عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

* These authors contributed equally
Genetics

Your institution must subscribe to JoVE's Genetics section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

يوضح هذا المقال بروتوكول مفصل لعزل الحمض النووي وبناء مكتبة التسلسل الفائق من المواد دار النباتات بما في ذلك الإنقاذ من الحمض النووي استثنائية ذات النوعية الرديئة.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Saeidi, S., McKain, M. R., Kellogg, E. A. Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens. J. Vis. Exp. (133), e56837, doi:10.3791/56837 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

العشبية مصدرا لا يقدر بثمن من المواد النباتية التي يمكن استخدامها في مجموعة متنوعة من الدراسات البيولوجية. ويرتبط استخدام العينات دار النباتات مع عدد من التحديات بما في ذلك عينة الحفاظ على نوعية والحمض النووي المتدهورة والمدمرة لأخذ العينات من عينات نادرة. من أجل استخدام أكثر فعالية المواد دار النباتات في المشاريع الكبيرة التسلسل، هناك حاجة إلى طريقة يمكن الاعتماد عليها وقابلة للتطوير لإعداد مكتبة وعزل الحمض النووي. وتبين هذه الورقة بروتوكول قوية، وبداية لنهاية للحمض النووي والعزلة والفائق مكتبة البناء من عينات دار النباتات التي لا تحتاج إلى تعديل لعينات الأفراد. هذا البروتوكول مصمم خصيصا لتدني نوعية المجفف مصنع المواد وتحيط الاستفادة من الأساليب القائمة عن طريق تحسين طحن الأنسجة وتعديل التحديد حجم المكتبة، وإدخال خطوة ريمبليفيكيشن اختياري لمكتبات منخفضة الغلة. ريمبليفيكيشن مكتبات الحمض النووي منخفضة الغلة يمكن إنقاذ العينات المستمدة من عينات دار النباتات لا يمكن الاستغناء عنه، ويحتمل أن تكون قيمة، يلغي الحاجة إلى أخذ العينات الإضافية المدمرة ودون إدخال التحيز تسلسل واضح للمشترك تطبيقات النشوء والتطور. البروتوكول قد تم اختباره على مئات الأنواع العشب، ولكن من المتوقع أن تكون قابلة للتكيف للاستخدام في السلالات النباتية الأخرى بعد التحقق. هذا البروتوكول يمكن أن تكون محدودة بالحمض النووي المتدهورة جداً، حيث لا توجد شظايا في نطاق الحجم المطلوب، ونواتج الأيض الثانوية الموجودة في بعض المواد النباتية التي تحول دون عزل الحمض النووي نظيفة. وعموما، يدخل هذا البروتوكول طريقة سريعة وشاملة تسمح بعزل الحمض النووي وإعداد مكتبة العينات 24 في أقل من 13 h, مع فقط 8 ح وقت العملي النشط مع الحد الأدنى من التعديلات.

Introduction

مجموعات دار النباتات مصدر يحتمل أن تكون قيمة الأنواع والتنوع الجينومي للدراسات بما في ذلك السلالات1،2،3،4،علم الوراثة السكانية5، الحفظ علم الأحياء6والأنواع الغازية البيولوجيا7سمة تطور8. ويسلط الضوء على إمكانية الحصول على مجموعة متنوعة غنية من الأنواع، والسكان، والمواقع الجغرافية، والنقاط الزمنية "الكنز"9 هو دار النباتات. تاريخيا، طبيعة الحمض النووي المستمدة من دار النباتات المتدهورة قد أعاق المشاريع المستندة إلى بكر، محيلة الباحثين غالباً باستخدام علامات فقط وجدت في نسخة عالية، مثل مناطق الجينوم بلاستيدات الخضراء أو مباعدة يدون الداخلية (البحث عن) ريبوسومال الجيش الملكي النيبالي. نوعية العينات والحمض النووي تختلف على نطاق واسع على أساليب المحافظة على9،10، مع فواصل مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل وتجزئة من الحرارة المستخدمة في عملية التجفيف يجري الأشكال الأكثر شيوعاً من الأضرار، وخلق ما يسمى 90% الحمض النووي إقفال التي قد شغلت الدراسات المستندة إلى بكر11. وبصرف النظر عن التجزؤ، المسألة الثانية الأكثر انتشارا في دار النباتات علم الجينوم هو التلوث، مثل التي تستمد من الفطريات اندوفيتيك13 أو الفطريات المكتسبة بعد الوفاة بعد جمع ولكن قبل تصاعد في دار النباتات12، على الرغم هذه المشكلة يمكن حلها بيوينفورماتيكالي نظراً لقاعدة حق فطري (انظر أدناه). مشكلة الثالثة، وأقل شيوعاً، تعديل تسلسل عن طريق السيتوزين deamination (C/G→T/A)14، على الرغم من أنه يقدر أن تكون منخفضة (~ 0.03 ٪) في دار النباتات العينات11. مع ظهور التسلسل الفائق (HTS)، يمكن التغلب على مسألة التجزؤ مع القراءات قصيرة وتسلسل عمق12،15، مما يتيح الحصول على البيانات الجينومية مستوى من عينات عديدة ذات جودة منخفضة الحمض النووي، وحتى في بعض الأحيان السماح تسلسل الجينوم كله15.

أصبحت أكثر كثيرا ما تستخدم عينات دار النباتات وهي من أكبر مكونات المشاريع النشوء والتطور16. تحدي الحالي لاستخدام العينات دار النباتات ل HTS هو استمرار الحصول على كافية مزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي، شرطا لازما لتسلسل البروتوكولات، من العديد من الأنواع في الوقت المناسب، دون الحاجة إلى تحسين أساليب للفرد العينات. في هذه الورقة، هو أثبت بروتوكول لاستخراج الحمض النووي وإعداد مكتبة دار النباتات عينات من أن يستفيد من الأساليب القائمة، وتقوم بتعديلها للسماح لنتائج سريعة وقابلة للتكرار. يسمح هذا الأسلوب لإكمال تجهيز من العينة إلى مكتبة عينات 24 في ح 13، مع وقت التدريب العملي على ح 8، أو ح 16، مع مرور الوقت العملي ح 9، عندما يكون مطلوباً الخطوة ريمبليفيكيشن الاختياري. المعالجة المتزامنة للمزيد من نماذج قابلة للتحقيق، على الرغم من عاملاً يحد من قدرة أجهزة الطرد المركزي، والمهارات التقنية. البروتوكول يهدف إلى تتطلب فقط نموذجي معدات المختبرات (ثيرموسيكلير وأجهزة الطرد المركزي، وتقف المغناطيسية) بدلاً من المعدات المتخصصة، مثل البخاخات أو سونيكاتور، أو لقص الحمض النووي.

نوعية الحمض النووي وحجم الشظايا والكمية تحد من عوامل لاستخدام العينات دار النباتات في تجارب التسلسل الفائق. وسائل أخرى لعزل الحمض النووي دار النباتات وإنشاء مكتبات التسلسل الفائق أثبتت جدوى استخدام أقل من 10 نانوغرام من16من الحمض النووي؛ إلا أنها تتطلب تجريبيا تحديد العدد الأمثل من بكر دورات اللازمة لإعداد المكتبة. يصبح هذا غير عملي عند التعامل مع كميات صغيرة للغاية من مزدوجة قابلة للحياة تقطعت الحمض النووي (dsDNA)، كما تنتج بعض العينات دار النباتات إلا ما يكفي الحمض النووي لإعداد مكتبة واحدة. يستخدم الأسلوب المقدمة هنا عدد واحد من الدورات بغض النظر عن نوعية العينة، حيث يتم فقدان لا الحمض النووي في مكتبة الأمثل الخطوات. بدلاً من ذلك، يتم استدعاء خطوة ريمبليفيكيشن عند المكتبات لا تفي الحد الأدنى من المبالغ اللازمة للتسلسل. العديد من دار النباتات عينات نادرة وحيازة المواد قليلة مما يجعل من الصعب تبرير أخذ العينات المدمرة في كثير من الحالات. ولمواجهة ذلك، يسمح البروتوكول المقدم دسدنا إدخال أحجام أقل من 1.25 نغ في عملية إعداد مكتبة، وتوسيع نطاق نماذج قابلة للتطبيق للتسلسل الفائق، والتقليل من الحاجة إلى أخذ العينات المدمرة للعينات.

وقد الأمثل للأعشاب البروتوكول التالي واختبارها على مئات أنواع المختلفة من عينات دار النباتات، على الرغم من أننا نتوقع أن البروتوكول يمكن أن تطبق على العديد من المجموعات النباتية الأخرى. وهو يشمل خطوة انتعاش اختيارية التي يمكن استخدامها لتوفير جودة منخفضة و/أو عينات نادرة. استناداً إلى ما يزيد على مائتي دار النباتات عينات اختبار، يعمل هذا البروتوكول على العينات مع إدخال الأنسجة منخفضة ونوعية، مما يسمح للحفاظ على عينات نادرة من خلال أخذ العينات المدمرة الحد الأدنى. ويتضح هنا أن هذا البروتوكول يمكن أن توفر مكتبات ذات جودة عالية والتي يمكن أن تكون متسلسلة للمشاريع المستندة إلى فيلوجينوميكس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-وقبل أن ابدأ

  1. جعل سيتيل الطازجة تريميثيلامونيوم بروميد (كتاب) العازلة17 بإضافة 20 غراما كتاب، 10 غم من بوفيدون (حماية الأصناف النباتية) 40، مل 100.0 1 م تريس pH 8.0، 40 مل من 0.5 م الإيثيلين حمض (يدتا) pH 8.0، مل 280.0 5 "م كلوريد الصوديوم"، ومل 400.0 من المياه الكاشف معا، وجلب الحجم الإجمالي إلى 1 لتر باستخدام الكاشف الصف المياه. قم بضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
    ملاحظة: يمكن إضافة الكواشف الإضافية لكتاب تبعاً للمركبات الثانوية في الأصناف الفردية. انظر الين et al. 18 للحصول على قائمة شاملة من الكواشف المضافة.
  2. إضافة 10 ميليلتر من β-mercaptoethanol الواحدة 5 مل من كتاب المخزن المؤقت.
    ملاحظة: هذا يمكن إعداده في دفعات من 50 مل وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 أسابيع.
    1. الحرارة الحل كتاب في حمام مائي 65 درجة مئوية.
  3. البرد ومدافع الهاون والمدقات في-20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  4. قم بتسمية 4 مجموعات من 2 × ن 2 مل أنابيب (حيث n = عدد العينات). وضع 1 مجموعة من الأنابيب المسماة على الجليد.
  5. الايزوبروبانول البرد على الجليد أو في ثلاجة-20 درجة مئوية.
  6. إزالة الخرز التثبيت عكسها (سبري) المرحلة الصلبة (انظر الجدول للمواد) من الثلاجة، والسماح لهم بحجته إلى درجة حرارة الغرفة (30 دقيقة على الأقل).
  7. تحضير الإيثانول 80%.
  8. تحديد العينات دار النباتات لاستخراج واسترجاع ~ 1 سم2أو 10 ملغ، الأنسجة في العينة، يفضل أن تكون أوراق المواد.

2. استخراج الحمض النووي

  1. طحن ~ 1 سم2 من الأنسجة دار النباتات المختارة باستخدام مدافع الهاون بريشيليد والمدقات. إضافة النتروجين السائل والرمال 30-50 مغ تعقيمها. طحن حتى الأنسجة يتحول إلى مسحوق ناعم.
    ملاحظة: 10 مغ أو الأنسجة أكثر من المرغوب فيه، ولكن أقل وعملت أيضا في بعض الحالات. عندما يتبخر النيتروجين السائل، إضافة المزيد حسب الحاجة حتى الأنسجة هو الأرض تماما. أسلوب مشترك آخر لتعطيل الخلايا والأنسجة هو استخدام الخافق حبة. ومع ذلك، وجدت هذا الأسلوب لا تعمل جيدا للعينات المستخدمة في هذه التجارب.
  2. نقل المسحوق المجمدة في اثنين من أنابيب 2 مل (إضافة أي أكثر من نصف الحجم في الأنبوب). إضافة 600 ميليلتر من الحارة كتاب الحل لكل أنبوبة ومزج الأنابيب جيدا بانعكاس وفورتيكسينج.
    ملاحظة: نظراً لكمية ونوعية المواد دار النباتات غالباً منخفضة، أداء عزل الحمض النووي في اثنين من التكرار يساعد على الحصول على مردود أعلى.
  3. احتضان هذه العينات في حمام مائي 65 درجة مئوية ح 1 – 1.5، فورتيكسينج كل 15 دقيقة.
  4. نقل عينات من أجهزة الطرد المركزي في 10,000 ز x للحد الأدنى 5 المادة طافية على مجموعة جديدة من أنابيب المسمى (~ 500 ميليلتر). تجاهل بيليه استخدام إجراء قياسي التخلص غير المكلورة.
  5. إضافة 4 ميليلتر رناسي-أ (10 مغ/مل) لكل أنبوبة ومزج بعكس أو بيبيتينج. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية في حمام كتلة أو الماء حرارة لمدة 15 دقيقة.
  6. إضافة وحدة تخزين متساوية (~ 500 ميليلتر) من خليط الكحول الفينول: كلوروفورم: إيسواميل 25:24:1 مجرد الأنابيب قد وصلت إلى درجة حرارة الغرفة. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً و/أو مع انعكاس. الأنابيب في س 12,000 ز 15 دقيقة لنقل الطبقة المائية (الطبقة العليا) إلى مجموعة جديدة من أجهزة الطرد المركزي المسمى أنابيب (~ 400 ميليلتر). تجاهل الطبقة العضوية في حاوية نفايات مكلورة.
    ملاحظة: الخطوة 2.6 يمكن أن تتكرر إذا كان من المتوقع كميات كبيرة من المركبات الثانوية في المواد النباتية.
  7. إضافة وحدة تخزين متساوية (~ 400 ميليلتر) من خليط الكحول كلوروفورم 24:1: إيسواميل. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً و/أو مع انعكاس. الطرد المركزي هذه الأنابيب في س 12,000 ز عن 15 دقيقة نقل الطبقة المائية (الطبقة العليا) إلى مجموعة جديدة من أنابيب بريشيليد، المسمى (~ 300 ميليلتر). تجاهل الطبقة العضوية في حاوية نفايات مكلورة.
  8. إضافة وحدة تخزين متساوية (~ 300 ميليلتر) الايزوبروبانول بريشيليد وميليلتر 12 من خلات الصوديوم 2.5 م لكل أنبوبة. احتضان عينات من-20 درجة مئوية لمدة 30 – 60 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن تمديد أوقات الاحتضان (حتى الحضانة بين عشية وضحاها)، ولكن ستنخفض جودة الحمض النووي يعد احتضان العينات.
  9. أخذ العينات من الثلاجة وأجهزة الطرد المركزي هذه الأنابيب في 12,000 س ز على 15 دقيقة إزالة وتجاهل المادة طافية بلطف دون إزعاج بيليه. أغسل بيليه بتعليق مع الإيثانول 70% الطازجة (حوالي 300 – 500 ميليلتر). لكل عينة الضعف، توطيد الكريات الفردية اثنين إلى واحد مع مرافقة الإيثانول.
    ملاحظة: العينات ينبغي أن تدمج في أنبوب واحد استخدام الإيثانول أولاً وثم المتابعة. فإنه ليس من الضروري أن يغسل كل عينة مع الإيثانول بشكل منفصل.
  10. الطرد المركزي هذه الأنابيب في 12,000 س ز لأدنى 10 إزالة وتجاهل المادة طافية بلطف دون إزعاج بيليه. الهواء الجاف الكريات.
    ملاحظة: نماذج يمكن أن تجفف أسرع باستخدام كتلة حرارة جافة (لا تتجاوز 65 درجة مئوية). تأكد من أن العينات لا الإفراط الجاف، وهذا يمكن أن يقلل العائد النهائي للحمض النووي.
  11. تعليق الحمض النووي المعزولة في 50 ميليلتر 1 x الشركة المصرية للاتصالات. تخزن في الثلاجة-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل أو 4 درجات مئوية لاستخدامها في الأسبوع التالي.

3-مراقبة الجودة (مراقبة الجودة)

  1. تشغيل [اغروس] هلام لفحص الجودة.
    1. إعداد المخزن مؤقت تريس/بورات/يدتا (TBE) 1 x بإضافة قاعدة تريس ز 54 وحمض البوريك ز 27.5 يدتا ز 3.75 ملح ثنائي الصوديوم، يصل الحجم الإجمالي إلى 5 لتر باستخدام الكاشف الصف المياه.
    2. تعد من 1% [اغروس] هلام بإضافة [اغروس] ز 1 إلى 100 مل 1 x TBE. الميكروويف الحل حتى [اغروس] لا يكون مرئياً. إضافة 0.01 ٪ الحمض النووي جل وصمة عار (انظر الجدول للمواد). السماح لتبرد قارورة حتى تصبح دافئة عند لمسها. مزيج جيد من إثارة. صب [اغروس] في علبة جل والسماح لها الجلوس حتى أنه يتصلب.
    3. خلط 3 ميليلتر من عينة و 2 ميليلتر من المياه الصف الكاشف 1 ميليلتر من 6 × تحميل صبغ. تحميل العينات في مصفوفة هلام، مشيراً إلى ترتيبها.
    4. تشغيل العينات لمدة 60 – 70 دقيقة في 60-70 ف صورة الجل تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع التعرض الصحيح، والتركيز.
      ملاحظة: وجود عصابة واضحة عالية الوزن الجزيئي علامة على الحمض النووي ذات جودة عالية، بينما مسحات عادة ما تشير إلى تدهور الحمض النووي. هي تتحلل معظم دار النباتات العينات.
  2. تشغيل تحليل الكمي دسدنا (انظر الجدول للمواد) لتحديد كمية مزدوج تقطعت الحمض النووي.
    1. استخدام 2 ميليلتر من عينة للتحليل.
      ملاحظة: تخفيف غير مطلوبة للتحليل الكمي للمواد دار النباتات كما أنها تميل إلى أن تكون بمبالغ ضئيلة. بذلت المكتبات الناجحة من قدر ضئيل من 1.26 دسدنا مجموع نانوغرام من هذه الخطوة.

4-الحمض النووي القص

ملاحظة: هذا إصدار محسن من فراجمينتاسي مزدوجة-الذين تقطعت بهم السبل التجارية البروتوكول (انظر الجدول للمواد).

  1. مكان دسدنا تجزئة الإنزيم على الجليد بعد فورتيكسينج 3 ق.
  2. في أنبوب تفاعل المتسلسل (PCR) معقم 0.2 مل بوليميريز، عزل ميليلتر ميكس 1 – 16 الحمض النووي مع 2 ميليلتر من المصاحبة لتجزئة رد فعل المخزن المؤقت. جعل مجموع حجم ميليلتر 18 بإضافة نوكلاس المياه مجاناً. إضافة ميليلتر 2 إنزيم تجزئة دسدنا ودوامه الخليط ل 3 s.
    ملاحظة: يختلف مقدار الحمض النووي اللازمة تبعاً لتركيز الحمض النووي (هدف 200 نانوغرام مجموع في الأنبوب).
  3. احتضان هذه العينات في 37 درجة مئوية لمدة دقيقة 8.5. قم بإضافة 5 ميليلتر يدتا 0.5 M للأنابيب.
    ملاحظة: تحتاج هذه الخطوة التي يتعين القيام بها في أقرب وقت هو فترة الحضانة على إنهاء رد فعل والحيلولة دون الإفراط قص عينات من الحمض النووي.

5-حبة تنظيف

  1. مجانسة الخرز سبري من فورتيكسينج.
  2. إحضار الحجم الإجمالي للحمض النووي المنفصمة إلى 50 ميليلتر بإضافة 25 ميليلتر نوكلاس المياه مجاناً. إضافة ميليلتر 45 من درجة حرارة الغرفة سبري الخرز (90% حجم) إلى 50 ميليلتر المنفصمة الحمض النووي ومزيج دقيق بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    ملاحظة: إضافة الخرز في 90% حجم العينة الكلية هو القيام بإزالة أصغر من شظايا من الحمض النووي، غالباً ما دون 200 قاعدة أزواج.
  3. اسمحوا العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية والسماح لهم بالجلوس للحد الأدنى 5 بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
    ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز، كما أنها تحتوي على الحمض النووي الأهداف المرجوة.
  4. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع لها غطاء مفتوحة.
    ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الحمض النووي.
  5. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوت الحمض النووي من الخرز إلى 55 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة).
  6. سحب قبالة ميليلتر 52 من المادة طافية. تشغيل تحليل الكمي الحمض النووي على عينات للتحقق من الانتعاش وتركيز أولى أن يذهب إلى المكتبة الإعدادية.
    ملاحظة: بذلت المكتبات مع مجموع دسدنا تقدر بأقل من 1.25 نغ، في كل حالة ريمبليفيكيشن وأن كان المطلوب.

6-إعداد المكتبة

ملاحظة: هذا نسخة معدلة من مجموعة المكتبة متاحة تجارياً (انظر الجدول من مواد البروتوكول).

  1. نهاية الإعدادية
    1. إضافة 3 ميليلتر من اندونوكليسي والفوسفات المخلفات الإنزيمات وميليلتر 7 المصاحبة رد فعل المخزن المؤقت إلى 50 ميليلتر من الحمض النووي تنظيفها، والمنفصمة. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. وتدور هذه الأنابيب لإزالة الفقاعات.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي 60 ميليلتر.
    2. وضع العينات في ثيرموسيكلير مع البرنامج التالي: 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية، 30 دقيقة عند 65 درجة مئوية، ثم عقد في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: تم تعيين غطاء دافئ إلى إيه سيفن فايف درجة مئوية
  2. ربط محول
    1. تمييع المحول حظيرة 25-50 (يعمل محول تركيز 0.6 – 0.3 ميكرومتر). إضافة 30 ميليلتر من مزيج الرئيسي ربط و 1 ميليلتر من ربط محسن ميليلتر 2.5 من محول لتسلسل قراءة قصيرة الفائق للأنابيب.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحجم الإجمالي 93.5 ميليلتر.
    2. مزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. وتدور هذه الأنابيب لإزالة الفقاعات. احتضان هذه الأنابيب في 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
    3. إضافة 3 ميليلتر من الخليط التجاري اليوراسيل DNA glycosylase (UDG) و "الثامن اندونوكليسي" جليكوسيلاسي لياز الحمض النووي (انظر الجدول للمواد) للأنابيب. التأكد من أن حجم مجموع 96.5 ميليلتر. مزيج دقيق واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة باستخدام ثيرموسيكلير.
      ملاحظة: يجب تعيين الغطاء إلى إيه فور سيفن درجة مئوية. النسخة الأصلية للبروتوكول التجاري على اختيار حجم بعد الخطوة ربط محول، يليه تنظيف حبة كخطوة أخيرة. تبديل ترتيب الخطوات هذا البروتوكول، الذي يحقق زيادة الغلات، وينفذ اختيار الحجم كخطوة أخيرة.
  3. تنظيف لإزالة شظايا صغيرة والأنزيمات
    1. مجانسة الخرز المغناطيسية التي فورتيكسينج.
    2. إضافة ميليلتر 78 من حبات مغناطيسية سبري (حجم 80%)، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
      ملاحظة: إضافة الخرز في 80% حجم العينة الكلية هو القيام بإزالة شظايا أصغر من الحمض النووي، التي غالباً ما تكون أقصر من 250 قاعدة أزواج. إزالة أكثر صرامة من شظايا صغيرة من الحمض النووي هو (ط) إزالة محولات الفائض (ثانيا) التشديد على تضخيم شظايا الكبيرة في الخطوات التالية.
    3. العينات احتضانها لأدنى 5 وضع الأنابيب في لوحة مغناطيسية للحد الأدنى 5 بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية يحتوي على الحمض النووي خارج نطاق الحجم المطلوب.
      ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز التي تحتوي على الحمض النووي الأهداف المرجوة.
    4. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع الغطاء مفتوحاً.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الحمض النووي.
    5. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوت الهدف الحمض النووي من الخرز بإضافة 17 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    6. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة).
    7. سحب قبالة ميليلتر 15 من المادة طافية.
  4. [بكر] تضخيم
    1. إضافة 25 ميليلتر من مزيج الرئيسي PCR عالية الدقة و 5 ميليلتر من قراءة قصيرة الفائق تسلسل مكتبة الإعدادية 5 'التمهيدي 5 ميليلتر من تسلسل قراءة قصيرة الفائق المكتبة الإعدادية 3' التمهيدي، إلى 15 ميليلتر من تنظيفها متصلة محول الحمض النووي.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم إجمالي 50 ميليلتر.
    2. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج. وضع العينات في ثيرموسيكلير استخدام الإعدادات الموجودة في الجدول 1: إعداد التضخيم ثيرموسيكلير.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى عدد كبير من الدورات بسبب انخفاض كمية الحمض النووي الإدخال.
دورة خطوة درجة الحرارة. الوقت دورات
تمسخ الأولى 98 درجة مئوية 30 s 1
تمسخ 98 درجة مئوية 10 s 12
الصلب/ملحق 65 درجة مئوية 75 s 12
التمديد النهائي 65 درجة مئوية 5 دقيقة 1
عقد 4 درجة مئوية

الجدول 1: بكر البروتوكول مرات تمسخ، والصلب، والإرشاد، ودرجات الحرارة- درجة الحرارة وأوقات كانت الأمثل الكواشف عرضت في هذا البروتوكول. إذا كان يتم تبديل الكواشف، ينبغي أن يكون الأمثل درجات الحرارة والأوقات مرة أخرى.

  1. اختيار حجم لحجم المكتبة المطلوبة
    ملاحظة: هذه الخطوة حبة سيزيل شظايا فوق وتحت نطاق الهدف على حد سواء.
    1. مجانسة الخرز سبري من فورتيكسينج.
    2. إضافة 25 ميليلتر (المجلد 50 ٪) من درجة حرارة الغرفة المغناطيسي الخرز ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً. اسمحوا العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية والسماح لهم بالجلوس للحد الأدنى 5 بعناية إزالة ونقل المادة طافية على مجموعة جديدة من أنابيب المسمى.
      ملاحظة: هذا الحجم يمكن تعديلها استناداً إلى حجم المكتبة المطلوبة. تحتوي المادة طافية على شظايا من الحمض النووي للحجم المطلوب. في الحضانة حبة الأول، ملزمة الخرز أكبر مكتبة شظايا. تتم إزالة هذه إلى التركيز على تلك الموجودة في نطاق 400 – 600 زوج قاعدي. وتتضمن المادة طافية أجزاء أصغر.
    3. إضافة 6 ميليلتر من درجة حرارة الغرفة سبري الخرز إلى المادة طافية ومزيج دقيق بيبيتينج صعودا وهبوطاً. العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية والسماح لهم بالجلوس لمدة 5 دقائق.
      ملاحظة: هذا الحجم يمكن تعديلها استناداً إلى حجم المكتبة المطلوبة وفقا للخطوة 6.5.2.
    4. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية.
      ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز التي تحتوي على الحمض النووي المطلوب. في الحضانة حبة الثاني، تقوم بربط الخرز شظايا تركت بعد إزالة الأولية من الحمض النووي أكبر عدد الأجزاء. هذه المجموعة من الشظايا عادة في نطاق الحجم المطلوب.
    5. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، ثم بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع الغطاء مفتوحاً.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الحمض النووي.
    6. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوت الهدف الحمض النووي من الخرز إلى 33 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    7. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة). سحب قبالة 30 ميليلتر من المادة طافية ونقل إلى أنابيب 2 مل (انظر الجدول للمواد) للتخزين.
      ملاحظة: يمكن الاحتفاظ المكتبات في ˚C-20 للتخزين على المدى الطويل.
  2. مراقبة الجودة
    1. تشغيل اختبار مراقبة الجودة على "مكتبات الحمض النووي". الرجوع إلى الخطوات 3.1 و 3.2.
      ملاحظة: لمكتبات الحمض النووي، تشغيل الجل ~ 45 دقيقة في 96 الخامس.
  3. مكتبة ريمبليفيكيشن: اختياري إذا كان مكتبة كمية غير كافية.
    ملاحظة: عينات مع مكتبة تركيزات أقل من 10 نانومتر ويمكن ريمبليفيد باستخدام الخطوات التالية. ريمبليفيكيشن مكتبات التركيز المنخفض يمكن تحقيق نتائج قابلة للتطبيق بالنسبة للتسلسل، ولكن ريمبليفيكيشن قد يسبب تحولاً متواضعة في تكوين قاعدة التنوع، على الرغم من أن جمع البيانات (الجدول 3) تشير إلى أن هذا الأمر لا يعتد بها لبعض المقاييس .
    1. تمييع الإشعال ريمبليفيكيشن العالمي 10 إضعاف استخدام 0.1 x TE.
    2. إضافة 25 ميليلتر من مزيج الرئيسي PCR عالية الدقة و 5 ميليلتر من ريمبليفيكيشن العالمي المخفف التمهيدي 1 (آتجاتاكجكجاككاككجا) و 5 ميليلتر من ريمبليفيكيشن العالمي المخفف التمهيدي 2 (كاجكاجاجاكجكاتاكجا) إلى 15 ميليلتر من مكتبات التركيز المنخفض. ملاحظة: ينبغي أن يكون الحجم الإجمالي في 50 ميليلتر.
    3. مزيج جيد من قبل فورتيكسينج. وضع العينات في ثيرموسيكلير استخدام الإعدادات الموجودة في الجدول 1: إعداد التضخيم ثيرموسيكلير
      ملاحظة: هناك حاجة إلى عدد كبير من الدورات بسبب انخفاض كمية الحمض النووي الإدخال.
    4. تنظيف حبة
    5. مجانسة الخرز سبري من فورتيكسينج. إضافة ميليلتر 45 من درجة حرارة الغرفة سبري الخرز (حجم 90%)، ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    6. واسمحوا العينات احتضانها للحد الأدنى 5 وضع الأنابيب على لوحة مغناطيسية لمدة 5 دقائق.
    7. بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية يحتوي على الحمض النووي غير المرغوب فيه.
      ملاحظة: ينبغي الحرص على عدم الإخلال بالخرز التي تحتوي على الحمض النووي الأهداف المرجوة.
    8. إضافة 200 ميليلتر من الإيثانول 80% جديدة للأنابيب بينما على الوقوف المغناطيسية. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 ثانية، وبعد ذلك بعناية إزالة وتجاهل المادة طافية. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
    9. الهواء الجاف الخرز لمدة 5 دقائق بينما الأنبوب على الوقوف المغناطيسي مع لها غطاء مفتوحة.
      ملاحظة: تجنب الإفراط في تجفيف الخرز. يمكن أن ينتج عن هذا الاسترداد أقل من الهدف الحمض النووي.
    10. إزالة الأنابيب من المغناطيس. الوتي الهدف الحمض النووي من الخرز إلى 33 ميليلتر من 0.1 x TE ومزيج دقيق من بيبيتينج صعودا وهبوطاً.
    11. احتضان في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 5 مكان أنابيب على الوقوف المغناطيسية والانتظار للحل لتشغيل مسح (~ 2 دقيقة).
    12. سحب قبالة 30 ميليلتر من المادة طافية. يمكن تخزينها في المكتبات في-20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.
  4. مراقبة الجودة
    1. تشغيل اختبار مراقبة الجودة على "مكتبات الحمض النووي". الرجوع إلى الخطوات 3.1 و 3.2. لمكتبات الحمض النووي، تشغيل الجل ~ 45 دقيقة في 96 الخامس.
      ملاحظة: إذا نظر إلى عصابة مزدوجة في الهلام، هذا المرجح نتيجة لاستنفاد التمهيدي من الخطوة ريمبليفيكيشن. يمكن إزالة العصابات بتكرار 6.9، ولكن باستخدام دورة واحدة فقط في البرنامج بكر المبينة في الجدول 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عزل الحمض النووي والعائد النهائي من مكتبة
في هذه الدراسة، تجلى فعالية البروتوكول لعزل الحمض النووي دار النباتات والانتعاش لمكتبات تسلسل عالية الجودة باستخدام عينات مختلفة الخمسون مع أقدم من عام 1920 وأصغر من 2012 (الجدول 2). لكل عينة، تم استخدام حوالي 10 ملغ أنسجة نبات لعزل الحمض النووي. كان يفضل خضرة أوراق الأنسجة إذا كانت متوفرة، واختير لا الأنسجة مع تلوث الفطرية الواضحة. يمكن أن العزلة ناجحة باستخدام أنسجة الأصفر أو البنى، على الرغم من أن العائد ينبغي أن يتوقع أن تكون أقل. مجموعة مزدوجة تقطعت الحمض النووي (dsDNA) من عزلة الأولية تراوحت 3.56 نغ إلى 2,610 نغ. كما هو متوقع، الحمض النووي التي تم الحصول عليها من عينات دار النباتات كانت متدهورة جداً (الشكل 1A، التكميلية الشكل 1). واستخدمت جزء من هذه العزلة للقص الأنزيمي (نغ 1.26-464). على الرغم من أن الفعل هو المنفصمة دار النباتات الحمض النووي من خلال عملية الحفظ، التحسين البروتوكول يتطلب القص إضافية لتحسين الغلة المكتبة الشاملة. استرداد إجمالي دسدنا بعد القص وتراوحت < 1% إلى 51% دسدنا الإدخال، أسفر عن الحد أدنى من أقل من 1.25 نانوغرام من ابتداء من الحمض النووي لإعداد مكتبة وبحد أقصى قدرة 328 نغ. يمكن أن يعزى فقدان المتطرفة من الحمض النووي في بعض العينات إلى حجم شظية صغيرة فعلا الكثير من الحمض النووي قبل الانزيمية القص (الشكل 1A، تكميلية الشكل 1). استخدام تنظيف 90% حجم حبة على الحمض النووي المنفصمة عمدا إزالة أجزاء أصغر من الحمض النووي لإثراء لأحجام جزء أكبر وأكثر جاذبية. وشوهدت هذه الشظايا الصغيرة خاصة في عينات TK463، و TK657، و TK694، حسب النطاق المرمز إليه بواسطة إشارة مكثفة عند علامة 100 زوج قاعدي (الشكل 1A).

وتراوحت الكمية الإجمالية لاختيار حجم وظيفة المكتبة 1.425 نغ إلى 942.5 نغ (الجدول 2، تكميلية الجدول 1). 23 من العينات، إعداد مكتبة والاستخراج الأولى لم تسفر عن كمية كافية من مكتبة (< 10 نانومتر؛ الجدول 2، تكميلية الجدول 1)، حيث تعرضت هذه العينات بالخطوات ريمبليفيكيشن والانتعاش من البروتوكول، نتج عنه س 14 – 680 زيادة في مجموع المكتبة (الجدول 2، تكميلية الجدول 1). مكتبات النهائية أدت إلى فرقة بين 350 و 500 زوج قاعدي (الشكل 1B، التكميلية الشكل 2). في بعض الأحيان، كان ينظر إلى فرقة ثانية التي كانت أكبر من حجم المكتبة المتوقعة (الشكل 1B، التكميلية الشكل 2). حدث هذا عندما ريمبليفيكيشن بكر استنفدت الإشعال المتاحة وبدأ الصلب محولات مكتبة من شظايا من الحمض النووي غير المتجانسة. وهذا يخلق جزيء حيث الصلب النهايات (المحولات) تم بشكل صحيح، ولكن لم تدخل الحمض النووي. هذا الجزيء "فقاعات" يبدو أكبر في هلام، كما أنه يتحرك ببطء أكثر من خلال مصفوفة هلام. تم إصلاح هذه الأخطاء انلينغ بإعداد رد فعل ريمبليفيكيشن آخر من مكتبة ريمبليفيد الفعل وتشغيله لدورة واحدة. قدمت هذه دورة واحدة كبسولة تفجير للصلب السليم والتضخيم، إزالة الفرقة الثانية (تكميلية الشكل 3).

ريمبليفيكيشن مكتبات يسرت تركيزات مكتبة النهائي لمالا يقل عن 10 نانومتر. هذه التركيزات المسموح به المكتبات تكون مخففة على قدم المساواة مولاريتي والمجمعة في التمثيل المتساوي، مساعدة لينفي القضايا التي سوف تنشأ مع نوعية العينات غير المتساوية وتسلسلها الغلة مكتبة. إذا كان الهدف من مشروع الجينوم بلاستيدات الخضراء التسلسل، ثم حاجة ستختلف المبلغ الإجمالي للتسلسل الأنساب المختلفة والأنسجة تختلف في المائة مجموع القراءات التي تنشأ من بلاستيدات الخضراء الحمض الخلوي الصبغي19. بشكل عام، 50 – 100 × التغطية المتوقعة لجينوم بلاستيدات الخضراء كافية للجمعية، ويمكن تجميع تسلسل يمتد تشمل ما يصل إلى 70 فردا حسب الأنواع وطريقة تسلسل.

اختبار للتلوث، والتحيز والتباينات الناجمة عن ريمبليفيكيشن
مصدر قلق ملحوظ لتسلسل HTS إدخال التحيز في المكتبات من خلال التضخيم بكر واسعة20. لاختبار آثار ريمبليفيكيشن وتحديد التطبيقات المشتركة النشوء والتطور التحيز المحتملة للمواد دار النباتات، قارنا مكتبة تسلسل بنجاح (TK686) مع نفس المكتبة المخفف 1:5 وريمبليفيد (المعين TK686-R). كل TK686 و TK686-R كانت متسلسلة في HiSeq4000 إيلومينا في جامعة إلينوي روي ج. كارفر مركز التكنولوجيا الحيوية وفي ميشيغان الدولة جامعة التكنولوجيا دعم مرفق البحوث، على التوالي، باستخدام زوج قاعدي 150 نهاية الاقتران ما يلي (انظر الجدول 3 للحصول على تفاصيل تسلسل). وأودعت يقرأ الخام في SRA نكبي (SRP128083). ما يلي: تم تنظيفها باستخدام تريموماتيك v.0.3621 بما في ذلك اقتطاع محول لاستخدام تسلسل محول NEB، جودة التصفية لدرجة phred متوسط 20 لزوج قاعدة 10 انزلاق النافذة، وقطع كحد أدنى حجم 40 قاعدة أزواج. كما واحدة من القضايا الرئيسية مع عينات دار النباتات الفطرية تلوث، تلوث قدرت عن طريق تعيين ما يلي ضد جزء من قاعدة بيانات الجينوم الفطرية "ميكوكوسم ججي"22 (312 الجينوم النووي والجينوم المتقدرية 79) استخدام bowtie2 v . 2.2.923 استخدام تعيين المعلمة "جداً حساسة-المحلي". مكتبات TK686 و TK686-R تم تمييزه في التلوث النووي الفطرية (9.24% و 9.68 في المائة، على التوالي) وتلوث الفطرية المتقدرية (0.94 في المائة و 0.8 في المائة) (الجدول 3). على الرغم من أن هذا مثال واحد فقط، تشير إلى أن تلوث العينات دار النباتات الفطرية ليست ضئيلة، ويجب إزالتها قبل استخدام البيانات المستمدة من دار النباتات التسلسل. ويمكن الاطلاع على قاعدة البيانات والأوامر المستخدمة لتحديد وإزالة التلوث بالفطريات في مستودع GitHub م. ر. ماكين "الجينوميات دار النباتات"24.

عموما يتم استخدام تسلسل الجينوم بلاستيدات الخضراء لتحليلات النشوء والتطور، وعينات دار النباتات تستخدم بشكل متزايد كمصدر المواد12. من أجل اختبار الإخلاص ريمبليفيكيشن في الجمعية الجينوم بلاستيدات الخضراء، تم تجميعها جينومات بلاستيدات الخضراء لكل من TK686 و TK686-R استخدام سريعة-بلاست v.1.2.525 تحت الإعدادات الافتراضية مع الفهرس bowtie تعيين إلى قبئيات. التي حصلت جينوم كامل بلاستيدات الخضراء ل TK686-R، ولكن تم تجميعها الجينوم بلاستيدات الخضراء TK686 في كونتيجس سبعة بسبب عمق القراءة أقل. كونتيجس TK686 تم تجميعها يدوياً بعد ماكين et al. 26 جينومات بلاستيدات الخضراء مجمع بشكل كامل كانت محاذية لبعضها البعض في برامج المستندة إلى واجهة المستخدم الرسومية محاذاة (انظر الجدول للمواد)، وتم تقييم التباين بين الجمعيات. تم تحديد ما مجموعة 12 بطانات وإينديل واحد بين جمعيات بلاستيدات الخضراء ل TK686 و TK686-ر. لكل متغير، تم تقييم التغطية في مجموعات القراءة من TK686 ور. TK686 وفي جميع الحالات، كان الخيار الأكثر شيوعاً نفسه بين المكتبتين. أظهر TK686 T→C واحد G→A واحد، G→T واحد، وواحد G→-، C→A واحد، T→A واحد ومتغيرات C→A الأربعة. خمس من هذه المتغيرات حدثت داخل سلسلة بولي، مما يوحي بإدماجها في الجمعية العامة قد يكون نتيجة لخطأ في تسلسل وانخفاض التغطية الشاملة. الآخرين قد يكون نتيجة لتباين haplotype بلاستيدات الخضراء، وتسلسل خطأ، أو deamination السيتوزين، أو مزيج من هذه العوامل. وقد TK686-R C→T واحد، G→T واحد، وواحد A→G. تم العثور على بدائل C→T و G→T في بولي النحو الوارد أعلاه. في نهاية المطاف، تم تحديد جينومات بلاستيدات الخضراء كاملة متطابقة من كلا مجموعات القراءة. وكان المشروح جينوم بلاستيدات الخضراء واحدة من TK686 استخدام الخضرة21 ومقارنة بغيره من أفراد قبيلة أندروبوجوني. كان المشروح كافة الميزات القياسية بلاستيدات الخضراء: 8 rRNAs و 38 ترنس 84 البروتين ترميز الجينات. أن الجينوم بلاستيدات الخضراء كاملة يتوفر من بنك الجينات (MF170217) و الخضرة27.

كما تقرر التحيز المحتمل من ريمبليفيكيشن المكتبات من خلال تقدير المئة GC ومحتوى ينقول المقدرة الإجمالية. وقدرت نسبة GC باستخدام برنامج نصي مخصص24. الاختلافات في محتوى GC العينتين كانت ضئيلة للغاية، مع GC 49.7 في المائة في TK686 و GC 51.2 في المائة في TK686-r. وقدرت ينقول تكوين باستخدام ترانسبوسومي28. لكل المكتبات، يقرأ 100,000 subsampled عشوائياً وتكوين ينقول قدرت باستخدام هوية 90 المئة، بتغطية جزء من 0.55، حجم كتلة من 100، وتعيين المرجع تكرار العشب 21.10 ريبباسي29. وتكررت هذا 100 مرة لأداء ألباس الحذاء في تقدير ينقول من قواعد البيانات هذه. الجينوم مجموع النسب المئوية سوبفاميليس الرئيسية ترانسبوزونات استخرجت من إخراج ترانسبوسومي، ويقدر المتوسط والانحراف المعياري لهذه ل 100 replicates. ويمكن الاطلاع على كافة البرامج النصية المستخدمة لتوليد هذه النواتج في مستودع Github م. ر. ماكين ترانسبوزونات30، وقد تم إيداع كافة النتائج في الجنيه (doi:10.5061/dryad.r8t2m). باستخدام سوبفاميليس ينقول الأكثر انتشارا هما كمؤشرات (أكرر الطرفية طويلةكوبيا و الغجر ريتروترانسبوسونس)، وكانت النتائج متطابقة تقريبا مع كوبيا في 33.52 ± 4.00% و 31.68 ± 2.94% و الغجر في 24.83 ± 2.72% و 24.00 ± 2.35% في TK686 وار TK686، على التوالي (الجدول 3). وهذه نتائج الاختبار تشير إلى أن الخطوة ريمبليفيكيشن من هذا البروتوكول لم تخلق التحيز تسلسل ذات مغزى للمقاييس الجينوم رفيعة المستوى. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن هذا مثال واحد قد لا يكون تمثيلاً كاملا لجميع المكتبات ريمبليفيد. يوضح هذا الاختبار وحيد أن الخطوة ريمبليفيكيشن كان لم يتحامل أصلاً مقاييس الجينوم في TK686 TK686-ر. لن يؤثر على التحيز أدخلت الجمعية الجينوم بلاستيدات الخضراء نظراً لتغطية كافية للتسلسل، ولكن من المستحسن إجراء التجارب، كما وردت في هذه الدراسة مع TK686/TK686-R، في الأنساب الهدف للتحقق من أن التحيز ليس التي تحدث أثناء دراسات التنوع عنصر قابلة التحقيق.

Figure 1
الشكل 1: [اغروس] هلام الصور أ) عزل الحمض النووي ومكتبات تسلسل ب) النهائي من عشر عينات من دار النباتات. لكل حارة، استخدمت 3 ميليلتر من الحمض النووي أو مكتبة. الحمض النووي (أ) كانت متدهورة في كل دار النباتات العزلة كما يراها اللطاخة عامة. (ب) التسلسل النهائي مكتبات تصور فرقة الأولى من 300-500 قاعدة أزواج مع توزيع على نطاق أوسع من زوج قاعدي 200-1,000؛ هذا الأخير أكثر انتشارا في المكتبات ريمبليفيد. ممرات لكلا (أ) و (ب) وحددت العينة ويمكن مقارنتها بالنتائج في الجدول 2. كان يصور حجم سلم في زوج قاعدي (bp). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : قطعة دائرية من سكوباريوم شيزاتشيريوم الجينوم بلاستيدات الخضراء (TK686) مع الشرح- جينوم مجمع بشكل كامل من بندقية تسلسل الحمض النووي المستمدة من دار النباتات معارضها بطول إجمالي 139,296 زوج قاعدي (bp)، منطقة نسخة واحدة كبيرة (المهارات) 81,401 شركة بريتيش بتروليوم، منطقة تكرار مقلوب (الأشعة تحت الحمراء) من 22,669 شركة بريتيش بتروليوم، ومنطقة صغيرة من نسخة واحدة (SSC) 12,557 شركة بريتيش بتروليوم. وحددت جميع الجينات البروتين الترميز القياسي وترنس rRNAs لأفراد من قبيلة أندروبوجوني في الشرح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 2: نتائج إعداد مكتبة واستخراج الحمض النووي لعشر عينات دار النباتات وأربع مكتبات ريمبليفيد. مجموع الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة في مختلف الخطوات في البروتوكول يمكن أن تبين كيف متغير نوعية، خصوصا عندما تمت تصفيتها لحجم. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 3: تسلسل الإحصاءات ل TK686 و TK686R ريمبليفيد- ريمبليفيكيشن لا يؤثر على حدوث تلوث الجينوم الفطرية، وتقدير محتوى GC، ينقول تكوين تقدير، أو القدرة على تجميع جينومات كاملة بلاستيدات الخضراء عموما. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

تكميلية الجدول 1: نتائج إعداد مكتبة واستخراج الحمض النووي لأربعين عينات إضافية دار النباتات، بما في ذلك المكتبات ريمبليفيد العشرين. مجموع الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل مزدوجة في مختلف الخطوات في البروتوكول يمكن أن تبين كيف متغير نوعية، خصوصا عندما تمت تصفيتها لحجم. اضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

تكميلية الشكل 1: [اغروس] هلام الصور من أربعين إضافية من العزلة الحمض النووي من عينات دار النباتات. كلا (أ) و (ب) تصور العشرين منفصلة العزلة الحمض النووي وإثبات تدهور المميزة المستمدة من دار النباتات الحمض النووي. لكل حارة، استخدمت 3 ميليلتر من الحمض النووي. ممرات لكلا (أ) و (ب) وحددت العينة ويمكن مقارنتها بنتائج تكميلية الجدول1. هو يصور حجم سلم في زوج قاعدي (bp). الأبيض رقط على الصورة سبب المصنوعات اليدوية في تصوير جل التي لا يمكن إزالتها بالتنظيف. اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

تكميلية الشكل 2: [اغروس] هلام الصور الأربعين مكتبات تسلسل إضافية من الحمض النووي المستمدة من دار النباتات. لكل حارة، استخدمت 3 ميليلتر من مكتبة. تم العثور على مكتبات التسلسل النهائي في كلا (أ) و (ب) مع حجم متوسط من 300-500 قاعدة أزواج. الثانوي العصابات ينظر إليها في بعض العينات تضخيم تشير إلى "السطح" للمكتبات. ممرات لكلا (أ) و (ب) يتم تحديدها بواسطة العينة ويمكن مقارنتها بنتائج تكميلية الجدول1. هو يصور حجم سلم في زوج قاعدي (bp). اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

تكميلية الشكل 3: [اغروس] هلام الصورة لإزالة الفرقة الثانوية مع خطوة بكر دورة واحدة إضافية- اضغط هنا لتحميل هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

البروتوكول المعروضة هنا طريقة شاملة وقوية لعزل الحمض النووي وتسلسل إعداد مكتبة من العينات النباتية المجففة. تناسق الأسلوب والحد الأدنى من الحاجة إلى تغيير على أساس جعل نوعية العينة أنها قابلة للتطوير للمشاريع الكبيرة التسلسل القائم على دار النباتات. إدراج خطوة ريمبليفيكيشن الاختياري لمكتبات منخفضة الغلة يسمح بإدراج منخفضة الجودة، وكمية قليلة، نادرة، أو عينات تاريخيا هاما وإلا لا تكون مناسبة للتسلسل.

أهمية الغلة الأولى الحمض النووي
الحمض النووي المستمدة من دار النباتات غالباً المتدهورة نتيجة العينة الأولى الحفاظ على11، مع الحمض النووي للعينات أقل من 300 سنة القديمة كما يجري المتدهورة كالحمض النووي المعزولة من بقايا الحيوانات التي هي عدة مئات الآلاف من سنوات من العمر31 , 32-ونتيجة لذلك، الأمثل للأولى الحمض النووي العائد الحيوية في الحصول على ما يكفي دسدنا عالية الجودة لإعداد مكتبة تسلسل النجاح. لأنواع العشب، ويتحقق عائد أمثل من خلال الجمع بين استخدام الرمل المعقم والخطوة النتروجين السائل في طحن الأولية، توفير أكثر من تدمير من جدران الخلايا والإفراج عن الأحماض النووية. هذا النهج يزيد دسدنا أكبر المرغوب وغير المرغوب فيها شظايا أصغر (الشكل 1، تكميلية الشكل 1، الجدول 2، تكميلية الجدول 1). عزل حبة اللاحقة خطوات التنظيف وإثراء للأجزاء ذات حجم مناسب للتسلسل (300 – 500 زوج قاعدي)، والحد كثيرا من الانتعاش ولكن أيضا إثراء للشظايا أطول (الجدول 2، تكميلية الجدول 1). قد يلزم إدخال تعديلات على الخطوات الأولية التي عزل الحمض النووي استناداً إلى النسب يتم أخذ عينات من أجل الحد من آثار نواتج الأيض الثانوية في التجهيز النهائي18.

الأمثل لمحولات مكتبة
تركيز المحولات المستخدمة لربط له تأثير مباشر على كمية ديمر محول في الانتهاء من المكتبات. محول dimers تنجم عن ربط محول ذاتي عند وجود عينة غير كافية، وتلوث تشغيل تسلسل33. دسدنا مجموع منخفضة نسبيا من العينات دار النباتات يقتضي تخفيف محولات قبل ربط. يمكن أن تضعف محولات 50-fold من الأسهم تركيز 15 ميكرون (انظر الفرع البروتوكول) تيسير إعداد مكتبة الفائق دون الحاجة إلى قياس فردي وتمييع محول لكل عينة (الجدول 2، "الجدول الإضافي" 1). على الرغم من أن يمكن تقليل تشبع محولات في مبدأ الغلة المكتبة الشاملة، من المستبعد أن العينات دار النباتات سوف تسفر عن dsDNA في هذه زيادة محول.

التباين في حبة تنظيف خطوات لزيادة الغلات
وعادة ما يتم اختيار الحجم في إعداد مكتبات التسلسل بعد ربط محول، مما يسمح لتضخيم شظايا أساسا داخل نطاق الحجم المطلوب؛ ويتم ذلك عن طريق إزالة الأجزاء التي أكبر وأصغر من حجم الهدف على حد سواء. كمية منخفضة دسدنا المستمدة من دار النباتات لإعداد مكتبة يتفاقم بعد اختيار حجم في هذه الخطوة، نتج عنه دسدنا مجموع أونووركابلي منخفضة ومنخفضة الغلة في مكتبة النهائي في نهاية المطاف. عن طريق إجراء خطوة التنظيف حبة قياسية باستخدام الخرز حجم 90% بعد عملية ربط، يظل دسدنا مجموع أكثر لتخصيب اليورانيوم في خطوة التضخيم. تتم إزالة شظايا صغيرة للغاية من الحمض النووي تفضيلي استخدام الخرز حجم 90%. ويجري اختيار حجم في الخطوة النهائية في المكتبة تضخيم، الذي يكفل الإثراء لأحجام الجزء المطلوب. يمكن تعديل مجموع كميات من الخرز لتحديد النطاق المطلوب، على الرغم من أحجام خطوتين ميليلتر 25 و 6 ميليلتر من الخرز هي الأمثل لاسترداد المكتبات من 400-500 زوج قاعدي يدرج ضمن هذا البروتوكول (الشكل 1B، تكميلية الشكل 2).

نموذج الإنقاذ من خلال ريمبليفيكيشن للمكتبات
على الرغم من أفضل الممارسات في عزل الحمض النووي وإعداد مكتبة، قد تكون التركيزات النهائية من مكتبات التسلسل غير كافية لمواصلة التسلسل. لا تسمح الطبيعة الهدامة لأخذ العينات، وكثيراً ما تكون محدودة من المواد القابلة للاستهلاك من عينات دار النباتات دائماً تكرار عزل الحمض النووي. قبل ريمبليفيينج المكتبة يصل إلى 12 دورات PCR إضافية، المكتبات الفقيرة حتى في حالات استثنائية يمكن حفظها. زوج التمهيدي قياسي يستخدم للتضخيم، ومتوافق مع أما البروتوكولات مكتبة مفهرسة مفرد أو مزدوج. الشاغل الرئيسي ريمبليفيكيشن هو الأخذ بالتحيز، غالباً من خلال تخفيض في الأجزاء الغنية GC ل الجينوم20. باستخدام بوليميريز عالية الدقة (انظر الجدول للمواد)، يحتمل أن يتم تجنب هذه التحيزات المحتملة. ويتضح ذلك من خلال اختلاف الحد الأدنى المضمون GC للمكتبات التسلسل TK686 و TK686-R (الجدول 3). للتحقق ثانية، قدرت محتوى ينقول TK686 و TK686-R وأظهر لا اختلافات ملحوظة (الجدول 3). وأخيراً، تم تجميع الجينوم كله بلاستيدات الخضراء لهذا الانضمام من TK686 و TK686-R، مما أسفر عن تسلسل مماثلة بعد التفتيش قريبة من الحزب الوطني اﻻسكتلندي التباين بين المجلسين (الشكل 2، الجدول 3). اقترح هذه الاختبارات أن المقاييس الجينوم القياسية، مثل المحتوى GC وتكوين ينقول، والقدرة على تجميع جينومات كاملة بلاستيدات الخضراء، لا يمكن أن تتأثر ريمبليفيكيشن. وهذا يفتح إمكانية إدراج دار النباتات العينات ويعتقد أيضا أن يتحلل أو تفتقر إلى المواد في الدراسات فيلوجينوميك دون الاهتمام بالتحيز أدخلت عن طريق PCR. قد تستخدم هذه المكتبات ريمبليفيد أيضا ل التقاط تسلسل34، على الرغم من أنه سيكون الضرورية لاختبار ما إذا كانت متحيزة يدعو الحزب الوطني اﻻسكتلندي. من المستحسن إجراء اختبارات صغيرة الحجم من التحيز مع كل مشروع للتحقق من أن التحيز هو عدم الأخذ في مكتبات التسلسل.

القيود والتعديلات الممكنة
على الرغم من أن هذا البروتوكول قد عملت على قد لا يزال تفشل مئات العينات دار النباتات، سيئة الحفاظ على الأنسجة في أي خطوة. مع ذلك، نادرة جداً للمكتبات بالفشل من الأنسجة بنجاح استخراج الحمض النووي، لا سيما بعد إنقاذ المكتبة من خلال ريمبليفيكيشن. يمكن تعديل الخطوات اختيار حجم لاستهداف أجزاء مختلفة الحجم أو للحد من طائفة واسعة من الشظايا التي ينظر إليها في بعض مكتبات النهائي. كما قد يلزم مع كافة البروتوكولات استخراج النباتية، خطوات لإزالة المركبات الثانوية الخاصة بالنسب التي يمكن أن تعوق البروتوكول العام. كما عرضت، هذا البروتوكول يوفر طريقة قياسية لإعداد مكتبة العزلة والفائق الحمض النووي للعينات دار النباتات العشب، ومن خلال التحقق والتجريب، من المرجح أن يكون التعديل للسلالات النباتية الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ونحن نشكر تايلور أوبوتشون-الأكبر، تيشير الأردن، وزودوك كريستينا للمساعدة في جمع العينات العينات دار النباتات، وحديقة ميسوري للنباتات للحصول على عينات من دار النباتات لأخذ العينات المدمرة. وكان هذا العمل الدعم بمنحه من "مؤسسة العلوم الوطنية" (ديب-1457748).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems 4452300 96 well 
Gel Imaging System Azure Biosystems c300
Microfuge 20 Series Beckman Coulter B30137
Digital Dry Bath Benchmark Scientific BSH1001
Electrophoresis System EasyCast B2
PURELAB flex 2 (Ultra pure water) ELGA  89204-092
DNA LoBind Tube  Eppendorf 30108078 2 ml
Mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Vortex-Genie 2 Fisher Scientific 12-812
Mortar Fisher Scientific S02591 porcelain
Pestle fisher Scientific S02595 porcelain
Centrifuge tubes fisher Scientific 21-403-161
Microwave Kenmore 405.7309231
Qubit Assay Tubes Invitrogen Q32856
0.2 ml Strip tube and Cap for PCR VWR 20170-004
Qubit 2.0 Fluorometer Invitrogen Q32866
Balance Mettler Toledo PM2000
Liquid Nitrogen Short-term Storage Nalgene F9401
Magnetic-Ring Stand  ThermoFisher Scientific  AM10050 96 well 
Water Bath VWR 89032-210
Hot Plate Stirrers VWR 97042-754
Liquid Nitrogen Airgas UN1977
1 X TE Buffer Ambion AM9849 pH 8.0
CTAB AMRESCO 0833-500G
2-MERCAPTOETHANOL AMRESCO 0482-200ML
Ribonuclease A AMRESCO E866-5ML 10 mg/ml solution
Agencourt AMPure XP Beckman Coulter A63882
Sodium Chloride bio WORLD 705744
Isopropyl Alcohol bio WORLD 40970004-1
Nuclease Free water bio WORLD 42300012-2
Isoamyl Alcohol Fisher Scientific A393-500
Sodium Acetate Trihydrate Fisher Scientific s608-500
LE Agarose GeneMate E-3120-500
100bp PLUS DNA Ladder Gold Biotechnology D003-500
EDTA, Disodium Salt IBI Scientific IB70182
Qubit dsDNA HS Assay Kit Life Technologies Q32854
TRIS MP Biomedicals 103133 ultra pure
Gel Loading Dye Purple (6 X) New England BioLabs B7024S
NEBNext dsDNA Fragmentase New England BioLabs M0348L
NEBNext Ultra II DNA Library Prep Kit for Illumina  New England BioLabs E7645L
NEBNext Multiplex Oligos for Illumina New England BioLabs E7600S Dual Index Primers Set 1
NEBNext Q5 Hot Start HiFi PCR Master Mix New England BioLabs M0543L
Mag-Bind RXNPure Plus Omega bio-tek M1386-02
GelRed 10000 X Pheonix Research 41003-1
Phenol solution SIGMA Life Science P4557-400ml
PVP40 SIGMA-Aldrich PVP40-50G
Chloroform VWR EM8.22265.2500
Ethanol Koptec V1016 200 Proof
Silica sand VWR 14808-60-7
Reamplification primers Integrated DNA Technologies see text
Sequencher v.5.0.1 GeneCodes

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Savolainen, V., Cuénoud, P., Spichiger, R., Martinez, M. D. P., Crèvecoeur, M., Manen, J. F. The use of herbarium specimens in DNA phylogenetics: Evaluation and improvement. Plant Syst Evo. 197, (1-4), 87-98 (1995).
  2. Zedane, L., Hong-Wa, C., Murienne, J., Jeziorski, C., Baldwin, B. G., Besnard, G. Museomics illuminate the history of an extinct, paleoendemic plant lineage (Hesperelaea, Oleaceae) known from an 1875 collection from Guadalupe Island, Mexico. Bio J Linn Soc. 117, (1), 44-57 (2016).
  3. Teisher, J. K., McKain, M. R., Schaal, B. A., Kellogg, E. A. Polyphyly of Arundinoideae (Poaceae) and Evolution of the Twisted Geniculate Lemma Awn. Ann Bot. (2017).
  4. Cozzolino, S., Cafasso, D., Pellegrino, G., Musacchio, A., Widmer, A. Genetic variation in time and space: the use of herbarium specimens to reconstruct patterns of genetic variation in the endangered orchid Anacamptis palustris. Conserv Gen. 8, (3), 629-639 (2007).
  5. Wandeler, P., Hoeck, P. E. A., Keller, L. F. Back to the future: museum specimens in population genetics. Tre Eco & Evo. 22, (12), 634-642 (2007).
  6. Rivers, M. C., Taylor, L., Brummitt, N. A., Meagher, T. R., Roberts, D. L., Lughadha, E. N. How many herbarium specimens are needed to detect threatened species? Bio Conserv. 144, (10), 2541-2547 (2011).
  7. Saltonstall, K. Cryptic invasion by a non-native genotype of the common reed, Phragmites australis, into North America. PNAS USA. 99, (4), 2445-2449 (2002).
  8. Besnard, G., et al. From museums to genomics: old herbarium specimens shed light on a C3 to C4 transition. J Exp Bot. 65, (22), 6711-6721 (2014).
  9. Särkinen, T., Staats, M., Richardson, J. E., Cowan, R. S., Bakker, F. T. How to open the treasure chest? Optimising DNA extraction from herbarium specimens. PLoS ONE. 7, (8), e43808 (2012).
  10. Harris, S. A. DNA analysis of tropical plant species: An assessment of different drying methods. Plant Syst Evo. 188, (1-2), 57-64 (1994).
  11. Staats, M., et al. DNA damage in plant herbarium tissue. PLoS ONE. 6, (12), e28448 (2011).
  12. Bakker, F. T., et al. Herbarium genomics: plastome sequence assembly from a range of herbarium specimens using an Iterative Organelle Genome Assembly pipeline. Bio J of the Linn Soc. 117, (1), 33-43 (2016).
  13. Camacho, F. J., Gernandt, D. S., Liston, A., Stone, J. K., Klein, A. S. Endophytic fungal DNA, the source of contamination in spruce needle DNA. Mol Eco. 6, (10), 983-987 (1997).
  14. Hofreiter, M., Jaenicke, V., Serre, D., Von Haeseler, A., Pääbo, S. DNA sequences from multiple amplifications reveal artifacts induced by cytosine deamination in ancient DNA. Nucl Acids Res. 29, (23), 4793-4799 (2001).
  15. Staats, M., et al. Genomic treasure troves: Complete genome sequencing of herbarium and insect museum specimens. PLoS ONE. 8, (7), e69189 (2013).
  16. Bakker, F. T. Herbarium genomics: skimming and plastomics from archival specimens. Webbia. 72, (1), 35-45 (2017).
  17. Doyle, J. J., Doyle, J. L. A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochem Bul. 19, 11-15 (1987).
  18. Allen, G. C., Flores-Vergara, M. A., Krasynanski, S., Kumar, S., Thompson, W. F. A modified protocol for rapid DNA isolation from plant tissue using cetryltrimethylammonium bromide. Nat Prot. 1, 2320-2325 (2006).
  19. Twyford, A. D., Ness, R. D. Strategies for complete plastid genome seqeuncing. Mol Eco Resour. (2016).
  20. Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome Bio. 12, (2), R18 (2011).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: A flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30, 2114-2120 (2014).
  22. Grigoriev, I. V., et al. MycoCosm portal: gearing up for 1000 fungal genomes. Nucl Acids Res. 42, (1), D699-D704 (2014).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Meth. 9, (4), 357-359 (2012).
  24. McKain, M. R. Herbarium Genomics. Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  25. McKain, M. R., Wilson, M. A. Fast-Plast: Rapid de novo assembly and finishing for whole chloroplast genomes. Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  26. McKain, M. R., McNeal, J. R., Kellar, P. R., Eguiarte, L. E., Pires, J. C., Leebens-Mack, J. Timing of rapid diversification and convergent origins of active pollination within Agavoideae (Asparagaceae). Am J Bot. 103, (10), 1717-1729 (2016).
  27. McKain, M. R., Hartsock, R. H., Wohl, M. M., Kellogg, E. A. Verdant: automated annotation, alignment, and phylogenetic analysis of whole chloroplast genomes. Bioinf. (2016).
  28. Staton, S. E., Burke, J. M. Transposome: A toolkit for annotation of transposable element families from unassembled sequence reads. Bioinf. 31, (11), 1827-1829 (2015).
  29. Bao, W., Kojima, K. K., Kohany, O. Repbase Update, a database of repetitive elements in eukaryotic genomes. Mobile DNA. 6, (1), 11 (2015).
  30. McKain, M. R. Transposons. Github Repository https://github.com/mrmckain/ (2017).
  31. Weiß, C. L., et al. Temporal patterns of damage and decay kinetics of DNA retrieved from plant herbarium specimens. Royal Soc Open Sci. 3, (6), 160239 (2016).
  32. Sawyer, S., Krause, J., Guschanski, K., Savolainen, V., Pääbo, S. Temporal patterns of nucleotide misincorporations and DNA fragmentation in ancient DNA. PLoS ONE. 7, (3), e34131 (2012).
  33. Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, (2), 61-64 (2014).
  34. Grover, C. E., Salmon, A., Wendel, J. F. Targeted sequence capture as a powerful tool for evolutionary analysis. Am J Bot. 99, 312-319 (2012).

Comments

1 Comment

  1. Thanks for this video!

    Reply
    Posted by: Anony m.
    August 25, 2018 - 10:13 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics