Utvinning av Hemocytes från Drosophila melanogaster larver för mikrobiell infektion och analys

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denna metod visar hur att visualisera patogen invasion in i insekt celler med tredimensionella (3D) modeller. Hemocytes från Drosophila larver var infekterade med virus- eller bakterieinfektion patogener, antingen ex vivo eller in-vivo. Infekterade hemocytes var sedan fixeras och färgas för avbildning med en confocal mikroskopet och efterföljande 3D cellulära rekonstruktion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Hiroyasu, A., DeWitt, D. C., Goodman, A. G. Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis. J. Vis. Exp. (135), e57077, doi:10.3791/57077 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Under den patogena infektionen i Drosophila melanogaster, roll hemocytes en viktig i immunförsvaret i hela infektionen. Målet med detta protokoll är således att utveckla en metod för att visualisera den patogen invasionen i särskilda immun kupé av flugor, nämligen hemocytes. Metoden presenteras här, upp till 3 × 10 kan6 levande hemocytes erhållas från 200 Drosophila 3rd instar larver i 30 min för ex vivo infektion. Alternativt kan hemocytes vara smittade i vivo genom injektion av 3rd instar larver följt av hemocyte utvinning till 24 h efter infektion. Dessa infekterade primärceller fastställdes, målat och avbildas med konfokalmikroskopi. Sedan genererades 3D representationer från bilderna att slutgiltigt Visa patogen invasion. Dessutom hög kvalitet RNA för qRT-PCR kan erhållas för upptäckt av patogen mRNA följande infektion och tillräckligt protein kan extraheras från dessa celler för Western blot analys. Sammantaget presenterar vi en metod för bestämd försoning av patogen invasion och bekräftelse av smitta med bakteriella och virala patogener typer och en effektiv metod för extraktion av hemocyte för att erhålla tillräckligt levande hemocytes från Drosophila Larverna för ex vivo och in-vivo infektion experiment.

Introduction

Drosophila melanogaster är en väletablerad modellorganism för studien av medfödd immunitet1. Under medfödda immunsvaret roll hemocytes en viktig i att bemöta patogen utmaning. Hemocytes är kritiska för encapsulating parasiter, samt ha en viktig funktion i att bekämpa patogener genom fagocytreaktion under svamp, viral och bakteriell infektion2,3.

För att bäst förstå värdens medfödda immunsvaret mot patogena mikrobiella infektioner, är det viktigt att visualisera hur patogenen invaderar värdceller vid infektion. Denna visualisering bidrar till en förståelse av mekanismen för invasion. Tillsammans med Detaljer för patogen intracellulära lokalisering och cellulära svar, kan dessa uppgifter ge ledtrådar om den värd reaktion på infektion och cellulära organeller som mikrob interagerar. Således, 3D modell återuppbyggnad efter avbildning av mikroskopi kan vara bra att bestämma den exakta platsen för patogener i värdceller. I denna studie var visualiserat vi invasionen av Coxiella burnetii (C. burnetii), vilka smittämnen av Q-feber, en zoonotisk sjukdom som utgör ett allvarligt hot mot både människors och djurs hälsa, in i primära Drosophila hemocytes. Nyligen, det visades att Drosophila är mottagliga för biosäkerhet nivå 2 Nine Mile fas II (NMII) klona 4 stam av C. burnetii och att denna stam är kunna replikera i Drosophila4, som anger att Drosophila kan användas som modellorganism för att studera C. burnetii patogenes.

Tidigare studier har använt hemocytes för att undersöka värdens medfödda immunsvar. Hemocytes har använts för morfologiska iakttagelser5,6,7, morfometriska analys2,8, fagocytos analys2,3, qRT-PCR2 , 9, immunoprecipitation10,11, Immunofluorescerande analys10,12, immunfärgning13, immunoblotting3,10, 11 och immunohistokemi9,14. Även om Drosophila S2 celler är också tillgängliga för olika in vitro- experiment, ändra immortalization och potentiella redan existerande virusinfektion deras beteende15,16. Användning av primära celler i motsats till en förevigade cellinje, såsom S2 celler, tillåter för studien av medfödda immunförsvaret i ett system mer representativa för hela organismen. Dessutom kan infektionen av hemocytes i vivo, före extraktion, cellerna att interagera med andra värd proteiner och vävnad, en fördel över utvinning av hemocytes före ex vivo infektion. Ett antal olika metoder har använts för att erhålla ett tillräckligt antal hemocytes i en kort tidsperiod att hålla hemocytes vid liv8,17,18,19.

I denna studie presenterar vi en metod för att extrahera hemocytes från Drosophila 3rd instar larver för patogena mikrobiell infektion med C. burnetii, Listeria monocytogenes (Listeria) eller ryggradslösa djur skimrande virus 6 (IIV6). Vi beskriver metoderna för både i vivo och ex vivo hemocyte infektioner. In vivo- och ex vivo-infekterade hemocytes var visualiserat med konfokalmikroskopi och används för att skapa 3D-modeller av C. burnetii invasion. Dessutom använda protokollet utvinning, ex vivo-infekterade hemocytes användes för gen- och protein uttryck analyser. Specifikt, för att undersöka omfattningen av infektion med IIV6 och Listeria, isolerades totalt RNA eller proteiner från cellerna för qRT-PCR eller Western blot analys. Sammantaget protokollet ger metoder för att snabbt samla in kick numrerar av hemocytes från 3rd instar larver och bevis att primär hemocytes, infekterade antingen i vivo eller ex vivo, är en lämplig plattform för mikrobiell patogen infektion studier och tillämpliga nedströms analyser t.ex mikroskopi, transkriptomik, proteomik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ex vivo infektion

  1. Medium och utrustning
    1. Under sterila förhållanden och förbereda färska Drosophila Hemocyte isolera Medium (DHIM) som innehåller 75% Schneiders Drosophila medium med 25% fetalt bovint Serum (FBS) och filter sterilisera det.
    2. Lager 2-3 bitar av 10 x 10 cm paraffin filma under ett stereomikroskop.
    3. Förbereda glas kapillären. Ange kapillär avdragare värmaren till 55% av max. Dra kapillärröret till en skarp punkt ca 10 µm.
    4. Återfyllning kapillären med mineralolja.
    5. Montera fyllda kapillärrör på nanoinjector (figur 1A) och öppna smält kapillärrör tip genom att bryta bort spetsen med pincett (figur 1B). Den yttre diametern av spetsen bör vara 100 µm för lätt upptag av hemocytes.
    6. Mata ut så mycket olja som möjligt från kapillärrör spets, sedan fylla med DHIM. För enkel visualisering av gränsa av upp-tagit hemolymph och olja, inkluderar en luftbubbla mellan olja och DHIM (figur 1B').
  2. Hemolymph utvinning
    1. Plocka 3rd instar Drosophila larver från insidan vägg av mat injektionsflaskor försiktigt med pincett och placera dem i en 100 µm sil (figur 1C). 3rd instar larver finns 3-6 dagar efter bördiga ägg om av en vuxen hona.
      Obs: Dessa experiment använde den genotyp, w1118; P {w+ mC= Hml-GAL4.Δ} 2, P {w+ mC= UAS-2xEGFP} AH2, eftersom hemocytes från dessa djur express förbättrade grönt fluorescerande protein (andra) för att underlätta identifiering av cellerna av mikroskopi.
    2. Häll 5 mL sterilt vatten över larver och skaka silen för 5 s. plats silen på uppgift torka bort överflödigt vatten (figur 1C').
    3. Överföra larverna i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör. Söva dem med CO2 gas för 5 s (figur 1D).
    4. Placera larverna på paraffin filma under stereomikroskopet, med dorsal-vänd uppåt (figur 2A).
    5. Plats glaset kapillär lätt på larval bakre kroppen att hålla den på plats och störa bakre nagelbanden öppna med fina spetsiga pincetter (figur 2B).
    6. Låt hemolymph strömma in paraffin filma (figur 2C).
    7. Göra en pool av hemolymph inklusive hemocytes från 20-50 larver vid en tidpunkt med paraffin-filmen.
    8. Ta upp poolade hemolymph använda glaset kapillär på nanoinjector (figur 2D).
      Obs: Det bör finnas ca 10-20 µL av hemolymph.
    9. Mata ut hemolymph i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör innehållande 500 µL av DHIM (figur 2E).
    10. Upprepa steg 1.2.4) - 1.2.9) för varje parti av larver.
  3. Räkna antalet hemocytes.
    1. Pipettera 5 µL av 0,4% Trypan blå lösning i ett 0,6 mL mikrocentrifug rör att färga döda celler. Försiktigt blanda DHIM och hemocytes i 1,5 mL röret med pipett och överför 5 µL av DHIM inklusive hemocytes till 0,6 mL mikrocentrifug röret och blanda försiktigt.
    2. Pipettera 10 µL av celler från 1:1 Trypan blå: hemocyte blandningen i hemocytometer.
    3. Räkna antalet levande hemocytes som färgas inte med Trypan som är blå i vart och ett av fälten 4 hörn av hemocytomter och beräkna koncentrationen av hemocytes per milliliter med hjälp av formeln:
      Equation 1
      där X är koncentrationen av levande hemocytes per milliliter; a, b, c och d är antalet levande celler (som bestäms av Trypan blå uteslutande) i varje 4 fält räknas in i hemocytometer. Division med 2 av det totala antalet celler räknas beror på 1:1 utspädning av cellerna med Trypan blå. Celler som färgas med Trypan blå anses vara döda.
  4. Ex vivo Infektioner
    1. Bestämma antalet brunnar till dirigeras med celler baserat på tidpunkter och biologiska replikerar behövs för varje experiment. 5,0 × 104 hemocytes är önskvärda för RNA och protein rening efter infektion.
    2. Beräkna volymen av patogen lager spädas med DHIM för infektion med följande formel:
      Equation 2
      där Multiplicity av infektion (MOI) är antalet virus eller bakterier önskas per cell.
      Obs: MOI som används beror på individuella experiment och analyser utförs. Här, 10 genomet medel (GE) / cell C. burnetii, 10 CFU per cell i Listeriaeller 1 TCID50/cell av IIV6 användes.
    3. Förbereda 500 µL av patogen medium för varje brunn 24-well platta genom att lägga till den korrekta volymen av DHIM viral eller bakteriell volymen i ett rör.
    4. Plats en 12 mm runda luckan glas (nr 1 tjocklek) i en väl 24-bra platta.
    5. Dela upp de DHIM inklusive hemocytes i brunnar i en 24-bra platta.
    6. Tillsätt 500 µL av patogen medium till hemocytes i en brunn.
    7. Centrifugera plattan vid 1 000 x g i 5 min.
    8. Inkubera plattan för 1 h vid 28 ° C. Varje 15 min, försiktigt luta plattan från baksidan till framsidan och sedan vänster till höger för 5 s för hand.
    9. Efter 1 h av invasion/infästning steg 1.4.8), försiktigt Pipettera av patogen medium och tvätta hemocytes med färsk DHIM, och fylla den med 500 µL av färska DHIM.
    10. Inkubera de infekterade hemocytes i önskad tid. I dessa experiment, C. burnetii- eller IIV6-infekterade hemocytes inkuberas i 24 h och Listeria-smittade hemocytes inkuberas i 1, 2 eller 4 h.

2. in vivo -infektion

  1. Infektion
    1. Varm Drosophila frukt juice agarplattan i rumstemperatur i 15 min. plattorna görs som tidigare beskrivs20.
      1. Tillsätt 30 g agar till 700 mL vatten och autoklavera det för 40 min.
      2. Lös 0,5 g metyl paraben i 10 mL absolut etanol.
      3. Lägg till metyl paraben lösningen till 300 mL frukt juicekoncentrat.
      4. Blanda juicekoncentrat i Ånghärdad agar lösningen och fördela 5 mL i 10 × 35 mm petriskålar snabbt.
      5. När plattorna har svalnat i 15 min, lagra dem vid 4 ° C.
    2. Förbered 3rd instar larver följande steg 1.2.1) - 1.2.3).
    3. Placera den jäst pastan på en agarplatta. Göra ett fint snitt i agarplattan där larver kan migrera till undvika uttorkning (figur 3A). Montera en 0,001 mm spetsiga Volfram nål med hålla tången med paraffin film (figur 3B, C).
    4. Överför med pipett 50 μl av hög-titer mCherry uttrycker -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL) till paraffinet filma under stereomikroskopet och placera larverna i poolen av bakterier.
    5. Placera larverna i poolen av bakterier. Sticka larver med en Volfram nål (figur 3D). Överföra larver på en agarplatta (figur 3E).
    6. Överföra de återstående patogener mediet på agarplattan och försegla plattan med paraffin film.
    7. Hålla larverna på plattan i fuktig luft tills önskad tid efter infektionen (figur 3F). I detta experiment, C. burnetii-infekterade larver är på plattan för 24 h.
  2. Hemolymph utvinning och plätering av hemocytes
    1. Förbereda medium och utrustning efter steg 1.1).
    2. Plats en 12 mm runda luckan glas (nr 1 tjocklek) i en väl 24-bra platta. Pipettera 500 µL av DHIM i brunnen.
    3. Extrahera hemolymph från infekterade larver följande steg 1.2.4) - 1.2.8).
    4. Mata ut hemolymph i väl följande steg 2.2.2).
    5. Upprepa 2.2.3) och 2.2.4) för flera partier av larver.
    6. Centrifugera plattan vid 1 000 x g i 5 min.

3. visualisering

  1. Fastställande och färgning
    1. Efter att hemocytes att bosätta sig på det runda luckan glaset i brunnen, ta försiktigt bort mediet från varje brunn.
    2. Varsamt tillsätt 200 µL av 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) till varje brunn fast hemocytes. Inkubera i hemocytes för 20 min i rumstemperatur.
    3. Ta bort de 4% PFA och varsamt tillsätt 200 µL av PBS som innehåller 0,1% Triton X-100 och 1% bovint serumalbumin (BSA) till varje brunn. Inkubera i hemocytes under 10 minuter vid rumstemperatur.
    4. Ta bort PBS och varsamt tillsätt 200 µL 1 × 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) till varje brunn. Inkubera i hemocytes i 10 min i mörker vid rumstemperatur.
    5. Ta bort DAPI lösningen och försiktigt lägga till PBS i varje brunn. Inkubera i hemocytes för 5 min i rumstemperatur.
    6. Släpp 10 µL av den antifade monteringsmedium på ett glas objektglas.
    7. Efter att PBS från varje brunn, ta bort skyddsglaset från 24-väl plattan med hjälp av fine-pekade pincett. Placera försiktigt skyddsglaset på den antifade monteringsmedium i glas bilden, med de hemocytes vänd nedåt.
    8. Låt bilden torka genom att placera den i den mörka natten.
  2. Confocal Imaging
    1. Konfigurera de confocal mikroskopet för tre färg avbildning av DAPI, andra och mCherry. Använd följande inställning: DAPI excitation (ex) 405 nm, emission (em) 415-480 nm. ANDRA ex 488 nm, em 493-564 nm. mCherry ex 587 nm, em 597-700 nm.
    2. Placera provet på mikroskopet och fokus på prov med en 63 X / 1.4 numeriska bländaröppningen (NA) mål. Leta upp önskad hemocytes i synfältet för avbildning.
    3. Justera laser power och detektor vinster för att uppnå lämplig exponering av provet. Kontrollera flera z-plan för att säkerställa exponeringsnivån är lämpligt för hela provets tjocklek.
    4. Hitta övre och nedre positionen på z-axeln för en hel hemocyte. Ange dessa positioner som de start- och slutpositionerna för z-snittning.
    5. Använd endast skanning zoom bilden området som innehåller hemocyte. Zooma faktorer av 3 X används ofta.
    6. Samla bild serien på lämplig upplösning t.ex 1024 x 1024 pixlar i x-y-planet och 0,3 µm mellanrum i dimensionen z.
  3. 3D-modell återuppbyggnad
    Obs: Öppen källkod finns som utför många av de funktioner som beskrivs nedan för 3D-modellen återuppbyggnad.
    1. Importera filen z-sektioneras bild serie till den programvara som är associerad med mikroskopet confocal för 3D-modellen återuppbyggnad.
    2. Markera en cell visar samtidig lokalisering av atomkärnor fläckade DAPI och mCherry uttrycka C. burnetii i en andra uttrycker hemocyte. Beskär bilden serien innehåller bara en enda cell.
    3. Välj alternativet för 3D Viewer som rekonstruerar 3D-modellen med programvarans färdigförpackade algoritm. Välj önskad typ av 3D-representation bland blandning, yta och blandade alternativ. I denna metod visas hemocytes, kärnor och C. burnetii med surface-modeller.
    4. Iaktta 3D rekonstruerade cellen från olika visning positioner genom att hålla ned musknappen och dra markören runt på skärmen. Justera cell orientering och position av modellerade ljuskällan att optimera bilden. Det finns andra alternativ för opacitet, minsta och högsta tröskelvärde, speglande, Ambient, Shineness och Gamma för att optimera bilden.
    5. Ta tvärsnitt genom modellen med klippning och snittning kommandon för att visualisera interiör innehållet i hemocyte.

4. ansökan om genen och/eller protein analys

  1. Efter infektion med IIV6 och Listeria, lyse celler för efterföljande qRT-PCR eller Western blot analys beskrivs som tidigare21 och följande tillverkarens anvisningar.
    Obs: Se Tabell av material för primers för qRT-PCR och antikropparna för Western blot.
  2. Analysera PCR-produkter av agaros gel-elektrofores, som tidigare beskrivits22, för att säkerställa rätt längd av förstärkt produkten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att samla leva hemocytes för ex vivo infektion, till 3 × 10 utvanns6 hemocytes från 200 Drosophila 3rd instar larver. För att utveckla vår metod, försökte ett antal olika tekniker. Enskilda larval dissektion skulle ta upp till 1,5 h och genomsnitt ~ 8000 celler erhölls med hjälp av denna metod18, varav de flesta inte var levande i slutet av samlingen. Nästa, vi försökte extrahera hemolymph, som innehöll hemocytes, från 20 larver på en tid med en glas kapillärrör19, men kapillären blev igensatt med nagelband material och hemolymph kunde inte tas effektivt upp av glaset Kapillär. Slutligen, vi mekaniskt störs nagelbanden av 20-50 larver per batch med fina tången12, och gjorde en pool av hemolymph för lätt upptag. Detta tillät lätt samling av en stor mängd hemocytes från ett stort antal larver (tabell 1).

För att indikera att de extraherade hemocytes var vid liv och lämplig för infektionen, utfördes en Trypan blå utslagning analys för att beräkna procentandelen av levande hemocytes extraheras med hjälp av metoden som presenteras här(figur 6). Dessutom jämförde vi vår metod för extraktion av hemocyte med en tidigare publicerade metod där målet var att utveckla en mekaniska störningar metod för att isolera och skilja mellan cirkulerande och bosatt hemocytes från enskilda Drosophila larv23. Vid jämförelse mellan de två metoderna från 10 oberoende experimentella isoleringar observerade vi att cellernas viabilitet var något större med hjälp av metoden som presenteras här (figur 6A). dock metoden från Petraki et al. gav nära dubbelt så många hemocytes från varje 10 dissekerade larver (figur 6B). En orsak till det ökade antalet hemocytes från Petraki et al. metoden är att denna metod samlar bosatta (fastsittande) hemocytes, liksom cirkulerande hemocytes. För att bekräfta att de celler som utvinns med metoden presenteras här i själva verket hemocytes, utnyttjade vi en linan som innehåller transgener för hemolectin (Hml) arrangören kör GAL4 i cirkulerande hemocytes som binder sekvensen uppströms aktivator (UAS) till Aktivera förbättrade grönt fluorescerande protein (andra) transkription och uttryck i hemocytes. Hemocytes från hml-GAL4 > UAS-andra larver utvanns på kamrar täckglas diabilder, fasta, permeabilized och färgas med DAPI beskrivs som tidigare21. Figur 7 visar att de flesta DAPI-positiva celler också andra-positiv. Kvantifiering av samtidig uttryck utfördes från flera bilder från som vi räknat ut att 86±9% av celler isolerade var hemocytes.

Protokollet i innovativa 3D-modeller av patogen invasion in i Drosophila hemocytes utvinns ur 3rd instar larver efter ex vivo - eller in vivo C. burnetii infektion. Vi kunde bild C. burnetii infektion eftersom bakterierna express mCherry. Efter infekterade hemocytes var fixeras och färgas, var de avbildade för DAPI, andra och mCherry med konfokalmikroskopi. Hemocyte infektion priser, som bestäms av procentandelen av andra-positiva celler som också uppvisade mCherry signal, för både ex vivo och i vivo C. burnetii infektioner var nästan 100%. Detta var väntat eftersom en MOI av 10 GE deponicell användes för ex vivo infektion, vilket bör leda till infektion av 100% av celler24. Angående de i vivo infektionerna, eftersom larverna placeras i en hög-titer droppe av mCherry uttrycker -C. burnetii (5,95 × 109 GE/mL), antalet bakterier är ungefär 10,000-fold högre än antalet hemocytes per larv. Därför förväntas en 100% infektionsfrekvensen för de in-vivo -infektionerna.

Nästa, Z-avsnitten samlades in genom hemocyte att visualisera hela cellen i 3D och bekräfta förekomsten av C. burnetii inne i cellen. Figur 4 visar öppet tvärsnitt av en hemocyte (i grönt) med C. burnetii (i rött) sett inne i cellen. Bilderna rekonstruerades också in i en 3D-modell (figur 5) som representerar ytbehandlar av hemocyte och C. burnetii, visar återigen C. burnetii i inre av de över uppställd hemocytes. Intressant, in-vivo-infekterade hemocytes uppvisade större cytoplasmiska tillägg och var plattare i naturen, medan ex vivo-infekterade hemocytes var mer sfäriska (figur 5). Detta kan tyda på en större befolkning av lamellocytes i i vivo-infekterade populationen och plasmatocytes i ex vivo befolkningen7. Medan lamellocyte differentiering är generellt induceras under parasitära geting infektion25, är sårande av larvaena Drosophila också tillräckligt för att framkalla lamellocyte differentiering26. Slutligen, medan inte utnyttjas i de experiment som presenteras här, det finns GFP-uttryckande former av Listeria27 och IIV628 som kunde användas för att generera 3D-modeller av hemocyte infektion. Listeria- och IIV6-infekterade hemocytes användes i stället för Western blotting och qRT-PCR experiment.

Använder metoden presenteras här infektioner utförs både ex vivo och in-vivo för avbildning. Dessutom följde patogen mRNA och protein analys ex vivo infektioner. Specifikt, extraherade hemocytes var infekterade med IIV6 och tillämpades på qRT-PCR-analys. Det visade signifikant högre nivåer av IIV6-193R, en viral genen som kodar för en förmodad hämmare av apoptos29, mellan mock - och IIV6-infekterade celler (figur 8A). Elektrofores av de förstärkta produkterna bekräftat förekomsten av ett band för IIV6-193R genprodukten i infekterade provet, men inte mock-infekterade provet (figur 8B). Förstärkt band för RpII endogen kontroll hittades i alla prover, och IIV6 infektion i S2 celler utfördes som en positiv kontroll. Eftersom IIV6 infektioner framfördes på en MOI av 1 TCID50/cell, förväntades cirka 50% av cellerna vara smittade, baserat på Poissonfördelning24.

Totalt protein från mock - eller Listeria -smittade hemocytes samlades på 1, 2 och 4 h efter infektion och proteinkoncentration bestämdes av Bicinchoninic syra (BCA) analys. 100% av cellerna förväntades vara infekterade ex vivo eftersom MOI var 10 CFU/cell24. Western blotting bekräftar förekomsten av Listeria-proteinprodukter i de infekterade hemocytes, framställda med höga nivåer uppnås genom 4 h efter infektion (figur 9). Listeria inokulum används som en positiv kontroll för detektion av Listeria-specifika band. Förekomsten av aktin visas i proverna som hemocyte att bekräfta nivåer av protein lastning. Sammantaget indikerar dessa resultat att de hemocytes som utvinns med hjälp av metoden som presenteras här var lämpliga för både viral och bakteriell infektion experiment.

Figure 1
Figur 1 : Skissera av utrustning och material som används för extraktion av hemocyte. Utrustning var först beredd före dissektion. (A) det drog glaset kapillär infogades i nanoinjector efter att ha tillbaka fyllda med mineralolja. (B) smält spetsen på glaset kapillär bröts med pincett att skapa en yttre diametern 100 µm. B') DHIM togs upp av kapillären att undvika cell kontaminering och luftbubblor infördes för att göra en tydlig åtskillnad mellan olja och DHIM. (C) larver är plockade från mat injektionsflaskor och placeras i en cell SIL. C') larver tvättas i sterilt vatten och vatten avlägsnas med en uppgift torka, D) larver överförs i en mikrocentrifug rör och bedövas med CO2 gas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Tidslinje och flöde diagram för utvinning av hemocytes. (A) larver är placerade på deras ryggsidan innan du öppnar fjällskiktet. (B) nagelbanden störs med fina spetsiga pincetter och kapillär nålen. (C) hemolymph är blödde på paraffin film. (D) pooler av hemolymph från 20-50 larver tas upp med glas kapillär och nanoinjector. E) hemolymph och hemocytes överförs till en mikrocentrifug rör innehållande 500 µL DHIM ska räknas med en hemocytometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: In vivo infektion. En) Drosophila frukt juice agarplattor och jäst pasta används för inkubation av i vivo infekterade larver. Nedskärningar görs i agarplattan att underlätta larver livslängd (grå pilar). (B) en 0,001 mm spetsiga Volfram nål bifogas pincett med paraffin film. (C) 0,001 mm spetsiga Volfram nål spets. (D) larven är spetsade med Volfram nål i patogen poolen på paraffin filma under stereo Mikroskop. (E) prickas larverna är placerade på en agarplatta. (F) plattan är förseglade med paraffin filma och behöll på fuktigt hushållspapper i behållaren till lämplig tidpunkt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Tvärsnitt av patogen invasion in i hemocytes. Sektioner som utvinns från 3D confocal scanning av patogen-infekterade hemocytes. A, B) xy-avsnitten visar C. burnetii (i rött markerade med vit pilspetsar) i inre av hemocyte. Grå pilspetsar visar atomkärnor av hemocytes. A', en ”, B') inklusive yz-xz-avsnittet och bilder visas invasionen av C. burnetii in hemocytes från 2 ytterligare visning poäng. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : 3D-modeller av patogen invasion in i hemocytes. Rekonstruerade 3D-modeller av C. burnetii invasion in i hemocytes genereras efter ex vivo och in-vivo -infektion. Modellen kan roteras fritt använda programvaran; Här visas 6 Visa punkter med hemocyte i grönt, C. burnetii i rött (vit pilspetsar), och kärnan i blått (grått pilspetsar). Tvärsnitt bilderna visar insidan av patogen-invaderade celler visas också. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Den procentsats och befolkningen av levande hemocytes. Hemocytes utvanns från grupper av 10 3rd instar larver med metoden för Petraki et al. och metoden presenteras här. (A) andelen av de levande hemocytes beräknades för varje teknik av Trypan blå utslagning assay. (B) den sammanlagda befolkningen av hemocytes jämfördes mellan de två teknikerna. Stolpdiagram representerar medelvärde ± standardavvikelsen från N = 10 biologiska replikat per metod av typen extraktion och analys. P-värden anges från en tvåsidiga Students T-test antar olika varians. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7 : Bilder av extraherade hemocytes använder drivrutinen hemolectin. Hemocytes utvanns från 80 larver av w1118; P {w [+ mC] = Hml-GAL4.Δ} 2, P {w [+ mC] = UAS-2xEGFP} AH2. Arrangören för Hml driver GAL4 i cirkulerande hemocytes, som binder UAS att aktivera andra transkription och uttryck. Hemocytes var fixeras och färgas med DAPI som tidigare beskrivits20. Hemocytes är monterad på kamrar coverslips och fotograferad av differentiell störningar kontrakt (DIC) och fluorescensmikroskopi. Den blå kanalen visar kärnan fläckade DAPI och den gröna kanalen visar de hemocytes som uttrycker andra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : qRT-PCR och gel elektrofores. Uttrycket av genen IIV6-193R observerades av qRT-PCR endast i de IIV6-infekterade hemocytes. (A) 193R genuttryck var normaliserade till den interna kontrollen, RpII, och presenteras som ett förhållande. Numret på cykel för de mock-infekterade hemocytes fastställdes godtyckligt till en maximal cykel nummer 40 för analys eftersom 193R inte påvisades i dessa prover. Data representerar medelvärde ± standardavvikelsen från N = 3 biologiska replikat per grupp. P-värdet anger tvåsidiga Students T-test antar olika varians. (B) qRT-PCR produkterna visas av agaros gelelektrofores. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9 : Western Blot analys. Uttrycket av Listeria antigener och aktin i mock- och Listeria-smittade hemocytes från 3rd instar Drosophila larver på 1, 2 och 4 h efter infektion (PI) bestäms av Western blotting. Totalprotein koncentrationer bestämdes av Bicinchoninic syra (BCA) analysen att normalisera totala mängden protein som lastas i varje körfält av gelen. Inokulum används att infektera hemocytes användes som ett positivt kontrollprov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Metoden Genomsnittligt antal larver
för hemocyte utvinning
Genomsnittligt antal totala hemocytes
hemolymph
Kapillär utvinning
(denna metod)
192.44 (SD: 86.05) 4.56 x 105 celler (SD: 5,83 x 105)
(Intervall: 70-390, N = 25 prövningar) (Intervall: 1,20 x 105 - 2.95 x 106 celler)
enskilda
Larverna dissektion
26,67 (SD: 11,55) 8.33 x 103 celler (SD: 6,66 x 103)
(Intervall: 20-40, N = 10 försök) (Intervall: 4,00 x 103 - 1,60 x 104 celler)
larval
Kapillär extraktion *
EJ TILLÄMPLIGT * EJ TILLÄMPLIGT *
* hemocytes har kunnat utvinnas med hjälp av denna metod på grund av igensättning av kapillär nålen

Tabell 1: antal dissekeras larver och extraherade hemocytes med olika tekniker. Det genomsnittliga antalet dissekerade larver och extraherade hemocytes jämfördes mellan metoden presenteras här och andra metoder. Vår metod resulterat i samlingen av ett högre antal larver och hemocytes. Metoden larval kapillär utvinning försökte också, men hemocytes har kunnat utvinnas på grund av igensättning av kapillär spetsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

För att bättre förstå hur värdceller blivit smittad, är det viktigt att klargöra localizationen av patogenet i cellerna, särskilt när experimentera på tidigare oprövade patogen och cell typ kombinationer4. Medan studera cellulära svar kaskad efter infektion kan indikera produktiva patogen invasion, är kombinationen av bilddata och cellulära svarsdata väsentliga att demonstrera patogen invasion och infektion. Medan rapporter visar 2D-bilder av patogen invasion in i värdceller tenderar att indikera produktiv infektion, kan några frågor kvarstår vad gäller tidpunkten för inledande patogen invasion av värdceller. Således, 3D modeller rekonstrueras från z-avsnitt scanning av 2D-bilder kan ta itu med dessa frågor och patogen plats i de mottagande cellerna (figurerna 4 och 5). En begränsning av använda primära hemocytes är dock deras livslängd i cellkultur. En tidigare rapport anger att hemocyte överlevnad i cell kultur media är bara 8 h18, och i våra infektion protokoll, vi kunde utföra analyser upp till 24 h, men inte längre. Därför var det inte möjligt att observera höga C. burnetii replikering eller bildandet av den parasitophorous vakuol som inte börjar att bilda tills 2 dagar efter infektion och inte är observably stor fram till 4-6 dagar efter infektionen30 .

För många experiment där endpoint analyserna utnyttja protein eller RNA för analys, är stort antal celler vanligtvis krävs för att producera tillräckligt material för förhör. Exempelvis här, använder vi endpoint analyser såsom Western blotting och qRT-PCR sond omfattningen av patogen infektion i primära hemocytes härrör från 3rd instar Drosophila larver. Metoden presenteras således här fokuserar på snabb larval dissektion och insamling av de hemolymph som innehåller tillräckligt levande hemocytes för ex vivo patogen infektion. Denna metod införs användningen av en nanoinjector att ta upp hemolymph och hemocytes snabbt. Placera hemocytes i DHIM som innehåller 25% är FBS viktigt för hemocyte överlevnad. För ex vivo infektionerna presenteras här, behövs dessutom ett stort antal hemocytes. För att undvika melanization31,32,33, måste dissektion och hemocyte samling ske snabbt. Även andra metoder för extraktion av hemocyte finns18,19,23, var varaktigheten av dessa metoder för att samla in ett tillräckligt stort antal hemocytes för ex vivo infektion för lång. Den 100 µm, fina spetsen är fördelaktigt för upptaget av hemolymph utan att ta upp andra organ som kan leda till igensättning av kapillär nålen. Användning av en nanoinjector kan också automatiseras när det är anslutet till ett micromanipulator Stadium och fot pedal, så att användaren kan fokusera på snabb dissekering av larvaena Drosophila och minska den tid som hemocytes är utan omgivande larver vävnads- eller kultur media. Användning av en pipett finns dock även att ta upp hemolymph för överföring till DHIM. Dessutom utnyttjar våra metoden CO2 gas för att söva larver före dissektion; användning av ett kallt block med paraffin filma tänkandet är en annan fungerande metoden23. Slutligen, dissektion av larver i en droppe av DHIM under lanseringen av hemolymph kan minska antalet hemocytes som försvinner från sticker till paraffin filma men kommer att öka tid som behövs för upptag av kapillär nålen.

En gemensam immunsvar i Drosophila till skada, som uppstår under öppning och dissektion av larval nagelband, är melanization31,32,33. Vid utvinning av hemocytes, skulle vi följa melanization av hemocytes i DHIM så tidigt som 10 min efter extraktion. Melanization är en snabb process, skulle dessa celler uteslutas från de patogen infektion experiment. Dessutom kan den antikoagulantia phenylthiourea läggas till DHIM att hämma phenoloxidase-aktiverande systemet och melanization under såra9. Ändå, som melanization och apoptos är medfödda immunsvar i Drosophila, deras nivåer kan vara kvantifierade följande hemocyte utvinning och stimulering använder de metoder som beskrivs här.

Samtidigt återhämtar sig stora mängder protein eller RNA material är ett krav för tekniker såsom Western blot och qRT-PCR, kräver nya tekniker, såsom RNAseq mycket mindre insatsmaterial, så lite som 10 pg av hög kvalitet total-RNA från en enda cell34. Experiment som dessa höja intressanta experimentella frågor, och sedan Drosophila hemocytes är en heterogen befolkning som innehåller crystal celler, plasmatocytes och lamellocytes7, man kunde börja att förhöra den transkriptionell svar i varje cell typ35. Till exempel Kurucz et al., har utvecklat antikroppar som kan användas för att isolera Drosophila hemocyte delmängder som kunde användas för transkriptionell eller proteomiska profilering efter olika stimuli. Dessutom, kan den senaste utvecklingen av enstaka cell RNAseq teknik definiera transcriptomes för varje celltyp utan användning av antikroppar att först separera varje cell typ36,37,38, 39. dessutom en kunde ställa frågor angående genreglering i hemocyte delmängder som kan hjälpa oss förstå hur människors blodkroppar härstamningar sitt ursprung och utvecklats från antika organismer genom jämförande genomik ansträngningar. Ta itu med problemen som dessa kräver kombinationen av en rad olika experimentella tekniker, och den teknik som beskrivs här kan vara användbart för sådana insatser när isoleringen av ett stort antal hemocytes från ryggradslösa larver krävs.

Vi föreslår här, kombinationen av 3D modeller med numeriska, biokemiska data för bekräftelse av smitta. I framtida studier, kan vi använda metoderna som beskrivs här för att observera immunsvar och mekanismen av patogen invasion in i värdceller genom samtidig färgning värd proteiner för mikroskopi analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgements

Vi är tacksamma till Dr Robert Heinzen för att tillhandahålla bestånd av mCherry-uttryckande Coxiella burnetii. Vi tackar Dr. Luis Teixeira för att tillhandahålla ryggradslösa skimrande virus 6 och Bloomington lager Center för att tillhandahålla flyga bestånd. Projektet var delvis finansierad av NIH grant R00 AI106963 (till A.G.G.) och Washington State University.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Schneider's Drosophila Medium  Thermo Fisher Scientific (Gibco) 21720024 1.1.1), 2.1.2)
Fetal Bovine Serum GE Healthcare Life Sciences  (HyClone) SH30070.03HI 1.1.1), 2.1.2)
Filter (0.22 µL) RESTEK 26158 1.1.1)
Strainer (100 µm) Greiner bio-one 542000 1.2.1), 2)
Stereo microscope Amscope SM-1BSZ-L6W 1.2), 2)
Glass capillary Fisher Scientific 21-171-4 1.1), 1.2), 2)
Capillary puller Narishige International USA, Inc. PC-10 1.1.3)
Mineral oil Snow River Products 1.1.4)
Nanoinjector Drummond Scientific Company 3-000-204 1.1), 1.2), 2.2)
Forceps VWR 82027-402 1.1.5), 1.2), 2), 3.1.7)
CO2 delivery apparatus Genesee Scientific 59-122BC 1.2), 2)
Trypan Blue Thermo Fisher Scientific (Gibco) 15250061 1.3)
Hemocytometer Hausser Scientific 3100 1.3)
24 well plate Greiner bio-one 662160 1.4), 2.2)
Coxiella burnetii - mCherry Dr. Heinzen, R. 1.4), 2.2)
Drosophila fruit juice plates Cold Spring Harbor Protocols 2.1) http://cshprotocols.cshlp.org/content/2007/9/pdb.rec11113.full
Agar Fisher Bioreagents BP1423-500 2.1.1.1)
Methyl paraben Amresco 0572-500G 2.1.1.2)
Absolute ethanol Fisher Bioreagents BP2818-500 2.1.1.2)
Welch's 100% Grape juice frozen concentrate, 340 mL Amazon B0025UJVGM 2.1.1.3)
Petri dishes, 10 x 35 mm Fisher Scientific 08-757-100A 2.1.1.4)
Microscope cover glass Fisher Scientific 12-545-80 1.4.4), 2.2.2)
Yeast, Bakers Dried Active MP Biomedicals 0210140001 2.1) Add 2 parts of water to 1 part of yeast (v/v)
Tungsten needle Fine Science Tools 10130-20 2.1)
Holding forceps VWR HS8313 2.1)
Paraformaldehyde Fisher Scientific FLO4042-500 3.1.3)
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500 3.1.3)
Bovine Serum Albumin Fisher Scientific BP9706-100 3.1.3)
4',6-diamidino-2-phenylindole Thermo Fisher Scientific 62247 3.1.4)
Antifade mounting medium Thermo Fisher Scientific P36930 3.1.6)
Confocal microsope Leica TCS SP8-X White Light Confocal Laser Scanning Microscope 3.2)
3D imaging reconstruction software Leica LASX with 3D visualization module 3.3)
Microscope slides Fisher Scientific 12-552-3 3.1.6)
Invertebrate iridescent virus 6 (IIV6) Dr. Teixeria, L. 4) PLoS Biol, 6 (12), 2753-2763, doi: 10.1371/journal.pbio.1000002, (2008)
Listeria monocytogenes ATCC strain: 10403S 4) Listeria monocytogenes strain 10403S (Bishop and Hinrichs, 1987) was grown in Difco Brain-heart infusion (BHI) broth (BD Biosciences) containing 50 µg/ml streptomycin at 30 °C.
DNase I Thermo Fisher Scientific(Invitrogen) 18068015 gDNA degradation
cDNA Synthesis Kit Bio-Rad 1708891 cDNA synthesis
IIV6_193R_F IDT qRT-PCR, 5'- TCT TGT TTT CAG AAC CCC ATT -3'
IIV6_193R_R IDT qRT-PCR, 5'- CAC GAA GAA TGA CCA CAA GG -3'
RpII_qRTPCR_fwd SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- GAA GCG TTT CTC CAA ACG -AG
RpII_qRTPCR_rev SIGMA-ALDRICH qRT-PCR, 5'- TTG AGC GTA AGC ATC ACC -TG
SYBR Green qRT-PCR reagent Thermo Fisher Scientific K0251, K0252, K0253 qRT-PCR
Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific 4351107, 7500 Software v2.0 qRT-PCR
Anti-Listeria monocytogenes antibody abcam ab35132 Western blot
Anti-Actin antibody produced in rabbit SIGMA-ALDRICH A2066 Western blot
Anti-Rabbit IgG (H+L), HRP Conjugate Promega W4011 Western blot

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Regan, J. C., et al. Steroid hormone signaling is essential to regulate innate immune cells and fight bacterial infection in Drosophila. PLoS Pathog. 9, (10), 1003720 (2013).
  3. Yano, T., et al. Autophagic control of listeria through intracellular innate immune recognition in Drosophila. Nat Immunol. 9, (8), 908-916 (2008).
  4. Bastos, R. G., Howard, Z. P., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Host and Bacterial Factors Control Susceptibility of Drosophila melanogaster to Coxiella burnetii Infection. Infect Immun. 85, (7), (2017).
  5. Kacsoh, B. Z., Schlenke, T. A. High hemocyte load is associated with increased resistance against parasitoids in Drosophila suzukii, a relative of D. melanogaster. PLoS One. 7, (4), 34721 (2012).
  6. Tsuzuki, S., et al. Switching between humoral and cellular immune responses in Drosophila. is guided by the cytokine GBP. Nat Commun. 5, 4628 (2014).
  7. Kurucz, E., et al. Definition of Drosophila. hemocyte subsets by cell-type specific antigens. Acta Biol Hung. 58, Suppl 95-111 (2007).
  8. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods. 68, (1), 116-128 (2014).
  9. Arefin, B., et al. Apoptosis in Hemocytes Induces a Shift in Effector Mechanisms in the Drosophila. Immune System and Leads to a Pro-Inflammatory State. PLoS One. 10, (8), 0136593 (2015).
  10. Rus, F., et al. Expression pattern of Filamin-240 in Drosophila blood cells. Gene Expr Patterns. 6, (8), 928-934 (2006).
  11. Kurucz, E., et al. Hemese, a hemocyte-specific transmembrane protein, affects the cellular immune response in Drosophila. P Natl Acad Sci USA. 100, (5), 2622-2627 (2003).
  12. Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. P Natl Acad Sci USA. 106, (12), 4805-4809 (2009).
  13. Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biol Open. 4, (3), 355-363 (2015).
  14. Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. P Natl Acad Sci USA. 101, (39), 14192-14197 (2004).
  15. Flynt, A., Liu, N., Martin, R., Lai, E. C. Dicing of viral replication intermediates during silencing of latent Drosophila viruses. P Natl Acad Sci USA. 106, (13), 5270-5275 (2009).
  16. Jovel, J., Schneemann, A. Molecular characterization of Drosophila cells persistently infected with Flock House virus. Virology. 419, (1), 43-53 (2011).
  17. Stoepler, T. M., Castillo, J. C., Lill, J. T., Eleftherianos, I. A simple protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. J Vis Exp. (69), e4173 (2012).
  18. Sampson, C. J., Williams, M. J. Protocol for ex vivo incubation of Drosophila primary post-embryonic haemocytes for real-time analyses. Methods Mol Biol. 827, 359-367 (2012).
  19. Nehme, N. T., et al. A model of bacterial intestinal infections in Drosophila melanogaster. PLoS Pathog. 3, (11), 173 (2007).
  20. Drosophila fruit juice egg plates. Cold Spring Harbor Protocols. (9), pdb.rec11113 (2007).
  21. Ahlers, L. R., Bastos, R. G., Hiroyasu, A., Goodman, A. G. Invertebrate Iridescent Virus 6, a DNA Virus, Stimulates a Mammalian Innate Immune Response through RIG-I-Like Receptors. PLoS One. 11, (11), 0166088 (2016).
  22. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
  23. Petraki, S., Alexander, B., Bruckner, K. Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva. J Vis Exp. (105), (2015).
  24. Figliozzi, R. W., Chen, F., Chi, A., Hsia, S. C. Using the inverse Poisson distribution to calculate multiplicity of infection and viral replication by a high-throughput fluorescent imaging system. Virol Sin. 31, (2), 180-183 (2016).
  25. Rizki, T. M., Rizki, R. M. Lamellocyte differentiation in Drosophila. larvae parasitized by Leptopilina. Dev Comp Immunol. 16, (2-3), 103-110 (1992).
  26. Markus, R., Kurucz, E., Rus, F., Ando, I. Sterile wounding is a minimal and sufficient trigger for a cellular immune response in Drosophila melanogaster. Immunol Lett. 101, (1), 108-111 (2005).
  27. McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infect Immun. 84, (4), 1083-1091 (2016).
  28. Ozgen, A., et al. Construction and characterization of a recombinant invertebrate iridovirus. Virus Res. 189, 286-292 (2014).
  29. Jakob, N. J., Muller, K., Bahr, U., Darai, G. Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus. Virology. 286, (1), 182-196 (2001).
  30. Ghigo, E., Colombo, M. I., Heinzen, R. A. The Coxiella burnetii parasitophorous vacuole. Adv Exp Med Biol. 984, 141-169 (2012).
  31. Liu, F., et al. Drosophila melanogaster prophenoloxidases respond inconsistently to Cu2+ and have different activity in vitro. Dev Comp Immunol. 36, (3), 619-628 (2012).
  32. De Gregorio, E., et al. An immune-responsive Serpin regulates the melanization cascade in Drosophila. Dev Cell. 3, (4), 581-592 (2002).
  33. Kari, B., et al. The raspberry Gene Is Involved in the Regulation of the Cellular Immune Response in Drosophila melanogaster. PLoS One. 11, (3), 0150910 (2016).
  34. Wu, A. R., et al. Quantitative assessment of single-cell RNA-sequencing methods. Nat Methods. 11, (1), 41-46 (2014).
  35. Buettner, F., et al. Computational analysis of cell-to-cell heterogeneity in single-cell RNA-sequencing data reveals hidden subpopulations of cells. Nat Biotechnol. 33, (2), 155-160 (2015).
  36. Nevil, M., Bondra, E. R., Schulz, K. N., Kaplan, T., Harrison, M. M. Stable Binding of the Conserved Transcription Factor Grainy Head to its Target Genes Throughout Drosophila melanogaster Development. Genetics. 205, (2), 605-620 (2017).
  37. Yang, C. P., et al. Transcriptomes of lineage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetic targeting and robotic sorting. Development. 143, (3), 411-421 (2016).
  38. Jaitin, D. A., et al. Dissecting Immune Circuits by Linking CRISPR-Pooled Screens with Single-Cell RNA-Seq. Cell. 167, (7), 1883-1896 (2016).
  39. Karaiskos, N., et al. The Drosophila embryo at single-cell transcriptome resolution. Science. 358, (6360), 194-199 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics