Genom kapsamındaki bir tanımlama ve ifade Meta-Analizi ATL E3 Ubikuitin ligaz gen ailesinin asma için kapsamlı iş akışı

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bu makalede tanımlama ve asma Arabidopsis Tóxicos Levadura içinde (ATL) E3 Ubikuitin ligazlar aile için uygulanan bir gen aile karakterizasyonu için yordam açıklanır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Ariani, P., Vandelle, E., Wong, D., Giorgetti, A., Porceddu, A., Camiolo, S., Polverari, A. Comprehensive Workflow for the Genome-wide Identification and Expression Meta-analysis of the ATL E3 Ubiquitin Ligase Gene Family in Grapevine. J. Vis. Exp. (130), e56626, doi:10.3791/56626 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sınıflandırma ve genlerin bir aile adlandırma önemli ölçüde kodlanmış protein çeşitliliği açıklaması ve aile işlevleri sıra motifler veya belirli gibi çeşitli özelliklerini temel alan tahmin katkıda bulunabilir translasyon modifikasyon ve farklı koşullarda aile üyelerinin ifade profil için siteler. Bu eser gen aile karakterizasyonu için detaylı bir protokolünü açıklar. Burada, yordamı Arabidopsis Tóxicos Levadura içinde (ATL) E3 Ubikuitin ligaz aile asma karakterizasyonu uygulanır. Aile üyeleri, gen yerelleştirme, yapısı ve çoğaltma karakterizasyonu, korunmuş protein motifleri analiz, protein fosforilasyon ve yerelleştirme siteleri tahmin genom çapında tanımlaması yöntemleri içerir yanı sıra gen ifadesi farklı DataSet'lerdeki aile arasında profil oluşturma. Deneysel amaçlar bağlı olarak daha fazla analiz için uzun olabilir, gibi işlem herhangi bir gen aile içinde kendileri için genomik veri kullanılabilen herhangi bir bitki türü için uygulanabilir ve ilginç adayları tanımlamak için değerli bilgiler sağlar fonksiyonel çalışmalar için bitki adaptasyon çevreleri için moleküler mekanizmaları anlayışlar veren.

Introduction

Son on yılda, asma genomik çok araştırma yapılmıştır. Grapevine araştırma meyve geliştirme ve odunsu bitkilerin yanıt-e doğru biyotik ve abiyotik stres için bir model haline gelmiştir tanınan bir ekonomik olarak uygun ürün var. Bu bağlamda, Vitis vinifera cv. PN40024 genom 20071 ve onun güncelleştirmek yorum 20112 serbest bırakılması için "Omics" ölçekli veri hızlı bir birikimi ve yüksek üretilen iş çalışmaların bir patlama yol açtı. Yayımlanmış sıra verilere dayanarak, kapsamlı bir analiz (genellikle korunmuş motifleri, yapısal ve/veya fonksiyonel benzerlikler ve evrimsel ilişkilerini paylaşımı proteinlerin oluşan) bir verilen gen ailesinin şimdi yapılabilir ortaya çıkarmak için onun Moleküler işlevler, evrim ve gen ifade profilleri. Bu analizler nasıl gen aileler bir genom geneli düzeyinde fizyolojik süreçleri kontrol anlamak için katkıda bulunabilir.

Bitki yaşam döngüsü birçok açıdan Ubikuitin-aracılı bozulması normal hücresel süreçler sağlamak için ince ayarlı bir ciro gerektirir anahtar proteinlerin tarafından düzenlenmektedir. Önemli bileşenleridir Ubikuitin-aracılı bozulma sürecinin E3 Ubikuitin ligazlar, hangi sistem esneklik, belirli hedefleri3alımı sayesinde sorumludur. Buna göre bu enzimlerin büyük gen ailesi, Arabidopsis thaliana genom4, belirli hedef proteinler ubiquitination için oyunculuk her E3 Ubikuitin ligaz öngörülen yaklaşık 1.400 E3 ligaz kodlama genler ile temsil eder. Substrat özgü ubiquitination tesislerinde hücresel yönetmelikte önemi rağmen nasıl ubiquitination yolu düzenlenir hakkında az şey bilinmektedir ve hedef proteinler sadece birkaç durumda tespit edilmiştir. Böyle özgüllük ve düzenleme mekanizmaları deşifre ilk kimlik ve özellikle sistemin farklı bileşenlerinin karakterizasyonu E3 ligazlar kullanır. Ubikuitin ligazlar arasında ATL alt familya 91 üye bir yüzük-H2 parmak etki alanı5,6, bazıları savunma ve hormon yanıt-e doğru7' rol görünen A. thaliana tanımlanan karakterizedir.

Yeni bir gen aile üyelerini tanımlamak için ilk önemli adım fikir birliği motifleri, anahtar etki alanları ve protein dizi özellikleri gibi aile özellikleri kesin tanımıdır. Nitekim, patlama analize dayalı tüm gen aile üyeleri güvenilir alınmasını etki alanlarındaki belirli protein protein işlevi/etkinlik, protein imza olarak hizmet veren sorumlu bazı zorunlu serisi özellikleri gerektirir. Bu önceki diğer bitki türleri aynı gen ailesinde karakterizasyonu tarafından kolaylaştırdı veya farklı genler putatively ortak sıraları ayırmak için farklı bitki türü içinde aynı aileye ait analiz ederek elde. Aile üyeleri daha sonra tek tek uluslararası konsorsiyum tarafından verilen bitki türleri için yerleşmiş ortak kurallarına adlandırılabilir. Grapevine içinde Örneğin, süper adlandırma V. vinifera ve A. thaliana dahil olmak üzere bir filogenetik ağaç inşaatı kurulması Komitesi üzüm Gene ek açıklama (sNCGGa), için öneriler gibi işlem tabi tutulur gen ek açıklama izin vermek için gen aile üyeleri üzerinde nükleotit dizileri8dayalı.

Kromozom yerelleştirme aile üyeleri ve gen çoğaltma anket izin bütün-genom veya tandem yinelenen genler varlığı vurgulayarak. Bu tür bilgiler bir işlevsel artıklık göstermek veya farklı durumlarda, Yani, Sigara functionalization, neo-functionalization veya alt functionalization9ortaya beri sözde gen fonksiyonları, çözülmeye yararlı görünür. Genetik yenilik, değişen ortamlar10bitki adaptasyon için yeni hücresel bileşenleri sağlama oluşturmak önemli olaylar her iki neo - ve alt - functionalization vardır. Özellikle, mükerrer atalarının genlerinin ve üretim yeni genlerin asma genom evrimi sırasında çok sık ve proksimal ve tandem mükerrer asma kaynaklanan yeni kurulan genler daha yeni üretmek olasılığı işlevleri11.

Gen aile işlevi deşifre başka bir önemli faktör transcriptomic profilidir. Transcriptomic veri çok büyük miktarda erişimlerini ortak veritabanları kullanılabilirliğini böylece sözde işlevleri büyük ölçekli silico ifade analizleri kullanarak gen aile üyelerine atamak için yararlanılabilir. Nitekim, bazı genler belirli bitki organlarında veya yanıt olarak bazı gerilmeler tuhaf ifade tanımlanmış koşullarında ilgili proteinlerin sözde rolleri ile ilgili bazı ipuçları vermek ve mümkün hakkında hipotezler destek vermek alt functionalization yinelenen genlerin farklı sorunlara yanıt vermek için. Bu amaçla, çeşitli veri kümeleri dikkate almak önemlidir: Bu zaten mevcut gen ifade matrisleri, genom-wide transcriptomic atlas asma organlar ve gelişim aşamalarında12, gibi olabilir ya da özel tarafından inşa edilebilir transcriptomic veri kümeleri için tanımlanmış stresleri tabi belirli bitki türleri için alınıyor. Ayrıca, iki matrisi kullanarak basit bir yaklaşım, bir ikili benzerlik verilerle ve ikili işbirliği ifade katsayıları ile diğer bir sıra benzerlik ve ifade desenleri bir gen ailesi içinde arasındaki ilişkileri değerlendirmek için uygulanabilir.

Bu çalışmanın amacı, gen yapısı, korunmuş protein motifleri, kromozom konumu, gen Mükerrer ve ifade desenleri, de protein fosforilasyon ve yerelleştirme siteleri ulaşmak için tahmini tanımlayan genel bir yaklaşım sağlamaktır bir bitkilerde gen aile ayrıntılı karakterizasyonu. Geniş kapsamlı bir yaklaşım burada ATL E3 Ubikuitin ligaz aile asma karakterizasyonu uygulanır. Göre ortaya çıkan rolü önemli hücresel işlemleri7düzenlenmesinde ATL alt familya üyelerinin bu eser de fonksiyonel çalışmalar için güçlü adaylar belirlenmesine yardımcı ve sonunda yöneten moleküler mekanizmaları unravel Bu önemli ürün kendi ortamına adaptasyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sözde ATL gen aile üye (ler) tanımlaması

  1. PSI-BLAST web sürümü
    1. PATLAMA web sayfa13 açın ve protein patlama bölümü tıklatın.
    2. Sonda ailenin diğer üyeleri tanımlamak için kullanılan protein (burada VIT_05s0077g01970) amino asit dizisi "Enter sorgu sırası" alanına girin.
      Not: İyi bir temsilcisi protein olmalıdır (aile karakterize tüm önemli özelliklerini görüntüleme bir protein) kullanılır.
    3. "Seç Arama set" alanında "protein" başvuru"veritabanı (refseq_protein) ve faiz (V. vinifera - taxid:29760) organizmanın seçin.
    4. Seçimdeki alan"Program", PSI-BLAST algoritma seçin ve analizler için patlama düğmesini tıklatın.
      Not: "algoritma parametreleri" tıklayarak bu (Max hedef sıraları, puanlama matris, PSI-BLAST eşik, vb) bazı gelişmiş parametrelerini ayarlamak mümkündür.
    5. İlk patlama yuvarlak sorgu ile alakalı eşleşmeleri görüntüleme tüm dizileri alır (e-değer seçili eşiğin - varsayılan olarak 0.005; bu deneyde 0.001). Açıkça "PSI-BLAST için Seç" sütunundaki onay tıklayarak inceleme altında ailesine ait ve ikinci PSI-BLAST yineleme adım 1.1.4 olduğu gibi patlama düğmesi tıklatılarak çalıştırılır tüm kayıtlar, seçimini kaldırır.
    6. Yeni tanımlanan dizileri Sarı renkle vurgulanır. Açıkça yanlış alınan sayısı seçimini kaldırın ve daha fazla 1.1.5 adımda anlatıldığı gibi yinelemeler ortaya çıkarmak.
    7. Yinelemeler ile algoritma değil bulmak ilgili herhangi bir giriş veya (yeni girdi bulunur) yakınsama ulaşır kadar devam. Daha fazla analizleri için sözde gen aile üyeleri listesini indirmek. Yanlış mutlak varlığı önlemek için her yineleme tarihinde erişilmiştir sayısı kontrol edin.
  2. PSI-BLAST standalone yorum
    1. PATLAMA tek başına sürümünü patlama ana sayfa13"Patlama download" butonuna basarak indirin.
      Not: Tek başına patlama yazılım daha önce açıklanan web arayüzü bir komut satırı sürümüdür. Özel bir yerel veya uzak veritabanı karşı PSİŞİK-BLAST arama yürütme hizmeti sağlar. Ayrıca, bu bir önceden tanımlanmış pozisyon belirli Puan matris (PSSM ile) arama sağlar.

2. el ile muayene PSI BLAST tespit aile üyelerinin

  1. Birden çok hizalama
    1. Daha önce tanımlanmış bir FASTA biçimli dosyada amino asitli dizileri toplamak ve içine MEGA yazılım14 çoklu hizalaması ile devam etmek için adatum.com'un.
    2. MEGA bilgisayar yazılımı açık, "Hizala" düğmesini tıklatın, tıklayın "Düzenle/Yapı Hizalama", "yeni bir hizalama oluştur" u tıklayın, "Protein"'ı tıklatın.
    3. "Düzenle" hizalama menüsü ve "Sıra dosya üzerinden Ekle" seçeneğini tıklatın. Kaş için daha önce oluşturulmuş FASTA eğe ve upload anketin sıralarının onaylayın.
    4. "Hizalama" hizalama menüsü ve "Hizalamak tarafından kas" tıklayın. Varsayılan parametrelerini kullanın, "Hesaplar" düğmesini tıklatın ve birden çok hizalama tamamlaması için beklemeye.
    5. Yanlış tahmin edilen aile üyeleri tutmak için birden fazla hizalama bakarak kontrol edin. Kurallı CxxC (13 x) PxCxHxxHxxCxxxW (7 x) CxxCW motifi, (özellikle üçüncü sistein önce prolin kalıntı varlığı), ATL aile üyeleri tanımlamak için gerekli önemli özelliktir.
  2. Özel LOGO analizi
    1. Aile üyeleri (96 asma dizileri ATL dikkate alınması gereken gereksinimlerini karşılayacak) kesin listesi birden çok korunmuş motifleri aile arasında tanımlamak için Em Motif yaşla (MEME)15 için gönderin.
    2. MEME giriş sayfasından "MEME" düğmesini tıklatın ve "Veri teslim formu" belirli bilgileri ile ilgili olarak aile ilgi tamamlamak.
    3. MEME analiz iki beklenen motifleri asma ATL aile üyeleri, Yani, yüzük-H2 ve GLD motifleri içinde varlığını doğrulamak için kullanın.
  3. Alternatif olarak, 2,1 ve 2,2 aynı anda Biyoinformatik yazılım paketi kullanarak adımları uygulayın (bkz. Tablo malzeme).
    1. FASTA dosya upload (bkz. Adım 2.1.1) içine belgili tanımlık maiyet. "Dosya" menüsünü, sonra "Al" ve tıklayın "dosya" seçin. FASTA dosyasını bulun ve "Aç"'ı tıklatın.
    2. İçe aktarılan tüm dizileri listesinde seçin ve araç çubuğundaki "Align/montajı" düğmesini tıklayın ardından "İkili birden çok hizalama". "Kas hizalama" seçin ve "OK" varsayılan parametrelerini kullanarak hizalama başlatmak için tıklatın.
    3. LOGO diziliş görselleştirmek için "Grafik" → "tıkırtı üstünde seçme hakkı" ve "Sıra logosu" seçin.

3. Protein fiziksel parametrelerini ve etki analizi

  1. Anketin aile üyelerinin farklı fiziksel parametrelerini tanımını aile kapsamlı bir açıklaması olması çok önemli olduğu için belirli web araçları için aile üyeleri listesini gönderin.
    1. İsoelectric noktası (PI) ve molekül ağırlığı (kDa) için varsayılan parametreleri ile Expasy Web ProtParam aracı16 kullanın.
    2. Protein hücre altı yerelleştirme için ngLOC v1.017 gibi varsayılan ayarları ve protein Avcı gemi hücre altı yerelleştirme v1.219 ile daha güvenilir bir tahmin varsayılan ayarları, targetP v1.118 ile elde etmek için farklı araçlar kullanabilir 0,5 olasılık cut-off ile. Fosforilasyon siteler için varsayılan parametreleri ile MUsite v1.0 web aracı20 kullanın.
  2. Ek protein etki alanlarında aile üyeleri araştırmak.
    1. Pfam veritabanı Web sayfası21açın, "Sıra arama" aracını seçin, protein sequences sorgu kutusuna göndermek ve analizler için "git" seçeneğini tıklatın.
      Not: Tek tek her protein dizi analiz edilir. Varsayılan ayar olarak 1,0 e değerini önemli ve önemli sigara sayısı arasında ayrım sağlar.
    2. TMHMM Server22 sözde Transmembran bölge varlığını araştırmak biyolojik dizi analizi için Merkezi'ni açın.
Tüm protein dizileri aynı anda sorgu kutusuna yapıştırın (veya alternatif olarak FASTA biçiminde tüm protein dizileri dahil olmak üzere bir metin dosyasına yüklemek) ve analizi çalıştırmak için "Gönder"'i tıklatın.
  • Tahmin edilen transmembran etki alanları, eksik proteinlerin sözde hidrofobik bölgeler tanımlamak için TMHMM göre (3.2.2. adım) ProtScale aracı ile analiz. ProtScale Web sayfası23açın. Her protein sıra sorgu kutusuna yapıştırın ve seçin "Hphob. / Kyte & Doolittle "amino asit ölçek olarak. Analizler için "Gönder"'i tıklatın.
  • 4. kromozom dağıtım, Mükerrer ve Exon-intron organizasyon

    1. Grapevine genom CRIBI biyoteknoloji Merkezi Web sitesi24alınan bilgileri temel alan kromozomlar ATL aile üyelerinde eşleyin.
      1. PhenoGram Web sitesi ana sayfasını25göz atın. "Giriş üzerinde ayrıntılı yönergeler ve örnekler sağlanan dosya yolunu takiben derlenmesi ile ilgili göre kromozomlar eşleşmesi için dosyayı" sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak genler belirli özellikleri ile "Phenogram" yazmak → " Belgeleri"→"Seçenekler"→"girdi dosyası".
      2. Çalışma "başlık" yazın. Çizilecek genom seçin. Grapevine genom gibi yazılım uygulanmamış genleri için "diğer" damla-aşağı yemek listesi seçin. Yönergeler ve örnekler verilmiştir, yolunu takiben göre genom dosya "Phenogram" yazmak → "Dokümantasyon" → "→"Genom"Seçenekler" ve yükleyin.
      3. Varsayılan parametreler "Fenotip aralığı", "Fenotip renk", "Görüntü biçimi" veya select alternatifler ilgili menülerde kullanın ve "Genler kromozomlar üzerinde görselleştirme elde etmek çıkart"'ı tıklatın.
    2. MCScanX yazılım26kullanarak aile üyeleri çoğaltma durumunu tanımlamak.
      1. İndirme ve MCscanX bir kopyasını komut satırları 1 (ek dosya 1) çalıştıran bir yerel makinede halletmek. MCscanX klasörüne girin ve komut satırları 2 (ek dosya 1) çalışan gerekli yürütülebilir dosyaları oluşturun.
        Not: MCscanX yüklenmesini bazı Linux 64 bitlik makinelerdeki işlevi chdir ile ilgili bir sorun nedeniyle başarısız olduğu bilinmektedir. Hata iletisi bu işlev yapmak üzerine ilgili IF verir komut yürütme, komut satırları 3 (ek dosya 1) çalıştırmak gerekir ve komut "yapmak" daha sonra denenmesi gerektiğini.
      2. V. vinifera proteinler ve komut satırları 4 (ek dosya 1) çalıştıran ek açıklama dosyasını indirin.
        Not: fermuarını açıp olmak asma ek açıklama dosyası ihtiyaçları ve komut satırları 5 (ek dosya 1) çalıştırarak benzersiz bir dosya içinde tek kromozom bilgi kedi.
      3. Bir "tüm tüm karşı" blastp arama sorgu ve konu V. vinifera protein dosyasını kullanarak Çalıştır.
      4. Komut satırları 6 (ek dosya 1) çalışan V. vinifera protein dosyası kullanarak bir aranabilir patlama veritabanı oluşturun. Blastp arama sorgu olarak V. vinifera proteinler dosyasını kullanarak komut satırları 7 (ek dosya 1) çalıştırarak önceden oluşturulmuş veritabanı karşı.
      5. Ek açıklama dosyasını uygun bir biçimde MCScanX için dönüştürün. Komut satırlarını 8 (özel perl komut dosyası parseMSCanXgff.pl indirmek için,ek dosya 1) çalıştırabilir. Komut satırları 9 (ek dosya 1) çalışan çözümlemesi gerçekleştirin.
        Not: Bir dosya vitis.gff gen koordinatları aşağıdaki biçimde tutan oluşturulur:
        başlama pozisyonu Bitiş pozisyonu sp # gen
        "#" iskele adı ise "sp" türler (Vv grapevine için) için iki harfli kod nerede. Not Bazı kod değişikliği kullanılabilir ek açıklama dosyasında sağlanan bilgi çeşitliliği nedeniyle belirli bazı durumlarda gerekli, ancak sağlanan özel perl komut dosyası çoğu dönüştürme için uygundur.
      6. Komut satırları 10 (ek dosya 1) çalışan MCScanX başlatın.
        Not: "vitis" ek açıklama ve patlama çıktı dosyası önektir. Bu yazılımın çalışmasına için zorunlu bir gereklilik temsil eder.
      7. MCScanX sonuçlarını analiz. MCScanX bir metin dosyasını "vitis.collinearity" collinear taşlarını içeren, üretir. Böyle bir dosya herhangi bir metin düzenleyicisi tarafından kontrol (bkz. örnek çıktı 1 ek dosya 1).
        Not: Birden fazla hizalamaları her başvuru kromozom karşı collinear blokların featuring html dosyalarını içeren bir "mcscaxOutput.html" dizini oluşturulur. Bu dosyaları bir web tarayıcısı üzerinden kontrol.
      8. Paralogous Genler kromozomlar komut satırları 11 (ek dosya 1) çalışan göreli konumlarını göre sınıflandırmak.
        Not: Paralogous gen sınıflandırma Ek tablo IIiçinde açıklanmıştır. Oluşturulan çıktı dosyası "vitis.gene_type" basit sekmeyle ayrılmış biçiminin tüm kaynak bilgilerini içerir.
      9. Gen aile yüksekokul komut satırları 12 (ek dosya 1) çalıştıran belirli bir mekanizma tarafından kökenli olup olmadığını değerlendirmek için zenginleştirme çözümlemesi gerçekleştirin.
        Not: dosya "gene_family_file" içinde ailesine ait tüm genler için odağı adları (örneğin, ATL_genes) aile adını izliyor bir satır metin dosyası ise dosya "vitis.gene_type" 4.2.8, bir adımda oluşturulur sekme ile ayrılmış. Fisher kesin test ve pzenginleştirme için uygulamalı istatistik test olduğunu-değerleri farklı kökenli "outputFile.txt" dosyasında depolanır.
    3. Görüntü, ek açıklama ve yönetim filogenetik ağaç için etkileşimli hayat ağacı (iTOL)27, çevrimiçi bir aracı kullanarak genler exon-intron organizasyonu görselleştirin.
      1. İTOL Web sitesi "Upload" bölümünde bir filogenetik ağaç yükleyin. Ağaç aşağıdaki bölüm 5 göre inşa edilmiştir. Her aile üyesi gen için V1 ek açıklama asma genomunun (yukarıda bahsedilen CRIBI Web sitesi) gen yapı tahmini almak. Uzunluğunu (bp) sözde ekzonlar, intron ve Çevrilmeyen bölgeler (UTRs) hesaplar.
      2. "Protein etki alanları" veri kümesi exon-intron desen grafik görselleştirme için kullanın.
    Yolu "Yardım" → "yardım sayfaları" → "Veri türleri" → "Protein etki alanları" iTOL Web sitesi27' deki takip sağlanan belirtimlerine göre hesaplanan uzunlukları kapsayan bir düz metin dosyası yazmak. "Protein etki alanları" veri kümesi kullanarak, "dikdörtgen (RE)" ve "dikdörtgen Aralık (GP)" şekiller exon ve UTRs sırasıyla temsil eder.

    5. Filogenetik analizi ve adlandırma

    1. Yüksek kaliteli filogenetik ağaç inşaat ve bir aile adlandırma tanımını ATL aile üyeleri arasındaki ilişkileri analiz.
      1. Bir asma gen ailesi için asma Super adlandırma Komitesi8tarafından kurulan kurallara uyun.
      2. UniProt veritabanı28 içinden asma gen adlandırma8için başvuru olarak gereken A. thaliana ATL serilerini almak.
      3. Asma ve A. thaliana gen aile üyeleri içinde Filogenetik analizi dahil edilecek tüm nükleotit dizileri de dahil olmak üzere bir FASTA dosya yazın. Nükleotit dizileri aile üyeleri (protein dizileri karşılaştırıldığında) arasında değişkenlik en izin.
    2. Filogenetik ağaç
      Not: Phylogeny.fr 29 boru hattı yüksek kaliteli filogenetik ağaç almak için önerilen ancak değil zorunlu kullanmaktır.
      1. Phylogeny.fr ana sayfa29gidin ve "Phylogeny analizi" boru hattı seçin.
        Not: "Bir tıkırtı" Olguların çoğunda uygundur, ancak bu gerekirse belirli gelişmiş ayarlar ("Gelişmiş") veya bile tamamen özelleştirilmiş bir çözümleme seçmek mümkündür (bkz "A la Carte";. Adım 5.2.5).
      2. Yazma "İsim analizi", upload, önceden oluşturduğunuz FASTA dosyasının (Adım 5.2.1 ve analizler için "Gönder"'i tıklatın.
      3. Alternatif olarak, yordam (yukarıdaki adımları 5.2.1, 5.2.2) tarif varsa hata iletisi sonuçlarında tamamlamak Phylogeny Süiti boru hattının her adımı ayrı ayrı, aşağıdaki gibi.
        1. KAS yazılım ana sayfa30, yükleme "Adım 1", FASTA dosyasında "Pearson/FASTA" "Çıktı biçimi" "Adım 2" ve tıkırtı "Boyun eğmek" olarak "sorgu serilerini hizalamak için adım 3" seçin.
        2. "Hizalama dosyayı yükle" ve daha fazla adımlar için FASTA dosyası olarak kaydedin.
        3. İşlem kötü ortadan kaldırmak için hizalama FASTA dosya konumları kullanarak Gblocks Server aracı31hizalı. Hizalama FASTA dosya yüklemek, "DNA" sıra "türü" olarak seçin ve (örneğin, asma ATL gen aile select üç seçenek önerilen "daha az sıkı seçimi için" çünkü için tam analizi ile en iyi uyan sıkılık seçenekleri açmadı yüksek sıralı sapma ile). "Blok için analizler al"'ı tıklatın.
        4. "Resulting hizalama" çıktı sayfa altında tıklatın ve sonuçları yeni FASTA dosyası olarak kaydedin.
        5. Phylogeny.fr ana sayfa29, "Phylogeny analizi" potansiyel "A la Carte" seçin. Sonra "Birden fazla hizalama" seçimini kaldırın ve "Hizalama küratörlüğü". "İş akışı oluştur" u tıklayın, FASTA Gblocks küratörlüğünü dosya (Adım 5.2.5.4) yüklemek, varsayılan parametreleri "Ayarlar" ile "Bootstrapping yordamı" seçin ve analizi çalıştırmak için "Gönder"'i tıklatın.
      4. Desteklenen Daralt kötü dalları (Yani, önyükleme değerleri < % 70) tıklayarak "Seçin ve eylem" bölümünde "daraltmak dalları" ve kesin sonuçları Newick biçiminde daha fazla analiz için download.
    3. Phylogeny üzerinde dayalı bir gen adı atayın.
      1. Filogenetik ağaç (Bölüm 4.3) bahsedilen iTOL oda içine yükleyerek ağaç yapısı güvenilirliğini değerlendirmek için gözden geçirin.
      2. Her bir aile üyesi için el ile bir gen adı atayın. Bire bir orthologues söz konusu olduğunda, Arabidopsisatamak-adı gibi (örneğin, AtATL3 → VviATL3). (İki veya daha fazla) kaynaklanan filogenetik mesafe kullanarak aynı ile tek bir Arabidopsis homolog üzerinden numaraları veya Arabidopsis gen bir sayıyla bitiyorsa mektupları asma genler ayırt etmek (örneğin, AtATL23 → VviATL23a, VviATL23b).
      3. Bir-çok veya çok-çok orthologues söz konusu olduğunda Arabidopsisoluşan yeni gen ad atama-adı gibi (burada, "ATL") zaten V. vinifera ve Arabidopsis için kullanılan en yüksek sayı daha yüksek bir sayı ile eşleştirilmiş (örn., VviATL83).
      4. En baştan filogenetik ağaç altına inen yeni tanımlanan aile adlandırma tamamlayın.

    6. asma Organ ve sahne ifade profil oluşturma

    1. Çalışma veri matrisi ifade verileri içeren aile üyeleri için oluşturur.
      1. V. vinifera cv. Corvina gen ifadesi Atlas datamatrix download--dan ResearchGate platform32üzerinde Dağıtılmış bağlantı. Bu dosya tabi merdiven kullanılmak üzere normalleştirilmiş RMA ifade değerleri içerir.
      2. Atlas datamatrix her aile gen ifade değerleri ayıklamak ve "aynı üstbilgi satırı olarak Atlas datamatrix içeren bir çalışma datamatrix" yazmak. "Çalışma datamatrix" bir sekmeyle ayrılmış metin dosyası olarak kaydedin.
    2. Çok deneme Viewer (MeV) yazılımını kullanarak hiyerarşik BI kümelenmiş çözümlemesi gerçekleştirin.
      1. Download ve install MeV yazılım33.
      2. "Çalışma datamatrix" upload (adım 6.1.2) yolunu takiben "Dosya" → "Load Data" → "Gözat" ve metin dosyasını seçin. "Tek renkli dizi" seçin ve otomatik bir ek açıklama değil sağlandığında "Yük açıklama" kene çıkarmak. İfade tablo önizleme üst en soldaki ifade değerini seçin ve "Yükle" düğmesini tıklatın.
      3. Log2 dönüştürme ("Ayarlamak veri" → "Günlük dönüşümler" → "Log2 dönüşümü") ve gen/satır normalleştirme ("Ayarlamak veri" → "Gen/satır ayarlamalar" → "medyan Merkezi gen/satır") uygulama verilerini ayarlamak. Uygun ölçek sınırı ("Göster" → "ayarla renk ölçeği sınırları") ayarlayın.
      4. Hiyerarşik kümeleme "Analiz" yolunu izleyerek hesaplamak "→"HCL"kümeleme" →.
    "En iyi duruma getirme Gene yaprak siparişi" ve "En iyi duruma örnek yaprak siparişi" alanında"sipariş en iyi duruma getirme", "Kümeleme ortalama bağlantı" ve "Mesafe matris seçimi" alanına "Pearson korelasyon" "Bağlantı yöntemi seçimi" alanında seçin. Sonra analizler için "Tamam"'ı tıklatın.
  • Pencerenin sol panelde "Çözümleme sonuçlarını" → "HCL" menüde sonuçları görüntüleyin. Isı haritası "Dosya" menüsünden "Resim Kaydet"'i tıklatarak dışa aktarın.
  • 7. ifade biyotik ve abiyotik stres yanıt olarak profil oluşturma

    1. İlgili yayınlar ve asma biyotik ve abiyotik stres araştıran çalışmalar elde edilen 6.1 GSE katılım kimliği olan adımları yineleyin. Örneğin, mantar patojen NimbleGen üzüm bütün-genom Mikroarray kullanarak Botrytis cinerea ile enfekte asma çilek transcriptome profil sağlayarak deneyler ile GSE Kımlığı GSE52586 göz olabilir. 6.1.1 ve 6.1.2 adımları yineleyin.
    2. NCBI sıra okur Arşiv34 SRA/BioProject kimlikli (örneğin, SRP055458 veya PRJNA275778 "grapevine çiçek gölgelendirme" deneyler için) ve ilişkili tüm ham sıra Okuma download. Birçok farklı çalışma Services'ten RNA-seq tutarlılık için tek bir ardışık düzeni kullanılarak işlenir.
      1. Kısaca, ham sıra FASTQ okuma (tek ve çift-uçlu) düzeltme ve kalite Trimmomatic35filtre. Bir AVGQUAL ve MINLEN 20 ve 40, sırasıyla filtre kullanımı ve tüm parametreleri varsayılan.
      2. 12 X asma başvuru genom1 Bowtie236kullanarak dizin. 12 X asma başvuru genom (örneğin, bowtie2-yapı) bowtie2 komutu çalıştırmadan önce indirin.
      3. Sayısı matris tablo asma V1 gen modeli ek açıklama (GFF/GTF) dosyası kullanarak htseq-sayısı37 ile elde edilir.
    3. R38 limma39 kitaplıklar için RMA normalleştirilmiş Matrisler ve DESeq240 kitaplıkları adım 7.1.1 ve 7.2.1, sırasıyla elde sayısı matris tablolar için ile fark gen ifade (re-) çözümlemesi gerçekleştirin.
      1. Standart bir "iki-grup" karşılaştırma gerçekleştirir (örneğin, "tedavi" / "kontrol"). Tasarım matrisi/gruplandırmalar "kontrol" ve "tedavi" koşulların doğru belirtildiğinden emin olun.
        Not: EL-33 çilek Botrytis cinerea ile denetim (sağlıklı) çilek karşı aynı geliştirme aşamasında komut satırları çalışan limma ile enfekte karşılaştırmak için tipik için bir tasarım Mikroarray fark ifade analizi (GSE52586) 13 ek dosya 1' de gösterilen. RNA-seq fark ifade analizi (SRP055458 veya PRJNA275778) çiçeklere (7 gün sonra kap-Güz) denetimin karşı gölge tedavi altında komut satırları 14 çalışan DESeq2 ile karşılaştırmak için için tipik bir tasarım ek dosya 1 gösterilir .
      2. Listeleri her aksine, limmaiçin differentially ifade genlerin (DEG) elde etmek, eBayes()tarafından takip işlevleri lmFit(), kullanın ve sonra topTable() işlevleri tarafından DESeq2iken için kullanın DESeqDataSetFromMatrix(), DESeq()ve results() işlevleri. Takip edilmesi gereken normal bir iş akışı aşağıda.
        1. Mikroarray fark ifade analizi için bkz: komut satırları 15 (ek dosya 1). RNA-seq fark ifade analizi için bkz: komut satırları 16 (ek dosya 1). Farklı uygun tasarım şeması (bkz: örnekler adım 7.3.1) diğer tüm kontrastlı için yukarıdaki adımları tekrarlayın
    4. Ayıklamak oluşturulan ağrıkesici listelerinden, ATL V1 katılım karşılık, log2 kat Değiştir (tedavi/denetim) içeren sütunlar korumak değil tüm satırları > | 0,5 | ve p-değerleri (FDR) < 0,05 ve birleştirme onları buna göre bir matrisi tabloya olup bir çalışma düşüyor "abiyotik" veya "biyotik/patojen etkileşim" compendia içine.
    5. Hiyerarşik kümelenmiş heatmaps (abiyotik ve biyotik compendia) R gplotskütüphaneleri kullanarak oluşturun.
      Not: heatmap.2 işlevini çağırarak heatmap ilgili matris tablodan satır dendrograms birlikte oluşturur. Cellnote kullanarak ek bağımsız değişkenler işlev differentially ifade ayırmak için yardımcı olur (log2FC > 0.5, FDR < 0,05) deneysel koşullar tarafından büyük bir dizi genelinde her karşılaştırma ATL genlerinde bir * sembolü. R komut satırları 17 (ek dosya 1) çalışan tipik iş akışında uygular veya alternatif olarak, heatmaps MeV yazılımını kullanarak oluşturmak için 6.2.2 6.2.5 adımları yineleyin.

    8. Paralogous sıra sapma ve ortak gen ekspresyonu arasındaki ilişkileri analizi

    1. İkili benzerlik içeren matris oluşturmak. Benzerlik matrisi değerleri sıra benzerlik ikili protein hizalamaları hesaplanan unsurlardır.
      1. KABARTMA iğne web sunucusu41 varsayılan ayarlarla ikili sıra hizalamaları yapmak ve metin dosyası olarak kaydetmek için kullanın. Çıkış metin dosyası açın ve "similarityTable.txt" adlı bir dosya oluşturmak için sütun ve satır adları ile birlikte tüm yorum satırları kaldırın.
        Not: Böyle bir tablo her ikili hizalama hesaplanan benzerlik değerler rapor her ATL gen için bir satır bulunur. Böylece bir simetrik matris diyagonal değerlerin saygı ile oluşturulan satırlar ve sütunlar loci sırasını aynıdır.
    2. Ortak ifade veri matrisiyle Pearson korelasyon katsayısı hesaplanarak inşa. Aşağıdaki yordam R ve perl modülü PDL gerektirir.
      1. İfade değerleri komut satırları 18 (ek dosya 1) bir terminal içinde çalışan 96 ATL genler için indirin. Komut satırları 19 (ek dosya 1) çalıştırarak indirilebilir bir özel perl komut dosyası kullanarak bir ortak ifade çözümlemesi gerçekleştirin. Böyle script daha önce bildirilen ATL loci çiftleri arasındaki Pearson korelasyon katsayısını hesaplar.
      2. Komut satırları 20 (ek dosya 1) çalışan komut dosyası başlatın ve çıkış yönergeleri izleyin.
    Komut dosyası (Bu sıralama şömine test çalıştırmak için aşağıya bakın esastır) adım 8.1 elde matris aynı locus adları sırasını içeren bir ortak ifade matris içeren bir çıktı dosyası (yani "coexpressionTable.txt") üretecek.
  • Bir şömine test adımları 8.1 ve 8.2 elde edilen veri matrisler arasında gerçekleştirin. ("R" dan bir terminal içinde koşmak buyurmak) R çevre girdikten sonra aşağıdaki komutu kullanarak ade4 kütüphane yük: library(ade4)
    1. İki veri matrisler yükleme ve komut satırları 21 (ek dosya 1), çalışan istatistik "ile nrep permütasyonların sayısını temsil eden" şömine testi çalıştırın. Test bu matrisler unsurları arasında korelasyon hesaplama, matrisler permuting ve sonra da aynı test istatistikleri yeniden hesaplamak oluşur.
      Not: Elde edilen değerlerin istatistik testinin bir phesaplamakta kullanılan istatistik testinin bir başvuru dağıtım oluşturmak için kullanılan-önemi için test etmek için değer. Hangi hassasiyetle permütasyon sayısını tanımlayan p-değeri elde edilebilir.
  • Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    En çok benzeyen A. thaliana ATL2 (At3g16720) BLASTp arama aracılığıyla kullanıldı olarak sonda asma genom ATL aile uyeleri anket için tanımlanan VIT_05s0077g01970 gen (V. vinifera cv Pinot Noir PN40024). Birkaç döngüleri sonra sözde genlerin asma ATL gen ailesine (şekil 1A) ait bir liste açığa PSI-BLAST analiz yakınsadı. Kurallı yüzük-H2 etki alanı her aday için varlığı kas diziliş analizi (şekil 1B) tanımlanan tüm kayıtların görsel denetim tarafından incelendi. Sadece düzgün aralıklı korunmuş amino asitler, iki histidin kalıntıları, aynı zamanda üçüncü sistein önce prolin kalıntı içeren genler Arabidopsis5orijinal ATL tanımına göre ATLs kabul edildi. Toplam 96 asma genlerin koşulları yerine getirmek ve daha fazla karakterizasyonu için kabul edildi. ATL aile bireylerinin gen ve karşılık gelen kodlanmış protein, Yani, yüzük-H2, yanı sıra diğer bilinen etki alanları veya hidrofobik transmembran zengin bölgeleri, hücre altı varlığı belirli özelliklerini tanımlamak için analiz edildi Yerelleştirme ve sözde fosforilasyon siteleri (Tablo 1 ve Tablo 2).

    Figure 1
    Şekil 1: PSI-BLAST anket ve sözde asma ATLs hizalamasını. (A)Screenshot protein serisini VIT_05s0077g01970 yem olarak kullanan ilk PSI-BLAST yineleme arama top 10 hits. Yüzük-H2 etki ve karşılık gelen LOGO gösteren sözde ATLs elde edilen moleküler biyoloji suite kullanarak 96 seçili asma hizalamasını bölümünü (B) ( Tablo malzemelerigörmek). 42altında bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisans lisanslı Ariani vd üzerinden çoğaltılamaz.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Adı Gene kimliği Gene uzunluğu (bp) İntron sayısı UniProt kimliği Protein uzunluğu (aa) Yüzük-H2 motifi TM/H etki alanı sayısı Diğer etki alanları
    VviATL3 VIT_09s0002g00220 1245 0 F6HXK6 304 PxC 1
    VviATL4 [VviRHX1A] VIT_15s0021g00890 1827 3 D7SM36 203 PxC 0
    VviATL18 VIT_11s0118g00780 1113 2 F6HCI8 193 PC 0
    VviATL23a VIT_18s0001g01060 935 0 F6H0E4 114 PxC 0,5
    VviATL23b VIT_18s0001g01050 399 0 E0CQX3 132 PxC 1
    VviATL24 VIT_17s0000g06460 4466 4 D7SI89 217 PxC 1
    VviATL27 VIT_00s0264g00020 2554 4 D7T1R5 235 PxC 1
    VviATL43 VIT_11s0052g00530 1576 2 D7SQD9 457 PxC 3
    VviATL54a VIT_18s0001g06640 3221 1 F6H0Y5 405 PxC 1
    VviATL54b VIT_03s0017g00670 2774 1 F6HTI0 427 PxC 1
    VviATL55 [VviRING1] VIT_07s0191g00230 1844 0 F6HRP9 372 PxC 1
    VviATL63 VIT_06s0004g06930 804 0 D7SJU6 267 PxC 1
    VviATL65 VIT_03s0063g01890 2068 0 F6HQI8 396 PxC 1
    VviATL82 VIT_01s0026g02540 820 0 F6HPQ9 233 PC 0,5
    VviATL83 VIT_17s0000g08400 1887 0 F6GSQ4 143 PC 0
    VviATL84 VIT_06s0004g00120 1853 0 F6GUP5 368 PC 0,5 ZF-RING_3
    VviATL85 VIT_12s0034g01400 786 0 F6H965 261 PC 0,5
    VviATL86 VIT_12s0034g01390 1434 1 D7T016 451 PC 0,5
    VviATL87 VIT_18s0001g03270 1002 0 F6H0T2 333 PC 0,5 ZF-RING_3
    VviATL88 VIT_08s0040g00590 1320 0 F6HQR2 314 PC 0 ZF-RING_3

    Tablo 1: ilk 20 VviATL genler ve sıralı özelliklere karşılık gelen proteinlerin. TM: transmembran; H: hidrofobik; 0,5 bir veya daha fazla hidrofobik bölgeler varlığını gösterir. 42altında bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisans lisanslı Ariani vd üzerinden çoğaltılamaz.

    Table 2
    Tablo 2: ilk 20 hakkında ayrıntılı bilgi VviATL Gen bulunduğu V. vinifera genom, çoğaltma durumu ve ATL protein FİZİKO-kimyasal özellikleri ve konumları. (bir) fosforilasyon sitelerin sayısı Musite tarafından öngörülen; (b) benzer Öngörüler ile en az iki yazılım elde olan vurgulanır kalın olarak; TargetP v1.1 ve Protein Avcı gemi hücre altı yerelleştirme olasılık 0,5 bir cut-off kullanıldı ise ngLOC varsayılan ayarlarla kullanıldı. NUC, çekirdeği; MIT, mitokondri; CHL, kloroplast; PLA, plazma zarı; S, salgı yolu (sinyal peptid varlığı); M, mitokondri; C, kloroplast; O ya da -, diğer yerlerde; nd, tespit (Yani, değerin eşik altında). 42altında bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisans lisanslı Ariani vd üzerinden çoğaltılamaz. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

    Başvuru A. thaliana ATL gen aile dizisi ile birlikte tespit asma ATL kodlama genlerin nükleotit dizileri de dahil olmak üzere bir Filogenetik analizi kurallarına göre asma ATL adlandırma için kullanıldı sNCGGa8. 96 ve 83 nükleotit dizileri V. vinifera ve A. thaliana, sırasıyla, güvenilir bir filogenetik ağaç elde etmek için Phylogeny.fr ardışık düzenine tabi tutuldu.İkinci dizileri daha sonra açıklama ekleyin ve asma genlerin sağlam ilişkiler (Şekil 2) temelinde adı kullanılmıştır. Bu yaklaşım 13 dışarı-in 96 asma ATLs bir A. thaliana ATL ile bire bir onların orthology dikkate alınarak belirli bir tanıtıcı aldı. Diğer 83 genlerin adları ile en yüksek sayı kullanılan A. thalianabüyük bir ATL gen sayı başlayarak üstten alta, numaralandırma bir ilerici filogenetik ağacını temel ayrıldı.

    Figure 2
    Resim 2: Filogenetik ağaç V. vinifera ve A. thaliana ATL E3 Ubikuitin ligaz kodlama genlerin. Unrooted ağaç Phylogeny.fr suite (V. vinifera (içinde yeşil) ve UniProt veritabanında (sarı) bildirilen A. thaliana 83 ATL genler. ile oluşturuldu Şube destek değerleri 100 önyükleme çoğaltır elde edilmiştir. Kırmızı yıldızlar bir BCA2 çinko parmak (BZF) etki alanına karşılık gelen proteinler varlığını gösterir. 42altında bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisans lisanslı Ariani vd üzerinden çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    ATL kodlama genler asma kromozomlar eşleme boyunca bütün-genom çoğaltma ATL gen aile asma genişlemesi önemli evrimsel güç olarak öne genom geniş bir dağıtım gösterdi. Gerçekten de, 31 ATLs potansiyel olarak gelen bir segmental veya tüm genom çoğaltma olaylardan kaynaklanan homolog kromozom bölgelerde bulundu. Ayrıca, aynı analiz vurgulanan 13 tandemly yinelenen genler, bir proksimal yinelenen ve 51 dağınık çoğaltmaları (şekil 3). Yinelenen ATL aile genlerinde çok sayıda göz önüne alındığında, biz yinelenen genlerin tercihli saklama genom ayırma sırasında kontrol etmek için bir zenginleştirme testi (Fisher'ın tam testi) gerçekleştirilen. Bir p-değeri < 0,001, bu test doğruladı ATL genler çoğaltılamaz hipotez muhafaza daha fazla rasgele bir rol ATL gen ailesi için asma adaptasyon ve evrim sırasında düşündüren beklenen.

    Figure 3
    Şekil 3: Grapevine ATL-kodlama gen dağıtım V. vinifera kromozomlar ve çoğaltma devlet. 96 asma ATL genlerin kromozom bilgileri veritabanında kullanılabilen tam olarak ile 19 V. vinifera kromozomlar için eşleştirilmiş. Rengi özgün çoğaltma olayı belirtir. Dikey siyah çizgiler ve kırmızı çizgiler tandem Mükerrer ve tüm genom mükerrer, sırasıyla elde çiftleri tanımlayın. 42altında bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisans lisanslı Ariani vd üzerinden çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Asma ATLs sözde biyolojik fonksiyonları daha fazla araştırmak için bir meta-analiz V. vinifera cv. Corvina küresel gen ifadesi Atlas12gerçekleştirilmiştir. Veri kümesi 54 farklı asma organlar ve gelişim aşamalarında bütün-genom ifade değerleri içerir ve hiyerarşik bir BI kümelenmiş Çözümlemeyi gerçekleştirmek için kullanılan. Sonuçları sadece 96 ATLs en az bir 54 dokular/etap dile getirdi, ancak da ifade profilleri (şekil 4A) beş ana kümeleri varlığı işaret olduğunu doğruladı. Kısaca, A ve E kümeleri davranışları gösterdi özellikle ilk ATL genlerin Juvenil örnekleri, erken berry aşamaları, genç yaprak, dalları, önümüzdeki ve bud aşamaları çoğu da dahil olmak üzere genel bir downregülasyon karakterizedir. Öte yandan, aynı kümede A aşamaları, odunsu dokularında ve tohum geliştirme ATL genler baskın upregulation gösterdi geç aşamalarında çilek olgunlaşma ve hasat sonrası gibi olgun örnekleri Soldurma. Küme D genlerinde ATL kez upregulated geç yaşlardaki berry küme C genlerinde esas olarak downregulated örnekleri, çoğunda bulunmuştur. Son olarak, küme B ifade profillerinde ilgili herhangi bir değişiklik yoktu.

    Benzer bir yaklaşım yanıt biyotik ve abiyotik olarak asma ATL aile üyeleri bu amaçla inşa belirli veri kümelerini kullanarak ifade çalışma uygulandı. Mikrodizi ve RNA-seq deneyleri ifade veri büyük miktarda gen ifade Omnibus (GEO) ve ArrayExpress gibi kamu access veritabanlarındaki mevcuttur. Bir kez toplanan ve elverişli bir konuma sahip Normalleştirilmiş, bilgileri daha fazla ATLs potansiyel işlevi bitki yanıt gerilmeler olarak anlayışlar için istismar edildi. Grapevine ATLs biyotik streslere karşılık olarak ifade profilleri analiz ortaya 62 dışarı-in 96 transkript önemli bir modülasyon gösterdi (log2 kat-Değiştir (FC) > | 0,5 |) yanlış bulma oranı (FDR) ile en az iki koşullarında < 0,05 () Şekil 4B). Yalnızca tek bir koşul FDR eşik dikkate alınarak 81 için sayısı artar. Bu sonuçlar güçlü doğrudan katılımı da asma patojenler cevaben ATL gen ailesinin önerdi. Özellikle, bir grup 12 genlerin (VviATL3-27-54b-55-90-97-123-144-148-149-156) şiddetle upregulated yanıt biotrophic ve necrotrophic mantarlar ve otobur, dahil olmak üzere çoğu patojenlere edildi ve böylece, için dikkate değerdir daha işlevsel analizleri.

    Figure 4
    Şekil 4: hiyerarşik clusteringof ATL gen ifadesi Atlas asma ve asma biyotik stres kaynaklı dataset içinde. (A) değerleri asma Atlas12 asma ATL genlerin Pearson'ın mesafe ölçüm üzerinde dayalı hiyerarşik küme analizi için kullanılan günlük dönüştürülmüş ifade. Her gen medyan transkript bolluk saygı ile renk ölçeği temsil daha yüksek (kırmızı) veya alt (yeşil) ifade tüm örnekler üzerindeki yüzey. Harfler A-e sağ tarafında tanımlanan farklı kümeleri gösterir.AB: patlama sonra; B: seri; Bud-W: kış bud; F: çiçekli; FB: çiçeklenme başlar; FS: meyve ayarla; G: yeşil; Bay: Orta-olgunlaşma; PFS: sonrası meyve seti; PHWI-II-III: 1, 2 ve 3 ay Soldurma sonrası hasat; R: olgunlaşma; S: senescent; kök-W: odunsu kök; V: veraison; WD: iyi gelişmiştir; Y: genç. (B) renk ölçeği artan (kırmızı) temsil eder veya (mavi) kat değişiklikleri asma ATL gen ifade virüslü örneklerinde her koşul için denetimlere kıyasla azalmıştır. Yıldız belirtmek önemli fark ifade (FDR < 0,05) karşılık gelen koşullar altında her sürümüyle. 42altında bir Creative Commons Attribution 4.0 Uluslararası Lisans lisanslı Ariani vd üzerinden çoğaltılamaz. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Ek tablo 1: Alternatif işlenim için ATL genler aday. (bir) ATL gen kimliği V1 üzüm gen öngörü ve ek açıklama, (b) ATL gen ID V2 üzüm gene tahmin ve ek açıklama43, sözde ATL alternatif alışılageldik türevleri, (d) sayısı (c) göre göre her sözde ATL variant dizisi kodlama hakkında bilgi. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

    Ek tablo 2: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

    Ek dosya 1: Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Genomik dönemde, birçok gen aile derinden birkaç bitki türü karakterize. Bu bilgiler için ön fonksiyonel çalışmalar ve daha fazla bir ailenin farklı üyesi rolünü araştırmak için bir çerçeve sağlar. Bu bağlamda, bir adlandırma sistemi izin kaçınarak artıklık ve adları bağımsız olarak farklı genler için farklı araştırma gruplarınca atandığında ortaya çıkabilecek karışıklıklara bir aile, her üye benzersiz olarak tanıtmak için bir ihtiyaç da vardır.

    Düşünceli dikkate sonra asma bilimsel topluluk adı asma Arabidopsis genler ile benzerlikler dayalı bir aile genlerinde kabul etti ve yeni gen aileler asma açıklamak için uygulanması gereken kurallar bir dizi kurulan, temelde nükleotit dizileri asma ve Arabidopsis aile üyeleri8arasında filogenetik karşılaştırılması başlayarak. Bu nedenle, zaten açıklamalı ve düzgün Arabidopsis içinde adlı tek gen asma adlandırma kullanılabilir. Grapevine ATL orthologues burada anlatılan Arabidopsis içinde tanımlanması için uygulanan yordamı yalnızca doğru asma gen aile adlandırma atanmasının gereksinimi karşılamak için bu nedenle gerçekleştirilmiştir. Yine de, diğer bitki türleri için alternatif yaklaşımlar bir seçenek olabilir. Örneğin, orthology orthologues daha fazla benzer iki tür gen çiftleri olarak tanımlandığı bir çift yönlü BLAST sayısı (BBH), kullanarak anlaşılmaktadır (Yani, en yüksek hizalama puanı ile) bir başkasına herhangi bir başka gen diğerinde için türler44. Ancak, bu yöntem bitki ve hayvan45' gibi birçok orthologues gen ikilenmesi, yüksek orandaki durumunda kaçırabilirsin. Ayrıca, ATL-encoding genler durumunda (prolin kalıntı da dahil olmak üzere) kesin ATL-tipi halka-H2 yapısı eksik genler BBH alabilir veya değil açıklamalı ve Arabidopsis ATLs olarak adlı genler. Evrimsel bir bakış açısından bu arama ilgili olabilir, ancak değil açıklamalı orthologues alınmasını asma ATL gen aile ek açıklama ve isimlendirme ve ATLs açıklamalı değil orthologues kapsamını yerine değil adı asma aile üyeleri için kullanılamaz. Başka bir ihtimal de olsa böyle iş akışları açıkça bilimsel topluluk tarafından tavsiye edilmez amino asit InParanoid46veya en son Hieranoid 247, kullanarak nükleotit dizileri yerine göre orthology anlaması için.

    İfade meta-analiz, çalışma ve farklı kamuya veri kümesi depoları ifade veri birleştirmek için sistematik bir yaklaşım tanımlanabilir, paylaşılan ve farklı moleküler mekanizmaları koşulları çeşitli vurgulayarak sağlar. Böylece, birden çok büyük ölçekli transcriptomic deneyler gen ifade bilgi entegrasyonu böylece minimize deneyler aile fertleri ifade profilleri tanımlayarak bir gen aile karakterizasyonu artırabilir deney özgü faktörler ve sözde gen işlevinin daha sağlam bir varsayım belirli işlemlerde destekleyen etkisi. Ancak, farklı platformlara kendi sınırlamaları dikkate alınarak elde edilen ifade veri entegrasyonu Mikroarray veri kullanımı gerektirir. Örneğin, içinde asma Nimblegen Mikroarray peron, probesets dizesi temsil edilen karşılık gelen genler için önemli bir bölümünü (~ 13.000 genler) potansiyel çapraz hibridizasyon sorunları48var. Grapevine ATL aile söz konusu olduğunda, 15 genler böyle olay tarafından etkilenip etkilenmedikleri sınanmamıştır. Yine de, Cramer ve ark. tarafından anlatıldığı gibi 48, son derece benzer gen aile üyeleri aynı prob tarafından çapraz tanımlaması ifadede özel koşullar, sadece tek bir gen ama iki yüksek sıra paylaşımı daha fazla genlerle ilgili ilginç bilgiler sağlayabilir benzerlik ve böylece potansiyel olarak paylaşım hedefleri ve işlevleri. Başka bir olası sorunu Mikroarray veri kümeleri için ilgili çok duyarlı değildir Mikroarray platformlarının ifade algılama sınırıdır. Her ikisi de çözmek için endişeleri, i.e., çapraz-hibridizasyon ve sinyal duyarlılık, olası bir çözüm sadece RNAseq ifade veri kümeleri dikkate almak olabilir. Ancak, RNAseq verilerin birçok farklı çalışmalar çok büyük veri kümeleri meta-analizi son derece zaman alıcı olabilir ve birçok Hesaplamalı kaynakları ve yüksek uzmanlık gerektiriyor olabilir.

    Yaklaşım burada ayrıntılı olmayı hedefleyen sunulan rağmen kesinlikle daha fazla olabilir diğer analizler ile tamamlanmaktadır. İlk olarak, moleküler evrim ve filogenetik ilişki bitkilerde gen aile üyeleri arasında daha fazla elde etmek için Filogenetik analizi kullanarak birden fazla sıra hizalamaları aile üyelerinin bir filogenetik ağaç bina uzun olabilir birçok bitki türü üzerinden. Ks değerleri belirlenerek aile genleri, eş anlamlı ve eşanlamlı ikame oranlarında bir tahmin sırasında evrim, evrim zamanı hesaplamak mümkündür (eşanlamlı site başına eşanlamlı oyuncu değişikliği sayısı bir verilen zaman dönem) ve Ka (aynı döneminde eşanlamlı site başına nonsynonymous oyuncu değişikliği sayısı). Ka/Ks oranı sapma onların atalarından sonra gene çoğaltma olayları mekanizmaları anlaması için kullanılır. Ka/Ks değeri = 1 öneriyor tarafsız seçimi, bir Ka/Ks değerini < 1 öneriyor seçimi ve Ka/Ks değeri arındırıcı > 1 pozitif seçim49öneriyor. Ayrıca, gen yapısı analiz intron varlığı ortaya koyarsa, geni aile karakterizasyonu daha fazla alternatif Uçbirleştirme türevleri algılama için genişletilebilir. Nitekim, RNA-seq verilerden farklı dokular, stres koşulları ve genotip43, 21 (Toplam 96) derin bir anketin temel ATLs güçlü potansiyel sayısı 2 ila 16 arasında değişen bu ATLs için (bkz: izoformlarının ile alternatif yapıştırma olayları için adaylar Ek tablo 1). Alternatif transkript sık amino asit serilerinde değişir protein izoformlarının üretmek ve bu değişiklikler proteinlerin hücresel özellikleri değiştirebilir ve ince modülasyon gen ürünü işlevinin değişiklikler dökülmesine neden olabilir. Bu nedenle, önemli bitki işlevler stres tepkisi, hastalık direnci, fotosentez ve çiçekli50,51alternatif yapıştırma olayları dahil edilmiştir.Sözde CISiçerir ATL gen düzenleyici bilgi entegrasyonu-düzenleyici elemanlarının52 veya molekülleri (örneğin, mikroRNA ve uzun kodlamayan RNA) potansiyel hedefleme ATLs53 bulma de takviye için karmaşık moleküler düzenleme ve asma ATLs etkileşiminin sistem anlayışlar ortaya koyuyor.

    Sonuç olarak, yanı sıra yeni bir gen aile içinde bir bitki türü tanımlamak için uygulanacak yönergeleri analizleri seçimi yapılması için esas olarak bilimsel topluluk kuralları yanı sıra gene aile kimlik kapsamını tarafından tahrik edilmektedir. Bilgiler kümesi sömürecek, mümkün sonraki soruşturma adımları unutmayın ki gene evrim bitki türleri, genom yapısı açıklamasını veya güvenilir seçim adayları arasında işlevsel içeren arasında çalışmalar.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar ifşa gerek yok.

    Acknowledgements

    İş ortak proje 2014 (karakterizasyonu ATL gen ailesinin asma ve direnç Plasmopara viticolaonun tutulumu) çerçevesinde Verona Üniversitesi tarafından desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Personal computer
    Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
    Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) http://www.megasoftware.net/
    Motif-based sequence analysis tools (MEME) http://meme-suite.org/
    Geneious Biomatters Limited http://www.geneious.com/
    ProtParam Tool http://web.expasy.org/protparam/
    ngLOC http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html
    TargetP v1.1 Server http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/
    Protein Prowler http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/
    MUsite http://musite.sourceforge.net/
    Pfam http://pfam.xfam.org/
    TMHMM Server v. 2.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
    ProtScale http://web.expasy.org/protscale/
    Grape Genome Database (CRIBI) http://genomes.cribi.unipd.it/grape/
    PhenoGram http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot
    MCScanX http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/
    Interactive Tree Of Life (iTOL) http://itol.embl.de/
    UniProt http://www.uniprot.org/
    Phylogeny.fr http://www.phylogeny.fr/index.cgi
    MUSCLE http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/
    Gblocks Server http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html
    Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas datamatrix https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_
    datamatrix_geneIDs_Fasoli2012
    Multi Experiment Viewer (MeV) http://mev.tm4.org/#/welcome
    Sequence Read Archive (SRA) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra
    R https://www.r-project.org/
    EMBOSS Needle (EMBL-EBI) http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449, (7161), 463-467 (2007).
    2. Adam-Blondon, A. -F., et al. Genetics, Genomics, and Breeding of Grapes. Science Publishers. 211-234 (2011).
    3. Chen, L., Hellmann, H. Plant E3 Ligases: Flexible Enzymes in a Sessile World. Mol. Plant. 6, (5), 1388-1404 (2013).
    4. Vierstra, R. D. The ubiquitin-26S proteasome system at the nexus of plant biology. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 10, (6), 385-397 (2009).
    5. Serrano, M., Parra, S., Alcaraz, L. D., Guzmán, P. The ATL Gene Family from Arabidopsis thaliana and Oryza sativa Comprises a Large Number of Putative Ubiquitin Ligases of the RING-H2 Type. J. Mol. Evol. 62, (4), 434-445 (2006).
    6. Aguilar-Hernández, V., Aguilar-Henonin, L., Guzmán, P. Diversity in the Architecture of ATLs, a Family of Plant Ubiquitin-Ligases, Leads to Recognition and Targeting of Substrates in Different Cellular Environments. PLoS One. 6, (8), e23934 (2011).
    7. Guzmán, P. The prolific ATL family of RING-H2 ubiquitin ligases. Plant Signal Behav. 7, (8), 1014-1021 (2012).
    8. Grimplet, J., et al. The grapevine gene nomenclature system. BMC Genomics. 15, 1077 (2014).
    9. Prince, V. E., Pickett, F. B. Splitting pairs: the diverging fates of duplicated genes. Nat. Rev. Genet. 3, (11), 827-837 (2002).
    10. Magadum, S., Nerjee, U., Murugan, P., Gangapur, D., Ravikesavan, R. Gene duplication as a major force in evolution. J. Gen. 92, (1), 155-161 (2013).
    11. Wang, N. Patterns of Gene Duplication and Their Contribution to Expansion of Gene Families in Grapevine. Plant Mol. Biol. Rep. 31, (4), 852-861 (2013).
    12. Fasoli, M. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24, (9), 3489-3505 (2012).
    13. BLAST. BLAST2.6.0. Available from: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (2016).
    14. MEGA. MEGA7.0.25 build 7170412. Available from: http://www.megasoftware.net/ (2017).
    15. MEME. MEME Suite Version 4.11.4. Available from: http://meme-suite.org/ (2017).
    16. ProtParam. ExPASy Server. Available from: http://web.expasy.org/protparam/ (2005).
    17. ngLOC v1.0. Available from: http://genome.unmc.edu/ngLOC/index.html (2007).
    18. TargetP v1.1 Server. Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/ (2000).
    19. Prowler v1.2. Available from: http://bioinf.scmb.uq.edu.au:8080/pprowler_webapp_1-2/ (2005).
    20. MuSite v1.0. Available from: http://musite.sourceforge.net/ (2010).
    21. Pfam. Pfam version 31.0. Available from: http://pfam.xfam.org/ (2016).
    22. TMHMM v2.0c. Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ (2007).
    23. ExPASy. ProtScale. Available from: http://web.expasy.org/protscale/ (2005).
    24. CRIBI. Grape genome database. Available from: http://genomes.cribi.unipd.it/grape/ (2012).
    25. PhenoGram. Available from: http://visualization.ritchielab.psu.edu/phenograms/plot (2012).
    26. ScanX v0.8. Available from: http://chibba.pgml.uga.edu/mcscan2/ (2013).
    27. Interactive Tree Of Life (iTOL). Version3.5.3. Available from: http://itol.embl.de/ (2016).
    28. UniProt. Available from: http://www.uniprot.org/ (2016).
    29. Phylogeny.fr. Available from: http://www.phylogeny.fr/index.cgi (2008).
    30. MUSCLE. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/ (2017).
    31. Gblocks Server. Version 0.91b. Available from: http://molevol.cmima.csic.es/castresana/Gblocks_server.html (2002).
    32. Vitis vinifera cv. Corvina gene expression Atlas. Available from: https://www.researchgate.net/publication/273383414_54sample_datamatrix_geneIDs_Fasoli2012 (2015).
    33. Multiple Experiment Viewer (MeV). Version 4.8.1. Available from: http://mev.tm4.org/ (2017).
    34. Sequence Read Archive (SRA). Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra (2017).
    35. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30, (15), 2114-2120 (2014).
    36. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9, (4), 357-359 (2012).
    37. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq-a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31, (2), 166-169 (2015).
    38. R. Version 3.4.1. Available from: https://www.r-project.org/ (2017).
    39. Ritchie, M. E. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Res. 43, (7), e47 (2015).
    40. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biology. 15, (12), 550 (2014).
    41. EMBL-EBI. EMBOSS Needle. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/ (2017).
    42. Ariani, P. Genome-wide characterisation and expression profile of the grapevine ATL ubiquitin ligase family reveal biotic and abiotic stress-responsive and development-related members. Sci. Rep. 6, 38260 (2016).
    43. Vitulo, N., et al. A deep survey of alternative splicing in grape reveals changes in the splicing machinery related to tissue, stress condition and genotype. BMC Plant Biol. 14, (1), 99 (2014).
    44. Overbeek, R., Fonstein, M., D'Souza, M., Pusch, G. D., Maltsev, N. The use of gene clusters to infer functional coupling. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, (6), 2896-2901 (1999).
    45. Dalquen, D. A., Dessimoz, C. Bidirectional Best Hits Miss Many Orthologs in Duplication-Rich Clades such as Plants and Animals. Genome Biol. Evol. 5, (10), 1800-1806 (2013).
    46. Remm, M., Storm, C. E. V., Sonnhammer, E. L. L. Automatic clustering of orthologs and in-paralogs from pairwise species comparisons1. J. Mol. Biol. 314, (5), 1041-1052 (2001).
    47. Kaduk, M., Sonnhammer, E. Improved orthology inference with Hieranoid 2. Bioinformatics. 33, (8), (2017).
    48. Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 370 (2014).
    49. Juretic, N., Hoen, D. R., Huynh, M. L., Harrison, P. M., Bureau, T. E. The evolutionary fate of MULE-mediated duplications of host gene fragments in rice. Genome Res. 15, (9), 1292-1297 (2005).
    50. Filichkin, S. A. Genome-wide mapping of alternative splicing in Arabidopsis thaliana. Genome Res. 20, (1), 45-58 (2010).
    51. Quesada, V., Macknight, R., Dean, C., Simpson, G. G. Autoregulation of FCA pre-mRNA processing controls Arabidopsis flowering time. EMBO J. 22, (12), 3142-3152 (2003).
    52. Wong, D. C. J., Gutierrez, R. L., Gambetta, G. A., Castellarin, S. D. Genome-wide analysis of cis-regulatory element structure and discovery of motif-driven gene co-expression networks in grapevine. DNA Res. 24, (3), 311-326 (2017).
    53. Wong, D. C. J., Matus, J. T. Constructing Integrated Networks for Identifying New Secondary Metabolic Pathway Regulators in Grapevine: Recent Applications and Future Opportunities. Front. Plant Sci. 8, 505 (2017).

    Comments

    0 Comments


      Post a Question / Comment / Request

      You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

      Usage Statistics