血管紧张素 II. 型小鼠白细胞滚动和粘附的可视化技术及缺陷

Immunology and Infection
 

Summary

这份手稿描述了使用转基因的记者小鼠和不同的管理途径荧光染料在血管紧张素 II 诱导高血压使用活体视频显微镜的血管评价免疫细胞的活化作用及其能够滚动和坚持内皮。

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Lagrange, J., Kossmann, S., Kiouptsi, K., Wenzel, P. Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls. J. Vis. Exp. (131), e56948, doi:10.3791/56948 (2018).

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Abstract

荧光活体视频显微镜 (综合防治) 的血管是一个既定的方法来评估免疫细胞的活化作用和他们的能力, 并坚持内皮层。通常使用荧光染料或荧光偶联抗体的注入来可视化循环细胞。另外, 还可以使用荧光报告小鼠。白细胞的相互作用, 特别是溶菌酶 M+ (LysM+) 单核分子, 血管壁在促进血管功能障碍和动脉高血压方面起着举足轻重的作用。我们在这里提出的技术, 以可视化和量化白细胞轧制和粘附在血管紧张素 II (ii) 诱导高血压的小鼠通过综合防治。

导管的植入会损害血管壁, 导致改变的血细胞反应。我们比较了不同的注射技术和管理路线, 以形象化的白细胞在一个 LysMCre 的+表意文字+小鼠广泛表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的条件表达在 LysM+单元格。为了研究 LysM 的+细胞活化, 我们使用了 ii 灌注小鼠, 其中白细胞的滚动和粘附增加到内皮。我们要么通过静脉导管注射吖啶橙, 要么直接通过尾静脉, 比较滚动和黏附细胞的数量。我们发现, 颈静脉导管植入本身增加了在假灌输的 LysMCre+表意文字+小鼠与对照组相比滚动和黏附 LysM+细胞的数量。这种活化作用增强了 ii 的小鼠。有趣的是, 直接通过尾静脉注射吖啶橙并没有增加 LysM 的+细胞粘附或在假灌注小鼠中的滚动。因此, 我们证明了转基因小鼠表达荧光蛋白在实验过程中不干扰体内过程的重要性。此外, 尾部静脉注射荧光示踪剂可能是一个可能的替代静脉导管注射。

Introduction

动脉高血压增加了心血管疾病和死亡的风险, 促进动脉粥样硬化, 冠心病, 动脉或静脉 thromboembolisms 的发展1。高血压的发展取决于环境、遗传、内分泌和血流动力学因素的相互作用。目前, 免疫及相关炎症在高血压病因中起重要作用2

在免疫细胞, T 淋巴细胞以及单核和巨噬细胞被发现是因果关系的 ii 诱导的血管炎症和高血压, 部分与他们的能力触发活性氧的物种3。巨噬细胞集落刺激因子缺乏小鼠表现出减少对 ii 的反应血压升高和血管炎症4。在以前的工作中, 我们可以证明 LysM + 单核细胞驱动血管功能障碍和炎症的 ii 诱发高血压5。最近, 我们描述了一个新的途径, 凝血因子 XI 配合血小板和血管壁诱导凝血酶依赖性血管炎症6。目前有关免疫系统在高血压中的作用的知识最近总结和回顾了罗德里格斯-Iturbe et al7

由于免疫细胞参与高血压的发展变得明显, 研究血管与免疫细胞相互作用的模型和技术成为必要。荧光的血管综合病是一个有用的工具, 观察体内循环血细胞和内皮之间的相互作用,8,9,10。用这种技术, 注射染料插与脱氧核糖核酸 (例如吖啶橙色) 能形象化有核的细胞 (循环和从内皮)。在动脉或静脉损伤模型中, 可以注入 rhodamin-6G 或ˊ (现金流量) 的分离血小板, 以显示血小板丰富的血栓.

通常, 颈静脉导管用于注射示踪剂或标记血小板。改变内皮和随后活化的凝血叶栅都知道有影响单核细胞活化。内皮损伤立即导致血小板活化通过内基质分子密封的组织, 随之而来的单核细胞吸引和激活11。相反, 一个完整的内皮细胞是已知的抗凝血特性 (例如,通过组织因子途径抑制剂或血栓调节蛋白)12和直接抑制作用的单核,例如, 通过分泌胞外囊泡含有 rna13。单核细胞是已知的产生组织因子, 外源性的凝血级联和表达蛋白酶活化受体 (部), 可以激活凝血酶和参与单核激活14,15.因此, 任何血小板活化或由于血管损伤引起的凝血级联, 可能对单核细胞活化产生意想不到的影响, 并干扰观察到的现象。在表意文字转基因 LysM 转基因小鼠的帮助下, 一个 double-fluorescent 的报告鼠 (LysMCre+表意文字+), 我们建议详细研究注射用导管的效果和替代方法在 LysM+粒细胞在小鼠动脉高血压模型中的作用16

Protocol

在由莱茵兰-Palatinate (授权号 23 177-07/G12-1-002 和 23 177-07/G15-1-051) 的动物实验伦理委员会批准下, 对8岁至12周龄的雄性小鼠进行了实验。

1. 小鼠麻醉和手术准备

  1. 手术前, 检查动物的健康状况。手术前, 每天对动物进行2-3 天的监测, 观察它们的一般情况 (外貌、姿势、自发行为) 以及体重、食物和用水量。
  2. 准备麻醉用咪唑安定 (5 毫克/千克体重), medetomidine (0.5 毫克/千克体重), 和芬太尼 (0.05 毫克/千克体重), 以腹腔 (ip) 注射200µL/30 克鼠标在1毫升注射器与26克针。
  3. 在一个39° c 升温平台的操作场上进行渗透泵植入和动物制剂的综合防治实验。在消毒浴中消毒所有工具, 消毒加温平台。
  4. 在手术过程中, 用眼药膏保护动物眼睛。在渗透泵植入前用剃刀除去毛皮。使用脱毛膏和棉签分离动脉和颈静脉导管植入在综合防治实验。用两种皮肤消毒剂对动物皮肤进行消毒: 一种含有聚维酮碘的防腐剂和消毒剂, 一种含有 octenidine 的皮肤防腐剂。
  5. 准备主混合拮抗麻醉 ("antisedan 混合") 与 atipamezol (0.05 毫克/千克体重) 和马西尼 (0.01 毫克/kgbody 重量), 并准备200µL/鼠标在1毫升注射器与 26 G 针是皮下注射 (南卡罗来纳州) 注射。

2. 渗透泵的制备和植入

注: 使用渗透泵的皮下 ii 输液详细介绍了鲁et al.17

  1. 用无菌盐水重组冻干粉制备 ii, 并以动物重量和泵送率调节浓度。将重组的 ii 在塑料管中 (不要使用玻璃管)。
  2. 用 ii 溶液填充泵, 以提供1毫克/(kg·d) 7 天。准备好后, 将泵在无菌盐水中保持在37° c 的4-6 小时以上。
  3. 在麻醉后用后足反射法对小鼠进行完全麻醉, 并将其置于温热的操作场。麻醉诱导需要10-15 分钟, 如果把动物放在黑暗环境中, 效果会更好。
  4. 剃掉老鼠的下背部, 用酒精性皮肤防腐剂消毒。
  5. 用剪刀将1厘米的切口垂直于脊柱。使用海峡止血为泵创建一个口袋, 并插入泵 (流版主第一)。口袋必须允许泵的自由运动, 在伤口上没有压力。
  6. 用缝线缝合伤口, 而不是夹紧, 以限制炎症;然后用皮肤防腐剂消毒。
  7. 拮抗麻醉的200µL 的 antisedan 混合和返回的老鼠到它的笼子。
  8. 用丁丙诺啡 (0.075 毫克/千克) 进行术后镇痛, 一次手术后根据动物的行为要求。

3. 颈静脉导管植入及动脉制剂

  1. 对麻醉后的小鼠进行全身麻醉, 用后部食物反应, 在39° c 手术板上用直肠探针将麻醉动物放在背 recumbence 上, 以保持体温并把药膏放在在程序中保护他们的眼睛。
  2. 使用脱毛膏去除颈部毛发。用棉签将奶油涂抹2分钟, 直到头发开始脱落。再加2分钟后, 用刮刀除去奶油和毛发, 用酒精性皮肤杀菌消毒皮肤。
  3. 在显微镜下进行手术。做一个 1-1. 5 厘米长的切口在皮肤纵向地在脖子, 1 cm 在气管旁边。然后使两个其他切口垂直于第一切口的两个肢。
  4. 小心地移除皮肤旁边的组织, 取出覆盖左颈静脉和气管的皮肤块。
  5. 仔细隔离腮腺;舌下和颌下腺腺体从感兴趣区与2弯曲钳。不要割伤或损伤腺体, 让它们进入颈静脉和动脉的最佳通路。
  6. 为了隔离颈静脉, 使用薄钳, 并慢慢打开和关闭它, 轻轻地释放血管从周围的组织。一旦静脉是完全清洁, 定位钳下的船只, 并放置两个7-0 缝合10厘米每下。
  7. 用两节结缝合头部近端。在其他缝合, 准备一个结, 但不要关闭它。
  8. 保持导管 (0.28 毫米内径, 0.61 毫米外径), 用一只手钳填充37° c 无菌生理盐水;而另一方面, 用一把薄薄的剪刀或一条弯曲的26克针, 在容器中做一个小切口。然后将导管插入颈静脉, 并闭合两次结节。在导管上缝合头部近端, 以确保完全固定。
  9. 为了分离和准备颈动脉, 用薄弯曲钳解剖覆盖气管的区域。
  10. 一旦动脉从周围的组织中解脱出来, 从血管中取出迷走神经 (它看起来像一条与颈动脉相邻的白线) (但不要割断它)。薄钳可以关闭, 慢慢打开, 轻轻地调动神经。
  11. 一旦两个动脉都完全清洁, 放置钳下第一颈动脉, 并放置一个小的黑色3毫米宽 x 2.5 厘米长的塑料件下的容器。这是非常重要的, 不过度的船只和检查, 血流存在, 一旦船舶持有人被放置。将第二个动脉放在容器的支架上。如果未将鼠标直接置于显微镜下, 则将腺体放回气管上, 并应用37° c 无菌生理盐水以避免干燥区。

4. LysM 和粘附细胞的评价

  1. 将吖啶橙从2毫克/毫升的库存溶液中贮存在-20 ° c, 并在1毫升注射器中稀释1:4 的无菌盐水 (0.5 毫克/毫升最终浓度)。
保护注射器免受光照, 每只老鼠使用200µL。
  1. 测试不同条件: (1) 用颈静脉导管注射吖啶橙;(2) 将吖啶橙直接注入尾侧静脉 (无颈静脉导管植入);(3) 无吖啶橙的测量使用荧光 LysMCre+表意文字+小鼠 (这里再次没有颈静脉导管植入)。
  • 一旦导管到位, 两个动脉被隔离, 将鼠标置于显微镜下。使用远距离冷凝器和 10X (NA 0.3) 水浸泡物镜, 用单色仪、分束器和电荷耦合器件摄像机对高速宽场荧光显微镜进行测量。利用 real-time 成像系统进行图像采集和分析。
  • 将显微镜物镜集中在血管内皮表面的颈动脉中央。缓慢注入50µL 吖啶橙 (0.5 毫克/毫升) (考虑到第一次注射的导管死体积)。将软件设置为记录100图像, 每个图像的曝光时间为120毫秒。
  • 每一个视频, 每颈动脉 (左, 右) 在不同的位置制作四视频。如果荧光信号减弱, 则再注入50µL 吖啶橙。
  • 录制完所有的视频后, 安乐的动物被颈椎脱位。
  • 将视频速度设置为每秒10图像, 并在每个视频的容器中间放置一个200µm x 250 µm 矩形视图中的滚动和粘连单元格的数量。计数轧制和黏附细胞;黏附细胞被定义为在十年代视频中不移动或脱离内皮的细胞。为了简化量化, 用红色荧光去除通道, 只使用绿色荧光计数轧制和粘附细胞。
  • 为实验使用吖啶橙, 做一个手动阈值的荧光, 以消除背景, 由内皮细胞。
  • Representative Results

    动脉的 LysMCre+表意文字的+小鼠注入 ii 的观察使用了综合病媒。用颈静脉导管注射吖啶橙。我们的目的是观察与血管壁接触的 LysM+细胞与所有有核循环细胞的比例 (这也可能与血管相互作用, 因为细胞类型与血管相互作用的区别仍然是一个开放我们以前的工作的问题)。在基线情况下, 颈静脉导管的出现会导致 LysM 的+细胞 (图 2A, D) 的粘连。吖啶橙注射液后, 相同的细胞是荧光的, 而且内皮细胞是荧光的 (图 2B, E)。在减少内皮相关荧光的背景下, 数据表明所有有核的黏附细胞是 LysM 的+ (图 2C, F);这些结果在 ii 输液确认我们以前的结果并证明 LysMCre 的+表意文字+是观察 ii 对 LysM+单元激活的影响的好模型后才成立。

    在 LysMCre+表意文字+中, 我们评估了吖啶橙在 ii 输液后的 LysM+细胞活化中的作用。在一周的 ii 输液后, LysMCre+表意文字、+小鼠颈动脉内的白细胞内皮相互作用通过经颈静脉导管或通过尾静脉的吖啶橙注射液进行影像和可视化。没有任何导管或注射, LysM 的滚动的+细胞是显着增加后, ii 输液相比, 未经处理的小鼠, 和粘连显示增加 (图 3)。注射吖啶橙与颈静脉导管增加了 ii 治疗小鼠的黏附力和滚动, 更大程度上与没有导管的小鼠相比 (图 3)。与未接受吖啶橙注射液的小鼠相比, 尾静脉注射吖啶橙会导致类似的粘连和轧制 (图 3)。

    Figure 1
    图1。血管紧张素 II. 的输液方案及对 LysM 的评价+细胞在小鼠体内滚动和黏附。LysMCre+表意文字+小鼠注入了7天, ii 和黏附, 以及滚动 LysM+细胞在动脉是量化的, 或没有注射吖啶橙通过颈静脉导管或尾静脉注射.请单击此处查看此图的较大版本.

    Figure 2
    图2。评价 LysM 的+细胞黏附和滚动在颈动脉 LysMCre+表意文字+鼠标。粘附 LysM+ LysMCre 中的细胞 + 表意文字 + 鼠标前 (a, D) 和后 ( B, E) 吖啶注射液通过颈静脉导管。红色和绿色荧光被记录, LysM 的+细胞 (绿色) 和平滑肌细胞 (红色) 是可见的。注射吖啶橙后, 内皮细胞也可在绿色可见, 但去除背景荧光只允许循环有核细胞可视化 (C, F)。请单击此处查看此图的较大版本.

    Figure 3
    图3。血管紧张素 II. LysMCre 中荧光染料的管理路线评价+表意文字+小鼠。滚动的量化 (A) 和黏附 (B) LysM+细胞在假操作或 ii 注入动物, 并有或不注射吖啶橙使用颈静脉导管或尾静脉注射。不同条件 (C) 的代表性图片。结果均值平均±标准误差。执行了2路方差分析和 Bonferroni 的post测试, n = 3-12/组;*p和 #60; 0.05。请单击此处查看此图的较大版本.

    Discussion

    LysM+单核细胞曾被证明与高血压的发展有牵连5。在这里, 我们表明, LysM 的免疫细胞的+ , 并坚持到内皮层, 以响应 ii 输液。此发现是使用 LysMCre+表意文字+小鼠获得的, 从我们以前的研究中探索免疫细胞在高血压中的作用在体内通过对吖啶橙注射液的可视化白细胞,6,10。因此, 细胞类型的黏附在内皮的歧视是不可能的。

    这是一个非常有用的工具的血管研究和体内观察细胞直接在血管, 但注射染料的影响, 在一个外科插入导管的帮助下, 高血压炎症的背景仍然未知。为了评价导管和吖啶橙注射液的潜在作用, 我们利用了 LysMCre+表意文字+鼠标。ii 输液增加了滚动的 LysM+细胞的数量到内皮。插入导管进入颈静脉放大的效果和更多的滚动和粘附白细胞检测 ii 注射小鼠导管与无导管植入的小鼠相比。这表明, 植入颈动脉导管导致全身炎症反应的伤口愈合的情况下覆盖与免疫反应看到的高血压18。此外, 由于颈静脉靠近颈部动脉, 另外的免疫活化可能是通过影响颈静脉而发生的。由于这种作用是不存在的, 当注射直接进入尾部静脉, 我们可以假设, 该效应不是由于染料, 而是插入导管的程序。我们在这里展示了转基因的报告鼠的重要性, 表达荧光蛋白, 以不干涉在体内过程中的实验。此外, 尾部静脉注射荧光示踪剂可能是一个可能的替代静脉导管注射。

    该过程的一个关键步骤是 ii 输液。尾袖评估的血压可以作出, 以控制的有效性, ii 交付的泵。2−3天后血压应增加。为了限制可能影响 LysM+细胞活化的炎症, 在植入泵的切口处, 应该用缝合线而不是夹子来做。必须注意的一个限制是尾静脉注射: 为了使最好的数据获取, 4 视频通常是为每一个颈动脉。如果荧光信号下降, 50 µL 吖啶橙注射, 但与尾部注射更难进行多次注射和保持动脉稳定在显微镜下的目标。颈静脉导管存在的持续时间也可能调节免疫细胞的活化作用, 因为它影响了在导管植入后4小时内制备的富含血小板血浆的凝血活化19。这方面的导管植入需要进一步的调查。

    最后, 即使我们赞赏颈静脉导管植入对 LysM 的影响, ii 输液后, 我们不能完全估计的准备, 皮肤移除和颈动脉隔离在潜在的 LysM +细胞的作用激活.我们的结论是, 使用荧光报告鼠像 LysMCre 的+表意文字+鼠标建议, 以避免破坏船只的完整性在动物准备为在体内成像。

    Disclosures

    作者没有透露

    Acknowledgements

    这项工作得到了德国教育和研究部 (BMBF 01EO1003 和 BMBF 01EO1503) 的支持。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Midazolam Ratiopharm GmbH Anesthesia mix
    Medetomidine Pfizer Deutschland GmbH Anesthesia mix
    Fentanyl Janssen-Cilag GmbH Anesthesia mix
    Alzane Zoetis Antisedan mix
    Flumazenil Hikma pharma Antisedan mix
    Braunol B Braun
    Octeniderm Schülke
    Osmotic pumps Alzet 1007D Osmotic pump implantation
    Angiotensin II Sigma-Aldrich Osmotic pump implantation
    7-0 prolene suture Ethicon Osmotic pump implantation
    Acridine orange Sigma-Aldrich
    Catheter Smiths Medical Deutschland GmbH Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm
    Microscope Olympus BX51WI fluorescence microscope
    Beam Splitter Photometrics CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager
    Objective Olympus UMPLFLN10X Water immersion objective with a monochromator
    Camera Hamamatsu Photonics ORCA-R2
    Image acquisition and analysis software Olympus Realtime Imaging System eXcellence RT
    Mice The Jackson Laboratory Jax 008705 B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
    Mice The Jackson Laboratory Jax 004781 LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )

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    References

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