6HQI8 396 PxC 1
    VviATL82 VIT_01s0026g02540 820 0 F6HPQ9 233 PC 0.5
    VviATL83 VIT_17s0000g08400 1887 0 F6GSQ4 143 PC 0
    VviATL84 VIT_06s0004g00120 1853 0 F6GUP5 368 PC 0.5 המיקלע זד אף-RING_3
    VviATL85 VIT_12s0034g01400 786 0 F6H965 261 PC 0.5
    VviATL86 VIT_12s0034g01390 1434 1 D7T016 451 PC 0.5
    VviATL87 VIT_18s0001g03270 1002 0 F6H0T2 333 PC 0.5 המיקלע זד אף-RING_3
    VviATL88 VIT_08s0040g00590 1320 0 F6HQR2 314 PC 0 המיקלע זד אף-RING_3

    טבלה 1: הראשון 20 גנים VviATL ומאפיינים רצף של החלבונים המתאים. TM: transmembrane; ח': הידרופובי; 0.5 מצביעה על הנוכחות של אחד או יותר אזורים הידרופובי. מרובה מן Ariani ואח . בעל רישיון Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון42.

    Table 2
    בטבלה 2: פרטים על ה-20 הראשון VviATL ג'ין בעמדה (פ') vinifera הגנום, שכפול המדינה, ו- ATL חלבון הכימי פיזיקלי מאפיינים ומיקום. () מספר אתרי זירחון שמנבאת Musite; (b) תחזיות דומה שהושג עם פחות שתי תוכנות מסומנים במודגש; ngLOC היה בשימוש עם הגדרות ברירת מחדל, ואילו TargetP v 1.1 ולוקליזציה חלבון גנבים Subcellular שימשו עם ניתוק ההסתברות של 0.5. NUC, גרעין; MIT, המיטוכונדריה; קלוא, כלורופלסט; פלה, קרום פלזמה; S, מסלול הפרשה (נוכחות של פפטיד אות); M, המיטוכונדריה; C, כלורופלסט; O - או, מיקומים אחרים; nd, לא נקבע (כלומר, הערך מתחת לסף). מרובה מן Ariani ואח . בעל רישיון Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון42. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    ניתוח פילוגנטי כולל את רצפי הגנים קידוד ATL הגפן מזוהה עם הרצפים של משפחת הגן הפניה ATL לבנה א שימשה הגפן ATL נומנקלטורה, על פי ההנחיות של sNCGGa8. רצפי תשעים ושש, 83 vinifera נ ו א לבנה, בהתאמה, היו נתונים הצינור Phylogeny.fr להשיג עץ פילוגנטי אמין.הרצף האחרון שימשו מאוחר יותר כדי להוסיף ביאורים ולתת שם הגפן גנים על בסיס מוצק קשרי גומלין (איור 2). בעקבות גישה זו, הגפן 13 מתוך 96 לעתירה קיבל מזהה מסוים בהתחשב שלהם הומולוגיה ליחיד עם לבנה א ATL. השמות של גנים אחרים 83 שהוקצו מבוסס על עץ פילוגנטי, עם מתקדמים מספור מלמעלה למטה, החל ממספר גנים ATL גבוה יותר מאשר הגבוה ביותר בשימוש מספר לבנה א.

    Figure 2
    איור 2: עץ פילוגנטי של נ' vinifera ו- E3 ATL לבנה א אוביקוויטין קידוד ליגאז גנים. העץ unrooted נוצר עם חבילת Phylogeny.fr ((פ') vinifera (בצבע ירוק), את הגנים ATL 83 של לבנה א דיווחו במסד הנתונים UniProt ' (בצהוב). סניף תמיכה ערכים, התקבלו משכפל האתחול 100. הכוכבים האדומים מצביעים על הנוכחות של תחום BCA2 אבץ אצבע (BZF) את החלבונים המתאימים. מרובה מן Ariani ואח . בעל רישיון Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון42. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    מיפוי גנים קידוד ATL גפנים הכרומוזומים הראה הפצה רחב ברחבי הגנום, רומז הגנום כולו שכפול ככוח אבולוציוני העיקריים להרחבת המשפחה ג'ין ATL הגפן. אכן, לעתירה 31 נמצאו באזורים כרומוזומלית הומולוגיים שמקורם פוטנציאל אירועים שכפול גנום סגמנטלי או כל. יתר על כן, הניתוח באותו מודגש 13 גנים tandemly כפולים כפולים צינתור אחד, כפילויות התפזרו 51 (איור 3). בהתחשב מספר גדול מאוד של גנים המשוכפלת במשפחה ATL, ביצענו בדיקת העשרה (מבחן המדויק של פישר) כדי לבדוק את השמירה מועדף של הגנים המשוכפלת במהלך fractionation הגנום. עם p-ערך < 0.001, בדיקה זו אישר את ההיפותזה ATL גנים משוכפלים נשמרו באופן אקראי יותר צפוי, רומז תפקיד המשפחה ג'ין ATL במהלך הגפן הסתגלות ואבולוציה.

    Figure 3
    איור 3: הגפן ATL-קידוד גנטי הפצה על כרומוזומים נ' vinifera , שכפול המדינה. הגנים ATL הגפן 96 עם מידע מדויק כרומוזומלית זמינים במסד הנתונים מופו הכרומוזומים נ' vinifera 19. הצבעים מצביעים על האירוע המקורי כפילות. קווים אנכיים שחור והקווים האדומים לזהות זוגות נגזר טנדם כפילויות וכפילויות הגנום כולו, בהתאמה. מרובה מן Ariani ואח . בעל רישיון Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון42. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    להמשיך לחקור בפונקציות ביולוגיות בשם של לעתירה בבית הגפן, בוצע מטא אנליזה על נ' vinifera cv. דג קורבינה הכללית גנים אטלס12. ערכת הנתונים כולל הגנום כולו ביטוי ערכים של איברים שונים הגפן 54 ו שלבים התפתחותיים, שימש לביצוע ניתוח מקובצים באשכולות bi הירארכי. התוצאות לא רק אישר כי כל לעתירה 96 היו לידי ביטוי לפחות לאחד השלבים/הרקמות 54, אבל גם הצביע על הנוכחות של חמישה אשכולות הראשי של פרופילי ביטוי (איור 4A). בקצרה, אשכולות A ו- E הראה מול התנהגויות, בפרט הראשון מאופיין downregulation הכללי של ATL גנים בדגימות לנוער, לרבות בשלבים המוקדמים של ברי, עלים צעירים, הזקופות, תפרחת, ואת רוב השלבים באד. מצד שני, באשכול באותו א, בוגר דוגמאות כגון פירות יער-הבשלה, שלאחר הקציר הקמילה שלבים רקמות וודי, כך שהאח של זרע התפתחות ATL גנים הראו על קולטנים upregulation השולט. גנים אשכול ג' היו בעיקר downregulated ברוב הדוגמאות, בעוד גנים ATL באשכול D היו לעתים קרובות upregulated מאוחר שלבי ההתפתחות ברי. בסופו של דבר, אשכול B לא הראה כל וריאציה הרלוונטיות בפרופילים הביטוי.

    בגישה דומה הוחל ללמוד את הביטוי של הגפן ATL בני המשפחה בתגובה ביוטיים, והאביוטיים לחצים באמצעות datasets ספציפי נבנה למטרה זו. כמות עצומה של נתונים הביטוי הנובעת microarray ו- RNA-seq הניסויים זמינים ממסדי גישה ציבורית כגון Omnibus ביטוי גנים (GEO) ו- ArrayExpress. לאחר שנאספו בנוחות מנורמל, המידע נוצלה במשך עוד תובנות פונקציית הפוטנציאל של לעתירה בתגובה צמח מדגיש. ניתוח פרופילים ביטוי של הגפן לעתירה בתגובה מדגיש ביוטיים חשף כי 62 מתוך 96 תעתיקים הראו של אפנון משמעותית (שינוי-קיפול log2 (FC) > | 0.5 |) בתנאים לפחות שני, עם שיעור גילוי שקר (פד) < 0.05 ( איור 4B). המספר גדל ל 81 שוקל רק הסף רוזוולט ב תנאי יחיד. תוצאות אלה הציע בתוקף על מעורבות ישירה של משפחת הגן ATL בתגובה פתוגנים גם בבית הגפן. בפרט, קבוצה של 12 גנים (VviATL3-27-54b-55-90-97-123-144-148-149-156) היו בתוקף upregulated בתגובה פתוגנים ברוב, כולל biotrophic, necrotrophic פטריות, אוכלי עשב, ומגיע לכן, תשומת לב על עוד יותר פונקציונלי ניתוחים.

    Figure 4
    איור 4: clusteringof הירארכיים ביטוי של גנים ATL הגפן אטלס, dataset הקשורות ללחץ ביוטיים הגפן. (א) הביטוי יומן טרנספורמציה ערכים של גנים ATL גפן הגפן אטלס12 שימשו לצורך ניתוח אשכול היררכית המבוססת על המדד למרחק של פירסון. צבע סולם מייצג גבוה יותר (אדום) או התחתון (ירוק) הביטוי רמות בכבוד השפע התעתיק החציוני של כל הגנים בכל הדוגמאות. האותיות A עד E בצד ימין מציינים האשכולות מזוהה.AB: לאחר פרץ; ב': פרץ; ניצן-w: חורף ניצן; F: פריחה; FB: הפריחה מתחילה; FS: פירות להגדיר; ז': ירוק; מר: אמצע-הבשלה; PFS: פוסט-פירות סט; PHWI-II-III: שלאחר הקציר הקמילה 1, 2 ו-3 חודשים; R: הבשלה; S: senescent; גזע-w: וודי גזע; V: veraison; WD: מפותחים היטב; יום: צעירים. סולם (B) הצבע מייצג מוגברת (אדום) או ירידה הקיפול (כחול) שינויים הגפן ATL גנים בדגימות נגועים לעומת שולט על כל תנאי. כוכביות מציינים את הביטוי דיפרנציאלית משמעותית (פד ר < 0.05) של כל ATL בתנאים המתאימים. מרובה מן Ariani ואח . בעל רישיון Creative Commons 4.0 הבינלאומי רישיון42. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    משלים טבלה 1: ATL גנים מועמדים שחבור חליפי- () ATL מזהה גנים לפי V1 ג'ין ענבים חיזוי ביאור, (b) ATL מזהה גנים לפי V2 ג'ין ענבים חיזוי, ביאור43, (ג) מספר בשם ATL חלופי splicing גרסאות, (ד) מידע על קידוד רצף של כל משתנה ATL בשם. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    משלים בטבלה 2: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    קובץ משלים 1: אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    בעידן הגנומי, משפחות גנים רבים כבר שאפיינו עמוקות של מספר מיני צמחים. מידע זה הינו preliminary to מחקרים פונקציונלי ומספק מסגרת להמשיך לחקור. את התפקיד של חברים שונות במשפחה. בהקשר זה, יש גם צורך ומאפשר מערכת נומנקלטורה כדי לזהות באופן ייחודי לכל חבר במשפחה, הימנעות יתירות בבלבולים שעלולות להתעורר כאשר שמות מוקצים באופן עצמאי גנים שונים על ידי קבוצות מחקר שונות.

    לאחר התחשבות מתחשב, הקהילה המדעית הגפן הסכים גנים הגפן שם משפחה בהתבסס על קווי דמיון עם תודרנית הגנים והקימו סדרה של כללים יש להחיל כדי לתאר את משפחות גנים חדשים בהגפן, בעיקרון החל ההשוואה פילוגנטי של רצפי בין הגפן תודרנית בני המשפחה8. לכן, ניתן להשתמש הגנים רק כי הם כבר מבואר שם כראוי תודרנית המינוח הגפן. ההליך חלה לצורך זיהוי הגפן orthologues ATL ב תודרנית המתוארים כאן ולכן בוצע רק כדי למלא את הדרישה של הקצאת המינוח המשפחתי של ג'ין הגפן הנכון. למרות זאת, מינים אחרים של הצמח, גישות אלטרנטיביות יכול להיות אופציה. למשל, הומולוגיה יכול מהמשמעת באמצעות כניסות הפיצוץ של דו-כיווניות (BBH), שבו מוגדרים orthologues זוגות של גנים שני המינים הדומים יותר (קרי, עם הציון הגבוה ביותר יישור) אחד לשני מאשר על כל הגן השני ביד השניה מינים44. עם זאת, שיטה זו יכול לפספס orthologues רבות במקרה של קצב גבוה של שכפול גנטי, כגון ב- צמחים ובעלי חיים45. יתר על כן, במקרה של קידוד ATL גנים, BBH ועשויה לאחזר גנים חסר המבנה ATL-סוג הטבעת-H2 מדויק (כולל את שאריות פרולין) או גנים לא מבואר, בשם לעתירה ב תודרנית. למרות מנקודת מבט אבולוציונית חיפוש זה עשוי להיות רלוונטי, לאחזור של orthologues זה לא מבואר לא מילאתי את היקף הגפן ATL ג'ין ביאור משפחה נומנקלטורה, ואני orthologues את זה הם לא מבואר כמו לעתירה אין אפשרות להשתמש בשם grapevine בני משפחה. אפשרות נוספת היא להסיק הומולוגיה המבוסס על חומצה אמינית במקום רצפי באמצעות InParanoid46, או את האחרונה Hieranoid 247, גם אם זרימות עבודה כאלה אינם מומלצים במפורש על ידי הקהילה המדעית.

    הביטוי מטא-אנליזה, אשר יכולה להיות מוגדרת כ גישה שיטתית כדי ללמוד ולשלב שונה ממאגרי הנתונים (dataset) זמין לציבור של הביטוי נתונים, מאפשרת סימון המנגנונים המולקולריים המשותפים ושונה במגוון של מצבים. לפיכך, השילוב של מידע ביטוי גנים מרובים ניסויים בקנה מידה גדול transcriptomic יכול לשפר את האפיון של משפחה ג'ין, על-ידי הגדרת את פרופילי ביטוי של בני המשפחה לאורך ניסויים, ובכך לחסוך ההשפעה של גורמים ספציפיים ניסוי ותמיכה הנחה עמידים יותר של פונקציה בשם ג'ין בתהליכים מסוים. עם זאת, השימוש microarray נתונים דורשת השילוב של הביטוי נתונים שהושגו עם פלטפורמות שונות, בהתחשב המגבלות שלהם. למשל, בפלטפורמת microarray Nimblegen הגפן, חלק ניכר probesets עבור גנים המתאימים ייצג במערך (~ גנים 13,000) יש בעיות שעשויות להיות קרוס-הכלאה48. במקרה של משפחת ATL הגפן, 15 גנים עשויים להיות מושפעים תופעה כזו. עם זאת, כפי נדון על-ידי. קרמר ואח 48, קרוס-הזיהוי של בני המשפחה מאוד דומה של ג'ין על ידי המכשיר זהה יכול לספק מידע מעניין לגבי הביטוי, בתנאים מסוימים, לא רק של גן יחיד אלא של שניים יותר גנים שיתוף רצף גבוה קווי דמיון, ולכן פוטנציאל שיתוף מטרות והפונקציות. עוד נושא פוטנציאליים הקשורים microarray datasets הוא הגבול זיהוי ביטוי microarray פלטפורמות, אשר אינם רגישים מאוד. כדי לפתור את שניהם מדאיג, כלומר., קרוס-הכלאה ו אות רגישות, פתרון אפשרי יכול להיות לשקול רק datasets ביטוי RNAseq. אולם, המטא-אנליזה של נתונים RNAseq של מאוד אלגוריתמית ממחקרים שונים רבים יכולים להיות מאוד זמן רב, עשויים לדרוש משאבים חישובית רבות ומומחיות גבוהה.

    על פי הגישה המובאת כאן שואף להיות ממצה, זה יכול להיות בהחלט נוספת השלים עם ניתוחים אחרים. ראשית, כדי להשיג עוד תובנות לתוך אבולוציה מולקולרית ו קשר פילוגנטי בין בני משפחה גנטי בצמחים, ניתוח פילוגנטי אפשרות להאריך בניית עץ פילוגנטי שימוש במערכים מספר רצף של בני המשפחה של מספר מיני צמחים. זה גם אפשרי לחישוב הזמן האבולוציוני של גנים משפחה, הערכת קצב החלפת נרדף ושם נרדף להם במהלך האבולוציה, על-ידי קביעת ערכי Ks (מספר החלפות נרדף לכל אתר נרדף ב נתון תקופת זמן) ו קה (מספר החלפות nonsynonymous לכל אתר ללא נרדף באותה תקופה). היחס קה/Ks משמש כדי להסיק את המנגנונים של אירועים שכפול גנטי לאחר התפצלות מאבותיהם. ערך של קה/Ks = 1 מצביע על בחירה נייטרלית, ערך קה/Ks של < 1 מצביע על טיהור ובחירת, ערך קה/Ks של > 1 מצביע על הבחירה חיובי49. יתר על כן, אם ניתוח מבנה גנטי מגלה הנוכחות של אינטרונים, האפיון משפחה ג'ין יכול וניתן להרחיב את הגילוי של חלופה שחבור גרסאות. ואכן, על פי סקר עמוק של RNA-seq נתונים ברקמות שונות, מתח תנאים אחרים43, 21 (of 96) לעתירה הם מועמדים לאירועים splicing חלופיים, עם פוטנציאל מספר איזופורמים הנע בין 2 ל-16 עבור אלה לעתירה (ראה משלים טבלה 1). תעתיקים חלופי לעתים קרובות לייצר חלבון איזופורמים להשתנות ברצפים חומצת אמינו, שינויים אלה עשוי לשנות את מאפייני הסלולר של חלבונים, עלול לגרום שינויים של אפנון עדין לאובדן של פונקציה של המוצר ג'ין. מסיבה זו, היו מעורבים אירועים אלטרנטיביים splicing בפונקציות צמח חשוב, כולל תגובת המתח, ההתנגדות המחלה, פוטוסינתזה של פריחה50,51.אינטגרציה של מידע וכאמצעי ג'ין ATL המכיל בשם cis-אלמנטים רגולטוריות52 או מציאת מולקולות (למשל, microRNA, לונג ללא קידוד RNA) פוטנציאל מיקוד לעתירה53 גם ניתן להשלים כדי לחשוף תובנות המערכת מורכבות מולקולרית תקנה ואת האינטראקציה של הגפן לעתירה.

    לסיכום, הבחירה של הבדיקות שיש לבצע, כמו גם את ההליכים כדי להחיל כדי לאפיין משפחה ג'ין חדשה בזן צמחים בעיקר מונעים על-ידי הקהילה המדעית כללי, כמו גם על ידי היקף זיהוי משפחה ג'ין. חשוב לזכור הצעדים החקירה הבאים אפשריים, אשר לנצל את ערכת מידע, בין אשר כוללת גנים האבולוציה בין מיני צמחים, תיאור מבנה גנום או אמין מועמדים לבחירה בפונקציונלי מחקרים.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים אין לחשוף.

    Acknowledgements

    העבודה נתמכה על ידי האוניברסיטה של ורונה בתוך המסגרת של פרויקט משותף 2014 (אפיון משפחת הגן ATL הגפן ועל מעורבותו בהתנגדות Plasmopara viticola).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Personal computer
    Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
    Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) http://www.megasoftware.net/
    Motif-based sequence analysis tools (MEME) http://meme-suite.org/
    Geneious Biomatters Limited http://www.geneious.com/
    ProtParam Tool http://web.expasy.org/protparam/
    ngLOC http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
    TargetP v1.1 Server http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
    Protein Prowler http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
    MUsite http://musite.sourceforge.net/
    Pfam http://pfam.xfam.org/
    TMHMM Server v. 2.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
    ProtScale http://web.expasy.org/protscale/
    Grape Genome Database (CRIBI) http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
    PhenoGram http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
    MCScanX http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
    Interactive Tree Of Life (iTOL) http://itol.embl.de/
    UniProt http://www.uniprot.org/
    Phylogeny.fr http://www.phylogeny.fr/index.cgi
    MUSCLE http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
    Gblocks Server http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
    Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_
    datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
    Multi Experiment Viewer (MeV) http://mev.tm4.org/#/welcome
    Sequence Read Archive (SRA) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
    R https://www.r-project.org/
    EMBOSS Needle (EMBL-EBI) http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449, (7161), 463-467 (2007).
    2. Adam-Blondon, A. -F., et al. Genetics, Genomics, and Breeding of Grapes. Science Publishers. 211-234 (2011).
    3. Chen, L., Hellmann, H. Plant E3 Ligases: Flexible Enzymes in a Sessile World. Mol. Plant. 6, (5), 1388-1404 (2013).
    4. Vierstra, R. D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (6), 385-397 (2009).
    5. Serrano, M., Parra, S., Alcaraz, L. D., Guzmán, P. The ATL Gene Family from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa Comprises a Large Number of Putative Ubiquitin Ligases of the RING-H2 Type. J. Mol. Evol. 62, (4), 434-445 (2006).
    6. Aguilar-Hernández, V., Aguilar-Henonin, L., Guzmán, P. Diversity in the Architecture of ATLs, a Family of Plant Ubiquitin-Ligases, Leads to Recognition and Targeting of Substrates in Different Cellular Environments. PLoS One. 6, (8), e23934 (2011).
    7. Guzmán, P. The prolific ATL family of RING-H2 ubiquitin ligases. Plant Signal Behav. 7, (8), 1014-1021 (2012).
    8. Grimplet, J., et al. The grapevine gene nomenclature system. BMC Genomics. 15, 1077 (2014).
    9. Prince, V. E., Pickett, F. B. Splitting pairs: the diverging fates of duplicated genes. Nat. Rev. Genet. 3, (11), 827-837 (2002).
    10. Magadum, S., Nerjee, U., Murugan, P., Gangapur, D., Ravikesavan, R. Gene duplication as a major force in evolution. J. Gen. 92, (1), 155-161 (2013).
    11. Wang, N. Patterns of Gene Duplication and Their Contribution to Expansion of Gene Families in Grapevine. Plant Mol. Biol. Rep. 31, (4), 852-861 (2013).
    12. Fasoli, M. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24, (9), 3489-3505 (2012).
    13. BLAST. BLAST2.6.0. Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2016).
    14. MEGA. MEGA7.0.25 build 7170412. Available from: http://www.megasoftware.net/ (2017).
    15. MEME. MEME Suite Version 4.11.4. Available from: http://meme-suite.org/ (2017).
    16. ProtParam. ExPASy Server. Available from: http://web.expasy.org/protparam/ (2005).
    17. ngLOC v1.0. Available from: http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html (2007).
    18. TargetP v1.1 Server. Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ (2000).
    19. Prowler v1.2. Available from: http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/ (2005).
    20. MuSite v1.0. Available from: http://musite.sourceforge.net/ (2010).
    21. Pfam. Pfam version 31.0. Available from: http://pfam.xfam.org/ (2016).
    22. TMHMM v2.0c. Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ (2007).
    23. ExPASy. ProtScale. Available from: http://web.expasy.org/protscale/ (2005).
    24. CRIBI. Grape genome database. Available from: http://genomes.cribi.unipd.it/grape/ (2012).
    25. PhenoGram. Available from: http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot (2012).
    26. ScanX v0.8. Available from: http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/ (2013).
    27. Interactive Tree Of Life (iTOL). Version3.5.3. Available from: http://itol.embl.de/ (2016).
    28. UniProt. Available from: http://www.uniprot.org/ (2016).
    29. Phylogeny.fr. Available from: http://www.phylogeny.fr/index.cgi (2008).
    30. MUSCLE. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ (2017).
    31. Gblocks Server. Version 0.91b. Available from: http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html (2002).
    32. Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas. Available from: https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012 (2015).
    33. Multiple Experiment Viewer (MeV). Version 4.8.1. Available from: http://mev.tm4.org/ (2017).
    34. Sequence Read Archive (SRA). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra (2017).
    35. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, (15), 2114-2120 (2014).
    36. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9, (4), 357-359 (2012).
    37. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31, (2), 166-169 (2015).
    38. R. Version 3.4.1. Available from: https://www.r-project.org/ (2017).
    39. Ritchie, M. E. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, (7), e47 (2015).
    40. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, (12), 550 (2014).
    41. EMBL-EBI. EMBOSS Needle. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ (2017).
    42. Ariani, P. Genome-wide characterisation and expression profile of the grapevine ATL ubiquitin ligase family reveal biotic and abiotic stress-responsive and development-related members. Sci. Rep. 6, 38260 (2016).
    43. Vitulo, N., et al. A deep survey of alternative splicing in grape reveals changes in the splicing machinery related to tissue, stress condition and genotype. BMC Plant Biol. 14, (1), 99 (2014).
    44. Overbeek, R., Fonstein, M., D'Souza, M., Pusch, G. D., Maltsev, N. The use of gene clusters to infer functional coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, (6), 2896-2901 (1999).
    45. Dalquen, D. A., Dessimoz, C. Bidirectional Best Hits Miss Many Orthologs in Duplication-Rich Clades such as Plants and Animals. Genome Biol. Evol. 5, (10), 1800-1806 (2013).
    46. Remm, M., Storm, C. E. V., Sonnhammer, E. L. L. Automatic clustering of orthologs and in-paralogs from pairwise species comparisons1. J. Mol. Biol. 314, (5), 1041-1052 (2001).
    47. Kaduk, M., Sonnhammer, E. Improved orthology inference with Hieranoid 2. Bioinformatics. 33, (8), (2017).
    48. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 370 (2014).
    49. Juretic, N., Hoen, D. R., Huynh, M. L., Harrison, P. M., Bureau, T. E. The evolutionary fate of MULE-mediated duplications of host gene fragments in rice. Genome Res. 15, (9), 1292-1297 (2005).
    50. Filichkin, S. A. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Genome Res. 20, (1), 45-58 (2010).
    51. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22, (12), 3142-3152 (2003).
    52. Wong, D. C. J., Gutierrez, R. L., Gambetta, G. A., Castellarin, S. D. Genome-wide analysis of cis-regulatory element structure and discovery of motif-driven gene co-expression networks in grapevine. DNA Res. 24, (3), 311-326 (2017).
    53. Wong, D. C. J., Matus, J. T. Constructing Integrated Networks for Identifying New Secondary Metabolic Pathway Regulators in Grapevine: Recent Applications and Future Opportunities. Front. Plant Sci. 8, 505 (2017).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Video Stats