Extracción de hemocitos de larvas de Drosophila melanogaster para infección microbiana y análisis

Immunology and Infection

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Summary

Este método muestra cómo visualizar la invasión del patógeno en las células de los insectos con modelos tridimensionales (3D). Hemocitos de larvas de Drosophila estaban infectadas con patógenos virales o bacterianos, o ex vivo o en vivo. Hemocitos infectados luego fijados y teñidos para la proyección de imagen con un microscopio confocal y la posterior reconstrucción celular 3D.

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Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

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Abstract

Durante la infección patógena de Drosophila melanogaster, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta inmune durante la infección. Así, el objetivo de este protocolo es desarrollar un método para visualizar la invasión del patógeno en un compartimiento inmune específico de las moscas, es decir, hemocitos. El método presentado aquí, 3 × 106 vivo hemocitos pueden obtenerse 200 larvas de Drosophila 3rd estadio en 30 min para la infección ex vivo . Alternativomente, hemocitos pueden ser infectado en vivo a través de la inyección de 3 larvas de estadiord seguido por extracción hemocyte a la infección después de 24 h. Estas células infectadas de la primaria fueron fijadas, teñidos y reflejada usando microscopia confocal. Entonces, se generaron representaciones 3D de las imágenes para mostrar definitivamente la invasión de patógenos. Además, se puede obtener RNA de alta calidad para qRT-PCR para la detección de siguiente de mRNA de patógeno infección y suficiente proteína pueden ser extraído de estas células para el análisis de Western blot. Tomados en conjunto, se presenta un método para la reconciliación definitiva de la invasión de patógenos y confirmación de la infección con tipos de patógeno bacterianos y virales y un método eficiente para la extracción de hemocyte obtener suficiente energizados hemocitos de Drosophila larvas para experimentos de infección ex vivo e in vivo .

Introduction

Drosophila melanogaster es un organismo modelo bien establecido para el estudio de la inmunidad innata1. Durante la respuesta inmune innata, hemocitos juegan un papel importante en la respuesta al desafío de patógeno. Hemocitos son cruciales para el encapsulamiento de parásitos, así como tener una función importante en la lucha contra el patógeno a través de la acción fagocítica durante la infección por hongos, virales y bacterianas2,3.

Para mejor entender la respuesta inmune innata del hospedador a la infección microbiana patógena, es importante visualizar cómo el patógeno invade las células del huésped durante la infección. Esta visualización contribuye a una comprensión del mecanismo de invasión. Junto con los datos de localización intracelular del patógeno y la respuesta celular, estos datos pueden proporcionar pistas sobre la respuesta del huésped a la infección y los orgánulos celulares con los cuales interactúa el microbio. Por lo tanto, reconstrucción 3D modelo después de la proyección de imagen por microscopia puede ser útil para determinar la ubicación precisa de los patógenos en las células del huésped. En este estudio, visualizamos la invasión de Coxiella burnetii (C. burnetii), el agente causal de la fiebre Q, una enfermedad zoonótica que plantea una grave amenaza para la salud humana y animal, en primarias hemocitos de Drosophila . Recientemente, se demostró que la Drosophila son susceptibles al nivel de bioseguridad 2 fase nueve milla II (NMII) clon 4 cepa de C. burnetii y que esta cepa es capaz de replicarse en Drosophila4, indicando Drosophila puede utilizarse como un organismo modelo para estudiar la patogenesia de C. burnetii .

Estudios previos han utilizado hemocitos para examinar la respuesta inmunológica innata del hospedador. Hemocitos se han utilizado para observaciones morfológicas5,6,7, morfométricos análisis2,8, fagocitosis análisis2,3, qRT-PCR2 , 9, inmunoprecipitación10,11, análisis inmunofluorescente10,12, immunostaining13, immunoblotting3,10, 11 e immunohistochemistry9,14. Aunque las células S2 de Drosophila también están disponibles para varios experimentos en vitro , inmortalización y potencial infección viral existente cambian su comportamiento15,16. El uso de pilas en lugar de una línea celular inmortalizada, como células de S2, permite el estudio de la función inmune innata en un sistema más representativo de todo el organismo. Además, la infección de hemocitos en vivo, antes de la extracción, permite a las células interactuar con otras proteínas de host y el tejido, una ventaja sobre extracción de hemocitos antes infección ex vivo . Un número de diferentes métodos se han utilizado para obtener un número suficiente de hemocitos en un corto período de tiempo para mantener los hemocitos vivo8,17,18,19.

En este estudio, se presenta un método para extraer hemocitos de larvas de Drosophila 3rd estadio de infección microbiana patógena con C. burnetii, Listeria monocytogenes (listeriosis) o invertebrados iridiscente Virus 6 (IIV6). Se describen los métodos para las infecciones hemocyte tanto in vivo y ex vivo . In vivoy ex vivo-hemocitos infectados fueron visualizadas con microscopía confocal y usados para construir modelos 3D de invasión de C. burnetii . Además, usando el protocolo de extracción, ex vivo-hemocitos infectados fueron utilizados para la expresión de gene y proteína ensayos. Específicamente, para examinar el grado de infección por IIV6 y Listeria, proteína o RNA total fue aislada de las células para qRT-PCR o análisis de Western blot. Tomados en conjunto, el protocolo proporciona métodos para recolectar rápidamente un número elevado de hemocitos de 3 larvas de estadio de lard y evidencia que los hemocitos primarias, infectado ya sea en vivo o ex vivo, son una plataforma conveniente para microbiana estudios de infección de los patógenos y análisis posteriores aplicables como la microscopía, transcriptómica y proteómica.

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Protocol

1. infección ex vivo

  1. Y aparatos
    1. Bajo condiciones estériles, preparar fresco Drosophila Hemocyte aislamiento medio (DHIM) que contiene de 75% Schneider Drosophila medio 25% suero bovino Fetal (FBS) y filtro de esterilización lo.
    2. Capa de 2-3 pedazos de la película de parafina 10 cm x 10 cm bajo un estereomicroscopio.
    3. Preparar el tubo capilar de vidrio. Ajuste el tirador capilar a 55% del máximo. Tire el tubo capilar a un punto agudo de aproximadamente 10 μm.
    4. Relleno capilar con aceite mineral.
    5. Ensamble tubo capilar lleno en el nanoinjector (figura 1A) y abra punta fundida tubo capilar interrumpiendo la punta con pinzas (figura 1B). El diámetro externo de la punta debe ser de 100 μm para la fácil absorción de los hemocitos.
    6. Extraer tanto petróleo como sea posible de la extremidad del tubo capilar, luego llene con DHIM. Para la fácil visualización de la frontera para arriba-tomado de la hemolinfa y el aceite, incluyen una burbuja de aire entre el aceite y DHIM (figura 1B').
  2. Extracción de la hemolinfa
    1. Escoger 3rd instar larvas de Drosophila del interior pared de comida los frascos suavemente con unas pinzas y colocarlos en un colador 100 de μm (figura 1C). 3 larvas de estadio de lard se encuentran 3-6 días siguientes ponedora fértil de una hembra adulta.
      Nota: Estos experimentos utilizan el genotipo, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, puesto que los hemocitos de estos animales expresan mayor proteína verde fluorescente (EGFP) para ayudar en la identificación de las células por microscopía.
    2. Vierta 5 mL de agua estéril sobre larvas y agitar el colador durante 5 s. Coloque el colador sobre paño de tarea eliminar el exceso de agua (figura 1C').
    3. Transferencia de las larvas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Anestesiar con CO2 gas para 5 s (figura 1D).
    4. Coloque las larvas en la película de parafina bajo el estereomicroscopio, con el lado dorsal hacia arriba (figura 2A).
    5. Lugar el vidrio capilar ligeramente sobre el cuerpo posterior larvas para mantener en su lugar y alterar la cutícula posterior abre con unas pinzas de punta finas (figura 2B).
    6. Permita que la hemolinfa fluir en la película de parafina (figura 2C).
    7. Hacer una piscina de hemolinfa incluyendo hemocitos de larvas de 20-50 en un momento en la película de parafina.
    8. Tienen hemolinfa combinado con el vidrio capilar en el nanoinjector (figura 2D).
      Nota: Debe haber aproximadamente 10-20 μl de hemolinfa.
    9. Expulsar la hemolinfa en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL conteniendo 500 μl de DHIM (figura 2E).
    10. Repita los pasos 1.2.4) - 1.2.9) para cada lote de larvas.
  3. Contar el número de hemocitos.
    1. Pipeta de 5 μl de solución de azul de tripano 0.4% en un tubo de microcentrífuga de 0.6 mL para teñir las células muertas. Suavemente mezcle el DHIM y hemocitos en el tubo de 1,5 mL con una pipeta y transferir 5 μl de DHIM incluyendo hemocitos en el tubo de microcentrífuga de 0.6 mL y mezclar suavemente.
    2. Pipetear 10 μl de células a partir de la mezcla 1:1 Trypan azul: hemocyte en el hemocitómetro.
    3. Contar el número de hemocitos vivo que no son manchó con Trypan azul en cada uno de los campos 4 esquina de la hemocytomter y calcular la concentración de los hemocitos por mililitro con la fórmula:
      Equation 1
      donde X es la concentración de hemocitos vivo por mililitro; a, b, c y d se contó el número de células vivas (según lo determinado por la exclusión del azul tripán) en cada 4 de los campos en el hemocitómetro. División por 2 el número total de células contadas es debido a la dilución de 1:1 de las células con azul tripán. Células teñidas con Trypan azul se consideran muertas.
  4. Ex vivo Infecciones
    1. Determinar el número de pozos a ser sembradas con las células basadas en puntos de tiempo y biológico Replica para cada experimento. 5.0 × 104 hemocitos son deseables para la purificación de RNA y proteínas después de la infección.
    2. Calcular el volumen de acción del patógeno a diluirse con DHIM para infección usando la siguiente fórmula:
      Equation 2
      Cuando multiplicidad de infección (MOI) es el número de virus o bacterias deseado por la célula.
      Nota: MOI utilizado depende de la experiencia individual y ensayos realizados. Aquí, 10 equivalentes de genoma (GE) / células de C. burnetii, 10 CFU/células de Listeriao 1 TCID50/cell de IIV6 fue utilizado.
    3. Preparar 500 μl de medio patógeno para cada pocillo de una placa de 24 pocillos añadiendo el volumen adecuado de DHIM al volumen viral o bacteriano en un tubo.
    4. Lugar un 12 mm redondo cubierta de vidrio (no. 1 de espesor) en un pozo de una placa de 24 pocillos.
    5. Dividir el DHIM incluyendo los hemocitos en pocillos de una placa de 24 pocillos.
    6. Añadir 500 μl de medio de patógeno a hemocitos en un pozo.
    7. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 5 minutos.
    8. Incubar la placa por 1 h a 28 ° C. Cada 15 minutos, incline suavemente la placa de atrás al frente, luego de izquierda a derecha para 5 s a mano.
    9. Después de la 1 h de paso de la invasión/accesorio 1.4.8), suavemente pipeta de medio patógeno y lavado los hemocitos con DHIM fresco y rellenarlo con 500 μl de DHIM fresco.
    10. Incubar los hemocitos infectadas durante el tiempo deseado. En estos experimentos, C. burnetii- o hemocitos IIV6 infectados se incuban durante 24 h y la Listeria-hemocitos infectados se incuban durante 1, 2 o 4 h.

2. infección in vivo

  1. Infección
    1. Caliente la placa de agar de Drosophila fruta zumo a temperatura ambiente durante 15 minutos las placas se hacen como se ha descrito20.
      1. Añadir 30 g de agar a 700 mL de agua y autoclave por 40 minutos.
      2. Disolver 0,5 g de metilparabeno en 10 mL de etanol absoluto.
      3. Añadir la solución de metil parabeno a 300 mL de jugo concentrado.
      4. Rápidamente mezclar el concentrado de jugo en la solución de agar esterilizado y añada 5 mL en 10 × 35 mm placas de Petri.
      5. Después de que las placas se han enfriado durante 15 min, almacenarlos a 4 ° C.
    2. Preparar 3rd instar larvas siguiendo pasos 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Coloque la pasta de levadura sobre una placa de agar. Hacer un corte fino en la placa de agar donde las larvas pueden migrar a evitar que se sequen (figura 3A). Montar una aguja de punta de tungsteno de 0,001 mm sosteniendo pinzas usando la película de parafina (figura 3B, C).
    4. Pipetee 50 μl de alto-título mCherry expresando -C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL) sobre la parafina de la película bajo el microscopio estéreo y coloque las larvas en la piscina de bacterias.
    5. Coloque las larvas en la piscina de bacterias. Las larvas del pinchazo con una aguja de tungsteno (figura 3D). La transferencia de las larvas en una placa de agar (figura 3E).
    6. Transfiera el medio restante del patógeno sobre la placa de agar y sellar la placa con la película de parafina.
    7. Mantenga las larvas en la placa en el aire húmedo hasta que la post-infección tiempo deseado (figura 3F). En este experimento, C. burnetii-larvas infectadas están en la placa de 24 h.
  2. Extracción de la hemolinfa y galjanoplastia de hemocitos
    1. Preparar el medio y el equipo siguiente paso 1.1).
    2. Lugar un 12 mm redondo cubierta de vidrio (no. 1 de espesor) en un pozo de una placa de 24 pocillos. Pipetear 500 μl del DHIM en el pozo.
    3. Extraer la hemolinfa de las larvas infectadas siguiendo pasos 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Expulsar la hemolinfa en el pozo siguiente paso 2.2.2).
    5. Repetición de 2.2.3) y 2.2.4) para varios lotes de larvas.
    6. Centrifugar la placa a 1.000 x g durante 5 minutos.

3. visualización

  1. Fijación y tinción
    1. Después de permitir que los hemocitos a posarse sobre la cubierta redonda de vidrio en el pozo, retire suavemente el medio de cada pozo.
    2. Suavemente, añadir 200 μL de paraformaldehído al 4% (PFA) en cada pocillo de hemocitos colocados. Incubar los hemocitos por 20 min a temperatura ambiente.
    3. Quitar el 4% PFA y suavemente agregar 200 μL de PBS con un 0.1% Tritón X-100 y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) a cada pocillo. Incubar los hemocitos durante 10 min a temperatura ambiente.
    4. Retirar el PBS y suavemente agregar 200 μL de 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a cada pocillo. Incubar los hemocitos durante 10 min en la oscuridad a temperatura ambiente.
    5. Retirar la solución DAPI y añadir suavemente el PBS a cada pocillo. Incubar los hemocitos por 5 min a temperatura ambiente.
    6. 10 μl de medio de montaje antifade la gota en un portaobjetos de vidrio.
    7. Después de retirar el PBS de cada bien, quitar el cristal de la cubierta de la placa de 24 pocillos con unas pinzas de punta fina. Coloque suavemente el vidrio de cubierta en el medio de montaje antifade en la diapositiva de cristal, con los hemocitos hacia abajo.
    8. Permita que el portaobjetos se seque colocándolo en la noche oscura.
  2. Proyección de imagen confocal
    1. Configuración del microscopio confocal para tres imágenes de color de DAPI, EGFP y mCherry. Utilice la siguiente configuración: excitación de DAPI (ex) 405 nm, emisión (em) 415-480 nm. EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Coloque la muestra en el microscopio y el enfoque en la muestra usando un 63 X / 1.4 objetivo de la apertura numérica (NA). Busque hemocitos deseadas en el campo de visión para la proyección de imagen.
    3. Ajustar ganancias poder y detector de láser para lograr la exposición correcta de la muestra. Revise varios z-planos para garantizar que el nivel de exposición es apropiado para el grosor de la muestra entera.
    4. Encontrar la posición superior e inferior en el eje z de un hemocyte todo. Establecer estas posiciones como las posiciones inicial y final para seccionamiento de z.
    5. Sólo utilice análisis zoom a la imagen el área que contiene el hemocyte. A menudo se utilizan factores de zoom de 3 X.
    6. Recoge la serie de imagen en resolución adecuada como 1024 x 1024 píxeles en el plano x-y y 0,3 μm espaciado en la dimensión z.
  3. Reconstrucción de modelos 3D
    Nota: El software de código abierto existe que realiza muchas de las funciones descritas para la reconstrucción de modelos 3D.
    1. Importar el archivo de la serie de imagen seccionada en z en el software asociado con el microscopio confocal para la reconstrucción de modelos 3D.
    2. Seleccione una celda que muestra la localización de núcleos teñidos con DAPI y mCherry expresando C. burnetii en un EGFP expresar hemocyte. Cultivo de la serie de imagen que contiene la célula.
    3. Seleccione la opción Visor 3D que reconstruye el modelo 3D usando algoritmo previamente empaquetado del software. Seleccione el tipo deseado de representación 3D mezcla, superficie y opciones mixtas. En este método, hemocitos, núcleos y C. burnetii se muestran utilizando modelos de superficie.
    4. Observar la célula 3D reconstruida desde varias posiciones de visualización manteniendo el botón del ratón y arrastrando el cursor por la pantalla. Ajustar la orientación de la célula y posición de la fuente de luz modelada para optimizar la imagen. Existen otras opciones de opacidad, mínimo y máximo umbral, Specular, Ambient, Shineness y Gamma para optimizar la imagen.
    5. Tomar secciones transversales a través del modelo usando comandos recorte y seccionamiento para visualizar el contenido interior de la hemocyte.

4. aplicación para el análisis del gene o proteína

  1. Después de la infección con IIV6 y Listeria, lyse las células para posterior qRT-PCR o análisis de Western blot como describieron anteriormente21 y siguiente las instrucciones.
    Nota: Consulte la Tabla de materiales para los cebadores para qRT-PCR y anticuerpos por Western blot.
  2. Analizar los productos PCR por electroforesis en gel de agarosa, como se describió anteriormente22, para asegurar la longitud adecuada del producto amplificado.

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Representative Results

Para cobrar altura hemocitos para infección ex vivo de 3 × 106 hemocitos se obtuvieron de 200 larvas de Drosophila 3rd estadio. Para el desarrollo de nuestro método, se trató de un número de técnicas diferentes. Disección larvas individual llevaría hasta 1,5 h y un promedio de ~ 8000 células fueron obtenidos usando este método18, la mayoría de los cuales no estaban viva al final de la colección. A continuación, intentó extraer hemolinfa, que contenía los hemocitos, de 20 larvas en un tiempo usando un tubo capilar de vidrio19, pero el capilar se convirtió obstruido con cutícula material y la hemolinfa no podía tomarse eficientemente por el vidrio tubo capilar. Finalmente, mecánicamente interrumpe la cutícula de 20-50 larvas por lote con pinzas finas12y había hecho una piscina de hemolinfa de fácil absorción. Esto permite fácil colección de una gran cantidad de hemocitos de un gran número de larvas (cuadro 1).

Para indicar que los hemocitos extraídos eran vivo y adecuado para la infección, se realizó un análisis de exclusión azul de tripano para calcular el porcentaje de hemocitos vivo extraído mediante el método presentado aquí (figura 6A). Además, comparamos nuestro método para la extracción de hemocyte con un método previamente publicado donde el objetivo era desarrollar un método de interrupción mecánica para aislar y diferenciar entre circulación y residente de hemocitos de individuo Drosophila larva23. Sobre la comparación entre los dos métodos de aislamientos experimentales independiente 10, observamos que la viabilidad celular fue ligeramente mayor, utilizando el método presentado aquí (figura 6A); sin embargo, el método de Petraki, et al. cedió cerca de dos veces tantos hemocitos de cada 10 larvas disecadas (figura 6B). Una razón para el aumento del número de hemocitos del Petraki et al. método es que este método recoge residente hemocitos (sésiles), así como de hemocitos circulantes. Para confirmar que las células extraídas con el método presentado aquí eran en realidad hemocitos, utilizamos una línea de mosca que contienen transgenes para la promotora hemolectin (Hml) conducción GAL4 en hemocitos de circulación que une a la secuencia ascendente activador (UAS) a activar mayor proteína verde fluorescente (EGFP) transcripción y expresión en los hemocitos. Hemocitos de hml-GAL4 > UAS-EGFP se extrajeron las larvas en cámaras cubreobjetos portaobjetos, fijo, permeabilized y teñida con DAPI como describió anteriormente21. La figura 7 muestra que la mayoría de las células positivas DAPI también es EGFP-positivo. Cuantificación de la expresión conjunta se realizó partir de varias imágenes, de que se calculó que 86±9 el % de células aisladas fueron hemocitos.

El protocolo en innovadores modelos en 3D de la invasión del patógeno en hemocitos de Drosophila extraído de 3 larvas de estadio de lard después de la infección ex vivo o in vivo de C. burnetii . Hemos sido capaces de infección por C. burnetii de la imagen ya que las bacterias expresan mCherry. Después de hemocitos infectados fueron fijos y manchados, ellos fueron reflejadas para DAPI, EGFP y mCherry usando microscopia confocal. Señal de las tasas de infección hemocyte, según lo determinado por el porcentaje de células de EGFP-positivo que exhiben también mCherry, para infecciones tanto ex vivo como en vivo C. burnetii era casi 100%. Esto se esperaba puesto que una MOI de 10 GE/celular fue utilizado para la infección ex vivo , que debe resultar en infección del 100% de las células24. En cuanto a las infecciones en vivo , ya que las larvas se colocan en una gota de alto título de mCherry expresando -C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL), el número de bacterias es aproximadamente 10,000-fold mayor que el número de hemocitos por larva. Por lo tanto, se espera una tasa de infección del 100% de las infecciones en vivo .

A continuación, Z-secciones fueron recogidas a través de la hemocyte para visualizar toda la célula en 3D y para confirmar la presencia de C. burnetii en el interior de la célula. La figura 4 muestra secciones transparentes de un hemocyte (en verde) con C. burnetii (en rojo) en el interior de la célula. Las imágenes también fueron reconstruidas en un modelo 3D (figura 5) que representan las superficies de la hemocyte y C. burnetii, otra vez mostrando C. burnetii en el interior de las sección hemocitos. Curiosamente, en vivo-hemocitos infectadas exhibieron mayor extensiones citoplásmicas y eran más planas en la naturaleza, mientras que ex vivo-hemocitos infectados fueron más esférico (figura 5). Esto podría indicar una mayor población de lamellocytes en el en vivo-infectados población y plasmatocitos en vivo ex población7. Mientras que la diferenciación lamellocyte es generalmente inducida durante la avispa parásita infección25, hiriendo de las larvas de Drosophila es también suficiente para inducir la diferenciación de lamellocyte26. Finalmente, mientras no se utiliza en los experimentos aquí presentados, existen formas expresando GFP de Listeria27 y IIV628 que podría utilizarse para generar modelos 3D de infección hemocyte. En cambio, Listeria- y hemocitos IIV6-infectados fueron utilizados para Western blotting y qRT-PCR experimentos.

El método presentado aquí, las infecciones se realizan ex vivo y en vivo para la proyección de imagen. Además, análisis de mRNA y proteína patógeno había seguido infecciones ex vivo . Específicamente, hemocitos extraídos fueron infectados con IIV6 y se aplicaron al análisis de qRT-PCR. Mostraron niveles significativamente más altos de IIV6-193R, un gen viral que codifica para un supuesto inhibidor de apoptosis29, entre las células infectadas de mock y IIV6 (figura 8A). Electroforesis de los productos amplificados confirman la presencia de una banda para el producto del gene IIV6-193R en la muestra infectada, pero no el mock infectado muestra (figura 8B). Bandas amplificadas para el control endógeno del Instituto fueron encontradas en todas las muestras, y IIV6 la infección en células S2 se realizaron como control positivo. Puesto que las infecciones IIV6 se realizaron a una MOI de 1 TCID50/cell, aproximadamente el 50% de las células debían ser infectados, basado en la distribución de Poisson24.

Proteína total de mofa o Listeria -infectados hemocitos fue recogida en 1, 2 y la post-infección 4 h y la concentración de proteína se determinó por análisis de Bicinchoninic ácido (BCA). se esperaba que el 100% de las células ser infectadas ex vivo , ya que el Ministerio del interior fue 10 CFU/celular24. Western Blot confirma la presencia de Listeria-derivan productos proteicos en los hemocitos infectados, con los altos niveles alcanzados por la infección después de 4 h (figura 9). Inóculo de Listeria se utiliza como control positivo para la detección de Listeria-bandas específicas. La presencia de la actina aparece en las muestras hemocyte para confirmar los niveles de proteína del cargamento. Tomados en conjunto, estos resultados indican que los hemocitos extraídos mediante el método presentado aquí eran convenientes para ambos experimentos de infección viral y bacteriana.

Figure 1
Figura 1 : Esquema de equipos y materiales utilizados para la extracción de hemocyte. Equipo primero fue preparado antes de la disección. A) el capilar de vidrio tirado fue insertado en el nanoinjector después de ser rellenada con aceite mineral. B) la punta fundida del vaso capilar se rompió con pinzas para crear 100 μm de diámetro exterior. B) DHIM fue tomado por el capilar para evitar la contaminación de la célula y las burbujas de aire fueron introducidas para establecer una distinción clara entre el aceite y DHIM. C) larvas de frascos de alimentos y los coloca en un colador de la célula. C') las larvas se lavan en agua estéril y se extrae el agua con una toallita de la tarea, D) las larvas se transfirió a un tubo de microcentrífuga y anestesiadas con CO2 gas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Gráfico de línea de tiempo y flujo para la extracción de hemocitos. A) las larvas se colocan en su lado dorsal antes de abrir la cutícula. B) la cutícula se interrumpe con pinzas de punta finas y la aguja capilar. C) la hemolinfa es bled en la película de parafina. D) piscinas de hemolinfa de las larvas de 20-50 se toman con el capilar de vidrio y nanoinjector. E) la hemolinfa y hemocitos se transfieren a un tubo de microcentrífuga conteniendo 500 μl DHIM ser contada con un hemocitómetro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: en vivo infección. Una) fruta Drosophila las placas de agar de jugo y pasta de levadura se utiliza para la incubación de larvas en vivo infectado. Los cortes se realizan en la placa de agar para facilitar la longevidad de larvas (flechas grises). B) una aguja de punta de tungsteno de 0.001 m m se une al fórceps usando la película de parafina. C) la punta de 0,001 mm tungsteno punta aguja. D) la larva se pinchó con la aguja de tungsteno en la piscina del patógeno en la película de parafina bajo microscopio estéreo. E) las larvas erguidas se colocan en la placa de agar. F) la placa es sellada con la película de parafina y mantenerse sobre toallas de papel húmedo en el envase hasta el momento adecuado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Cortes transversales de la invasión del patógeno en los hemocitos. Secciones extraídas de exploración confocal 3D de hemocitos de infectados por el patógeno. A, B) las secciones xy muestra C. burnetii (en rojo marcado con las puntas de flecha blancas) en el interior de la hemocyte. Las puntas de flecha grises muestran los núcleos de hemocitos. A' a ", B') vistas incluyendo yz y xz sección imágenes muestran la invasión de C. burnetii en los hemocitos de 2 puntos de visualización adicional. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 : Modelos 3D de la invasión del patógeno en los hemocitos. Modelos 3D reconstruidos de invasión de C. burnetii en los hemocitos se generan después de la infección ex vivo e in vivo . Modelo puede girarse libremente usando el software; Aquí se muestran 6 miradores con hemocyte en verde, C. burnetii en rojo (flecha blanca) y el núcleo en azul (flecha gris). También se muestran las imágenes de corte transversal que muestra el interior de las células invadidas por el patógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : El porcentaje y la población de hemocitos vivo. Extrajeron los hemocitos de grupos de larvas de estadio 3 10rd utilizando el método de Petraki et al y el método presentado aquí. A) el porcentaje de los hemocitos vivo se calculó para cada técnica por análisis de exclusión azul de tripano. B) la población total de hemocitos se comparó entre las dos técnicas. Los gráficos de barras representan la media ± desviación estándar de N = 10 repeticiones biológicas por método de extracción y ensayo de tipo. Se indican los valores de P de prueba T asumiendo desigual la varianza del estudiante dos colas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7 : Imágenes de hemocitos extraídos usando el controlador hemolectin. Extrajeron los hemocitos de 80 larvas de w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH2. El promotor de Hml unidades GAL4 en circulación hemocitos, que vincula la UAS para activar la expresión y la transcripción de EGFP. Los hemocitos eran fijas y teñidas con DAPI como se describió anteriormente20. Hemocitos son montados en cámaras cubreobjetos y reflejadas por contrato de interferencia diferencial (DIC) y microscopía de fluorescencia. El canal azul se muestra el núcleo teñido con DAPI y el canal verde los hemocitos que expresan EGFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 8
Figura 8 : electroforesis en gel y qRT-PCR. La expresión del gen IIV6-193R fue observada por qRT-PCR sólo en los hemocitos de infectados por el IIV6. A) expresión del gen 193R fue normalizado para el control interno, el Instituto y se presenta como una relación. El número de ciclo de los hemocitos mock infectados fue fijado arbitrariamente a un número de ciclo máxima de 40 para el análisis desde 193R no se detectó en estas muestras. Datos representan la media ± desviación estándar de N = 3 réplicas biológicas por grupo. El valor de P indica una dos colas de-prueba de T Student asumiendo varianza desigual. B) se muestran los productos qRT-PCR por electroforesis en gel de agarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9 : Mancha blanca /negra occidental análisis. La expresión de antígenos de Listeria y actina en mofa y Listeria-hemocitos infectados de 3rd instar Drosophila larvas en 1, la 2 y la post-infección 4 h (p.i.) se determinan por borrar occidental. Las concentraciones de proteínas totales se determinaron por el análisis de (BCA) ácido Bicinchoninic para normalizar la cantidad total de proteína en cada carril del gel. Inóculo utilizado para infectar a los hemocitos se utilizó como muestra control positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Método Número promedio de larvas de
para la extracción de hemocyte
Promedio del número de hemocitos total
hemolinfa
extracción capilar
(este método)
192.44 (SD: 86.05) 4.56 x 105 células (SD: 5.83 x 105)
(Rango: 70-390, N = 25 ensayos) (Rango: 1.20 x 105 - 2.95 x 106 células)
individual
disección de las larvas
26.67 (SD: 11.55) 8.33 x 103 células (SD: 6.66 x 103)
(Rango: 20-40, N = 10 ensayos) (Rango: 4.00 x 103 - 1,60 x 104 células)
larval
extracción capilar *
N / A * N / A *
* hemocitos no pudieron ser extraídos utilizando este método debido a la obstrucción de la aguja capilar

Tabla 1: número de disecado larvas y extrajeron los hemocitos usando técnicas diferentes. El número promedio de larvas disecadas y hemocitos extraídos fueron comparado entre el método y otros métodos. Nuestro método dio lugar a la colección de mayor número de larvas y hemocitos. El método de extracción capilar larvas también se ha intentado, pero hemocitos no pudieron ser extraídos debido a la obstrucción de la punta del capilar.

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Discussion

Para entender mejor cómo se infectan las células del huésped, es importante aclarar la localización del patógeno en las células, especialmente cuando experimenta previamente patógeno y células tipo combinaciones4. Mientras que el estudio de la cascada de la respuesta celular después de la infección puede indicar invasión patógeno productiva, la combinación de datos de respuesta de imagen y celular es esencial para demostrar la infección y la invasión de patógenos. Mientras reportes imágenes 2D de la invasión del patógeno en las células hospedadoras tienden a indicar la presencia de infección productiva, algunas preguntas pueden permanecer sobre el momento de la invasión del patógeno inicial en las células del huésped. Así, modelos 3D reconstruidos a partir de z-sección digitalización de imágenes 2D pueden abordar estos interrogantes e indicar Ubicación del patógeno en las células del huésped (figuras 4 y 5). Sin embargo, una limitación del uso de hemocitos primarios es su longevidad en cultivo celular. Un informe anterior indica que hemocyte supervivencia en medios de cultivo celular es sólo 8 h18, y en nuestro protocolo de infección, hemos sido capaces de realizar ensayos de hasta 24 h, pero no más. Por lo tanto, no fue posible observar altos niveles de replicación de C. burnetii o la formación de la vacuola parasitófora que no empiezan a formar hasta 2 días post-infección y no es observable grande hasta 4-6 días post infección30 .

Para muchos experimentos donde los ensayos de punto final utilizan proteína o RNA para análisis, gran número de células se requiere generalmente para producir suficiente material para ser interrogado. Por ejemplo, aquí, usamos análisis de punto final como el borrar occidental y qRT-PCR para sondear el grado de infección del patógeno en hemocitos primarios derivada 3rd instar larvas de Drosophila . Así, el método aquí había presentado se centra en la rápida disección larval y la colección de la hemolinfa contiene hemocitos vivo suficientes para la infección de patógenos ex vivo . Este método introduce el uso de un nanoinjector a la hemolinfa y hemocitos rápidamente. Colocación de los hemocitos en DHIM que contiene 25% FBS es importante para la supervivencia de hemocyte. Además, para el ex vivo las infecciones presentadas aquí, se necesita un gran número de hemocitos. Para evitar melanization31,32,33, disección y colección hemocyte deben ocurrir rápidamente. Mientras que existen otros métodos para extracción de hemocyte18,19,23, la duración de estos métodos para reunir un número suficientemente grande de hemocitos de infección ex vivo era demasiado largo. La punta fina de 100 μm es beneficiosa para la absorción de hemolinfa sin tomar otros órganos que pueden llevar a la obstrucción de la aguja capilar. El uso de un nanoinjector también puede ser automatizado cuando está conectado a una etapa de amalgamas dentales y pie pedal, permitiendo al usuario concentrarse en rápida disección de las larvas de Drosophila y disminuir el tiempo que los hemocitos son sin alrededor de larvas medios de cultivo de tejido o célula. Sin embargo, el uso de una pipeta también está disponible para tomar la hemolinfa para transferencia a DHIM. Además, nuestro método utiliza CO2 gas para anestesiar las larvas antes de la disección; el uso de un bloque de frío con la cubierta de la película de parafina es otro método viable23. Por último, la disección de las larvas en una gota de DHIM durante el lanzamiento de la hemolinfa puede reducir el número de hemocitos que se pierden se adhiera a la película de parafina pero aumentará el tiempo necesario para la absorción por la aguja capilar.

Una respuesta inmune común en Drosophila a la lesión, que ocurre durante la apertura y disección de la cutícula larval, es melanization31,32,33. Durante la extracción de hemocitos, observaríamos melanization de hemocitos en la DHIM tan pronto como 10 min después de la extracción. Como melanization es un proceso rápido, estas células quedarían excluidas de los experimentos de infección del patógeno. Además, el phenylthiourea de anticoagulante puede agregarse a DHIM para inhibir el sistema de activación de fenoloxidasa y melanization durante hiriendo a9. Sin embargo, como melanization y apoptosis inmunorespuestas naturales de Drosophila, sus niveles pueden ser cuantificada siguiente extracción de hemocyte y estimulación mediante los métodos descritos aquí.

Mientras que recuperación de grandes cantidades de proteína o RNA material es un requisito para técnicas como el inmunoblot y qRT-PCR, técnicas nuevas, como RNAseq requieren mucho menos entrado material, tan poco como 10 pg de RNA total alta calidad de una sola celda34. Experimentos como estos levantar experimentales preguntas interesantes y hemocitos de Drosophila son una población heterogénea que contiene las células de cristal, plasmatocitos y lamellocytes7, uno podría comenzar a interrogar el respuesta transcripcional de cada célula tipo35. Por ejemplo, Kurucz et al., han desarrollado anticuerpos que podrían ser utilizados para aislar los subconjuntos hemocyte de Drosophila que se podrían utilizar para transcripcional o proteómica perfiles siguiendo varios estímulos. Además, el reciente desarrollo de unicelular RNAseq tecnología podría definir transcriptomas de cada tipo de celular sin el uso de anticuerpos inicialmente separar cada célula tipo36,37,38, 39. por otra parte, uno podría preguntar preguntas sobre regulación génica en los subconjuntos hemocyte que puede ayudarnos a entender cómo humano linajes de células sanguíneas se originaron y evolucionaron a partir de organismos antiguos a través de la genómica comparativa esfuerzos. Hacer frente a problemas como estos requiere la combinación de una amplia gama de técnicas experimentales, y la técnica descrita aquí puede ser útil para tales esfuerzos cuando se requiere el aislamiento de un gran número de hemocitos de larvas de invertebrados.

Aquí, sugerimos que la combinación de 3D modelos con datos numéricos, bioquímicos para la confirmación de la infección. En el futuro estudios, podemos utilizar los métodos descritos aquí para observar las respuestas inmunes y el mecanismo de invasión del patógeno en las células del huésped por Co tinción de las proteínas del anfitrión para el análisis de microscopía.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgements

Estamos agradecidos con el Dr. Robert Heinzen para proporcionar reservas de expresar mCherry burnetii de la coxiella. Agradecemos a Dr. Luis Teixeira para proporcionar virus iridiscente invertebrados 6 y el centro de Stock de Bloomington para proporcionar a las poblaciones de la mosca. Este proyecto fue financiado en parte por NIH subsidio R00 AI106963 (A.G.G.) y Universidad Estatal de Washington.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

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