एक्स-रे विकिरणित कएको-2 कोशिकाओं और PBMC के बीच Crosstalk की जांच करने के लिए एक सह-संस्कृति पद्धति

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Published 1/30/2018
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Immunology and Infection
 

Summary

हम एक्स-रे-विकिरणित कएको-2 और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं (PBMC) के बीच crosstalk की जांच करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । प्रोटोकॉल कएको-2 विकिरण और PBMC के साथ सह-संस्कृति के सेट अप के साथ शुरू होता है; इसके बाद, ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध नियमित रूप से मापा जाता है पर ४८ एच और पश्चिमी दोनों कएको में प्रदर्शन दाग-2 और PBMC.

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Babini, G., Morini, J., Barbieri, S., Baiocco, G., Ivaldi, G. B., Liotta, M., et al. A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC. J. Vis. Exp. (131), e56908, doi:10.3791/56908 (2018).

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Abstract

इस काम में अपनाया प्रोटोकॉल को सुलझाना करना है कैसे एक्स-रे आंत्र बाधा के कामकाज perturb, कोलोरेक्टल ट्यूमर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक साथ खेलना पर ध्यान केंद्रित । कोलोरेक्टल कार्सिनोमा कैंसर का सबसे आम प्रकार के बीच है, आमतौर पर सर्जरी, कीमोथेरेपी, और रेडियोथेरेपी द्वारा इलाज किया । रेडियोथेरेपी के ट्यूमर को लक्षित करने में लाभ अच्छी तरह से जाना जाता है । हालांकि, स्वस्थ ऊतकों की भी सीमित जोखिम बड़ी चिंता का विषय है, विशेष रूप से आंत्र बाधा और प्रतिरक्षा प्रणाली पर प्रभाव के बारे में । गोद लिया सेटअप के लिए एक और अधिक शारीरिक एक, जब सामांय कोशिका संस्कृतियों की तुलना में समान हालत में दो कोशिका आबादी के बीच एक नाटक का अध्ययन करने की अनुमति देता है । इस प्रयोजन के लिए, हम विभिंन तकनीकों का सहारा है और हम एक इन विट्रो सह संस्कृति मॉडल, कएको-2 एक monolayer और PBMC के रूप में अंतर कोशिकाओं पर आधारित है, एक ही संस्कृति माध्यम बांटने का इस्तेमाल किया । इस प्रोटोकॉल दोनों macroscopic प्रभाव पर ध्यान केंद्रित करने के लिए विकसित किया गया है, यानी सेल व्यवहार्यता और ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध (तीळ), और, पश्चिमी दाग के माध्यम से, आणविक परिवर्तन, यानी भड़काऊ रास्ते के सक्रियकरण प्रतिरक्षा कोशिकाओं और कएको-2 कोशिकाओं में तंग जंक्शन प्रोटीन अभिव्यक्ति. कएको-2 सेल व्यवहार्यता पर विकिरण प्रभाव का प्रारंभिक मूल्यांकन 3 के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) और Trypan ब्लू परख, जबकि तीळ एक ohmmeter के माध्यम से तय समय अंतराल पर मापा गया था विशेष रूप से सह संस्कृति प्रणालियों के लिए बनाया गया है । इस तरह, विकिरण के कारण प्रभाव, परिधीय रक्त Mononuclear कोशिकाओं की उपस्थिति (PBMC), और अंततः उनके synergistic प्रभाव, प्रदर्शन किया जा सकता है । इन पूरक तकनीक के माध्यम से, हम कएको के एक उच्च रेडियो प्रतिरोध-2 की 2-10 Gy की सीमा के भीतर मनाया एक्स-रे और एक वृद्धि हुई कएको-2 monolayer पारगम्यता जब PBMCs जोड़ा गया. विशेष रूप से, PBMC उपस्थिति के लिए तंग जंक्शन पाड़ प्रोटीन अभिव्यक्ति में भिंनता के साथ जुड़ा हुआ पाया गया ।

Introduction

इस कार्य में अपनाया पद्धति कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच एक साथ खेलने की जांच करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, एक सेट अप का दोहन शारीरिक हालत के करीब जब सामांय 2-आयामी सेल संस्कृतियों की तुलना में ।

कोलोरेक्टल कार्सिनोमा (सीआरसी) कैंसर का तीसरा सबसे लगातार प्रकार माना जाता है, अधिक से अधिक १,०००,००० के मामलों के साथ दुनिया भर में (वैश्विक कैंसर वेधशाला, अंतर्राष्ट्रीय कैंसर पर अनुसंधान के लिए एजेंसी, विश्व स्वास्थ्य संगठन, http://gco.iarc.fr) । सीआरसी के प्रबंधन नियमित रूप से या तो सर्जरी, कीमोथेरेपी या रेडियोथेरेपी1के माध्यम से किया जाता है । जब सर्जरी या कीमोथेरेपी की तरह इनवेसिव तकनीक की तुलना में, रेडियोथेरेपी काफी हद तक विशिष्ट हानिकारक प्रणालीगत प्रतिक्रियाओं इन नैदानिक दृष्टिकोण से प्राप्त करने से परहेज, विकिरण खुराक के स्थानीयकृत वितरण के लिए धंयवाद । हालांकि, दुष्प्रभाव आसपास के स्वस्थ ऊतकों में पैदा कर सकते हैं, स्वस्थ कोशिकाओं को प्रत्यक्ष क्षति के साथ सूजन को ट्रिगर और गैर द्वारा मध्यस्थता क्षति-लक्षित प्रभाव2,3,4. कोलोरेक्टल कैंसर के इलाज के दौरान विकिरण के कारण प्रतिकूल प्रभाव पर ध्यान केंद्रित, दो पहलुओं की जांच करने की आवश्यकता है । सबसे पहले, आंत्र पारगम्यता के जिंमेदार तंत्र विकिरण प्रसव के कारण, बदले में, बैक्टीरियल आबादी की एक बदल रोकथाम और अणुओं और solutes के paracellular पारित होने के कारण दुष्प्रभाव की संभावना को बदल दिया जा सकता है । दूसरा, आंत की उपस्थिति-जुड़े लसीका ऊतक (GALT) प्रतिरक्षा प्रणाली की एक चौकी के रूप में कार्य करता है, बैक्टीरियल विकास को नियंत्रित करने और सामांय प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया5मध्यस्थता के कार्य के साथ,6,7। इन कार्यों को पूरा करने के लिए, आंत्र पारगम्यता कोशिकाओं ' झिल्ली के बीच जंक्शन परिसरों के समारोह के कारण रखा जाता है । इन कारणों के लिए, एक्स-रे की अलग खुराक के कारण प्रेरित हानिकारक परिणाम कएको-2 कोशिकाओं में अकेले और PBMC के साथ सह संस्कृतियों में जांच की गई ।

हालांकि सेल संस्कृतियों पर अध्ययन का आयोजन जैव चिकित्सा अनुसंधान में जांच का पहला setline है, कोशिका जीवविज्ञान ड्राइविंग तंत्र और विभिंन प्रकार के सेल के बीच पारस्परिक संबंधों की विस्तृत जानकारी की कमी महत्वपूर्ण हो सकता है जब अंगों, प्रणालियों, और उपकरण है कि आसानी से प्रयोगशाला में निर्मित नहीं किया जा सकता है फिजियोलॉजी के अध्ययन आ । इसलिए, हम एक सह संस्कृति को अपनाने का फैसला किया, दोनों दो सेल आबादी के अध्ययन एक साथ और सेलुलर और extracellular तंत्र से संबंधित पहलुओं के विच्छेदन की अनुमति ।

सह संस्कृति एक तकनीक का दोहन जब उपकला कार्यों का अध्ययन और विभिंन प्रकार के सेल के बीच में खेलना है । विशेष रूप से, इस तरह के एक तकनीक का उपयोग हमारे मामले में अनिवार्य हो जाता है, क्योंकि epithelia ध्रुवीयता की विशेषता कोशिकाओं से बना रहे हैं । आंत्र बाधा के मामले में, एन्तेरोच्य्तेस एक अच्छी तरह से परिभाषित ध्रुवीकरण, शिखर और basolateral डंडे के साथ आम तौर पर तंग जंक्शन की उपस्थिति-आसंजन बनाने के अणुओं की वजह से अलग दिखा । इस compartmentalization ऊतक शरीर क्रिया विज्ञान के लिए आवश्यक है, paracellular तस्करी से परहेज और निर्धारित अणुओं के पारित होने की अनुमति ही । यह सुविधा निश्चित रूप से एक सामांय सेल संवर्धन सेट अप के साथ बहलाना असंभव है । इसके अलावा, सह संस्कृति की गोद में स्थापित प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उपस्थिति केवल basolateral सतह में reproduces, जबकि शिखर सतह (आंतों लुमेन के लिए इसी) सीधे अन्य कोशिकाओं के साथ संपर्क में नहीं है.

हाल ही में, कएको-2 सेल लाइनों आंतों बैरियर के एक इन विट्रो मॉडल के रूप में अधिक महत्व प्राप्त की । हालांकि मानव बृहदांत्र ग्रंथिकर्कटता से व्युत्पंन, कएको-2 कोशिकाओं के अंतर की क्षमता बनाए रखने और एक कार्यात्मक ध्रुवीकरण monolayer8है, जो कोशिका झिल्ली जब एक सह संस्कृति डालने में उगाया संपत्तियों की जांच की अनुमति देता है बनाएं ।

एक छिद्रित झिल्ली पर कएको-2 संवर्धन के बाद से एक अच्छी तरह से स्थापित है आंत्र monolayer के इन विट्रो मॉडल, एक सुधार सह है कएको-2 और अंय कोशिकाओं के बीच संस्कृति । इस सेट अप अक्सर अलग सेल प्रकार9 के बीच crosstalk को मापने के लिए अपनाया गया है और जब सह संस्कृति में exogenous उत्तेजनाओं को कएको-2 परेशान प्रतिक्रिया जानने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, कएको के संबंध में-2 अकेले संस्कृति ।

कई अध्ययनों से संबोधित किया है कएको-2 व्यवहार जब सह दोनों गैर के साथ संस्कृति रोगजनक बैक्टीरिया और परिधीय रक्त mononuclear कोशिकाओं, विशेष रूप से प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ crosstalk में स्पष्ट करने के लिए10. Pozo-रूबियो एट अल. 11 bifidobacteria उत्तेजक कएको-2 कोशिकाओं के साथ एक कएको-2/PBMC सह संस्कृति में कई साइटोकिंस की अभिव्यक्ति का अध्ययन किया । उनके काम cytokine अभिव्यक्ति की उपस्थिति में प्रदर्शन बैक्टीरियल उत्तेजना के आधार पर प्रोफाइल को पर्याप्त संशोधन पर प्रकाश डाला/PBMC के अभाव । उनके परिणाम इस निष्कर्ष पर ले जाते हैं कि PBMC की उपस्थिति कएको-२ को bifidobacteria.

गैर रोगजनक और रोगजनक बैक्टीरिया के लिए कएको-2 कोशिकाओं के विभिंन प्रतिक्रियाओं के विभिंन अनुसंधान टीमों द्वारा मूल्यांकन किया गया है । Parlesak एट अल. 12 ई कोलाई-उत्तेजित PBMC पर कएको-2 कोशिकाओं के गुर्दे प्रभाव का प्रदर्शन किया । इसके अलावा, हॉलर एट अल13 कएको-2 कोशिकाओं के उत्तर का अध्ययन किया enteropathogenic ई. कोलाई एसपीपी. या गैर enteropathogenic बैक्टीरिया से दोनों lipopolysaccharide (एलपीएस) के साथ उत्तेजित i.e.E. कोलाई एसपीपी., लैक्टोबैसिलस एसपीपी., को मजबूत बनाने अनुमान है कि कएको-2 कोशिकाओं की प्रतिक्रिया कड़ाई से सह संस्कृति सेट अप में ल्यूकोसाइट्स की उपस्थिति पर निर्भर करता है ।

विभिन्न पूरक प्रयोगशाला परख प्रदर्शन करके (उदा पश्चिमी दाग, ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध, MTT, आदि), सह-संस्कृति में उगाई विभिन्न कोशिका प्रकारों के विश्लेषण के अलावा, पूरी कार्यप्रणाली का वादा किया परिणाम है कि क्या वास्तव में vivo मेंहोता है की अधिक प्रतिनिधि माना जा सकता है । इसके अलावा, इस सेट अप विभिंन सह संस्कृति डिब्बों की जुदाई सक्षम बनाता है, न केवल सेल शामिल प्रकार के अध्ययन की अनुमति है लेकिन यह भी सेलुलर संकेतन ऊपरी बनाम निचले डिब्बे या उपस्थिति में जारी अणुओं बनाम सह संस्कृति की अनुपस्थिति ।

Protocol

निंनलिखित प्रोटोकॉल स्वस्थ स्वयंसेवकों से मानव रक्त निकासी शामिल है । रक्तदाताओं ने नामांकन से पूर्व लिखित सूचना सहमति प्रदान की । इस प्रक्रिया के अनुसार हेलसिंकी घोषणा और रक्त निकासी एक पेशेवर स्वास्थ्य सहायक द्वारा प्रदर्शन किया गया है ।

1. सेल संस्कृति और सह संस्कृति सेट अप

  1. विकिरण से पहले एक सप्ताह, एक कएको-2 सेल २.५ × 105 कोशिकाओं/एमएल से युक्त ताजा RPMI1640 मध्यम में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 मिमी एल-glutamine, १०० U/एमएल पेनिसिलिन, और १०० μg/एमएल streptomycin के साथ पूरक तैयार ।
  2. बीज बाँझ में सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर 1 µm-ध्यान में लीन होना व्यास सेल संस्कृति 6 के लिए आवेषण-अच्छी तरह से प्लेटें और एक 6-अच्छी तरह से थाली में डाल डालें ।
    नोट: सेल संस्कृति आवेषण बाँझ पूरा मध्यम से पहले सेल बोने की मशीन द्वारा सक्रिय करने की आवश्यकता हो सकती है । इस मामले में, संस्कृति मीडिया छोड़ दिया जाना चाहिए और सेल निलंबन मीडिया के साथ प्रतिस्थापित ।
  3. ताजा RPMI1640 मध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें 10% FBS, 2 मिमी L-glutamine, १०० IU/एमएल पेनिसिलिन के साथ पूरक, और १०० µ जी/एमएल streptomycin प्रत्येक नीचे डिब्बे में, और संस्कृति ३७ ° c में humidified वातावरण के साथ एक मशीन में कोशिकाओं 5% CO2
  4. कएको-2 सेल विकिरण के एक ही दिन पर, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध लिथियम-हेपरिन लेपित 6 मिलीलीटर ट्यूबों में मानव पूरे रक्त इकट्ठा (ट्यूब आकार: 13 x १०० मिमी) ।
  5. बाद में, Ficoll ग्रैडिएंट का उपयोग करके पेरिफेरल रक्त mononuclear कक्षों (PBMC) को अलग करें । PBMC अलग करने के लिए, एक ५० मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब और परत में Ficoll के 25 मिलीलीटर डाल पूरे रक्त की एक बराबर मात्रा Ficoll सतह पर RPMI1640 के साथ 1:1 पतला ।
    नोट: एक सामांय स्वस्थ दाता आमतौर पर लगभग 4-10 ×10 6 PBMC/
  6. ५० एमएल ट्यूबों ४०० x g पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक ।
  7. धीरे एक पाश्चर पिपेट के साथ आकांक्षा द्वारा Ficoll और प्लाज्मा के बीच इंटरफेस पर PBMC इकट्ठा और एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में डाल दिया ।
  8. PBMC दो बार फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के 10 मिलीलीटर जोड़कर और 10 मिनट के लिए २५० x g पर PBMC केंद्रापसारक से धो लो ।
  9. संस्कृति पूर्ण RPMI1640 मीडिया में T25 सेमी2 कुप्पी में 3-5 एच की एक अधिकतम के लिए PBMC, जैसा कि पहले वर्णित है, ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक humidified 5%CO2 युक्त वातावरण में ।
    नोट: प्रयोग और बीज 2 × 106 कोशिकाओं के दिन पर PBMC इकट्ठा/अच्छी तरह से, सह संस्कृति के नीचे डिब्बे में, पूरा RPMI1640 माध्यम के 3 मिलीलीटर में निलंबित कर दिया । कएको-2 कोशिकाओं के साथ आवेषण PBMC-युक्त कुओं में स्थानांतरित कर रहे है उनके विकिरण के बाद 30 मिनट । PBMC पूरे रक्त से एकत्र लगभग ७२ ज से अधिक के लिए संस्कृति में नहीं रखा जा सकता है, अगर के साथ उत्तेजित नहीं है उदा phytohaemagglutinin (्ह्), जिसके बाद कोशिकाएं व्यवहार्यता खो जाती है ।
    चेतावनी: गुणवत्ता और सभी रक्त और रक्त उत्पादों की सुरक्षा पूरी प्रक्रिया में गारंटी होना चाहिए ।

2. विकिरण सेट-अप

नोट: कएको के विकिरण-2 कोशिकाओं Istituto di Ricovero ई Cura के रेडियोथेरेपी विभाग में प्रदर्शन किया गया एक Carattere Scientifico (IRCCS) एस Maugeri (पविया, इटली) एक रैखिक त्वरक नियमित रूप से कैंसर के विभिंन प्रकारों के इलाज के लिए इस्तेमाल के साथ ।

  1. सेट फोटॉन एक्स रे ऊर्जा 6 एमवी पीक करने के लिए । रैखिक त्वरक एक स्पंदन शासन में संचालित (दो लगातार दालों के बीच समय लगभग 4 ms के; अवधि के बारे में एक पल्स की एक खुराक की दर के साथ 5 µs 1 × 10-3 Gy/
  2. एक १.४ सेमी-मोटी Plexiglas शीट पर एक्स-रे के पथ पर कएको-2 के साथ आवेषण युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेटें (एक से अधिक की दूरी के लिए इसी का निर्माण-इस्तेमाल किया विकिरण के ऊपर) विकिरण के स्रोत से १०० सेमी पर ।
  3. विकिरण backscattered विकिरण घटक और आरोप लगाया कणों संतुलन की गारंटी के लिए होता है इससे पहले कि प्रत्येक नमूने पर एक ०.५ सेमी-मोटी बोल्स प्लेस ।
  4. विकीर्ण (श्रेणी 2-10 Gy में खुराक) एक फ्लैट और सममित के साथ (± 2%) 20 x 20 सेमी2 विकिरण क्षेत्र और एक खुराक-दर 3 Gy/
    नोट: नियंत्रण "अन्तर्वासना"-विकिरणित कोशिकाओं विकिरण कक्ष में प्रवेश करने के बिना विकिरणित वालों की एक ही प्रक्रियात्मक स्थिति गुजरा (खुराक: 0 Gy) प्राप्त किया.
    चेतावनी: विकिरण उत्पादन उपकरणों के विशेष कर्मियों द्वारा ही इस्तेमाल किया जाना चाहिए ।

3. सेल व्यवहार्यता परख (MTT परख)

नोट: कएको-2 कक्ष चयापचय गतिविधि के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था 3-(4, 5-dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium ब्रोमाइड (MTT) परख14

  1. बीज 2 × 105 कएको-2 में एक 24-अच्छी तरह से प्लेट 24 एच में विकिरण से पहले १.२५ मिलीलीटर में पूर्ण मध्यम ।
  2. विकीर्ण चरणों में वर्णित के रूप में कक्षों को २.१-२.४ फिर 5% CO2युक्त एक humidified वातावरण में ३७ ° c पर कोशिकाओं की मशीन ।
  3. 21 एच विकिरण के बाद, 5 मिलीग्राम/एमएल MTT समाधान के १०० µ एल जोड़ें और एक humidified वातावरण में ३७ ° c पर कोशिकाओं रखने के लिए 5% सह2 के लिए 3 एच ।
  4. supernatant को त्यागें और पंजाबियों की 1 मिलीलीटर से कोशिकाओं को धोएं ।
  5. एक अच्छी तरह से dimethyl sulfoxide (DMSO) के ५०० µ एल जोड़कर formazan क्रिस्टल भंग और λ में एक बहु अच्छी तरह से प्लेट रीडर के साथ अवशोषक का मूल्यांकन = ५७० एनएम ।
  6. चरण ३.३-३.४-३.५-३.६ पर ४५ एच विकिरण के बाद दोहराएँ ।
    नोट: परिणाम इसी शम शर्त से एक गड़बड़ी के रूप में दिखाया गया है, जो १००% करने के लिए सामान्यीकृत है ।
    चेतावनी: DMSO ज्वलनशील और त्वचा, आंखों और श्वसन प्रणाली (GHS07, GHS08) के लिए एजेंट परेशान है । आंखों के साथ संपर्क के मामले में, प्रचुर मात्रा में पानी के साथ तुरंत धोने और चिकित्सा सलाह लेनी । MTT त्वचा, आंखों और श्वसन प्रणाली (GHS07, GHS08) के लिए एक परेशान एजेंट है । आंखों के साथ संपर्क के मामले में, पानी के बहुत से तुरंत कुल्ला और चिकित्सा सलाह लेनी ।

4. व्यवहार्य कोशिकाओं के निर्धारण का प्रतिशत (Trypan ब्लू डाई अपवर्जन परख)

नोट: व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत Trypan ब्लू डाई अपवर्जन परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था ।

  1. बीज 2 × 105 कएको-2 में 24-अच्छी तरह से प्लेट 24 एच में विकिरण से पहले १.२५ मिलीलीटर में पूर्ण मध्यम ।
  2. विकीर्ण रेंज में खुराक के साथ कोशिकाओं को 0-10 Gy (देखें चरणों २.१-२.४) तो एक humidified वातावरण में ३७ ° c में कोशिकाओं की मशीन 5%CO 2 के लिए 24-48 एच युक्त ।
  3. दो चुने गए समय अंक के बाद, पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धोने, इसे त्यागें, तो Trypsin-ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) समाधान के १०० µ एल जोड़ें । ३७ ° c में एक humidified 5% सह 2 मिनट के लिए2 युक्त वातावरण में कोशिकाओं रखो तो एंजाइमी प्रतिक्रिया को गिरफ्तार करने के लिए पूरा माध्यम जोड़ें ।
  4. एक १.५ मिलीलीटर-ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने और 5 मिनट के लिए ५०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant को छोड़ दें और पंजाब के ५० µ एल में कोशिकाओं को फिर से सस्पेंड करें ।
  5. Trypan ब्लू डाई समाधान के ५० µ एल के साथ सेल निलंबन मिश्रण और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए मिश्रण गर्मी ।
  6. एक Bürker चैंबर के साथ दाग (गैर व्यवहार्य) और दाग (व्यवहार्य) कोशिकाओं गिनती ।

5. ट्रांस-उपकला विद्युत प्रतिरोध (तीळ)

  1. बीज 5 × 105 कएको-2 कोशिकाओं एक सप्ताह विकिरण से पहले 6 में अच्छी तरह से थाली सह संस्कृति आवेषण (पॉलीथीन terephthalate (पीईटी), 2 x 106 pores/
  2. विकिरण से पहले 1 ज, एक वाल्टमीटर के साथ तीळ उपाय/ohmmeter ।
  3. चरण २.१-२.४ में वर्णित के रूप में विकीर्ण कक्ष ।
  4. 5% कं2युक्त humidified वातावरण में ३७ ° c में PBMC के साथ सह-संस् कृति की उपस्थिति में कएको-2 कोशिकाओं की कमी ।
  5. पहले कुछ घंटों के बाद के लिए विकिरण, उपाय तीळ हर घंटे, और बाद में हर 3 अप करने के लिए ४८ ज ।

6. Claudin के पश्चिमी दाग विश्लेषण-1, Occludin, Afadin, ZO-1, ZO-2, NF-kB, और XIAP

  1. बीज 5 × 105 कोशिकाओं 1 सप्ताह एक्स-रे प्रदर्शन से पहले 6 में अच्छी तरह से थाली सह संस्कृति आवेषण (पीईटी, 2 x 106 pores/cm2) और चरणों में वर्णित के रूप में विकीर्ण कोशिकाओं २.१-२.४ ।
  2. 5% कं2युक्त humidified वातावरण में ३७ ° c में PBMC के साथ सह-संस् कृति की उपस्थिति में कएको-2 कोशिकाओं की कमी ।
  3. ४८ ज विकिरण के बाद, सेल lysis बफर और स्टोर नमूनों के साथ कोशिकाओं के इलाज के द्वारा कएको-2 और PBMC सेल lysates-20 डिग्री सेल्सियस पर तैयार करते हैं ।
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  4. bicinchoninic अम्ल (बीसीए) विधि द्वारा कुल प्रोटीन राशि को बढ़ाता है.
    नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
  5. मिश्रण Laemli नमूना बफर के साथ कुल प्रोटीन की बराबर मात्रा β-mercaptoethanol के साथ जोड़ा गया (β-mercaptoethanol के अंतिम एकाग्रता 5%), 5 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर नमूनों गर्मी और १०,००० x g पर उन्हें स्पिन
  6. एक 4-20% कास्ट जेल में नमूने लोड और १२० वी पर ट्रो प्रदर्शन के लिए 1 h. Transfer प्रोटीन पर एक polyvinildiene फ्लोराइड (PVDF) झिल्ली.
  7. ब्लॉक गैर विशेष बाध्यकारी साइटों के साथ कमरे के तापमान पर PVDF झिल्ली में 5% गैर वसा शुष्क दूध (NFDM) के साथ जोड़ा ०.२% के बीच-20 (PBT) । 5 मिनट के लिए ०.२% PBT की 10 मिलीलीटर के साथ झिल्ली तीन बार धो लें ।
  8. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए कोमल आंदोलन के साथ झिल्ली की मशीन 4 निंनलिखित प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ डिग्री सेल्सियस पर रात भर रखा जा रहा है: विरोधी claudin-1, विरोधी ZO-1, विरोधी ZO-2, विरोधी afadin, विरोधी occludin, विरोधी NF-केबी, विरोधी XIAP, और विरोधी actin । 5 मिनट के लिए ०.२% PBT की 10 मिलीलीटर के साथ झिल्ली तीन बार धो लें ।
  9. सहिजन Peroxidase (एचआरपी) के साथ झिल्ली गर्मी-कोमल आंदोलन के साथ कमरे के तापमान पर 1 ज के लिए संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी । 5 मिनट के लिए ०.२% PBT की 10 मिलीलीटर के साथ झिल्ली तीन बार धो लें ।
  10. कमरे के तापमान पर, बढ़ाया chemo-luminescent किट के साथ झिल्ली की मशीन द्वारा फोटो फिल्मों का विकास ।
  11. एक स्कैनिंग प्रणाली के साथ फोटो फिल्मों के अधिग्रहण और उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त बैंड यों तो ।
    नोट: Claudin-1, Occludin, Afadin, ZO-1, और ZO-2 का मूल्यांकन कएको-2 कक्षों में किया जाता है । NF-kB और XIAP का मूल्यांकन PBMC में किया जाता है ।
    सावधानी: β-mercaptoethanol विषाक्त (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09) है । वाष्प साँस मत करो, पर्यावरण में रिहाई से बचने के लिए, और व्यक्तिगत संरक्षण उपकरणों और श्वसन संरक्षण पहनते हैं । अगर निगल लिया तो तुरंत चिकित्सकीय सलाह मांग लें ।

7. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. विकिरण जोखिम और सह-संस्कृति एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण गड़बड़ी प्रेरित है कि क्या यह निर्धारित करने के लिए, एक दो-तरफा विश्लेषण (ANOVA) दोहराया माप के लिए एकाधिक तुलना के साथ परीक्षण (Bonferroni के साथ तुलना करने के लिए पोस्ट-हॉक परीक्षण दोहराने का मतलब है) ।
  2. अगर अंयथा नहीं कहा गया है, सांख्यिकीय महत्व की गणना (पी) से दो पूंछ छात्र टी परीक्षण । प्रत्येक मान ≥ का मतलब है 3 स्वतंत्र प्रयोगों ± मानक त्रुटि का मतलब (SEM) ।

Representative Results

एक सप्ताह के प्रयोग से पहले, कोशिकाओं को डालने के छिद्रित झिल्ली पर बोया जाता है और निंनलिखित दिनों के दौरान बढ़ने की अनुमति दी । संगम के स्तर की जाँच की जा सकती है या तो एक उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग कर या फिर तीळ मूल्यों की माप के माध्यम से. दरअसल, वृद्धि चरण के दौरान, जब तक सभी छिद्रित झिल्ली कोशिकाओं द्वारा कवर किया गया है और वे एक विभेदित कोशिका monolayer रूप में, तीळ बढ़ती रहती है । यदि कक्ष तेज/पैदा, प्रयोग पहले/बाद के समय अंक में बीज बोने के बाद शुरू कर सकता है । जब संगम पर, कोशिकाओं तो विकिरण सुविधा के लिए लाया जाता है, प्रदान की पर्यावरण तनाव कम (तापमान या पीएच), के साथ सह संस्कृति शुरू करने से पहले/PBMC के बिना, नीचे डिब्बे में वरीयता प्राप्त (चित्रा 1), या कएको-2 कोशिकाओं के प्रसार का मूल्यांकन. प्रारंभिक सीडिंग घनत्व को देखते हुए, दिन पर 0 कोशिकाओं १००% संगम तक पहुँचने और उपकला कोशिकाओं के एक विभेदित monolayer बनाने के लिए, जो चित्रा 1में दिखाया गया है तीळ में पठार द्वारा देखा जा सकता चाहिएबी. एक बार जब कोशिकाएं ऐसी स्थिति में पहुंच जाती हैं, तो तीळ मान को अगले सप्ताह से अपेक्षाकृत स्थिर रखा जाता है, जब तक पुराने कल्चरल मीडियम को ताजा माध्यम से बदला जाता है, सप्ताह में कम से कम एक बार (चित्रा 1बी). के रूप में चित्रा 1सीमें दिखाया गया है, MTT परख किसी भी सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं दिखा है कएको-2 कोशिकाओं के प्रफलन स्थिति का न तो 24 में और न ही एच पर ४८ एच, स्वतंत्र रूप से प्राप्त की खुराक (अप करने के लिए 10 Gy).

एक अलग परिणाम कएको-2 कोशिकाओं के अल्पकालिक मृत्यु दर के विषय में मनाया गया था । दोनों समय अंक में, Trypan ब्लू धुंधला सेल मृत्यु दर में एक खुराक पर निर्भर वृद्धि दिखाते हैं । इन परिणामों के विकिरण जोखिम का एक स्पष्ट प्रभाव दिखाने के लिए, हालांकि मृत कोशिकाओं के प्रतिशत बहुत कम दिखाई देते हैं, विशेष रूप से जब विचार है कि सबसे अधिक वितरित खुराक (10 Gy) सेल मौत के केवल लगभग 20% का उत्पादन (चित्रा 1डी) ।

नमूने निचले डिब्बे में PBMC के साथ या बिना संस्कृति के सह रहे थे. इस तथ्य को देखते हुए कि PBMC किसी भी बाहरी उत्तेजना पैदा को प्राप्त नहीं किया, एक ४८ एच प्रयोग आदर्श माना जाता था PBMC द्वारा शुरू पूर्वाग्रह से बचने के लिए मरने की शुरुआत । इसलिए, विकिरण से पहले तुरंत से, तीळ नियमित रूप से विकिरण प्रोटोकॉल की वजह से संभावित क्षणभंगुर प्रभाव का ट्रैक रखने के लिए, ४८ घंटे के लिए मापा गया था । जैसा कि चित्रा 1 ई-एफमें दिखाया गया है, तीळ मूल्यों पूर्व इलाज हालत के संबंध में सापेक्ष भिन्नता के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं (जो १२०० के आदेश के थे-१५०० Ω · cm2) बेहतर गड़बड़ी पर प्रकाश डाला करने के लिए एक्स-रे विकिरण से प्रेरित और उतना द्वारा सह-संस्कृति में PBMC की अनुपस्थिति/ दोनों ही मामलों में, एक प्रारंभिक क्षणिक पीक विकिरण जोखिम है, जो विकिरण प्रक्रिया के लिए जिंमेदार ठहराया जा सकता है के बाद पहली बार बिंदु पर स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है ।

जब PBMC के साथ सह-संस्कृति में नहीं (चित्रा 1), तीळ मूल्यों लगभग ४८ घंटे तक लगातार कर रहे हैं, जबकि, एक्स-रे के 10 Gy के बाद, कोशिकाओं 3 एच के बाद विकिरण शुरुआत में एक लंबे समय तक कमी दिखा । PBMCs की उपस्थिति पूरी तरह से तीळ लौकिक गतिशीलता (चित्रा 1एफ) को संशोधित करता है । जब तीळ एक स्थिर मूल्य (चित्रा 1) पर व्यवस्थित करने के लिए प्रकट होता है सभी खुराक के लिए, तीळ में एक कमी स्पष्ट रूप से 3 एच के लिए लगभग 30 एच के बाद विकिरण, से चौकस है ।

पश्चिमी दाग परख के माध्यम से lysates कएको-2 कोशिकाओं में तंग जंक्शन परिसरों अभिव्यक्ति स्तर की जांच की गई । कएको-2 कोशिकाओं (0, 2, और 10 Gy की खुराक के साथ) विकिरण से अवगत कराया गया और बाद में अकेले हो या सह-संस्कृति में PBMCs के साथ नीचे डिब्बे में ४८ ज के लिए (जैसा कि चित्रा 2ए-एफमें दिखाया गया है). दोनों Claudin-1 और Occludin (चित्रा 2एक, 2 बी) के लिए काफी एक्स द्वारा बदल नहीं पाया गया रे और/या सह PBMC के साथ संस्कृति । बड़े उतार चढ़ाव के बजाय पाड़ प्रोटीन ZO-1, ZO-2 और Afadin (चित्रा 2सी, 2d, 2E) में मनाया गया । विशेष रूप से, ZO-2 अभिव्यक्ति के स्तर में कमी पहले से ही 2 Gy के बाद मनाया जाता है जब PBMC के साथ सह संस्कृति में जबकि केवल 10 Gy जब कएको-2 अकेले बढ़ रहे थे । Afadin अभिव्यक्ति स्तर के बजाय केवल 10 Gy एक्स-रे के बाद प्रभावित कर रहे हैं, एक अतिरिक्त कमी के साथ जब कएको-2 PBMCs के साथ सह-कल्चरल हैं ।

PBMCs सह कएको-2 के साथ संस्कृति भड़काऊ राज्य के बारे में विश्लेषण किया गया, विशेष रूप से, नाभिकीय प्रतिलेखन कारक kb (NF-kb) और apoptosis प्रोटीन (XIAP) स्तरों के X-लिंक्ड अवरोधक (चित्र 2 G-I) की जांच की गई है । NF-kB कुल राशि अलग विकिरण खुराक (चित्रा 2जी) को उजागर कएको-2 के साथ सह संस्कृति से प्रभावित नहीं था. इसके विपरीत, XIAP स्तर 4 थे गुना-दोनों 2 Gy और 10 Gy सह संस्कृतियों में विनियमित, हालांकि बड़े बदलाव की मांग नमूनों की एक उच्च संख्या में ऐसे उतार चढ़ाव को कम करने और एक बेहतर सांख्यिकीय शक्ति हासिल विश्लेषण किया ।

के रूप में चित्रा 2एफ और 2Iमें दिखाया गया है, कुछ गैर विशिष्ट बैंड ब्याज की प्रोटीन की उंमीद आणविक वजन के बगल में दिखाई दे सकता है । जब तक कि सच और गैर विशिष्ट बैंड आसानी से अलग कर रहे हैं, विभिंन एंटीबॉडी और/या BSA या NFDM सांद्रता विचार किया जाना चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1 . कुल मिलाकर प्रायोगिक सेटअप और विकिरण जोखिम और/या PBMC सह संस्कृति के macroscopic प्रभाव । A) सह संस्कृति मॉडल का योजनाबद्ध चित्रण । ख) तीळ मान कएको-२ कोशिकाओं के आरंभिक बीज से प्रतिदिन मापा जाता है ताकि monolayer के समुचित विकास और विभेदन की स्थिति का आकलन हो सके. ग) कोशिका व्यवहार्यता और घ) कएको-2 में मृत्यु दर एक्स-रे (0, 2, 5, और 10 Gy) को उजागर । ङ) कएको में तीळ माप-२ कोशिकाओं विकिरणित के साथ 0, 2, और एक्स-रे के 10 Gy के बिना या च कल्चर्ड PBMCs के साथ. प्रत्येक मूल्य ≥ 3 स्वतंत्र प्रयोगों ± SEM. * p-वैल < 0.05 का मतलब है; * * p-va l < ०.०१; p-वैल < ०.००१ । रेखांकन मोरिन् एट अलसे अनुकूलित । 15. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2। कएको-2 और PBMC lysates के पश्चिमी दाग परिणाम । तंग जंक्शन प्रोटीन की अभिव्यक्ति स्तर (Claudin-1 (ए), Occludin (ख), ZO-1 (ग), ZO-2 (घ), और Afadin (ङ)) में कएको-2 के बाद 0, 2, और 10 Gy के एक्स-रे और उपस्थिति में सह-संस्कृति में PBMC की अनुपस्थिति/ मान Actin स्तर पर सामान्यीकृत होते हैं. प्रत्येक तंग जंक्शन प्रोटीन और शर्तों के लिए गाये फिल्मों पैनल (एफ) में दिखाया गया है । कएको-2 कोशिकाओं के साथ PBMCs सह-कल्चर्ड में NF-κB (G) और XIAP (H) का व्यंजक स्तर । NF-kB, XIAP, और Actin के लिए प्रतिनिधि फिल्मों पैनल में दिखाया गया है । प्रत्येक मूल्य ≥ 3 स्वतंत्र प्रयोग ± SEM. रेखांकन मोरिन् एट अलसे अनुकूलित का मतलब है । 15. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें ।

Discussion

कोलोरेक्टल कैंसर, विकसित देशों में अपने उच्च घटना के साथ, आबादी में रुग्णता और मृत्यु के सबसे लगातार कारणों में से एक है । यह आमतौर पर सर्जरी, कीमोथेरेपी द्वारा प्रबंधित किया जाता है, और रेडियोथेरेपी1। रेडियोथेरेपी उपचार के ढांचे में, विशेष रूप से ध्यान स्वस्थ ऊतक जोखिम के प्रभाव के लिए दिया जाना चाहिए4; इसके अलावा, विकिरण जोखिम और प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच संबंधों पर व्यवस्थित अध्ययन रेडियो के दृष्टिकोण विकसित करने के लिए मौलिक हैं-immunotherapy3

इस कार्य में हमने जो पद्धति अपनायी है, कएको-2 के कक्षों और PBMC crosstalk की जांच के अनुरूप बनाई गई है । हम एक्स के प्रभाव पर ध्यान केंद्रित, ट्यूमर कोशिकाओं के रे जोखिम, लेकिन एक ही प्रोटोकॉल औषधीय एजेंटों के साथ अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । मानक सेल संवर्धन के संबंध में शारीरिक स्थितियों के करीब होने के नाते, इस विधि का मजबूत लाभ एक जटिल प्रणाली की एक पूरी विच्छेदन की संभावना है, दोनों अलग प्रकार के सेल का विश्लेषण करने की संभावना दी और की रिहाई सह के दो डिब्बों में अणु संकेत-संस्कृति ही । इस तरह, नियमित रूप से लागू जैविक तरीकों सेलुलर खेल से संबंधित तंत्र की समझ में मदद कर सकते हैं ।

कएको-2 कोशिकाओं पर एक्स-रे-प्रेरित प्रभाव के प्रारंभिक लक्षण वर्णन दो पूरक माप पर आधारित था, यानी MTT वर्णमिति परख और Trypan ब्लू डाई अपवर्जन परीक्षण. जाहिरा तौर पर असंगत परिणाम इन दो परख के अलग ध्यान से समझाया जा सकता है । MTT oxidoreductase एंजाइमों गतिविधि का आकलन है, जबकि Trypan नीले रंग एक जीवित कोशिका अपवर्जन डाई तंत्र पर आधारित है ।

कएको-2-PBMC की जांच के लिए एक उपकला monolayer के निर्माण के लिए सह संस्कृति के दो डिब्बों के बीच एक पूरी जुदाई का नेतृत्व करने में सक्षम की आवश्यकता है । सह-संस्कृति में कएको-2 कोशिकाओं बोने की संभावना केवल इस सेल जनसंख्या के विकिरण की अनुमति देता है । के बाद से सह संस्कृति विकिरण के बाद शुरू होता है, वहां कोई PBMC के किसी भी आकस्मिक जोखिम के कारण पूर्वाग्रह है । इस सेट को ध्यान से एक 6 से डालने के आंदोलनों के दौरान सेलुलर monolayer को नुकसान (या संदूषण) से बचने के लिए संभाला जाना चाहिए दूसरे के लिए अच्छी तरह से थाली । जब ध्यान से प्रदर्शन किया, तीळ माप एक सरल और गैर इनवेसिव विधि monolayer पारगम्यता की जांच करने के लिए कर रहे हैं । यह परख कड़ाई से सह संस्कृति सेट अप करने के लिए संबंधित है, और यह monolayer पारगम्यता की जांच के लिए एकमात्र विकल्प नहीं है । यह एक अच्छा reproducibility उपायों की अनुमति देता है एक बार यह अच्छी तरह से ताजा पूरा माध्यम से तुले है । आम परख ऊपरी "शिखर" डिब्बे से नीचे "basolateral" एक (जैसे fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran परख)16से रासायनिक रंगों के प्रसार पर ध्यान केंद्रित । हालांकि, चूंकि PBMC इस अध्ययन में basolateral डिब्बे में मौजूद हैं, इसलिए हमने प्रयोगों में केमिकल रिएजेंट की शुरूआत से बचने का फैसला किया ।

इस कार्य में अपनाए गए विभिन्न तकनीकों में, तीळ माप केवल एक ही है कि सह-संस्कृति सेट अप17,18की आवश्यकता है । हालांकि, अंय सामांय प्रयोगशाला तकनीक और अधिक जानकारीपूर्ण जब सह संस्कृति में कोशिकाओं को लागू परिणाम प्रदान करते हैं, के रूप में वे एक सेटअप की जांच की अनुमति के करीब शारीरिक स्थितियों और डेटा एक मजबूत जैविक महत्व है । दूसरी ओर, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक असुरक्षित समर्थन पर हो कोशिकाओं के उपयोग के लिए नमूनों को तैयार करने के लिए आवश्यक कार्रवाई में कुछ कठिनाइयों का कारण बन सकता है, जैसे सेलुलर अर्क की तैयारी के लिए सेल lysis पश्चिमी सोख्ता के माध्यम से विश्लेषण किया जाना है ।

इस अध्ययन में अपनाया प्रणाली को और अधिक सुधार करने की क्षमता है, extracellular मैट्रिक्स वातावरण विश्राम करने में सक्षम पदार्थों के आवेदन के साथ उदा . हालांकि, यह भी सिस्टम की एक बढ़ी हुई जटिलता में परिणाम होगा, और सेट अप की एक पूरी विच्छेदन प्राप्त किया जा करने के लिए और अधिक कठिन हो जाएगा ।

सेल सह संस्कृति के लिए setups निश्चित रूप से इन विट्रो अनुसंधान में की उंनति के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं, और जटिल प्रणालियों की समझ के लिए । इस तकनीक की क्षमता मौलिक तंत्र पर ज्ञान बढ़ाने के लिए, आणविक संकेतन पर बुनियादी अनुसंधान अध्ययन करने के लिए नए आदानों प्रदान करने, और के ढांचे में प्रतिरक्षा प्रणाली की गतिविधि का मॉडुलन करने के लिए संभव अनुप्रयोगों के साथ है आंकलोजिकल नैदानिक रोगी प्रबंधन ।

Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।

Acknowledgements

इतालवी परमाणु भौतिकी संस्थान (INFN) आंशिक रूप से INFN-मध्याह्न परियोजना के माध्यम से इस काम को वित्त पोषित । लेखक INFN-मध्याह्न परियोजना समंवय के लिए प्रो Edoardo Milotti (भौतिकी विभाग, ट्राइस्टे, इटली के विश्वविद्यालय) स्वीकार करते हैं; Dr. रॉबर्टो Chignola (जैव प्रौद्योगिकी विभाग, वेरोना विश्वविद्यालय, इटली) कएको-2 कोशिकाओं, ohmmeter प्रदान करने के लिए, और उसके मूल्यवान मदद और प्रशिक्षण के लिए । हम भी तकनीकी सहायता के लिए एग्नेस Solari स्वीकार करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ThinCert
6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates
Greiner Bio-one 657610 Equipment
Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well  Greiner Bio-one 657160 Plastic
Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well  Greiner Bio-one 662160 Plastic
RPMI 1640 without L-Glutamine Lonza 12-167F Reagents
Foetal Bovine Serum Lonza DE14-801 Reagents
L-Glutamine 200 mM Lonza 17-605C Reagents
Penicillin/Streptomycin  10K/10K Lonza 17-602E Reagents
CO2 Incubator Heal Force HF240 Equipment
Ficoll Histopaque-1077 Sigma-Aldrich 10771 Reagents
Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 227261 Plastic
Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom Greiner Bio-one 188261 Plastic
Centrifuge ThermoScientific CL31R Equipment
Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma-Aldrich P3813 Reagents
Cell Culture Flask, 25 cm2, PS Greiner Bio-one 690175 Plastic
Clinac 2100 Linear Accelerator Varian CLINAC 2100C/D Equipment
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) Sigma-Aldrich M5655 Reagents
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D8418 Reagents
Multiwell Plate Reader GDV DV990BV6 Equipment
Trypan Blue Solution 0,4 %  Amresco K940 Reagents
Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049 Reagents
1.5 mL tubes Eppendorf 0030125150 Reagents
Millicell-ERS voltmeter/ohmeter Millipore MERS 00001 Equipment
Cell Lysis Buffer (10x) Cell Signalling Technology #9803 Reagents
Bürker Hemocytometer Sigma-Aldrich BR719520 Equipment
BCA Protein Quantification Kit Abcam ab102536 Reagents
2x Laemmli Sample Buffer  BioRad #1610737 Reagents
2-Mercaptoethanol  BioRad #1610710 Reagents
Accublock Digital Dry Bath Labnet International Inc. D1100 Equipment
4–20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 µL BioRad #4568093  Reagents
Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel BioRad #1658004 Equipment
PowerPac HC High-Current Power Supply BioRad #1645052  Equipment
Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards BioRad #1610385  Reagents
10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer BioRad #1610732  Reagents
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Packs BioRad #1704156 Reagents
Trans-Blot Turbo Transfer System BioRad #1704150 Equipment
Blotting-Grade Blocker  BioRad #1706404 Reagents
Tween-20 Sigma-Aldrich 93773 Reagents
Claudin-1 (D5H1D) XP Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #13255 Reagents
Bovine Serum Albumine Sigma-Aldrich A7906 Reagents
ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb  Cell Signalling Technology #8193 Reagents
ZO-2 Antibody  Cell Signalling Technology #2847 Reagents
Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb Cell Signalling Technology  #13531 Reagents
Anti-Occludin Antibody Millipore ABT146 Reagents
Anti-NF-kB p65 antibody [E379] Abcam ab32536 Reagents
Anti-XIAP antibody  Abcam ab21278 Reagents
Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep) GE Healthcare Life Sciences NA931V Reagents
Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey) GE Healthcare Life Sciences NA934V Reagents
Clarity Western ECL Substrate, 200 mL BioRad #1705060  Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX developer/replenisher Sigma-Aldrich P7042 Reagents
Carestream Kodak autoradiography GBX fixer/replenisher Sigma-Aldrich P7167 Reagents
Carestream Kodak BioMax light film Sigma-Aldrich Z370401 Reagents
Gel Doc EZ System BioRad #1708270  Equipment

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