Utvinning av Hemocytes fra Drosophila melanogaster larver for mikrobielle infeksjoner og analyse

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne metoden viser hvordan du visualisere patogen invasjonen i insekt celler med tredimensjonale (3D) modeller. Hemocytes fra Drosophila Larvene var infisert med virus eller bakterielle patogener, ex vivo eller i vivo. Infiserte hemocytes ble deretter fast og farget for bildebehandling med AC confocal mikroskop og påfølgende 3D cellular rekonstruksjon.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Under patogene infeksjon av Drosophila melanogaster, spiller hemocytes en viktig rolle i immunforsvaret gjennom infeksjonen. Dermed er målet med denne protokollen å utvikle en metode for å visualisere den patogen invasjonen i en spesifikk immun kupé av fluer, nemlig hemocytes. Ved hjelp av metoden som presenteres her, opptil 3 × 10 kan6 live hemocytes fås fra 200 Drosophila 3rd skikkelsen larver i 30 min ex vivo infisert. Alternativt kan hemocytes være infisert i vivo gjennom injeksjon av 3rd skikkelsen Larvene etterfulgt av hemocyte utvinning til 24 timer etter infeksjon. Disse infiserte primære celler ble løst, beiset og fotografert bruker AC confocal mikroskopi. Deretter ble 3D representasjoner generert fra bilder å vise definitivt patogen invasjon. I tillegg høykvalitets RNA for qRT PCR kan oppnås for påvisning av patogen mRNA følgende infeksjon og tilstrekkelig protein kan trekkes fra disse cellene for Western blot analyse. Sammen presenterer vi en metode for bestemt avstemming av patogen invasjonen og bekreftelse av infeksjon med bakteriell og viral patogen typer og effektiv metode for hemocyte utvinning få nok live hemocytes fra Drosophila Larvene for ex vivo og i vivo infeksjon eksperimenter.

Introduction

Drosophila melanogaster er en veletablert modell organisme for studier av medfødt immunitet1. Under medfødte immunforsvaret spiller hemocytes en viktig rolle i svaret til patogen utfordring. Hemocytes er avgjørende for innkapsle parasitter, samt har en viktig funksjon i å bekjempe patogen gjennom phagocytic aksjon under sopp, viral og bakteriell infeksjon2,3.

For å best forstå vertens medfødte immunforsvaret til sykdomsfremkallende mikrober infeksjon, er det viktig å visualisere hvordan patogen invaderer vertsceller under infeksjon. Denne effekten bidrar til en forståelse av mekanismen for invasjon. Detaljer av patogen intracellulær lokalisering og cellulær respons, kan disse dataene gi hint om vert respons på infeksjon og mobilnettet organeller som mikrobe samhandler. Dermed kan 3D modell gjenoppbygging etter avbildning av mikroskopi være nyttig å finne nøyaktige plasseringen av patogener i verten cellene. I denne studien visualisert vi invasjonen av Coxiella burnetii (C. burnetii), den utløsende agenten for Q feber, en zoonotiske sykdommer som utgjør en alvorlig trussel for både mennesker og dyr helse, i primære Drosophila hemocytes. Nylig ble det vist at Drosophila er utsatt til biosikkerhet nivå 2 ni mil fase II (NMII) klone 4 stammen av C. burnetii og at denne belastningen er stand til å gjenskape i Drosophila4, som angir at Drosophila kan brukes som en modell organisme for å studere C. burnetii patogenesen.

Tidligere studier har brukt hemocytes for å undersøke vertens medfødte immunforsvaret. Hemocytes har vært brukt i morfologiske observasjoner5,6,7, morphometric analyse2,8, fagocytose analyse2,3, qRT PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, immunofluorescent analyse10,12, immunostai-13, immunoblotting3,10, 11 og immunohistochemistry9,14. Selv om Drosophila S2 celler er også tilgjengelig for forskjellige i vitro eksperimenter, endre immortalization og potensielle eksisterende virusinfeksjon sin atferd15,16. Bruk av primære celler i motsetning til en udødeliggjort cellen linje, for eksempel S2 celler, tillater for studier av medfødte immunforsvar i et system mer representative for hele organismen. I tillegg gir infeksjon av hemocytes i vivo, før ekstraksjon, cellene å samhandle med andre vert proteiner og vev, en fordel over utvinning av hemocytes før ex vivo infeksjon. En rekke ulike metoder har blitt benyttet for å få et tilstrekkelig antall hemocytes i løpet kort tid å holde hemocytes i live8,17,18,19.

I denne studien presenterer vi en metode for å trekke ut hemocytes fra Drosophila 3rd skikkelsen Larvene sykdomsfremkallende mikrober infisert med C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) eller virvelløse dyr iriserende virus 6 (IIV6). Vi beskriver metodene for både i vivo og ex vivo hemocyte infeksjoner. I vivo- og ex vivo-infiserte hemocytes var visualisert med AC confocal mikroskopi og brukes til å lage 3D-modeller av C. burnetii invasjon. I tillegg ved hjelp av utvinning, ex vivo-infiserte hemocytes ble brukt til genet og protein uttrykk analyser. Spesielt for å undersøke omfanget av infeksjon med IIV6 og Listeria, ble totalt RNA eller protein isolert fra celler for qRT PCR eller Western blot analyse. Samlet protokollen inneholder metoder for å raskt samle høyt antall hemocytes fra 3rd skikkelsen larver og bevis at primære hemocytes, infisert i vivo eller ex vivo, er en passende plattform for mikrobiell patogen infeksjon studier og gjeldende nedstrøms analyser som mikroskopi, transcriptomics og Proteomikk.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ex vivo infeksjon

  1. Medium og utstyr
    1. Under sterile forhold, forberede frisk Drosophila Hemocyte isolere Medium (DHIM) som inneholder 75% Schneider's Drosophila medium med 25% fosterets Bovine Serum (FBS) og filter steriliseres.
    2. Lag 2-3 stykker av 10 cm x 10 cm parafin film under en stereomicroscope.
    3. Forberede av glass kapillær. Angi kapillær avtrekker varmeren 55% av maksimal. Dra kapillarrør til en skarp spissen av ca 10 µm.
    4. Etterfylle av kapillær med mineralolje.
    5. Montere fylt kapillær røret på nanoinjector (figur 1A), og åpne smeltet kapillarrør tips ved å bryte tipset med tang (figur 1B). Den ytre diameteren tips skal 100 µm for enkelt opptaket av hemocytes.
    6. Løs ut så mye av oljen som mulig fra kapillarrør spissen, og fylle med DHIM. For enkel visualisering grensa opp-tatt hemolymph og olje, inkluderer en luftboble mellom olje og DHIM (figur 1B').
  2. Hemolymph utvinning
    1. Velg 3rd skikkelsen Drosophila larver fra innsiden av mat ampuller forsiktig ved hjelp av pinsett og plassere dem i en 100 µm sil (figur 1C). 3rd skikkelsen Larvene finnes 3-6 dager etter fruktbare egg legging av en voksen kvinne.
      Merk: Disse eksperimentene brukes av genotype, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2 P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, siden hemocytes fra disse dyrene express forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) for å hjelpe med identifikasjonen av cellene av mikroskopi.
    2. Hell 5 mL av sterilt vann over larver og riste silen 5 s. sted silen på oppgaven tørke fjerne overflødig vann (figur 1C").
    3. Overføre Larvene til en 1,5 mL microcentrifuge tube. Bedøve dem med CO2 gass 5 s (figur 1D).
    4. Plassere Larvene til parafin filmen i stereomicroscope, med rygg-siden vendt opp (figur 2A).
    5. Sett glasset kapillær lett på larver bakre kroppen å holde det på plass og avbryte bakre cuticle åpne med fin spiss forceps (figur 2B).
    6. Tillate hemolymph å strømme til parafin filmen (figur 2C).
    7. Gjøre en pool av hemolymph inkludert hemocytes fra 20-50 Larvene samtidig på parafin filmen.
    8. Ta opp grupperte hemolymph bruker glass kapillær på nanoinjector (figur 2D).
      Merk: Det bør være ca 10-20 µL av hemolymph.
    9. Løse ut hemolymph i en 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder 500 µL av DHIM (figur 2E).
    10. Gjenta trinn 1.2.4) - 1.2.9) for hver gruppe med larver.
  3. Antall hemocytes.
    1. Pipetter 5 µL 0,4% Trypan blå løsning i et 0,6 mL microcentrifuge rør stain døde celler. Forsiktig bland DHIM og hemocytes i 1,5 mL tube bruker en pipette, og overføre 5 µL av DHIM inkludert hemocytes til 0,6 mL microcentrifuge røret og bland forsiktig.
    2. Pipetter 10 µL av celler fra 1:1 Trypan blå: hemocyte blandingen i hemocytometer.
    3. Telle antall live hemocytes som ikke er er flekket med Trypan blå i hver av de 4 hjørnet av hemocytomter og Beregn konsentrasjonen hemocytes per milliliter bruker formelen:
      Equation 1
      der X er konsentrasjonen av live hemocytes per milliliter; a, b, c og d er antall levende celler (som bestemmes av Trypan blå utelukkelse) i hver 4 feltene telt i hemocytometer. Oppdelingen av 2 av totalt antall celler regnet er 1:1 fortynning av cellene med Trypan blå. Celler farget med Trypan blå anses som død.
  4. Ex vivo Infeksjoner
    1. Bestemme antall brønner å være plantet med cellene basert på timepoints og biologisk replikerer nødvendig for hvert eksperiment. 5.0 × 104 hemocytes er ønskelig for RNA og protein rensing etter infeksjon.
    2. Beregne volumet av patogen lager fortynnes med DHIM for infeksjon ved hjelp av følgende formel:
      Equation 2
      der mangfold av infeksjon (MOI) er hvor mange virus eller bakterier ønsket per celle.
      Merk: MOI brukes avhenger av de individuelle eksperiment og analyser utført. Her, 10 genomet ekvivalenter (GE) / celle C. burnetii, 10 CFU/cellen Listeriaeller 1 TCID50/cell av IIV6 ble brukt.
    3. Klargjør 500 µL av patogen medium for hver brønn av en 24-vel-plate ved å legge til riktig antall DHIM virus eller bakterielle volumet i et rør.
    4. Sted en 12 mm runde cover glass (nr. 1 tykkelse) i en godt av en 24-vel plate.
    5. Delt DHIM inkludert i hemocytes i brønner av en 24-vel plate.
    6. Legg til 500 µL av patogen medium hemocytes i en brønn.
    7. Sentrifuge platen på 1000 x g i 5 min.
    8. Inkuber platen 1t på 28 ° C. Hvert 15 min, forsiktig vippe platen fra tilbake til forsiden og venstre til høyre for 5 s hånd.
    9. Etter 1 h invasjon/vedlegg trinn 1.4.8), forsiktig Pipetter av patogen mediet vask hemocytes med ferske DHIM og fylle den med 500 µL av ferske DHIM.
    10. Inkuber de infiserte hemocytes for tiden. I disse eksperimentene, C. burnetii- eller IIV6-infiserte hemocytes er ruges i 24 timer og Listeria-infiserte hemocytes er ruges for 1, 2 eller 4 h.

2. i vivo infeksjon

  1. Infeksjon
    1. Varm Drosophila frukt juice agar platen ved romtemperatur for 15 min. plater er laget som tidligere beskrevet20.
      1. Legge til 30 g agar 700 mL vann og autoklav det for 40 min.
      2. Oppløse 0,5 g methyl paraben i 10 mL av absolutt etanol.
      3. Legge til methyl paraben løsningen 300 mL av frukt juice konsentrat.
      4. Raskt bland juice konsentrat til autoklaveres agar løsningen og dispensere 5 mL til 10 × 35 mm Petri retter.
      5. Når platene har avkjølt i 15 min, lagre dem på 4 ° C.
    2. Forberede 3rd skikkelsen Larvene følgende 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Plass gjær lim på en agar plate. Gjør en fin kutt i agar platen hvor larvene kan overføre for å unngå tørking (Figur 3A). Sett sammen en 0,001 mm pekte tungsten nål med fange tang bruke parafin filmen (Figur 3B, C).
    4. Pipetter 50 µL av høy-titer mCherry uttrykke -C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL) på parafinen film under stereo mikroskopet og plassere Larvene i bassenget av bakterier.
    5. Plass Larvene i bassenget av bakterier. Stikk Larvene med en tungsten nål (Figur 3D). Overføre Larvene til en agar plate (Figur 3E).
    6. Overføre gjenværende patogen mediet på agar platen og forsegle platen med parafin film.
    7. Holde Larvene på plate i fuktig luft før ønsket tid etter infeksjon (Figur 3F). I dette eksperimentet, C. burnetii-infiserte Larvene er på platen i 24 timer.
  2. Hemolymph utvinning og plating av hemocytes
    1. Forberede medium og utstyr etter trinn 1.1).
    2. Sted en 12 mm runde cover glass (nr. 1 tykkelse) i en godt av en 24-vel plate. Pipetter 500 µL av DHIM i brønnen.
    3. Pakke ut hemolymph fra infiserte Larvene følgende 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Løse ut hemolymph i tillegg følgende trinn 2.2.2).
    5. Gjenta 2.2.3) og 2.2.4) for flere kladder av larver.
    6. Sentrifuge platen på 1000 x g i 5 min.

3. visualisering

  1. Feste og flekker
    1. Etter at hemocytes å bosette seg på runde cover glass i brønnen, forsiktig fjerne mediet fra hver brønn.
    2. Forsiktig legge 200 µL av 4% paraformaldehyde (PFA) hver brønn av utlignet hemocytes. Inkuber hemocytes etter 20 min ved romtemperatur.
    3. Fjerne 4% PFA og forsiktig legge 200 µL av PBS 0,1 prosent Triton X-100 og 1% Bovine Serum Albumin (BSA) i hver brønn. Inkuber hemocytes i 10 min ved romtemperatur.
    4. Fjern PBS og forsiktig legge 200 µL av 1 × 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) i hver brønn. Inkuber hemocytes i 10 min i mørket ved romtemperatur.
    5. Fjern DAPI løsningen og forsiktig legge PBS i hver brønn. Inkuber hemocytes i 5 minutter ved romtemperatur.
    6. Slipp 10 µL av antifade montering mediet på en barometer microscope skyve.
    7. Etter fjerner PBS fra hver brønn, Fjern dekselet glass fra 24-vel plate med fine-spiss tang. Forsiktig plassere dekket glasset på antifade montering mediet på lysbildet glass med hemocytes vendt nedover.
    8. Tillate lysbildet tørke ved å plassere den i den mørke natten.
  2. AC confocal Imaging
    1. Konfigurere AC confocal mikroskopet ved tre farge avbildning av DAPI, EGFP og mCherry. Bruk følgende innstilling: DAPI eksitasjon (ex) 405 nm, utslipp (em) 415-480 nm; EGFP ex 488 nm, em 493-564 nm; mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Plasser prøven på mikroskopet og fokus på prøven ved hjelp av en 63 X / 1.4 numeriske blenderåpning (NA) mål. Finn ønsket hemocytes i synsfeltet for bildebehandling.
    3. Justere laser makt og detektor gevinster for å oppnå riktig eksponering av prøven. Sjekk flere z-fly for å sikre eksponering er passer for hele eksempel tykkelsen.
    4. Finne topp- og plasseringen på z-aksen til en hel hemocyte. Angi disse stillingene som start- og sluttposisjonen z-snitting.
    5. Bare bruke skanning zoom bildet området som inneholder hemocyte. Zoom faktorer av 3 X brukes ofte.
    6. Samle bildet serien på løsningen som 1024 x 1024 piksler x-y flyet og 0,3 µm avstand for z-dimensjonen.
  3. 3D-modellen gjenoppbygging
    Merk: Åpen kildekode finnes som utfører mange av funksjonene som er beskrevet nedenfor for 3D-modellen gjenoppbygging.
    1. Importere z-delt serie bildefilen til programvaren forbundet med AC confocal mikroskop for 3D-modellen gjenoppbygging.
    2. Merk en celle viser co lokalisering av kjerner med DAPI og mCherry uttrykke C. burnetii i en EGFP uttrykke hemocyte. Beskjære bildet serien inneholder bare én celle.
    3. Velg 3D Viewer som rekonstruerer 3D-modellen ved hjelp av programvaren ferdigpakkede algoritme. Velg ønsket 3D-representasjon blanding, overflate og blandet alternativer. I denne metoden, er hemocytes, kjerner og C. burnetii vist med overflaten modeller.
    4. Observere 3D rekonstruert cellen fra ulike visning stillinger ved holder museknappen og dra markøren rundt på skjermen. Justere celle retning og posisjon på modellerte lyskilden å optimalisere bildet. Det finnes andre alternativer for tetthet, Minimum og maksimum dørterskel, reflekterende, Ambient, Shineness og Gamma for å optimalisere bildet.
    5. Ta tverrsnitt gjennom modellen med klipping og snitting visualisere interiør innholdet i hemocyte.

4. program for genet og/eller protein analyse

  1. Etter infeksjon med IIV6 og Listeria, lyse celler for påfølgende qRT PCR eller Western blot analyse som tidligere beskrevet21 og følgende produsentens instruksjoner.
    Merk: Se Tabell for materiale for primere for qRT PCR og antistoffer for Western blot.
  2. Analysere PCR produkter av agarose gel geleelektroforese, som beskrevet tidligere22, for å sikre riktig lengde forsterket produktet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Å samle lever hemocytes for ex vivo infeksjon, opp til 3 × 10 ble6 hemocytes Hentet fra 200 Drosophila 3rd skikkelsen larver. For å utvikle vår metode, er en rekke ulike teknikker forsøkt. Individuelle larver disseksjon ville ta opptil 1,5 t, og gjennomsnittlig ~ 8000 celler ble hentet ved hjelp av denne metoden18, de fleste som ikke var i live på slutten av samlingen. Neste, vi prøvde å trekke ut hemolymph, som finnes i hemocytes, fra 20 larver på en gang med et glass kapillarrør19, men av kapillær ble tett med cuticle materiale og hemolymph kunne ikke være effektivt tatt opp av glass kapillær. Til slutt, vi mekanisk forstyrret styrke 20-50 Larvene per batch med fine tang12, og gjorde en pool av hemolymph for enkel opptak. Dette tillot lett samling av store mengder hemocytes fra et stort antall Larvene (tabell 1).

For å angi at de utpakkede hemocytes var i live og egnet for infeksjon, ble en Trypan blå utelukkelse analysen utført for å beregne prosentdelen av live hemocytes utdraget benytter metoden presenteres her (figur 6en). Dessuten, vi sammenlignet vår metode for hemocyte utvinning en tidligere publiserte metode der målet var å utvikle en mekanisk avbrudd metode for å isolere og skille mellom sirkulerende og bosatt hemocytes fra enkelte Drosophila Larven23. Ved sammenligning mellom de to metodene fra 10 uavhengig eksperimentelle isolasjoner observerte vi at cellen levedyktighet var litt større med metoden presenteres her (figur 6A); men metoden fra Petraki et al. gitt nær dobbelt så mange hemocytes fra hver 10 dissekert Larvene (figur 6B). En grunn til økt antall hemocytes fra Petraki et al. metoden er at denne metoden samler bosatt (fastsittende) hemocytes, samt sirkulerende hemocytes. For å bekrefte at cellene utdraget med metoden presenteres her faktisk var hemocytes, benyttet vi en flua linjen som inneholder effekter av transgener for hemolectin (Hml) selskapet driver GAL4 i sirkulerende hemocytes som binder oppstrøms aktivator sekvensen (UAS) til Aktiver forbedret grønne fluorescerende protein (EGFP) transkripsjon og uttrykk i hemocytes. Hemocytes fra hml-GAL4 > UAS-EGFP larver ble pakket ut til kamret coverglass lysbilder, fast, permeabilized og flekker med DAPI som tidligere beskrevet21. Figur 7 viser at de fleste DAPI-positive celler er også EGFP-positive. Kvantifisering av co uttrykket ble utført fra flere bilder, fra som vi beregnet at 86±9% av celler isolert var hemocytes.

Protokollen i nyskapende 3D-modeller av patogen invasjonen i Drosophila hemocytes Hentet fra 3rd skikkelsen Larvene etter ex vivo eller i vivo C. burnetii infeksjon. Vi kunne bilde C. burnetii infeksjon siden bakterier express mCherry. Når infiserte hemocytes var fast og farget, ble de fotografert for DAPI, EGFP og mCherry med AC confocal mikroskopi. Hemocyte infeksjon priser, som bestemmes av andelen EGFP-positive celler som også utstilt mCherry signalet, både ex vivo og vivo C. burnetii infeksjoner var nesten 100%. Dette var ventet siden en MOI 10 GE/cellen ble brukt for ex vivo infeksjon, som skal resultere i infeksjon på 100% av celler24. Angående i vivo infeksjoner, siden Larvene er plassert i en høy-titer dråpe mCherry uttrykke -C. burnetii (5.95 × 109 GE/mL), bakterier er omtrent 10,000-fold høyere enn antall hemocytes per larve. Derfor forventes en 100% infeksjon rate for infeksjoner i vivo .

Deretter Z-partiene samlet inn gjennom hemocyte å visualisere hele cellen i 3D, og for å bekrefte tilstedeværelse av C. burnetii i indre av cellen. Figur 4 viser gjennomsiktig tverrsnitt av en hemocyte (i grønt) med C. burnetii (i rødt) sett i indre av cellen. Bildene ble også ombygget til en 3D-modell (figur 5) representerer overflater av hemocyte og C. burnetii, igjen viser C. burnetii i indre av de kryss-delt hemocytes. Interessant, i vivo-infiserte hemocytes viste større cytoplasmatiske utvidelser og var flatere i naturen, mens ex vivo-infiserte hemocytes var mer sfærisk (figur 5). Dette kan indikere en større befolkning av lamellocytes i i vivo-infisert befolkningen og plasmatocytes i ex vivo befolkningen7. Mens lamellocyte differensiering er generelt indusert under parasittiske veps infeksjon25, er sårer Drosophila Larvene også tilstrekkelig til å indusere lamellocyte differensiering26. Til slutt, mens ikke benyttet i eksperimentene presenteres her, det er GFP-uttrykke former for Listeria27 og IIV628 som kan brukes til å generere 3D-modeller av hemocyte infeksjon. I stedet ble Listeria- og IIV6-infiserte hemocytes brukt for vestlige blotting og qRT PCR eksperimenter.

Med metoden presenteres her infeksjoner utføres både ex vivo og i vivo for bildebehandling. I tillegg fulgt patogen mRNA og protein analyse ex vivo infeksjoner. Spesielt utdraget hemocytes var infisert med IIV6 og ble brukt til qRT PCR analyse. Det viste signifikant høyere nivåer av IIV6-193R, en viral genet som koder for en antatte hemmer apoptose29, mellom uekte - og IIV6-infiserte celler (Figur 8A). Geleelektroforese av forsterket produktene bekreftet tilstedeværelse av en sammenbinding for IIV6-193R gene produktet i infiserte prøven, men ikke uekte-infiserte prøven (Figur 8B). Forsterket band for kontrollen RpII endogene ble funnet i alle prøvene, og IIV6 infeksjon i S2 celler ble utført som en positiv. Siden IIV6 infeksjoner ble utført på en MOI av 1 TCID50/cell, var ca 50% av cellene ventet å bli infisert, basert på Poisson-fordelingen24.

Totalt protein fra uekte - eller Listeria -infisert hemocytes var samlet på 1, 2 og 4 h etter infeksjon og protein konsentrasjon ble bestemt av Bicinchoninic syre (BCA) analysen. 100% av cellene var ventet å være infisert ex vivo siden MOI var 10 CFU/mobiltelefon24. Vestlige blotting bekrefter tilstedeværelsen av Listeria-avledet protein produkter i de infiserte hemocytes, med høye nivåer av 4 h etter infeksjon (figur 9). Listeria inoculum brukes som en positiv for påvisning av Listeria-spesifikke band. Tilstedeværelsen av utgangen vises i de hemocyte prøvene å bekrefte nivåer av proteinet lasting. Til sammen indikerer disse resultatene at hemocytes utdraget benytter metoden presenteres her var egnet for både viral og bakteriell infeksjon eksperimenter.

Figure 1
Figur 1 : Omrisset av utstyr og materialer for hemocyte utvinning. Utstyret var først forberedt før disseksjon. A) trakk glasset kapillær ble satt inn i nanoinjector, etter å rygg-fylte med mineralolje. B) smeltet spissen av glasset kapillært ble delt med tang til å opprette en 100 µm ytre diameter. B') DHIM ble tatt av av kapillær å unngå celle forurensning og luftbobler ble innført for å gjøre et klart skille mellom olje- og DHIM. C) Larvene er plukket fra mat ampuller og plassert i en celle sil. C ") Larvene er vasket i sterilt vann og vann er fjernet med en oppgave tørke, D) Larvene er overført til et microcentrifuge rør og anesthetized med CO2 gass. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Tidslinjen og flyt diagram for utvinning av hemocytes. A) Larvene plasseres på deres dorsal side før du åpner cuticle. B) cuticle avbrytes med fin spiss forceps og kapillær nålen. C) i hemolymph er bled på parafin film. D) bassenger av hemolymph fra 20-50 Larvene er tatt opp med glass kapillære og nanoinjector. E) hemolymph og hemocytes er overført til et microcentrifuge rør som inneholder 500 µL DHIM regnes med en hemocytometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: I vivo infeksjon. En) Drosophila frukt juice agar plater og gjær lim brukes for inkubasjonstiden for i vivo infisert larver. Kutt er laget i agar plate å lette Larvene levetid (grå piler). B) en 0,001 mm pekte tungsten nål er knyttet til tang bruke parafin filmen. C) spissen av 0,001 mm pekte tungsten nål. D) Larven er stukket med tungsten strikkes patogen bassenget på parafin film under stereo mikroskop. E) stukket Larvene plasseres på agar platen. F) platen er forseglet med parafin film og holdt på fuktig papirhåndklær i beholderen til riktig tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Tverrsnitt av patogen invasjonen i hemocytes. Deler utvunnet fra 3D AC confocal skanning av patogen-smittede hemocytes. A, B) xy-delene viser C. burnetii (i rødt merket med hvite pilspisser) i indre av hemocyte. Grå pilhodene viser kjerner i hemocytes. A', en ", B') visninger inkludert yz - og xz-delen bilder vises invasjonen av C. burnetii i hemocytes fra 2 ekstra utsiktspunkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : 3D-modeller av patogen invasjonen i hemocytes. Rekonstruerte 3D-modeller av C. burnetii invasjonen i hemocytes genereres etter ex vivo og i vivo . Modellen kan fritt roteres med programvaren; Her vises 6 viser steder med hemocyte i grønt, C. burnetii i rødt (hvit pilspisser) og kjernen i blått (grå pilspisser). Tverrsnitt bildene viser indre av patogen-invaderte celler vises også. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Prosentandel og befolkningen av levende hemocytes. Hemocytes ble Hentet fra grupper av 10 3rd skikkelsen Larvene med metoden av Petraki et al., og metoden som presenteres her. A) andelen live hemocytes ble beregnet for hver teknikk av Trypan blå utelukkelse analysen. B) den totale befolkningen i hemocytes ble sammenlignet mellom de to teknikkene. Søylediagrammer representerer standardavviket gjennomsnittlig ± fra N = 10 biologiske gjentak per metoden for utvinning og analysen. P-verdiene angis fra en tosidige Student T-test antar ulik varians. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7 : Bilder av utdraget hemocytes med hemolectin driveren. Hemocytes ble Hentet fra 80 larver av w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2 P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH2. Arrangøren for Hml driver GAL4 i sirkulerende hemocytes, som binder UAS å aktivere EGFP transkripsjon og uttrykk. Hemocytes var fast og farget med DAPI som beskrevet tidligere20. Hemocytes er montert på kamret coverslips og fotografert av differensial innblandingen kontrakt (DIC) og fluorescens mikroskopi. Den blå kanalen viser kjernen med DAPI og den grønne kanalen viser hemocytes uttrykke EGFP. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8 : qRT PCR og gel geleelektroforese. Uttrykk for IIV6-193R genet ble observert av qRT PCR bare i IIV6-smittede hemocytes. A) 193R genuttrykk var normalisert til intern kontroll, RpII, og presentert som et forhold. Syklus nummeret for de uekte-infiserte hemocytes ble vilkårlig satt til maksimal syklus flere 40 for analyse siden 193R ikke ble funnet i disse prøvene. Dataene representerer standardavviket gjennomsnittlig ± fra N = 3 biologiske gjentak per gruppe. P-verdien angir en tosidige Student T-test antar ulik varians. B) qRT PCR produktene vises etter agarose gel geleelektroforese. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9 : Western Blot analyse. Uttrykket av Listeria antigener og utgangen i uekte- og Listeria-infiserte hemocytes fra 3rd skikkelsen Drosophila larver på 1, 2 og 4 h etter infeksjon (pi) bestemmes av vestlige blotting. Totalt protein konsentrasjoner ble fastsatt av Bicinchoninic acid (BCA) analysen normalisere totale mengden protein i hver bane av gel. Inoculum brukes til å infisere hemocytes ble brukt som en positiv kontroll prøven. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Metoden Gjennomsnittlig antall larver
for hemocyte utvinning
Gjennomsnittlig antall totale hemocytes
hemolymph
kapillær utvinning
(denne metoden)
192.44 (SD: 86.05) 4.56 x 105 celler (SD: 5.83 x 105)
(Utvalg: 70-390, N = 25 forsøk) (Utvalg: 1.20 x 105 - 2,95 x 106 celler)
Personlige
Larvene disseksjon
26,67 (SD: 11.55) 8.33 x 103 celler (SD: 6.66 x 103)
(Utvalg: 20-40, N = 10 forsøk) (Utvalg: 4.00 x 103 - 1,60 x 104 celler)
larver
kapillær utvinning *
I/T * I/T *
* hemocytes kunne ikke hentes ved hjelp av denne metoden pga knekk kapillær nålen

Tabell 1: antall dissekert larver og pakket ut hemocytes ved hjelp av forskjellige teknikker. Gjennomsnittlig antall dissekert larver og utdraget hemocytes var forhold mellom metoden presenteres her og andre metoder. Vår metode resulterte i samling av høyere antall larver og hemocytes. Larver kapillær utvinning metoden forsøkte også, men hemocytes var pakkes pga knekk kapillær tips.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For bedre å forstå hvordan verten cellene blir smittet, er det viktig å avklare lokaliseringen av patogen i cellene, spesielt når eksperimentere på tidligere testet patogen og celle type kombinasjoner4. Mens studere cellulær respons kaskade etter infeksjon kan angi produktiv patogen invasjon, er kombinasjonen av tenkelig og cellulær respons viktig å demonstrere patogen invasjon og infeksjon. Mens rapporter som viser 2D-bilder av patogen invasjonen i verten cellene pleier å indikere produktiv infeksjon, kan noen spørsmål være om tidspunktet for første patogen invasjonen i verten cellene. Dermed kan 3D modeller rekonstruert fra z-delen skanning av 2D-bilder håndtere disse spørsmålene og angi patogen plassering i verten cellene (tall 4 og 5). En begrensning av bruk av primære hemocytes er imidlertid sin levetid i cellekultur. En tidligere rapport sier at hemocyte overlevelse i celle kultur medier er bare 8 h18, og i våre infeksjon protokollen, kunne vi utføre analyser opp til 24 h, men ikke lenger. Derfor var det ikke mulig å observere høye nivåer av C. burnetii replikering eller dannelsen av den parasitophorous vacuole som begynner ikke skjemaet før to dager etter smitte og er ikke oppfattes stor til 4-6 dager etter smitte30 .

For mange eksperimenter der analyser sluttpunktet benytte protein eller RNA for analyse, er store antall celler vanligvis nødvendig for å produsere nok materiale for avhør. For eksempel her, bruker vi endepunktet analyser som vestlige blotting og qRT PCR å undersøke omfanget av patogen infeksjon i primære hemocytes avledet fra 3rd skikkelsen Drosophila larver. Dermed presenteres metoden her fokuserer på rask larver disseksjon og samlingen av hemolymph som inneholder tilstrekkelig live hemocytes ex vivo patogen infisert. Denne metoden innebærer bruk av en nanoinjector å ta opp hemolymph og hemocytes raskt. Plassering av hemocytes i DHIM med 25% er FBS viktig for hemocyte overlevelse. I tillegg til ex vivo infeksjoner presenteres her, er et stort antall hemocytes nødvendig. For å unngå melanization31,32,33, må disseksjon og hemocyte samling skje raskt. Mens andre metoder for hemocyte utvinning finnes18,19,23, var varigheten av disse metodene til å samle et tilstrekkelig stort antall hemocytes for ex vivo infeksjon for langt. 100 µm fine tips er gunstig for opptaket av hemolymph uten å ta opp andre organer som kan føre til tilstopping av kapillær nålen. Bruk av en nanoinjector kan også være automatisert når det legges til en micromanipulator fase og fot pedal, tillater brukeren å fokusere på rask Disseksjon av Drosophila larvene og redusere tiden som hemocytes uten larver vev eller celle kultur medier. Likevel er bruk av en pipette også tilgjengelig for å ta opp hemolymph for overføring til DHIM. I tillegg bruker våre CO2 gass for å bedøve før disseksjon; Bruk av en kald blokk med parafin filmen dekker er en annen levedyktige metoden23. Til slutt, Disseksjon av larver i en dråpe DHIM under utgivelsen av hemolymph kan redusere antall hemocytes som er tapt stikker til parafin filmen men vil øke tiden som trengs for opptak av kapillær nålen.

En vanlig immunrespons i Drosophila å skade som oppstår under åpning og Disseksjon av larver cuticle, er melanization31,32,33. Under utvinning av hemocytes, ville vi observerer melanization av hemocytes i DHIM så tidlig som 10 min etter utvinning. Melanization er en rask prosess, ekskluderes disse cellene fra patogen infeksjon eksperimenter. I tillegg kan de anti-koagulere phenylthiourea legges til DHIM å hemme phenoloxidase-aktivere systemet og melanization under såret9. Likevel, som melanization og apoptose er medfødte immunreaksjoner av Drosophila, deres nivåer kan være kvantifisert følgende hemocyte utvinning og stimulering bruke metodene som er beskrevet her.

Utvinne store mengder protein eller RNA materiale er et krav for teknikker som Western blot og qRT PCR, krever nye teknikker, som RNAseq mye mindre input materiale, så lite som 10 pg av høy kvalitet totalt fra en enkeltcelle34. Eksperimenter som dette øke interessant eksperimentelle spørsmål, og siden Drosophila hemocytes er en heterogen befolkning med krystall celler, plasmatocytes og lamellocytes7, en kan begynner å avhøre de transcriptional svar hver celle type35. For eksempel Kurucz et al., utviklet antistoffer som kan brukes til å isolere Drosophila hemocyte delsettene som kan brukes til transcriptional eller proteomic profilering etter ulike stimuli. I tillegg kan den siste utviklingen av enkelt celle RNAseq teknologi definere transcriptomes for hver celle type uten bruk av antistoffer først skille hver celle type36,37,38, 39. Videre kan man spørre spørsmål angående genet regulering i hemocyte delsettene som kan hjelpe oss å forstå hvordan menneskelige blodlegemer overleveringslinjer stammer og utviklet seg fra gamle organismer gjennom komparativ genomikk arbeid. Takle slike problemer krever en kombinasjon av en rekke eksperimentelle teknikker, og teknikken beskrevet her kan være nyttig for slikt arbeid når isolering av et stort antall hemocytes fra virvelløse Larvene er nødvendig.

Her foreslår vi kombinasjonen av 3D-modeller med numerisk og biokjemiske data for bekreftelse av infeksjon. I fremtidige studier, kan vi bruke metodene som er beskrevet her for å observere immunreaksjoner og mekanismen av patogen invasjonen i verten cellene av co flekker vert proteiner for mikroskopi analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgements

Vi er takknemlige for Dr. Robert Heinzen for å gi bestander av mCherry-uttrykke Coxiella burnetii. Vi takker Dr. Luis Teixeira for å gi virvelløse iriserende virus 6 og Bloomington lager Center for å gi fly aksjer. Prosjektet ble finansiert delvis NIH grant R00 AI106963 (til A.G.G.) og Washington State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9, (10), 1003720 (2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9, (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85, (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7, (4), 34721 (2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68, (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10, (8), 0136593 (2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6, (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100, (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106, (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4, (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101, (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106, (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419, (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, (11), 173 (2007).
  20. Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11, (11), 0166088 (2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31, (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16, (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101, (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84, (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286, (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36, (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3, (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11, (3), 0150910 (2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11, (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33, (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205, (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143, (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167, (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358, (6360), 194-199 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics