Извлечение Hemocytes из личинки Drosophila melanogaster микробной инфекции и анализа

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Этот метод демонстрируется визуализировать возбудителя вторжения в насекомое клетки с трехмерной (3D) модели. Hemocytes от дрозофилы личинки были инфицированы вирусных или бактериальных патогенов, ex vivo или в естественных условиях. Зараженных hemocytes были затем фиксированной и витражи для изображений с конфокального микроскопа и последующих клеточных 3D реконструкции.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Во время патогенной инфекции Drosophila melanogaster, hemocytes играют важную роль в иммунной реакции на протяжении инфекции. Таким образом цель настоящего Протокола заключается в разработке метода для визуализации возбудителя вторжения в конкретных иммунной отсеке мух, а именно hemocytes. С помощью метода, представленные здесь, до 3 × 106 живой hemocytes можно получить из 200 дрозофила 3rd instar личинок в 30 минут для ex vivo инфекции. Кроме того hemocytes может быть зараженных в естественных условиях путем инъекций личинок 3rd instar следуют кровяные добычи 24 ч после инфекции. Эти зараженные клетки первичной были исправлены, витражи и образы с помощью конфокальной микроскопии. Затем 3D представлений были созданы из изображений, чтобы окончательно показать возбудителя вторжения. Кроме того, можно получить РНК высокого качества для qRT ПЦР для выявления возбудителя мРНК следующие инфекции и достаточно белка могут быть извлечены из этих клеток для Западный анализ помаркой. Взятые вместе, мы представляем метод определенное согласование возбудителя вторжения и подтверждения инфекции, используя типы бактериальных и вирусных патогенов и эффективный метод для извлечения кровяные для получения достаточно живой hemocytes от дрозофилы Личинки для ex vivo , так и в естественных условиях инфекции экспериментов.

Introduction

Drosophila melanogaster это организм устоявшихся моделей для изучения врожденного иммунитета1. Во время врожденный иммунный ответ hemocytes играют важную роль в ответ на вызов возбудителя. Hemocytes являются критическими для инкапсуляции паразитов, а также важную роль в борьбе против возбудителя через фагоцитарной действий во время грибковые, вирусные и бактериальные инфекции2,3.

Для того чтобы лучше понять врожденный иммунный ответ хозяина патогенные микробные инфекции, важно для визуализации, как возбудитель поражает клетки хозяина во время инфекции. Эта визуализация способствует пониманию механизма вторжения. Вместе с детали внутриклеточной локализации возбудителя и клеточного ответа эти данные могут предоставить подсказки о принимающей реакции на инфекции и клеточных органелл, с которыми взаимодействует микроба. Таким образом 3D-модель восстановления после съемки по микроскопии может быть полезно определить точное местоположение патогенов в клетки хозяина. В этом исследовании мы визуализирована вторжения Coxiella burnetii (C. burnetii), возбудитель Ку-лихорадки, зоонозные болезни, которая представляет собой серьезную угрозу для здоровья человека и животных, в первичной Drosophila hemocytes. Недавно было продемонстрировано, что дрозофилы восприимчивы к биобезопасности уровня 2 9 км фаза II (NMII) клон 4 штамм C. burnetii и что этот штамм имеет возможность реплицировать в дрозофилы4, указанием что Дрозофила может использоваться в качестве модельного организма для изучения патогенеза C. burnetii .

Предыдущие исследования использовали hemocytes для изучения врожденный иммунный ответ хозяина. Hemocytes были использованы для морфологических замечания5,6,7, морфометрический анализ2,8, фагоцитоз анализ2,3, qRT ПЦР2 , 9, иммунопреципитация10,11, immunofluorescent анализ10,12, иммуноокрашивания13,, immunoblotting3,10 11 и иммуногистохимии9,14. Хотя дрозофилы S2 клетки также доступны для различных экспериментов в пробирке , увековечении и потенциальных существующей вирусной инфекции изменить их поведение15,16. Использование первичных элементов увековечен клеток линии, таких как S2 клетки, в отличие от позволяет для изучения врожденной иммунной функции в системе более представителя всего организма. Кроме того инфекции hemocytes в естественных условиях, до извлечения, позволяет клетки взаимодействуют с другими принимающей белков и ткани, преимущество над добычей hemocytes до ex vivo инфекции. Получить достаточное количество hemocytes в течение короткого времени, чтобы сохранить hemocytes жив8,,1718,19были использованы несколько различных методов.

В этом исследовании мы представляем метод для извлечения hemocytes из дрозофила 3rd instar личинки патогенные микробные инфекции с C. burnetii, листерий (листериоз) или беспозвоночных радужные вирус 6 (IIV6). Мы описываем методы как в естественных условиях , так и ex vivo кровяные инфекций. В естественных условиях- и ex vivo-зараженных hemocytes были визуализируется с помощью конфокальной микроскопии и используется для создания 3D-моделей C. burnetii вторжения. Кроме того, используя протокол извлечения, ex vivo-зараженных hemocytes были использованы для выражения генов и белков анализов. В частности изучить масштабы инфицирования с IIV6 и Listeria, всего RNA или протеина был изолирован от клеток для qRT ПЦР или Западный анализ помаркой. Взятые вместе, протокол предоставляет методы быстро собрать большое количество hemocytes от 3rd instar личинок и доказательства того, что основной hemocytes, инфицированных в vivo или ex vivo, являются подходящей платформой для микробной возбудитель инфекции исследования и применимым течению анализы микроскопии, transcriptomics и протеомики.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ex vivo инфекции

  1. Средний и оборудование
    1. В стерильных условиях, подготовить Свежая дрозофилы кровяные изоляции среднего (DHIM) содержащие 75% Шнайдер дрозофилы средних с 25% плода Bovine сыворотки (ФБС) и фильтр стерилизовать его.
    2. Слой 2-3 куска пленки парафин 10 см х 10 см под стереомикроскопом.
    3. Подготовьте стеклянный капилляр. Установите нагреватель капиллярного съемник до 55% от максимума. Вытяните капиллярной трубки острием приблизительно 10 мкм.
    4. Засыпки капилляра с минеральным маслом.
    5. Соберите заполненные капилляр на nanoinjector (рис. 1А) и открыть плавленого капилляр наконечник, облом кончик с щипцами (рис. 1Б). Наружный диаметр кончика должно быть 100 мкм для легко поглощения hemocytes.
    6. Извлечь столько нефти как можно дальше от кончика капиллярной трубки, а затем заполнить с DHIM. Для легкой визуализации границы до получения гемолимфа и масла, включают пузырек воздуха между нефтью и DHIM (рис. 1Б').
  2. Гемолимфа добыча
    1. Выберите 3rd Инстар дрозофилы личинки изнутри стена пищи флакон осторожно с помощью щипцов и поместите их в 100 мкм фильтр (рис. 1C). 3rd instar личинки находятся 3-6 дней после плодородные откладки взрослой самки.
      Примечание: Эти эксперименты используемые генотип, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= бла 2xEGFP} AH2, так как hemocytes от этих животных Экспресс расширенной зеленого флуоресцентного белка (EGFP) для оказания помощи в идентификации клеток при микроскопии.
    2. Залить 5 мл стерильной воды личинки и встряхните сетчатый фильтр для 5 s. место сетчатый фильтр на задачи очистки, чтобы удалить излишки воды (рис. 1C').
    3. Переноса личинок в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Анестезировать их с газом CO2 для 5 s (рис. 1D).
    4. Место личинки на парафин фильм под стереомикроскопом, с спинной стороне, обращенной вверх(рис. 2).
    5. Место стеклянный капилляр слегка на личиночной задней тела чтобы удерживать его на месте и сорвать задняя кутикулы открыть, с помощью тонкой острые щипцы (рис. 2B).
    6. Разрешить гемолимфа поступать на фильм парафина (рис. 2C).
    7. Чтобы пул гемолимфа, включая hemocytes от 20-50 личинок одновременно на фильм парафина.
    8. Занять до пула гемолимфа, используя стекло капилляров на nanoinjector (рис. 2D).
      Примечание: Там должно быть примерно 10-20 мкл гемолимфа.
    9. Извлечь гемолимфа в 1,5 мл microcentrifuge трубка, содержащая 500 мкл DHIM (2 рисунокE).
    10. Повторите шаги 1.2.4) - 1.2.9) для каждого пакета личинок.
  3. Подсчитать количество hemocytes.
    1. Пипетка 5 мкл раствора Трипановый синий 0,4% в пробки microcentrifuge 0,6 мл пятно мертвые клетки. Осторожно смешать DHIM и hemocytes в 1,5 мл трубку с помощью пипетки и передача 5 мкл DHIM, включая hemocytes пробки microcentrifuge 0,6 мл и осторожно перемешать.
    2. Пипетка 10 мкл клеток от 1:1 смесь Трипановый синий: кровяные в Горяева.
    3. Подсчитать количество живой hemocytes, которые не запятнаны с Трипановый синий в каждом из 4 угла поля hemocytomter и рассчитать концентрацию hemocytes на миллилитр, используя формулу:
      Equation 1
      где X — концентрация живой hemocytes на миллилитр; а, b, c и d являются количество живых клеток (как определено исключение Трипановый синий) в каждом 4 полей учитываются в Горяева. Деление на 2 общего числа клеток насчитал объясняется разбавления 1:1 клеток с Трипановый синий. Клетки окрашивали Трипановый синий считается мертвым.
  4. Ex vivo Инфекции
    1. Определите количество скважин для заполнения с клетками, основанные на timepoints и биологического реплицирует необходимые для каждого эксперимента. 5,0 × 104 hemocytes желательны для очистки РНК и белка, после инфицирования.
    2. Рассчитайте объем запасов возбудителя быть разведен с DHIM для инфекции, с использованием следующей формулы:
      Equation 2
      где обилие инфекции (мои) — это количество вирусных или желаемого бактерии в клетку.
      Примечание: MOI используется зависит от индивидуальных эксперимент и выполненных анализов. Здесь, 10 генома эквиваленты (GE) / клеток C. burnetii, 10 кое/ячейки листерийили 1 TCID50/cell от IIV6 было использовано.
    3. Подготовьте 500 мкл возбудителя среднего для каждой скважины 24-ну плиты, добавив надлежащего объема DHIM вирусной или бактериальной громкости в трубке.
    4. Место 12 мм круглые Стекло покровное (№ 1 толщина) в хорошо 24-ну плиты.
    5. Разделение DHIM, включая hemocytes в скважины 24-ну плиты.
    6. Добавьте 500 мкл возбудителя среднего hemocytes в колодец.
    7. Центрифуга пластину на 1000 x g за 5 мин.
    8. Инкубировать пластину за 1 час на 28 ° C. Каждые 15 мин, нежно наклона пластины от задней стойки, а затем слева направо для 5 s вручную.
    9. После 1 h вторжения/вложение шаг 1.4.8) аккуратно Пипетка от возбудителя среднего и мыть hemocytes с свежими DHIM и пополнить его с 500 мкл свежих DHIM.
    10. Инкубируйте зараженных hemocytes на требуемое время. В этих экспериментах, C. burnetii- или IIV6-инфицированных hemocytes инкубируют 24 h, и Listeria-зараженных hemocytes инкубируют для 1, 2 или 4 h.

2. в естественных условиях инфекции

  1. Инфекции
    1. Теплый, агар сок дрозофилы фрукты при комнатной температуре 15 мин пластины сделаны ранее описал20.
      1. Добавьте 30 г агара 700 мл воды и автоклав для 40 мин.
      2. Растворите 0,5 г метил paraben в 10 мл абсолютного этанола.
      3. Метил парабена решение добавьте 300 мл фруктовый сок.
      4. Быстро смешать сок концентрат в раствор ячеистого агар и распределить 5 мл на 10 × 35 мм Петри.
      5. После того, как пластины остыли 15 мин, храните их на 4 ° C.
    2. Подготовка 3rd instar личинки следующие шаги 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Место вставки дрожжей на плите агар. Сделайте прекрасный разрез в пластину агар, где личинки можно перенести во избежание высыхания (рисA). Соберите иглы указал вольфрама 0,001 мм с проведением щипцы с использованием парафина фильмов (Рисунок 3B, C).
    4. Пипетка 50 мкл высокого титра mCherry выражая -C. burnetii (5,95 × 109 GE/мл) на парафин фильм под стерео микроскоп и личинки в бассейн бактерий.
    5. Поместите личинки в бассейн бактерий. Укол личинки с вольфрамовой иглой (рис. 3D). Переноса личинок на агаре пластину (рис. 3E).
    6. Переносить оставшиеся среды патогена на пластину агар и печатью пластины с парафином фильм.
    7. Держите личинки на плите в влажный воздух до желаемого времени послеоперационные инфекции (рис. 3F). В этом эксперименте, C. burnetii-зараженные личинки находятся на табличке на 24 часа.
  2. Гемолимфа добыча и покрытием hemocytes
    1. Подготовка среднего и оборудование после шага 1.1).
    2. Место 12 мм круглые Стекло покровное (№ 1 толщина) в хорошо 24-ну плиты. Пипетка 500 мкл DHIM в колодец.
    3. Извлечение гемолимфа из зараженные личинки, следующие шаги 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Извлечь гемолимфа в хорошо после шаг 2.2.2).
    5. Повторить 2.2.3) и 2.2.4) для нескольких пакетов личинок.
    6. Центрифуга пластину на 1000 x g за 5 мин.

3. Визуализация

  1. Фиксации и окраски
    1. После позволяя hemocytes поселиться на круглые Стекло покровное в колодец, аккуратно извлеките носитель из каждой скважины.
    2. Аккуратно добавьте 200 мкл параформальдегида 4% (PFA) для каждой скважины поселились hemocytes. Инкубируйте hemocytes 20 минут при комнатной температуре.
    3. Удалите 4% PFA и аккуратно 200 мкл PBS, содержащие 0,1% тритон X-100 и 1% бычьим сывороточным альбумином (БСА) для каждой скважины. Инкубируйте hemocytes 10 мин при комнатной температуре.
    4. Удаление PBS и аккуратно добавить 200 мкл 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) для каждой скважины. Инкубируйте hemocytes 10 мин в темноте при комнатной температуре.
    5. Удаление решения DAPI и осторожно добавить PBS в каждой скважине. Инкубируйте hemocytes 5 минут при комнатной температуре.
    6. Падение 10 мкл среднего antifade монтажа на стекло микроскопа.
    7. После удаления PBS из каждой скважины, удалите крышку стекла из 24-ну пластину, используя штраф отметил пинцет. Осторожно поместите крышку стекла на носитель antifade монтажа на слайде стекла, с hemocytes вниз.
    8. Разрешить на слайд, чтобы высушить, поместив его в темной ночи.
  2. Конфокальная томография
    1. Настройка Конфокальный микроскоп для трех изображений цвета DAPI, EGFP, и mCherry. Используйте следующие настройки: DAPI возбуждения (бывших) 405 нм, выбросов (ЭМ) 415-480 Нм; EGFP ex 488 нм, Эм 493-564 Нм; mCherry ex 587 Нм, Эм 597-700 Нм.
    2. Поместите образец на Микроскоп и сосредоточиться на образце с помощью 63 X / 1.4 Цель числовой апертуры (NA). Найдите нужную hemocytes в поле зрения для воображения.
    3. Отрегулируйте лазер мощности и детектор выгоды для достижения соответствующей экспозиции образца. Проверьте несколько z самолеты, чтобы убедиться, что уровень воздействия подходит для толщины весь пример.
    4. Найти верхней и нижней позиции по оси z весь кровяные. Задайте эти позиции как начальную и конечную позиции для z резании.
    5. Используйте только сканирование масштаб изображение области, содержащей кровяные. Часто используются факторы зум 3 X.
    6. Соберите изображения серии в соответствующей резолюции, например, 1024 x 1024 пикселей в плоскости x-y и 0,3 мкм интервалов в измерении z.
  3. 3D модель восстановления
    Примечание: С открытым исходным кодом существует, выполняет многие из описанных ниже функций 3D модель восстановления.
    1. Импортируйте файл серии z секционного изображения в программное обеспечение, связанное с Конфокальный микроскоп для 3D модель восстановления.
    2. Выберите показаны совместно локализации ядер, окрашенных с DAPI и mCherry, выражая C. burnetii в EGFP, выражая кровяные клетки. Обрезка изображения серии содержат только одну ячейку.
    3. Выберите параметр просмотра 3D, который реконструирует 3D-модели с использованием алгоритма расфасованных программного обеспечения. Выберите требуемый тип 3D представительства среди смесь, поверхности и смешанные варианты. В этом методе hemocytes, ядер и C. burnetii указаны с использованием моделей поверхности.
    4. Наблюдать за 3D реконструированный ячейки с различных позиций, просмотра, удерживая кнопку мыши и перетащив курсор вокруг экрана. Измените ячейки ориентации и положение моделируется источника света для оптимизации изображения. Существуют и другие варианты для непрозрачности, минимального и максимального порога, зеркальные, Ambient, Shineness и гамма для оптимизации изображения.
    5. Возьмите сечения с помощью модели, с помощью команды срезания и резания для визуализации интерьера содержимое кровяные.

4. Заявка на ген и/или белка анализа

  1. После инфекции с IIV6 и Listeria, лизировать клетки для последующего qRT ПЦР или Западный анализ помаркой как описано ранее21 и следующими инструкциями.
    Примечание: Приведена Таблица материалов для грунтовки для qRT-PCR и антитела для западной помарки.
  2. Анализ продуктов ПЦР электрофорезом геля агарозы, как описано выше22, для обеспечения надлежащей длины амплифицированного продукта.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Собирать жить hemocytes ex vivo инфекции, до 3 × 106 hemocytes были извлечены из 200 дрозофила 3rd instar личинки. Развивать наш метод, были попытки ряда различных методов. Индивидуальные личиночной рассечение примет до 1,5 ч, и в среднем ~ 8000 клетки были получены с помощью этого метода18, большинство из которых не были живы в конец коллекции. Далее мы попытались извлечь гемолимфа, который содержит hemocytes, от 20 личинок на время, используя стеклянный капилляр19, но капилляра стал забиты с кутикулы материал и гемолимфа не смог эффективно рассмотрен стекло капилляр. Наконец мы механически нарушается кутикулы 20-50 личинок в пакете с тонкой щипцы12и сделал пул гемолимфа легко поглощения. Это позволило легко коллекции большое количество hemocytes из большого числа личинки (Таблица 1).

Чтобы указать, что извлеченные hemocytes были живы и подходит для инфекции, пробирного Трипановый синий исключения была проведена вычислить процент живой hemocytes, извлеченные с помощью метода, представленные здесь(рис. 6). Кроме того, мы сравнили наш метод для извлечения кровяные с ранее опубликованным методом, где целью было разработать метод механического нарушения изоляции и дифференцировать между циркулирующих и житель hemocytes от лица дрозофила личинка23. После сравнения между этими двумя методами от 10 независимой экспериментальной изоляции мы наблюдали, что жизнеспособность клеток была немного больше, с помощью метода, представленные здесь (рисA); Однако метод от Петраки и др. принесли почти вдвое больше hemocytes от каждые 10 расчлененных личинки (Рисунок 6B). Причины увеличения числа hemocytes от Петраки и др. метод является, что этот метод собирает резидентов (сидячие) hemocytes, а также оборотных hemocytes. Чтобы убедиться, что клетки, извлеченные с помощью метода, представленные здесь на самом деле были hemocytes, мы использовали летать строку, содержащую трансгенов для hemolectin (Hml) промоутер вбивания циркулирующих hemocytes GAL4, который связывает вверх по течению активатор последовательности (УАС) для активируйте расширение Зеленый флуоресцентный белок (EGFP) транскрипции и выражение в hemocytes. Hemocytes от hml-GAL4 > UAS-EGFP личинки были извлечены на патрон coverglass слайды, фиксированные, permeabilized и окрашенных с DAPI как описано21. Рисунок 7 показывает, что большинство DAPI-положительных клеток являются также EGFP-позитивными. Количественная оценка совместного выражения была выполнена из нескольких изображений, из которых мы подсчитали, что 86±9% изолированных клеток были hemocytes.

Протокол в инновационной 3D модели возбудителя вторжения в hemocytes дрозофилы , извлеченные из 3rd instar личинок после ex vivo или в естественных условиях C. burnetii инфекции. Мы смогли изображения C. burnetii инфекции, поскольку бактерии Экспресс mCherry. После того, как инфицированных hemocytes были исправлены и витражи, они были imaged DAPI, EGFP, и mCherry, с помощью конфокальной микроскопии. Кровяные инфицирования, как определяется процент EGFP-положительных клеток, которые также выставлены mCherry сигнал, как ex vivo , так и в естественных условиях C. burnetii инфекции был почти 100%. Это было ожидать, поскольку мои 10 GE/клетки была использована для ex vivo инфекции, которая должна привести к инфекции 100% клеток24. Относительно инфекций в естественных условиях , так как личинки находятся в высокой титр капли mCherry выражая -C. burnetii (5,95 × 109 GE/мл), количество бактерий примерно 10,000-fold выше, чем количество hemocytes на личинки. Таким образом 100% заболеваемости ожидается инфекций в естественных условиях .

Далее Z-образные профили были собраны через кровяные визуализировать всю ячейку в 3D и подтвердить наличие C. burnetii в глубь клетки. Рисунок 4 показывает прозрачные сечения кровяные (в зеленом) с C. burnetii (в красном) видели в внутрь клетки. Изображения также были реконструированы в 3D модель (рис. 5), представляющие на поверхности кровяные и C. burnetii, снова показывая C. burnetii в интерьере поперечном hemocytes. Интересно, что в естественных условиях-зараженных hemocytes выставлены более цитоплазматических расширений и были плоскими в природе, в то время как ex vivo-зараженных hemocytes были более сферической (рис. 5). Это может означать больше населения lamellocytes в в естественных условиях-инфицированных населения и plasmatocytes в ex vivo населения7. В то время как lamellocyte дифференциация обычно индуцированных течение инфекции паразитарные осы25, ранив дрозофилы личинки также достаточно, чтобы побудить lamellocyte дифференциация26. Наконец хотя не использованы в экспериментах, представленные здесь, есть GFP-выражая форм Listeria27 и28 IIV6, которые могут быть использованы для создания 3D-моделей кровяные инфекции. Вместо этого, листерии- и IIV6-инфицированных hemocytes были использованы для западный blotting и qRT ПЦР экспериментов.

С помощью метода, представленные здесь, инфекции выполняются как ex vivo , так и в естественных условиях для воображения. Кроме того анализ мРНК и белка возбудителя последовал ex vivo инфекции. В частности извлеченные hemocytes были заражены IIV6 и применялись к qRT ПЦР анализа. Оно показало значительно более высокий уровень IIV6-193R, вирусный ген, который кодирует для предполагаемого Ингибитор апоптоза29, между МОК - и IIV6-инфицированных клеток (рис. 8A). Электрофорез усиливается продукции подтвердили наличие группы для продукта гена IIV6-193R в образце инфицированных, но не макет инфицированных образца (рис. 8B). Усиленные полос для внутреннего управления ИРЗИ были обнаружены во всех пробах, и IIV6 инфекции в S2 клетки были выполнены как позитивный элемент управления. Поскольку IIV6 инфекции были исполнены на /cell50MOI 1 TCID, примерно 50% клеток ожидается быть инфицированы, основанные на распределение Пуассона24.

Общий белок от МОКА - или листериоз -инфицированных hemocytes была собрана в 1, 2 и 4 h после инфекции и концентрацию белка определяется Bicinchoninic кислоты (BCA) анализа. 100% клеток ожидается быть зараженных ex vivo , поскольку МВД было 10 кое/клетки24. Западный blotting подтверждает наличие листерии-производных белковых продуктов в зараженных hemocytes, с высоким уровнем, достигнутые 4 ч после инфекции (рис. 9). Listeria посевным материалом используется в качестве позитивного элемента управления для обнаружения Listeria-конкретных групп. Присутствие актина отображается в образцах кровяные для подтверждения уровня белка загрузки. Взятые вместе, эти результаты показывают, что hemocytes, извлеченные с помощью метода, представленные здесь были пригодны для обоих экспериментов вирусные и бактериальные инфекции.

Figure 1
Рисунок 1 : План оборудования и материалы, используемые для извлечения кровяные. Оборудование впервые был подготовлен до вскрытия. A) вытащил стеклянный капилляр был вставлен в nanoinjector после того, как заполнены обратно с минеральным маслом. B) расплавленный кончик стеклянный капилляр был сломан с щипцами для создания 100 мкм наружный диаметр. B) DHIM был рассмотрен капилляра во избежание заражения клеток и воздушные пузыри были введены сделать четкое различие между нефтью и DHIM. C) личинки выбрали из пищи флаконов и помещены в ячейку ситечко. C') личинки промывают в стерильной водой и вода удаляется с задачей уничтожить, D) личинки передаются в microcentrifuge трубку и наркозом с газом CO2 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Диаграмма временной шкалы и потока для извлечения hemocytes. A) личинки находятся на их спинной стороне до открытия кутикулы. B кутикулы нарушается с тонкой острые щипцы и капиллярной иглы. C гемолимфа Блед на фильм парафина. D) бассейны гемолимфа от 20-50 личинок take up с стеклянный капилляр и nanoinjector. E гемолимфа и hemocytes передаются в microcentrifuge трубка, содержащая 500 мкл DHIM считаться с Горяева. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: В vivo инфекции. Фрукт) дрозофилы сок плиты агара и дрожжей пасты используются для инкубации в естественных условиях зараженные личинки. Отрубы производятся в пластину агар для облегчения личинки долголетия (серые стрелки). B) иглы указал вольфрама 0,001 мм прилагается к щипцы с использованием парафина фильм. C) кончик иглы указал вольфрама 0,001 мм. D) личинка кололи иглой вольфрама в бассейне патогена на парафин фильм под стерео Микроскоп. E) кололи личинки размещаются плита агара. F пластина опечатаны с парафином фильм и хранится на влажные салфетки в контейнере до соответствующего времени. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Поперечное сечение возбудителя вторжения в hemocytes. Разделы, извлеченные из 3D конфокальных сканирование возбудителя инфицированных hemocytes. A, B) секции xy показывает C. burnetii (в красном, отмеченные белыми стрелками) в интерьере кровяные. Серые стрелки показывают ядра hemocytes. A',», B') мнения, включая yz - и xz раздел изображения показывают вторжение C. burnetii в hemocytes от 2 дополнительных смотровые площадки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 5
Рисунок 5 : 3D модели возбудителя вторжения в hemocytes. Реконструированный 3D модели C. burnetii вторжения в hemocytes создаются после инфицирования ex vivo , так и в естественных условиях . Модель может быть свободно вращать с помощью программного обеспечения; Здесь 6 Просмотр точек отображаются с кровяные в зеленом, C. burnetii в красном (белые стрелки) и ядро в голубой (серые стрелки). Также показываются сечения изображения показаны интерьер захватили патоген клетки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 6
Рисунок 6 : Процент и населения живут hemocytes. Hemocytes были извлечены из группы 10 3rd instar личинки, с помощью метода Петраки et al. и метод представлен здесь. A) процент живой hemocytes была рассчитана для каждого метода Трипановый синий исключение анализа. B) общая численность населения hemocytes сравнивали между двумя методами. Столбчатые диаграммы представляют среднее ± стандартное отклонение от N = 10 биологических реплицирует на метод типа, извлечения и анализа. P-значения указаны с двух-Стьюдента T-теста при условии неравными дисперсиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 7
Рисунок 7 : Изображения извлеченного hemocytes, используя драйвер hemolectin. Hemocytes были извлечены из 80 личинок w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = бла 2xEGFP} AH2. Промоутер для Hml диски GAL4 в распространении hemocytes, который связывает UAS для активации EGFP транскрипции и выражения. Hemocytes были исправлены и витражи с DAPI как описано выше20. Hemocytes монтируется на патрон coverslips и исходным дифференциальных вмешательства контракт (ОПК) и микроскопии флуоресцирования. Синий канал показывает, ядро, окрашенных с DAPI и зеленый канал показывает hemocytes, выражая EGFP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 8
Рисунок 8 : qRT-PCR и гель-электрофорез. Экспрессия гена IIV6-193R наблюдалось qRT-PCR только в IIV6-инфицированных hemocytes. A) 193R экспрессии генов был нормализации внутреннего контроля, ИРЗИ и представлен как отношение. Номер цикла для hemocytes макет инфицированных произвольно было присвоено максимальная цикла, количество 40 для анализа, поскольку 193R не был обнаружен в этих образцах. Данные представляет среднее ± стандартное отклонение от N = 3 биологических реплицирует каждой группы. P-значение указывает две Стьюдента T-тест предполагая неравными дисперсиями. B qRT ПЦР продукты указаны электрофорезом геля агарозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 9
Рисунок 9 : Западный анализ помаркой. Выражение Listeria антигены и актина в макет - и Listeria-зараженных hemocytes от 3rd Инстар дрозофилы личинок на 1, 2 и 4 h после инфекции (п.и.) определяются Западный blotting. Общий белок концентрации определяется Bicinchoninic кислоты (BCA) пробирного нормализовать общее количество белка, загруженной в каждой полосе геля. Посевным материалом для заразить hemocytes был использован как пример позитивного управления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Метод Среднее количество личинок
для извлечения кровяные
Среднее количество общего hemocytes
Гемолимфа
Капиллярный добыча
(этот метод)
192.44 (SD: 86,05) 4,56 x 105 клеток (SD: 5,83 x 105)
(Диапазон: 70-390, N = 25 процессов) (Диапазон: 1.20 x 105 - 2.95 х 106 клеток)
Индивидуальные
Личинки рассечение
26.67 (SD: 11.55) 8.33 х 103 клеток (SD: 6.66 x 103)
(Диапазон: 20-40, N = 10 испытаний) (Диапазон: 4.00 x 103 - 1.60 х 104 клетки)
личинок
капиллярные добыча *
Н/Д * Н/Д *
* hemocytes не смогли быть извлечены с помощью этого метода из-за закупорки капилляров иглы

Таблица 1: количество расчлененный личинок и извлекается с использованием различных методов hemocytes. Средняя численность расчлененных личинки и извлеченного hemocytes были сопоставлены между методом, здесь представлены и другие методы. Наш метод привели к коллекции более высоких чисел личинок и hemocytes. Личинок капиллярного извлечения метода также была предпринята попытка, но hemocytes не смогли быть извлечены из-за закупорки капилляров кончика.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Чтобы лучше понять, как инфицированных клеток хозяина, важно уточнить локализации возбудителя в клетках, особенно когда эксперименты на ранее непроверенных возбудителя и ячейки типа комбинации4. Во время учебы Каскад клеточный ответ, после инфицирования может указывать продуктивной возбудителя вторжения, сочетание данных изображений и клеточного ответа необходимо продемонстрировать возбудителя вторжения и инфекции. В то время как отчеты, показывающие 2D изображения возбудителя вторжения в клетки хозяина, как правило, указывают продуктивной инфекции, некоторые вопросы могут оставаться относительно сроков первоначальных возбудителя вторжения в клетки хозяина. Таким образом 3D модели, реконструированный из z раздел сканирование 2D изображения можно решить эти вопросы и указать расположение возбудителя в клетки хозяина (рисунки 4 и 5). Однако ограничение использования первичных hemocytes является их долговечность в клеточной культуре. Предыдущем докладе говорится, что кровяные выживания в средства массовой информации культуры клеток является всего лишь 8 h18, и в нашей инфекции протокол, мы были в состоянии выполнять анализы до 24 ч, но не больше. Таким образом невозможно соблюдать высокий уровень репликации C. burnetii , или формирование вакуоль parasitophorous, которые не начинают формироваться до 2 дней после инфицирования и не observably большой до 4-6 дней после инфицирования30 .

Для многих экспериментов, где конечной анализов используют белка и РНК для анализа большое количество клеток обычно требуется для производства достаточного материала для допроса. Например здесь, мы используем конечной точки анализа, таких, как Западный blotting и qRT ПЦР для проверки степени возбудителя инфекции в первичной hemocytes, производные от 3rd Инстар дрозофилы личинки. Таким образом метод представлен здесь сосредоточена на быстрой личиночной диссекции и коллекции гемолимфа, содержащие достаточно живой hemocytes ex vivo возбудителя инфекции. Этот метод вводит использование nanoinjector принять гемолимфа и hemocytes быстро. Размещение hemocytes в DHIM, содержащих 25% FBS имеет важное значение для выживания кровяные. Кроме того для инфекций ex vivo , представленные здесь, необходимо большое количество hemocytes. Чтобы избежать melanization31,,3233, рассечение и кровяные коллекции должно произойти быстро. В то время как другие методы для извлечения кровяные существует18,19,23, продолжительность этих методов, чтобы собрать достаточно большое количество hemocytes ex vivo инфекции был слишком долго. Штрафа отзыв 100 мкм выгодно для поглощения гемолимфа не занимая другие органы, которые могут привести к засорению капилляров иглы. Использование nanoinjector также могут быть автоматизированы, когда он присоединен к стадии микроманипулятор и педаль, позволяя пользователю сосредоточиться на быстрый рассечение личинок дрозофилы и уменьшить время, hemocytes без окружающих личинок ткани или клетки культуры СМИ. Тем не менее использование пипетки также предлагается занять гемолимфа для передачи DHIM. Кроме того наш метод использует газ CO2 чтобы анестезировать личинки до вскрытия; использование холодного блока с покрытием фильм парафин является еще жизнеспособный метод23. Наконец рассечение личинок в капле DHIM во время выпуска гемолимфа может уменьшить количество hemocytes, которые потеряли от прилипания к фильму парафина, но увеличит время, необходимое для поглощения капиллярного иглой.

Общий иммунный ответ у дрозофилы травмы, которая происходит во время открытия и рассечение личиночной кутикулы, является melanization,3132,33. Во время извлечения hemocytes мы бы наблюдать за melanization hemocytes в DHIM уже как 10 мин, после извлечения. Как melanization это быстрый процесс, эти клетки будут исключены из экспериментов возбудителя инфекции. Кроме того, анти коагулянт фенилтиомочевины могут добавляться к DHIM ингибировать phenoloxidase активации системы и melanization во время ранены9. Тем не менее как melanization и апоптоз innate иммунных реакций дрозофилы, их уровень может быть количественных следующие кровяные добычи и стимуляции с помощью методов, описанных здесь.

В то время как восстановление большое количество белка и РНК материала является обязательным требованием для методов, таких как Западная помарка и qRT-PCR, новые методы, такие как RNAseq требуют гораздо меньше материала, как мало, как 10 pg высокого качества всего РНК от одноклеточного34. Эксперименты, такие как эти поднять интересующие вопросы экспериментальной, и так как дрозофила hemocytes гетерогенных населения, содержащие кристалл клетки, plasmatocytes и lamellocytes7, одно может начать допросить транскрипционный анализ ответов каждой ячейки типа35. Например, Kurucz et al., разработали антитела, которые могут быть использованы для изоляции подмножеств кровяные дрозофилы , которые могут быть использованы для транскрипционный анализ или proteomic профилирования после различные стимулы. Кроме того недавнее развитие одной ячейки RNAseq технология может определить transcriptomes каждого типа клеток без использования антител к первоначально отдельно каждой ячейки типа36,,3738, 39. Кроме того, можно спросить вопросы, касающиеся регулирования гена в кровяные подмножеств, которые могут помочь нам понять, как человеческие линий клеток крови возникла и развивалась от древних организмов через сравнительной геномики усилия. Решение проблем таких требует сочетания широкого круга экспериментальных методов, и метод, описанный здесь может быть полезным для таких усилий, когда необходима изоляция большое количество hemocytes из беспозвоночных личинки.

Здесь мы предлагаем сочетание 3D моделей с числовой, биохимические данные для подтверждения инфекции. В будущем исследования, мы можем использовать методы, описанные здесь соблюдать иммунных реакций и механизм возбудителя вторжения в клетки хозяина путем совместного пятнать хост белков для микроскопии анализа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.

Acknowledgements

Мы благодарны д-р Роберт Heinzen для обеспечения запасов выражая mCherry Coxiella burnetii. Мы благодарим д-р Луис Тейшейра за предоставление беспозвоночных радужные вирус 6 и фондового центра Bloomington для предоставления летать запасов. Этот проект частично финансировался NIH Грант R00 AI106963 (A.G.G.) и университета штата Вашингтон.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9, (10), 1003720 (2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9, (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85, (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7, (4), 34721 (2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68, (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10, (8), 0136593 (2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6, (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100, (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106, (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4, (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101, (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106, (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419, (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, (11), 173 (2007).
  20. Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11, (11), 0166088 (2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31, (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16, (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101, (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84, (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286, (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36, (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3, (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11, (3), 0150910 (2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11, (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33, (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205, (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143, (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167, (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358, (6360), 194-199 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics