Visualizando leucócitos rolamento e adesão em angiotensina II-infundido ratos: técnicas e armadilhas

Immunology and Infection
 

Summary

Este manuscrito descreve o uso de camundongos transgênicos repórter e vias de administração diferentes de corantes fluorescentes em angiotensina II induzida por hipertensão usando microscopia intravital de vídeo dos vasos sanguíneos para avaliar a ativação de células do sistema imunológico e suas capacidade de rolar e aderir ao endotélio.

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Lagrange, J., Kossmann, S., Kiouptsi, K., Wenzel, P. Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls. J. Vis. Exp. (131), e56948, doi:10.3791/56948 (2018).

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Abstract

Epifluorescência vídeo a microscopia intravital (IVM) dos vasos sanguíneos é um método estabelecido para avaliar a ativação de células do sistema imunológico e sua capacidade de papel e aderem à camada endotelial. Visualização de células em circulação por injeção de corantes fluorescentes ou anticorpos acoplados fluoróforo é comumente usada. Alternativamente, os ratos repórter fluorescentes podem ser usados. Interações de leucócitos, em particular lisozima M+ (LysM+) monócitos, com a parede do vaso desempenham um papel crucial na promoção da disfunção vascular e hipertensão arterial. Aqui apresentamos a técnica para visualizar e quantificar leucócitos rolamento e adesão em artérias carótidas em angiotensina II (Sandra)-induzido por hipertensão arterial sistêmica em ratos pelo IVM.

A implantação de um cateter danifica a parede vascular e leva a respostas de células alteradas. Comparamos a injeção de diferentes técnicas e vias de administração para visualizar leucócitos em um LysMCre++ do IRG mouse com expressão generalizada da proteína fluorescente vermelha e expressão condicional da proteína verde fluorescente em LysM + células. Para estudar a ativação de células LysM+ , usamos Sandra infundida ratos em que o rolamento e adesão de leucócitos ao endotélio é aumentada. Também injetamos cateter acridina laranja usando uma jugular ou diretamente que a cauda da veia e compararam a quantidade de rolamento e aderindo as células. Descobrimos que implante de cateter na jugular, por si, aumentou o número de rolamento e aderente LysM+ células em Souza-infundido LysMCre+ratos IRG+ , comparados aos controles. Essa ativação foi aumentada em camundongos Sandra-infundido. Curiosamente, injetando a aderência de célula de acridina laranja diretamente através da cauda veia não aumentar LysM+ ou rolando em camundongos Souza-infundido. Assim, demonstramos a importância de camundongos transgênicos repórter expressando proteínas fluorescentes para não interferir na vivo processos durante a experimentação. Além disso, injeção de veia de cauda dos marcadores fluorescentes poderia ser uma alternativa possível para injeções de cateter na jugular.

Introduction

Hipertensão arterial aumenta o risco de doença cardiovascular e morte e promove o desenvolvimento da aterosclerose, doença coronariana e thromboembolisms arterial ou venosa1. O desenvolvimento de hipertensão depende da interação de fatores ambientais, genéticos, endócrino e hemodinâmicas. Atualmente, a imunidade e inflamação relacionada são apreciados para desempenhar um papel importante na etiologia da hipertensão2.

Entre as células imunes, macrófagos, bem como os monócitos e linfócitos T foram encontrados para ser causalmente envolvidos na inflamação vascular induzida por Sandra e hipertensão, em parte relacionados com sua capacidade de desencadear de espécies reativas de oxigênio3. Macrófago colônia-estimulando fator deficientes ratos mostrou resposta reduzida a Sandra sobre o aumento da pressão arterial e inflamação vascular4. Em um trabalho anterior, poderíamos mostrar que LysM + monócitos dirigir disfunção vascular e inflamação na hipertensão induzida pela Sandra5. Mais recentemente, descrevemos um romance caminho no qual coagulação fator XI coopera com plaquetas e da parede do vaso para induzir inflamação vascular dependente de trombina6. O atual conhecimento sobre o papel do sistema imunológico em hipertensão foi recentemente resumido e analisado por Rodriguez-Iturbe et al. 7

Desde que a participação de células imunes no desenvolvimento da hipertensão tornou-se evidente, modelos e técnicas para estudar a interação entre o navio e células do sistema imune tornou-se necessário. Epifluorescence IVM dos vasos sanguíneos é uma ferramenta útil para observar na vivo interações entre circulantes de células do sangue e o endotélio8,9,10. Com esta técnica, injeção de corantes intercalante com DNA (como laranja de acridina) pode visualizar células nucleadas (circulação bem como do endotélio). Plaquetas isoladas manchado ex vivo com rhodamin - 6G ou diclorofluoresceína (DCF) pode ser injectada para visualizar trombo rico em plaquetas em modelos de lesão arterial ou venosa.

Normalmente, um cateter de veia jugular é usado para injetar traçadores ou marcado as plaquetas. Alteração do endotélio e subsequente ativação da cascata de coagulação são conhecidos por ter efeitos na ativação de monócitos. Lesão endotelial, imediatamente, leva a ativação plaquetária através de moléculas de subendothelial matriz para selar o tecido, com consequente monócito atração e ativação11. Pelo contrário, um endotélio intacto é conhecido por ter propriedades anticoagulante (por exemplo, através do inibidor de caminho de fator de tecido ou trombomodulina)12 e efeito inibitório direto sobre os monócitos, por exemplo, através da secreção de vesículas extracelulares contendo microRNAs13. Os monócitos são conhecidos por produzir um fator tecidual, o ativador extrínseco da cascata de coagulação e expressos protease-ativado receptores (PARs) que podem ser ativados pela trombina e participar da ativação de monócitos14,15 . Portanto, qualquer ativação das plaquetas ou da cascata de coagulação devido a lesão vascular pode ter efeitos inesperados na ativação de monócitos e interferir com o fenômeno observado. Com a ajuda do IRG transgénica LysM Cre transgénica dos ratos, um rato de repórter do Cre de duplo-fluorescente (LysMCre++do IRG), propomos a estudar detalhadamente o efeito de injeções com um cateter e métodos alternativos na LysM+ mielomonocítica células em um modelo do rato da hipertensão arterial16.

Protocol

Experimentos foram conduzidos na idade de ratos masculinos 8 a 12 semanas de idade sob a aprovação do Comitê de ética em experimentação animal do estado da Renânia-Palatinado (número de autorização de 23 177-07/G12-1-002 e 23 177-07/G15-1-051).

1. anestesia e cirurgia preparação de rato

  1. Antes da cirurgia, verificar a saúde e a condição dos animais. Antes da cirurgia, monitor animais uma vez por dia durante 2-3 dias por sua condição geral (aparência, postura, comportamento espontâneo), bem como o peso corporal, consumo de água e comida.
  2. Preparar a mistura de mestre para anestesia com midazolam (5 mg/kg de peso corporal), medetomidina (0,5 mg/kg de peso corporal) e fentanil (0,05 mg/kg de peso corporal) de intraperitonealmente (i.p.) injetar 200 rato µ l/30 g em seringa de 1 mL com agulha 26G.
  3. Implantação de bomba osmótica e preparação de animais para experiências IVM são executadas em um campo de operação com 39 ° C plataforma de aquecimento. Esterilizar todos os equipamentos em um banho de desinfecção e desinfectar a plataforma de aquecimento.
  4. Durante os procedimentos, protege os olhos do animais com pomada. Retire a pele com lâminas de barbear antes da implantação da bomba osmótica. Use um creme da remoção do cabelo e cotonetes para isolamento de carótidas e implantação de cateter jugular em experimentos IVM. Desinfectar a pele do animal usando dois desinfetantes de pele: um anti-séptico e desinfetante contendo iodopovidona e uma pele octenidine contendo anti-séptico em solução à base de álcool.
  5. Preparar a mistura de mestre para hostilizar a anestesia ("antisedan mix") com o atipamezol (0,05 mg/kg de peso corporal) e flumazenil (0,01 mg/kgbody peso) e prepare-se 200 µ l/rato em seringa de 1 mL com agulha 26G para ser por via subcutânea (s.c.) injetado.

2. implantação e preparação da bomba osmótica

Nota: A infusão subcutânea de Sandra usando bombas osmóticos foi descrita em detalhe por Lu et al 17

  1. Prepare a Sandra, reconstituir o pó liofilizado com solução salina estéril e ajustar a concentração com o peso do animal e a taxa de entrega da bomba. Manter a Sandra reconstituída em tubos de plástico (não utilize tubos de vidro).
  2. Encha as bombas com a solução de Sandra para entregar 1 mg/(kg·d) por 7 dias. Após o preparo, manter as bombas em solução salina estéril para 4-6 h mínimo a 37 ° C.
  3. Teste a anestesia completa do mouse após injeção da mistura anestesia com traseira reflexos do pé e coloque-o sobre o campo de operação quente. Indução de anestesia leva 10-15 min e funciona melhor se os animais são colocados em um ambiente escuro.
  4. Raspar a parte inferior das costas o mouse e desinfectá-la com um anti-séptico de pele alcoólica.
  5. Faça uma incisão de 1 cm perpendicular à espinha com uma tesoura. Crie uma bolsa para a bomba usando uma pinça hemostática estreita e introduza a bomba (fluxo moderador primeiro). O bolso deve permitir a livre circulação da bomba sem pressão sobre a ferida.
  6. Feche a ferida com suturas e não de clipes, a fim de limitar a inflamação; em seguida desinfecte com anti-séptico de pele.
  7. Antagonizar a anestesia por injeção s.c. de 200 µ l da mistura antisedan e retornar o mouse para sua gaiola.
  8. Realizar a analgesia pós-operatória com buprenorfina (0,075 mg/kg s.c.) uma vez após a cirurgia e sob demanda, dependendo do comportamento animal.

3. implantação de cateter jugular e preparação de carótidas

  1. Testar a anestesia completa do mouse após injeção da anestesia misturar com reflexos traseira comida e colocar o animal anestesiado em decúbito dorsal na placa cirúrgica de 39 ° C com uma sonda retal a fim de manter a temperatura e passar a pomada os olhos para protegê-los durante o procedimento.
  2. Remova os pelos do pescoço usando o creme depilatório. Use um cotonete para espalhar e esfregue o creme por 2 min, até que os pelos começam a cair. Depois de um adicional 2 min, retire o creme e os cabelos com uma espátula e desinfectar a pele com um anti-séptico de pele alcoólica.
  3. Realizar a cirurgia sob um estereomicroscópio. Faça uma incisão longa de 1-1,5 cm na pele longitudinalmente no pescoço, 1 cm ao lado da traqueia. Em seguida, fazer duas outras incisões perpendicular a ambas as extremidades das incisões primeiras.
  4. Cuidadosamente remova tecidos ao lado da pele e o pedaço de pele que cobre a esquerda jugular e a traqueia.
  5. Cuidadosamente, isolar a glândula parótida; glândulas sublinguais e submandibulares, da zona de interesse com 2 pinças curvas. Não cortar ou danificar as glândulas, colocá-los para permitir o melhor acesso para a veia jugular e as carótidas.
  6. Para isolar a veia jugular, usar pinça fina e lentamente abra e feche-a suavemente livre do navio no tecido circundante. Uma vez que a veia é completamente limpa, posicione a pinça sob o vaso e coloque duas suturas de 7-0 de 10 cm sob ele.
  7. Feche a sutura proximal na cabeça com dois nós. Na outra sutura, preparar um nó, mas não fechá-lo.
  8. Segure o cateter (0,28 mm diâmetro, 0,61 mm de diâmetro exterior interior) preenchido com solução salina estéril de 37 ° C com fórceps com uma mão; enquanto com a outra mão, faça uma pequena incisão no vaso com uma tesoura fina ou uma agulha 26G curvo. Em seguida, insira o cateter na veia jugular e feche o nó duas vezes. Feche a sutura proximal na cabeça sobre o cateter a fim de garantir a imobilização completa.
  9. Para isolar e preparar as artérias carótidas, disse a zona que abrange a traqueia usando pinça curva fina.
  10. Uma vez que as carótidas estão livres de tecidos circundantes, remover o nervo vago (parece que uma linha branca adjacente na carótida) do navio (mas não cortá-la). A pinça fina pode ser fechada e aberta lentamente para mobilizar suavemente o nervo.
  11. Uma vez que ambas as artérias estão completamente limpas, coloque a pinça sob a primeira artéria carótida e um pequeno preto 3 mm x largura 2,5 cm comprimento pedaço de plástico sob o vaso. É muito importante não overstretch o navio e para verificar que o fluxo de sangue está presente, uma vez que o titular do vaso é colocado. Coloque a segunda artéria sobre o titular do navio. Se o mouse não é colocado diretamente sob o microscópio, volte a colocar as glândulas sobre a traqueia e aplicar soro fisiológico estéril de 37 ° C para evitar a secagem da zona.

4. avaliação do rolamento e adesão de leucócitos / LysM + pilhas com IVM

  1. Preparar a acridina laranja de um 2 mg/mL de solução armazenado a-20 ° C e diluir 1:4 em soro fisiológico estéril (concentração final de 0,5 mg/mL) em uma seringa de 1 mL.
Proteger a seringa de luz e usar 200 µ l por um rato.
  1. Diferentes condições experimentais: (1) injeção de acridina laranja com o cateter na jugular; (2) injeção de laranja de acridina diretamente para a veia lateral da cauda (com esta condição que foi implantado sem cateter jugular); (3) medição sem ratos acridina laranja usando a fluorescência LysMCre++ do IRG (aqui de novo sem cateter jugular foi implantado).
  • Uma vez que o cateter está no lugar e as duas carótidas são isoladas, posicione o mouse sob o microscópio. Realizar medições com um microscópio de fluorescência de campo amplo de alta velocidade usando um condensador de longa distância e um 10 X (NA 0.3) objectivo de imersão de água com um monocromador, um divisor de feixe e uma câmera de dispositivo de carga acoplada. Realize a aquisição de imagens e análise com sistema de imagem em tempo real.
  • Focar o objetivo do microscópio no meio da artéria carótida na superfície do endotélio. Injecte lentamente 50 µ l de laranja de acridina (0,5 mg/mL) (levar em conta o volume morto do cateter para a primeira injeção). Ajustar o software para gravar 100 imagens com um tempo de exposição de 120 milissegundos por imagem.
  • Faça quatro vídeos por artéria carótida (esquerda e direita) em diferentes locais na artéria para cada vídeo. Se o sinal de fluorescência diminui, injete outro 50 µ l de laranja de acridina.
  • Depois de gravar todos os vídeos eutanásia do animal por deslocamento cervical.
  • Definir a velocidade de vídeo em 10 imagens por segundo e quantificar as células aderentes e rolamento em uma exibição de retângulo µm 200 µm x 250 colocado no meio do navio para cada vídeo. Contar as células de rolamento e aderentes; as células aderentes são definidas como células que não mover-se ou desconectar-se de endotélio dentro de 10 s video. Para simplificar a quantificação, remover o canal com a fluorescência vermelha e usar só a fluorescência verde para contar as células de rolamento e aderente.
  • Para experimentos usando laranja de acridina, fazer um limiar manual da fluorescência a fim para remover fundo produzido pelas células endoteliais.
  • Representative Results

    Carótidas de LysMCre++ do IRG ratos infundidos com Sandra foram observados usando IVM. Laranja de acridina foi injetada usando um cateter na jugular. Visamos olhar a proporção de células LysM+ em contacto com a parede vascular, em comparação com todas as células nucleadas circulantes (que também podem interagir com o navio desde a discriminação do tipo de células interagindo com o recipiente permaneceu aberto pergunta de nosso trabalho anterior). No início do estudo, a presença de um cateter na jugular faz com que a adesão das células LysM+ (Figura 2A, D). Após a injeção de laranja de acridina, as mesmas células eram fluorescentes, mas também as células endoteliais eram fluorescentes (Figura 2B, E). Após a redução do fundo para limitar endotelial relacionadas a fluorescência, os dados indicam que todas as células nucleadas de aderente são LysM+ (Figura 2, F); Estes resultados prendem verdadeiros após a infusão de Sandra, confirmando os resultados anteriores e demonstrando que a LysMCre++ do IRG é um bom modelo para observar o efeito da Sandra na ativação de células LysM+ .

    Avaliamos o papel das vias de administração de acridina laranja na ativação de células LysM+ após a infusão de Sandra no LysMCre++do IRG. Após uma semana de infusão de Sandra, interações de leucócitos endotélio em artérias carótidas de LysMCre++ do IRG ratos foram fotografados e visualizados pelo IVM, com ou sem injeção de laranja de acridina, através de um cateter na jugular, ou através da veia da cauda. Sem cateter ou injeção, rolamento de LysM+ células aumentou significativamente após infusão de Sandra comparado com ratos não tratados e adesão mostrou um aumento (Figura 3). Injeção de acridina laranja com uma adesão de cateter jugular aumentada e rolando no Sandra tratou ratos em maior medida em comparação com ratos sem um cateter (Figura 3). Injeção de acridina laranja na veia da cauda leva à adesão semelhante e rolamento em comparação com os ratos que não receberam injeção de laranja de acridina (Figura 3).

    Figure 1
    Figura 1. Regime de infusão de angiotensina II e a avaliação das LysM+ células de rolamento e adesão em camundongos. LysMCre++ do IRG ratos foram infundidos 7 dias com Sandra e aderindo bem como rolamento LysM+ células sobre as carótidas foram quantificadas com ou sem injeção de acridina laranja através de um cateter na jugular ou pela veia da cauda injeção. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 2
    Figura 2. Avaliação da aderência de célula LysM+ e rolamento em artérias carótidas de LysMCre+ratos IRG+ . Adesão de LysM+ em LysMCre+células ratos IRG+ antes (A, D) e após a injeção de acridina (B, E) através de um cateter na jugular. Fluorescência vermelha e verde foram gravadas, células LysM+ (em verde) e células de músculo liso (em vermelho) eram visíveis. Após a injeção de laranja de acridina, células endoteliais também são visíveis no verde mas remover fluorescência de fundo permite que circulam apenas nucleated visualização da célula (C, F). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Figure 3
    Figura 3. Avaliação das vias de administração de corantes fluorescentes em angiotensina II infundido LysMCre+ratos IRG+ . Quantificação de rolamento (A) e aderindo LysM (B)+ células em farsa operado ou Sandra-infundido animais e com ou sem injeção de laranja de acridina, usando um cateter na jugular ou por injeção de veia da cauda. Fotos representativas das diferentes condições (C). Os resultados são média ± erro padrão da média. realizou-se 2-way ANOVA e post hoc teste do Bonferroni, n = 3-12/grupos; p < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

    Discussion

    LysM+ monócitos anteriormente foram mostrados para ser implicados no desenvolvimento da hipertensão5. Aqui nós mostramos que as células imunes LysM+ rolar e aderem à camada endotelial em resposta à infusão de Sandra. Esta constatação foi obtida usando LysMCre++ do IRG ratos de nossos estudos anteriores, explorar o papel das células do sistema imunológico em hipertensão na vivo através da visualização de leucócitos com injeção de acridina laranja6,10. Assim, a discriminação dos tipos de célula, aderindo ao endotélio não foi possível.

    O IVM é uma ferramenta muito útil para estudos vasculares e observações na vivo de células diretamente na vasculatura, mas o impacto da injeção de corantes com a ajuda de um cateter inserido cirurgicamente no contexto inflamatório da hipertensão permanece desconhecido. Para avaliar o efeito potencial do cateter e laranja de acridina injeção aproveitamos a LysMCre+ratos IRG+ . Infusão de Sandra aumentou o número de células LysM+ de rolamento para o endotélio. Inserção de um cateter na veia jugular amplificado o efeito e mais rolamento e aderente leucócitos foram detectados em camundongos Sandra-infundido instrumentados com um cateter em comparação com ratos sem implantes de cateter. Isto indica a implantação de um causas de carótida cateter uma reação inflamatória sistêmica no contexto da cicatrização que se sobrepõe com a reação imune, vista em hipertensão arterial18. Além disso, devido à proximidade da veia jugular à artéria carótida uma ativação imune adicional pode ter ocorrido por afetar a veia jugular. Uma vez que este efeito não estava presente quando as injeções foram feitas diretamente para a veia da cauda, podemos assumir que o efeito era devido não a tintura, mas o procedimento de inserção do cateter. Temos aqui demonstrado a importância de camundongos transgênicos repórter expressando proteínas fluorescentes para não interferir na vivo processos durante a experimentação. Além disso, injeção de veia de cauda dos marcadores fluorescentes poderia ser uma alternativa possível para injeções de cateter na jugular.

    Uma etapa crítica do processo é a infusão de Sandra. Cauda do manguito avaliação da pressão arterial pode ser feita a fim de controlar a eficácia de Sandra entrega pela bomba. Pressão arterial deve aumentar depois de 2−3 dias de infusão. Para limitar a inflamação que pode influenciar a ativação de células LysM+ , fechamento da incisão onde a bomba é implantada deve ser feito com suturas em vez de clipes. Deve-se notar uma limitação sobre a inclusão de veia da cauda: para fazer a melhor aquisição de dados possíveis, 4 vídeos são geralmente tomados para cada carótida. Se o sinal fluorescente diminui, 50 µ l de laranja de acridina são injetados, mas com injeção de cauda é mais difícil de fazer várias injeções e manter as carótidas estável no âmbito do objectivo de microscópio. A duração da presença de um cateter na veia jugular também pode modular a ativação de células do sistema imunológico, desde que está afetando a ativação da coagulação no plasma rico em plaquetas preparado 4 h após a implantação de cateter19. Este aspecto da implantação do cateter precisa de mais investigação.

    Finalmente, mesmo se nós apreciamos o impacto da implantação do cateter jugular na ativação de células LysM+ após a infusão de Sandra, não totalmente estimamos o papel de preparação, remoção de pele e carótido isolamento na cela potencial LysM+ ativação. Podemos concluir que o uso de ratos de repórter de fluorescência como o LysMCre++ do IRG rato é recomendado para evitar o rompimento da integridade da embarcação durante a preparação de animais para a imagem latente na vivo .

    Disclosures

    Os autores não têm nada a divulgar

    Acknowledgements

    Este trabalho foi financiado pelo Ministério alemão de educação e pesquisa (BMBF 01EO1003 e BMBF 01EO1503).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Midazolam Ratiopharm GmbH Anesthesia mix
    Medetomidine Pfizer Deutschland GmbH Anesthesia mix
    Fentanyl Janssen-Cilag GmbH Anesthesia mix
    Alzane Zoetis Antisedan mix
    Flumazenil Hikma pharma Antisedan mix
    Braunol B Braun
    Octeniderm Schülke
    Osmotic pumps Alzet 1007D Osmotic pump implantation
    Angiotensin II Sigma-Aldrich Osmotic pump implantation
    7-0 prolene suture Ethicon Osmotic pump implantation
    Acridine orange Sigma-Aldrich
    Catheter Smiths Medical Deutschland GmbH Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm
    Microscope Olympus BX51WI fluorescence microscope
    Beam Splitter Photometrics CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager
    Objective Olympus UMPLFLN10X Water immersion objective with a monochromator
    Camera Hamamatsu Photonics ORCA-R2
    Image acquisition and analysis software Olympus Realtime Imaging System eXcellence RT
    Mice The Jackson Laboratory Jax 008705 B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J
    Mice The Jackson Laboratory Jax 004781 LysM Cre (B6.129P2-Lyz2tm1(cre)Ifo/J )

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    References

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