酶活化致癌物和药物对共价 DNA 加合物的生成研究体外及其32 P-postlabeling 的测定

Biochemistry

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Summary

评价环境化学物质和药物的效力, 将其酶 bioactivated 到产生共价 DNA 加合物的中间体, 是癌症及其治疗发展的一个重要领域。方法描述了复合活化形成 DNA 加合物, 以及检测和定量的技术。

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Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

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Abstract

由化学物质或具有致癌效力的药物形成的共价 DNA 加合物被认为是致癌过程起始阶段最重要的因素之一。这种共价键被认为是肿瘤发生的原因, 现在被评估为化学致癌的中心教条。在这里, 使用细胞色素 P450 和其他生物转化酶催化反应的方法来研究化学物质或药物对形成这些 DNA 加合物的代谢物的活性的效力。介绍了用细胞色素 P450 或其他生物转化酶 (微粒体和胞浆样品) 分离具有生物转化酶的细胞组分的方法, 即, 过氧化物, 细胞色素 P450 氧化还原酶 (P) H: 醌氧化还原酶, 或黄嘌呤氧化酶)。此外, 描述的方法可以用于代谢活化的分析化学物质的这些酶, 以及那些分离的 DNA。此外, 能够检测和量化化学/药物衍生 DNA 加合物的适当方法,即,32 P postlabeling 技术的不同修改和使用放射性标记分析的化学品, 是详细显示。

Introduction

外来化合物 (环境化学物质或药物) 的新陈代谢发生在两个阶段 1.阶段 I 和 II 的目的是使最初疏水性 (不水溶性) 化合物更亲水性 (水溶性), 从而使它们容易 excretable 通过尿, 粪便或汗水。第一阶段 (功能化) 反应包括氧化、还原和羟化酶催化的酵素, 如细胞色素 P450s (P450s, CYPs), 过氧化物 (I. e, 环氧合酶, COX), 酮酮硝酸 (AKRs) 和微粒体黄素含 monooxygenases (FMOs)。第一阶段还包括减少反应, 介导的各种硝酸即,微粒体: 细胞色素 P450 还原酶 () 和胞浆 NAD (P) H: 醌氧化还原酶 (NQO1), 黄嘌呤氧化酶 (XO) 和醛氧化酶 (AO) 1.在第二阶段 (共轭) 中, 第一阶段所附的官能团用于共轭小极性分子, 进一步增加极性。考虑参与第二阶段反应的酶的例子包括 sulfotransferases (结果), N, O-乙酰转移酶 (NATs), 甲基转移酶如邻苯酚-O-甲基 (COMT), 谷甘肽 S-转移酶 (禾采赞) 和苷二磷酸 glucuronosyltransferases (UGTs) 1。然而, I. 期和 II. 类酶的分类并不是硬性的, 有些酶可以被归类为任何一类。

P450 酶 (EC 1.14.14.1) 是含有多种生物的蛋白质的血红素, 参与多种化学物质的转化, 催化其转化为3,4。P450 酶催化许多基质的羟基化, 反应中, 氧气的一个原子被引入外来化合物分子中, 而第二个氧原子通过需要两个电子的反应而被还原形成水 [方程 (1)]3,4:

RH + O2 + NADP + h+ →卢武铉 + h2O + + (1)

哺乳动物细胞内质网膜中的 P450 酶 (微粒 P450 系统) 是酶甲烷系统的成员, 进一步包含了细胞色素 P450 还原酶 () 和细胞色素 b 5 , 该酶的基质称为 NADH: 细胞色素b5 还原酶。一个普遍接受的理论假设, P450 所需的两个电子的供体是系统。然而, 细胞色素b5 也可能充当 P450 电子的捐助者, 即作为电子减少 P450 的捐助者, 在其反应周期的第二次还原期间, 它与 NADH 一起行动: 细胞色素b5 还原酶2,3,4

哺乳动物利用各种 P450 酶 (例如,家庭5、8、11、17、19、21、24、26和27的酶, 用于合成有价值的内源化合物, 如类固醇, 并用于天然产物的分解代谢2,3.其他 CYP 哺乳动物的酶, 如人类 CYP1A2, 2C9, 2C19, 2D6 和 3A4, 代谢外源化学药品作为药物。5,6最重要的酶催化代谢的药物是 CYPs 的3A 亚科, 特别是 CYP3A4。外来化合物的转换, 如亲致癌物和亲毒物, 由人类 CYP1A1、1A2、1B1、2a6 型坦克、2E13A4 2 5 介导.大多数这些 CYPs 都存在于肝脏中 (除了 CYP1A1 和 1B1)。然而, CYPs 也表达在一些肝外器官。这种 P450s 可能具有很大的意义, 主要是在参与它们在 bioactivation 代谢化学物质 (药物) 到反应中间体的这些器官7。各种 P450s 都是由其基底的几种化合物引起的, 但不一定如此。

许多 P450 酶在化学 (药物) 毒性中起着作用。它们不仅可以将外来化合物转化为解毒代谢物, 还能将它们激活到反应性物种, 从而改变另外表现出不同生物特性的内源大分子, 通常会引起它们的毒性。DNA、脂质和蛋白质可能是由活性化学物质产生的反应性 electrophiles 和自由基修饰的靶点。在 DNA 的情况下, 解决几个重要的基因应答及其机制已经被称为2,3,4,5

DNA 的变化会导致细胞生长控制的减少, 这种现象被认为是导致致癌过程发展的主要因素。生成具有致癌效力的化学物质的共价 DNA 加合物被认为是致癌过程启动阶段最重要的步骤之一8, 9, 10, 11.结果表明, dna 加合物的形成与肿瘤发生之间存在关系, 而 dna 加合物的数量减少化学 8, 9, 10,11,12,13,14. 致癌/药物衍生的 dna 加合物的形成依赖于 dna 的个体基础, 并受 dna 中这些碱基序列的影响。dna 加合物的修复依赖于它们的位置 (在转录或非转录 dna 链上) 和类型的修改核苷酸序列8, 11, 12, 15, 16

在本文中, 我们描述了使用酶催化转化的化学物质 (药物) 的过程, 以调查其效力, 以活化成代谢物, 改变 dna (生成 dna 加合物)。对于共价 DNA 结合, 测试化合物通常应由氧化或还原反应激活, 取决于个别药物。被测试的化学物质的氧化或还原活化由 P450-dependent 酶系统介导的微粒体亚细胞分数或减少与硝酸目前在微粒 (NADH: 细胞色素b5 还原酶, P450 酶) 和细胞胞浆亚组分 (NQO1, XO, AO, 过氧化物酶)。反应性代谢产物随后绑定到 dna 加合物 dna 的形成。由于氧化和还原反应对于激活几种药物对这些活性物种都很重要, 本文介绍了采用氧化还原酶体系的实验过程。此外, 还详细介绍了能够检测和量化这些 DNA 加合物的适当方法。

两个独立的程序, 以确定测试化学, 激活的酶系统, 是绑定到 DNA 的建议: 32p-postlabeling 技术和利用放射性标记化合物 (e. g, 3H 或14C)。对于第一个飞行员, 建议筛选32p-postlabeling 检测。精确评价的溶液中 DNA 含量的测定必须在两种方法之前。

32p-postlabeling 技术利用非放射性化学物质 (致癌物/药物) 修饰的 DNA 的酶水解, 3´-phosphodeoxynucleosides, 在5´中加磷酸化与放射性磷 (32P)-OH 位置, 并通过色谱17 (图 1) 将化学核苷酸加合物从正常 (未修改) deoxynucleotides 分离出来。该化合物修饰的 DNA 由限制性、micrococcal 核酸酶和 exonuclease 的混合物水解而成, 称为脾脏磷酸二酯酶。含有正常 (未修改) 和修饰的 deoxyribonucleoside 3´ monophosphates 的水解 DNA 的混合物, 与 [γ-32P] atp 在 9.5 pH 值的载体 (非放射性) atp 和 T4-polynucleotide 激酶的存在下反应, 形成 5´-32P 标记的3´、5´ bisphosphates ("标准" 过程图 1)。所使用的碱性 pH 值能将 T4-polynucleotide 激酶的酶活性降到最低, dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´ monophosphates。在聚乙烯亚胺 (PEI) 纤维素上采用多向阴离子交换薄层色谱 (TLC)32 P 标记的加合物进行分离和解析, 其标记 deoxynucleotides 不经化学修饰 (图2).在第一和第二洗脱步骤 (在 D1 和 D2 方向), 标记正常 (未修改) deoxynucleotides 以及 [32P] 磷酸盐是洗脱从开始的薄层-裴-纤维素板使用电解液的水溶液到一个短的片断色谱纸应用于薄层板的顶部, 而含有束缚化学物质 (致癌物/药物-加合物) 的 deoxynucleotides 在培纤维素板的起始处保持, 以进一步解决在 D3 和 D4 方向有几个不同的溶剂系统 (图 2)。加合物的定位是使用屏幕增强显影进行的;分离的加合物被发现作为黑暗的可认识的斑点在 x 射线影片。斑点的区域从板材被切除并且用于定量放射性由液体闪烁或切伦科夫计数。目前还使用了一种存储荧光粉成像方法, 用于在32P-postlabeling 检测的图谱上对 DNA 加合物进行映射和量化。18快速成像机经常用于检测和量化 DNA 加合物。此方法比屏幕增强显影19技术提供的检测32P 的灵敏度高10倍。

DNA 加合物的数量被确定为相对加合标记 (RAL) 的值, 使用等式 (2) 计算如下:

cpm.在加合 deoxynucleotides
RAL =-----------------------------------------------------------------------------------------(2)
32p-ATP (cpm/pmol) x pmol deoxynucleotides 的特定活动

RALs 的值是 adducted deoxynucleotides 的计数率与总计 [adducted 和正常 (未修改) deoxynucleotides] deoxynucleotides2021的计数率的比率。但是, 此计算基于加合物和正常deoxynucleotides22 的相同标记效率。32postlabeling 技术的经典 ("标准") 过程适用于各种 dna 加合物 (笨重和/或非笨重的加合物), 然而, 它的灵敏度并不令人满意, 以检测在 DNA 中发现的低量加合物。使用此过程, 107中未修改的 deoxynucleotides dna (0.3 fmol 加合/µg dna) 中的加合量是可检测的。

对这种经典的32postlabeling 程序进行了多种修改, 提高了该技术的灵敏度。通过对 [γ-32P] ATP (强化过程) 的限制水平, 对32p 标记测定加合物的灵敏度达到了 10-100 倍以上。23,24进一步的过程, 增加了32p-postlabeling 方法的灵敏度, 利用含有加合物的消化 DNA 的孵化与核酸酶 P1 (从青霉马勃) 21(图 1)。这种酶倾向于 dephosphorylate 未修改的 deoxyribonucleoside 3´ monophosphates, 而 deoxynucleotides 与绑定化学品 (adducted 核苷酸) 本质上不是这种酶的基质。因此, 去磷酸化 deoxyribonucleoside 3´ monophosphates(即、deoxyribonucleosides) 不是由[32 p] 磷酸盐从γ-32 p] ATP 磷酸化而成的。然而, 某些化学物质被束缚的核苷酸 (adducted deoxynucleotides), 如 C8 脱氧的芳胺类加合物, 可以用这种酶 bedephosphorylated。与此相反, 大多数其他加合物(例如, 加物在 N 2 脱氧中替换) 不是核酸酶 P1 去磷酸化的.32postlabeling 的这种修改使此方法具有更高的灵敏度, 从而提高了三多个数量级的敏感性。此外, 此版本的32p-postlabeling 提供了一种方法, 即可以利用较高数量的 DNA (5-10 µg) 和过量的无载波 [γ- 32P] ATP。

加合25 描述的另一种方法是利用笨重的核苷酸加合物的物理化学性质, 可以在相转移剂四丁基的存在提取到 n 丁醇中。氯化物 (TBA) (图 1) 在 [32P] 磷酸盐标记之前, 而未修改的 deoxynucleotides 是由这种有机溶剂提取出来的。然而, 较少疏水性加合物, 例如 deoxynucleotides 改性与非芳香的笨重的基团或小烷基残渣, 没有有效地提取n-丁醇。因此, 在对32postlabeling 方法进行此修改分析时, 它们基本上是无法检测到的。

前面提到的32postlabeling 的版本都增加了 DNA 加合物的灵敏度和量化能力 (多达三级), 能够检测到每109、10正常核苷酸 (0.3-3 amol/µg DNA)。这两种方法被推荐用于测试化学品的效率, 以共价键绑定到 DNA, 因此, 他们在这项工作中详细描述。

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Protocol

所有动物实验都是按照《赫尔辛基宣言》 (311/1997, 捷克共和国农业部) 的规定进行的, 这是根据《关于保护和使用实验动物的条例》进行的。

1. 肝微粒体和胞浆组分的分离

  1. 用简单的微分离心法 (10.5万 x g) 制备大鼠肝脏亚细胞分 (微粒富含 P450 酶或富含硝酸或可溶性过氧化物的 cytosols)。
    注: 颗粒和上清液分别作为微粒和 cytosols。
    1. 用50毫米三盐酸缓冲液将肝脏样品 (1-10 克) 冲洗两次, pH 值7.4 包含150毫米氯化钾缓冲 (缓冲 1) (10 倍以上的体积比组织的重量,10-100 毫升), 并把组织切成小块 (大约 2 x 2 毫米大小)。
    2. 融汇该缓冲器 (> 3 体积/重量毫升/克) 存在于4摄氏度5分钟内的组织, 并通过过滤纸将组织中残留的非匀质件丢弃。离心匀浆在 600 x g为10分钟在4°c 和转移上清到另一个离心管。
    3. 重新融汇在缓冲 1 (1 毫升每1克组织) 的颗粒, 重复步骤 1.1.3, 并丢弃颗粒。离心机汇集上清液在 1.5万x g 为20分钟在4°c。将上清液转移到另一离心管。
    4. 离心机在 10.5万 x g上清液60分钟4摄氏度。收集上清 (细胞质) 和存储在整除数 (1-10 毫升) 在-80 摄氏度。使用布拉德福德26描述的方法表征细胞质的蛋白质含量。
    5. 在100毫米磷酸钠缓冲液中重新悬浮颗粒, pH 值为 7.4 (> 2 体积/重量毫升/克), 离心机在 10.5万 x g处为60摄氏度。放弃上清。重新融汇颗粒 (微粒) 在50毫米三盐酸缓冲, pH 7.4 包含150毫米氯化钾和20% 甘油 (< 5 体积/重量毫升/克) 在均质体在4°c。存储微粒在 0.5-1 毫升整除数在-80 摄氏度。使用布拉德福德26描述的方法表征蛋白质含量的微粒。
    6. 测定微粒中细胞色素 P450 的浓度。
      注: P450 酶在微粒中的浓度是由大村和佐藤27所描述的, 用于测定 P450 与一氧化碳 (CO) 的复合物的吸收。一氧化碳是一种有毒化合物, 必须小心处理和罩着。

2. 在酶系统存在的情况下, 用 DNA 孵化测试化学品 (致癌物/药物)

  1. 在含有细胞色素 P450 氧化酶系统的情况下, 用 DNA 培养测试化学品 (致癌物/药物)
    1. 准备孵化混合物, 其最终体积为0.75 毫升, 在4摄氏度, 以下化合物和酶系统。
      1. 混合100毫米磷酸盐缓冲液, pH 值 7.4, (0.375 毫升) 与10毫米的或生成系统 (10 毫米氯化镁2, 10 毫米 d-葡萄糖 6-磷酸盐, 10 毫米 NADP+, 1 U/毫升 d-葡萄糖 6-磷酸脱氢酶) (75 µL)。
      2. 加入这种混合物微粒或纯重组 P450 在 Supersomes, 这是微粒分离的昆虫细胞与杆状病毒结构的基因重组 P450 酶, 50 pmol P450 酶在50µL 微粒体或 supersomal制剂. 在实验室或从商业来源分离的肝脏微粒体分数。
      3. 添加1毫克小牛胸腺 DNA (0.3 毫升的库存溶液-3.3 毫克/毫升蒸馏水), 并在涡流振动筛上晃动5秒。
      4. 最后, 添加7.5 µL 0.1 毫米测试 ellipticine 药物溶解在亚砜和42.5 µL 蒸馏水, 以达到一个数量的孵化混合0.75 毫升。根据检测 DNA 加合物的过程, 使用标记3 H14 C 或无标号化学物质的化学品。
      5. 在涡流振动筛上摇动5秒, 在打开的管子上孵育37摄氏度, 30-60 分钟。
      6. 也准备两个控制孵化相似, 但 (i) 没有活化系统 (微粒体样品) 或 (ii) 与它, 但没有测试化合物。
  2. 孵化还原酶系统存在下的 DNA 检测化学物质 (致癌物/药物)
    1. 准备孵化混合物, 其最终体积为0.75 毫升, 在4摄氏度, 以下化合物和酶系统。
      1. 摄氏4摄氏度, 混合100毫米三 HCl 缓冲液, pH 7.4, 含0.2% 吐温 20, (0.375 毫升), 10 毫米溶液余子的 NQO1 还原酶 (µL), 胞浆分数 (肝胞浆分数-隔离在实验室或在使用胞浆的情况下从个人捐献者中分离出来的分数从含有1毫克蛋白质 (50 µL) 的商业来源获得。
      2. 添加1毫克小牛胸腺 DNA (0.2 毫升的库存溶液-3.3 毫克/毫升蒸馏水), 并在一个摇摇器 5 s。
      3. 最后, 添加7.5 µL 0.1 毫米测试化学物质 (溶解在蒸馏水, 甲醇, 乙醇或亚砜, 取决于化合物的溶解度) 和42.5 µL 蒸馏水达到0.75 毫升的容量为孵化混合物。根据检测 DNA 加合物的过程, 使用标记3 H14 C 或无标号化学物质的化学物质 (见下文)。
      4. 用氩气将反应混合物清除1分钟, 在5秒的振动器上摇动, 在37摄氏度的封闭管中孵育 30-60 分钟。
      5. 也准备两个控制孵化相似, 但 (i) 没有活化系统 (胞浆组分) 或 (ii) 与它, 但没有测试化学制品。
  3. 用有机溶剂提取孵化混合物去除过量的化学试剂
    1. 加入这些溶剂, 将孵化混合物与同一容积的醋酸乙酯 (或二乙基醚或己烷) 混合在试管中。在振动筛上摇动管子的内容, 直到乳液形成。
    2. 在室温下离心机中, 在 1600 x g处旋转 (3 分钟)。如果有机和水相不正确分离, 旋转一次更长的时间或更高的离心速度。
    3. 用吸管去除上部, 有机相收集。如果使用小体积 (< 400 µL), 则使用装有适当尖端的自动吸管。抛开这个有机的阶段。
    4. 重复步骤 2.3.1, 2.3.2, 和2.3.3。通过氮气流 (至少需要 5-10 分钟) 去除残留的有机溶剂。
  4. 孵化 DNA 的分离
    1. 苯酚/氯仿溶液中 DNA 的提取及其与乙醇的沉淀
      1. 消除蛋白质从孵化混合物中提取的 dna 与苯酚, 苯酚/氯仿 (1:1) 的 dna 溶液, 和氯仿的步骤如下所示。
      2. 将具有相同量的苯酚或苯酚/氯仿 (1:1) 的孵化混合物与一顶帽子的猎鹰或离心管结合在一起。搅拌混合物, 直到乳液形式。
      3. 在室温下离心机中, 在 1600 x g处旋转 (3 分钟)。如果有机和水相没有适当的分离, 旋转一次更长的时间或更高的离心速度。
      4. 用吸管将上水相转移到新的聚丙烯管上。如果使用小容量 (< 400 µL), 则使用装有适当尖端的自动吸管。与有机相一起去除蛋白质界面。
      5. 将上水相与苯酚和氯仿混合物的相同量 (1:1) 结合起来。重现步骤2.4.1.2。-2.4.1.4。
      6. 将上水相与相同量的氯仿结合, 重复步骤2.4.1.2。-2.4.1.4。用2卷的冷 (-20 °c) 乙醇回收 DNA。确定 DNA 溶液的体积。
      7. 通过添加5米氯化钠, 对 0.1 m 的最终浓度进行强力搅拌, 以适应单价阳离子的浓度。结合2卷的冷 (-20 °c) 乙醇和适当的混合。冷却到-20°c.
      8. 储存在-20 摄氏度, 直到 DNA 沉淀。当 dna 在孵化 (e. g) 期间被碎片化时 (通过在酶活化反应过程中形成氧自由基) 或在隔离过程中的 dna 体积小 (< 1 kb) 或当 dna 小数量 (< 0.1 毫克/mL), 冷却时间必须增加, 温度降低到-70 摄氏度。
      9. 旋转 (10 分钟) 在 1600 x g在0°c 在离心机。如果 DNA 以低浓度或小片段的形式存在, 则在更长的时间内旋转一次 (30 分钟)。放弃上清。
      10. 要除去可能存在于沉淀 dna 中的任何溶质 (或残留的测试化学痕迹), 用70% 乙醇和二乙基醚冲洗 dna。用冷 (-20 °c) 70% 乙醇洗涤沉淀的 DNA。旋转 (10 分钟) 在 1600 x g在0°c 在离心机。放弃上清。
      11. 重复步骤2.4.1.10。用冷 (-20 °c) 70% 乙醇洗涤沉淀的 DNA。旋转 (10 分钟) 在 1600 x g在0°c 在离心机。放弃上清。
      12. 重复步骤2.4.1.10。将管子置于吸水纸的垂直状态, 以除去残留的上清。通过添加1毫升乙醚, 从分离的 dna 中去除试验化学物质的潜在残留物, 对 dna 颗粒进行清洗。旋转 (10 分钟) 在 1600 x g在0°c 在离心机。放弃上清。
      13. 将 dna 颗粒溶于适当的体积 (通常在 100-400 µL 中, 以达到 0.5-1 µg/µL) 蒸馏水的 dna 浓度 (或在0.15 毫米柠檬酸钠和1.5 毫米氯化钠中)。dna 溶液可以在一夜之间站立4摄氏度, 或者可以加热到37摄氏度10-30 分钟, 以增加溶解 dna。
      14. 贮存前, 将 dna 分离成小整除数 (10-20 µL), 因为 dna 溶液的反复冻结和解冻可能导致加成浓度下降。贮存在-80 摄氏度或更冷。
        注: 分光光度法测定 dna: 一种简单而准确的方法, 它广泛用于测量制剂中 dna 的含量 (如果样品是纯的 (), 而没有大量的污染物, 如蛋白质、苯酚或其他核酸), 是分光光度法测量碱基吸收的紫外线的 DNA 量 (见上文所述的过程)28
  5. DNA 加合物形成的检测程序
    1. 32对 postlabeling 的测定
      注: DNA 水解利用本阶段制备的水解产物对加合物 (2.5.1) 以及正常 (未修改) deoxynucleotides (2.5.7) 进行分析。
      1. 将 micrococcal 核酸酶 (锰) 溶于水中, 浓度为450单位 (U)/毫升。透析对蒸馏水和调整到 300 U/毫升。透析脾脏磷酸二酯酶 (SPD) 溶液和调整 4 U/毫升。
      2. 混合锰和 spd 到最终浓度150亩/µL 锰和2.5 亩/µL spd (锰/SPD 解决方案)。采取含有12.5 µg 的 DNA 溶液, 在蒸发器中蒸发至干燥。溶解在6.5 µL 蒸馏水。
      3. 添加5.0 µL 锰/SPD 溶液 (最终浓度的锰是60亩/µL, 最终浓度的 SPD 是1亩/µL), 1.0 µL 消化缓冲 (最后浓度的琥珀酸钠是20毫米, 最后浓度 CaCl2是8毫米)。混合物的最终体积为12.5 µL. 混合并允许反应为3小时37摄氏度。
      4. 去除2.5 µL (转移到另一管) 进一步稀释和分析未修改的 deoxynucleotides (2.5.7)。
    2. 核酸酶 P1 浓缩程序
      1. 对剩余的10.0 µL 水解物, 添加0.65 µL 醋酸钠缓冲液 (最终浓度, 40 毫米), 0.65 µL ZnCl2溶液 (最终浓度0.1 毫米), 1.25 µL NP1 溶液 (最终浓度, 0.385 µg/µL), 0.45 µL 蒸馏水。混合物的最后体积是13µL。
      2. 允许混合物反应30分钟在37°c, 并且结束反应与增加3µL 的三溶液。
    3. n-丁醇浓缩过程
      1. 对剩余的10.0 µL DNA 水解液, 添加215µL 11.6 毫米甲酸铵溶液, pH 值 3.5, 25 µL 10 毫米 TBA 氯溶液。提取与250µL n-丁醇 (饱和与水) 通过剧烈的混合。在 1600 x g处旋转 (3 分钟) 以分隔图层, 然后脱下上n-丁醇层。再提取250µL n-丁醇 (饱和与水), 旋转, 脱下上n丁醇层, 并与前萃取物结合。
      2. 加入400µL 水 (饱和与n-丁醇) 对此萃取物, 并积极搅拌。旋转以分离层并删除底部的水层。用400µL 水 (用n-丁醇饱和) 重复此洗涤过程。将3µL 250 毫米的三 HCl 溶液, pH 9.5, 添加到n-丁醇层。蒸发n-丁醇在常温下在蒸发器中干燥。
      3. 将残留物溶于100µL n丁醇, 再蒸发至干燥, 并在16.0 µL 水中溶解残渣。
    4. 标签的加合物
      1. 添加1µL bicine 缓冲液 (标记缓冲) 和4.5 µL 的混合包含100µCi [γ-32P] ATP, 45 pmol 的冷 ATP, 10.0 U T4-PNK (T4-phosphonucleotide 激酶) 到16.0 µL 溶液从 NP1 或丁醇浓缩混合。试剂的最终浓度将如下:20 毫米 bicine, 10 毫米氯化镁2, 10 毫米 dithiotreitol, 0.5 毫米胺, 0.5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP。混合物的总体积为20µL。
      2. 允许混合物在室温下反应30分钟。将整个示例 (i. e20 µL) 应用到裴纤维素薄层板上 (2.5.6.)。
    5. NP1 或n-丁醇强化程序的疗效评价
      1. 用50µL 水冲洗管子的底部。搅拌三十年代和旋转 (1 分钟) 在 1600 x g在离心机, 以确定没有污染的盖子。5µL 在裴纤维素薄层板上 (20 x 20 厘米)。色谱仪使用280毫米的解决方案 (NH4)2, 所以4和 50 mM NaH2PO4, pH 6.8。
    6. adducted deoxynucleotides 的薄层色谱分离
      1. 用蒸馏水预洗薄层色板。特别推荐用于国产板材。
        注: 此清洗应进行, 以消除黄色的板材, 一种颜色, 可以提高背景, 特别是在溶剂的前面。
      2. 将整个样品点到裴纤维素薄层板上, 开始色谱 (2.5.4);加合物的清理是通过在 D1 和 D2 方向上开发板块(图 2) 来完成的。
      3. 以 D1 方向开发板 (图 2)。使用1.7 米磷酸钠缓冲液, pH 值为 6.8, 以确保 DNA 加合物在薄层色板开始时保持不动。类似, 使用此缓冲器在 D2 方向上开发板。有关过程的可能缓冲区的信息, 请参见为解决几种类型的加合20、28而描述的解决方案.
        注: 可省略 D2 方向的板的开发。
      4. 在连续两个浴缸中, 用色谱法洗去去离子水中的盘子5分钟。然后把盘子擦干。
      5. D4 3.5 米甲酸锂缓冲液、ph 值为 D3 方向的8.5 米尿素、0.5 米三盐酸缓冲液、ph 8.0、含0.8 米 LiCl 和8.5 米尿素的 D4 方向 (图 2), 开发出 D3 和3.5 方向的板材。必须对溶剂进行调整, 以在薄层板上开发加合点。有关 D3 和 D4 开发过程可能的缓冲区的信息, 请参见为解决几种类型的加合23、24、25、28而描述的解决方案.
      6. 为避免任何问题在 D4, 在开发以后在 D4 方向和水洗涤, 开发板材 (沿 D4) 在 1.7 M 磷酸钠, pH 值 6.0 (通常被分配作为发展方向 D5), 到纸灯芯 (12 x 11.5 cm) 的顶部。
        注意: D5 方向也可以省略。在这种情况下, 有必要打开薄层色谱池时, 溶剂已经达到了薄层色谱的顶部, 并允许运行高达60分钟。这种方法甚至比添加灯芯 (在许多实验室中经常使用的方法来删除 D4 中的任何问题) 要好。
    7. 水解后正常 (未修改) deoxynucleotides 的量化
      1. 稀释整除的水解物 (从2.5.1描述 DNA 水解) 与蒸馏水, (i. e, 2.5 µL 的消化混合物从2.5.1.调整为250µL, 而此解决方案的10µL 调整为150µL)。
      2. 采取5µL (10 pmol 正常 deoxynucleotides) 整除本文摘, 在µL 中添加 2.5 2.5.4 10 毫米的三 HCl 缓冲液、pH 值9.0 和标签.(混合物的最后的容量是10µL)。允许在室温下反应30分钟。
      3. 采取4µL 整除的混合物和稀释到750µL 10 毫米三 HCl, pH 9.0。混合和旋转, 以建立没有污染的盖子。在培纤维素薄层板上应用5µL。在280毫米 (NH4)2的解决方案中开发薄层色板, 所以4和 50 mM NaH2PO4, pH 6.5。允许干燥后薄层色谱。
      4. 使用显影在室温下进行约45分钟, 以本地化四未修改的核苷酸双磷酸盐。通过液体闪烁或切伦科夫计数来进行量化的切割点。
    8. 相对加合标记的计算 (RAL)
      1. 确定加合点中的计数值和标记为未修改 (正常) deoxynucleotides 的整除中的计数。
        注: 后者必须确定在18万计数比前者少的材料, 一个数字, 这是换算系数, 适用于未修改 (正常) deoxynucleotides 的计数, 以评估的 RAL 价值的加成水平。根据上面所示的方程式 (2) 计算出 DNA 加合物的 RAL。
    9. 用放射性标记药物检测测试致癌物或药物对 DNA 的约束力
      1. 用液体闪烁计数法评估用化学物质修饰的 DNA 的3H 或14C 的放射性。
      2. 在闪烁瓶中添加 10-50 µL 的 DNA 溶液到3毫升的闪烁溶液中。混合好。使用闪烁计数器测量放射性。

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Representative Results

使用这里描述的协议, 利用酶催化活化 (即, P450, 过氧化物酶, 还原酶), 以调查化学物质 (致癌物/药物) 的效力, 将代谢成中间体, 导致其共价绑定到 dna (生成 dna 加合物), 我们能够解决 (i) 抗癌剂 ellipticine 药理作用的新机制 (查看,29, 30, 31), (二) 两种病因学肾病与上尿路癌相关的植物生物碱马兜铃酸 (马兜铃酸肾病和巴尔干地方性肾病) (查看,32,33,34, 3536373839) 和 (iii) 几种致癌物质致癌性的毒性机制, 例如空气污染物 3-nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45及其还原对应, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48植物生物碱马兜铃酸,32,33,34,35,36,37,38,39和芳香胺o-甲醚。49,50,51,52此外, 使用所述方法确定了测定这些化学物质的生物效应的酶。

在这里, 有代表性的结果, P450s 和过氧化物氧化活化 ellipticine 导致生成共价加合物与 dna, 并在减少 3 NBA 的代谢物, 共价键改进的 DNA, 显示。

植物生物碱 ellipticine (511-二甲基-6H-pyrido [43-b] 咔唑) 及其衍生物是抗肿瘤药物, 通过多种机制作为 DNA 损伤药物, 包括在细胞周期的抑制和诱导细胞凋亡 (概述, 请参阅29,30,31)。使用这项工作中描述的协议, 我们证明了抗癌药物产生的共价 DNA 加合物后代谢 bioactivation 催化微粒 P450s (图 3) 和过氧化物(图 4)29,30,31,53,54,55,56,57,58,59,60,61, 这解释了此代理对癌症细胞30的强大效率。[3H]-核素 ellipticine 和32P postlabeling 技术的核酸酶 P1 版本主要用于研究 29, 30, 31, 53 ,61。利用所描述的协议, 采用亚细胞酶系统、酶抑制剂和纯酶的复合研究, 主要的 P450 酶氧化 ellipticine 对形成 DNA 加合物的活性物种和结构这些反应物种的特点是29,30,31,55。P450s 检查, 人类 CYP3A4 酶是最有效的 ellipticine 氧化 12-hydroxyellipticine 和 13 hydroxyellipticine, ellipticine 代谢产物, 自发分解为 ellipticine-12-ylium 和 ellipticine-13-ylium绑定到 DNA (图 5)。55,61 CYP 酶还产生进一步的代谢产物, 如 9-hydroxyellipticine, 被认为是解毒代谢产物, 7-hydroxyellipticine 和 ellipticine N2-氧化物, 它们被形成为次要ellipticine 代谢产物。9-hydroxyellipticine 以及 7 hydroxyellipticine 和 ellipticine N2氧化物主要由 CYP1A1 和 CYP2D6 分别组成。55,57,58

过氧化物 (、辣根过氧化物酶 (HRP)、乳过氧化物酶 (LPO)、髓 (MPO) 和 cyclooxygenases (COX-1 和 COX-2)) 代谢 ellipticine 生成相同的 ellipticine 源 DNA 加合物(图4 ) 61由图 5中显示的机制。

nitroaromatic 3-NBA (3 硝基-7H-奔驰deanthracen-7-one) 是柴油机排气的一个组成部分, 在机载粒子62,63,64中找到。这类污染物的主要代谢产物, 3-ABA,64,65是在长期暴露于柴油排放的盐矿工人的尿液中检测到的,63。这一发现表明, 这些工人被暴露在 3-NBA。这 nitroaromatic 导致大鼠肺肿瘤在气管灌注后67。3-NBA 也作为诱变在埃姆斯沙门氏菌测试 (在应变 YG1024 overexpressing nitroreductase 和O乙酰转移酶), 产生超过 600万 revertants 每 nanomole 在这个应变62。它的毒性效力也证明了通过生成共价加合物与DNA 在体外, 后, 通过多种酶活化, 使用本工作中描述的协议,在体内在几个啮齿动物动物器官(图6)39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,64,67,68

3-nba 衍生的 DNA 加合物形成后 3-nba 激活与胞浆硝酸(即, NQO1) 测量的核酸酶P1和 n-丁醇浓缩方法的 32 P postlabeling 方法中描述的协议在本研究中提出。结果表明, 在图 7中, 形成了多达五个 DNA 加合物 (加合点 1-5), 其中三的特征是 2-(2 '-deoxyadenosin-N6-基)-3-aminobenzanthrone (dAN6-C2-ABA; 加合点 1), N-(2 '-deoxyguanosin-n2-基)-3-aminobenzanthrone (dG-N2-C2-ABA; 加合点 3) 和N-(2 '-deoxyguanosin 8-基)-3-aminobenzanthrone (dG-C8-N-ABA; 合物点4和 5) (图 7 图 8)。利用 32P postlabeling 方法的核酸酶 P1 版本, dG-C8 N-ABA (加合点4和 5) 无法检测到 (7 和8)。此结果强调了此版本的32postlabeling 的某些限制, 即去磷酸化核酸酶 P1 (即加合物) 检测到的 adducted deoxynucleotides 的低 (如果有的话)。arylamines 氧化或将芳香 nitroderivatives 还原为N-hydroxyarylamine 衍生物, 取代脱氧 C8)。与 ellipticine 的研究类似, 利用该项工作中所描述的协议中的酶抑制剂、纯酶和 DNA 加合标准进行的复杂研究, 主要的胞浆还原酶代谢 3-nba 对产生 DNA 加合物的代谢产物, 即由 3-nba(N OH-ABA) 还原形成的反应性代谢产物, 以及 3-nba 产生的三种 DNA 加合物的结构特征(图7图 8)。在肝脏, bioactivation 3-NBA体外被发现主要归因于人和鼠 NQO1 (图 7), 而人类N,O-乙酰转移酶 (NATs), NAT2, NAT1, 硫酸转移酶 (夏洛蒂), SULT1A1 和, 到一个较小程度上, SULT1A2 是第二阶段激活 3-NBA42的主要酶。肝脏微粒体也有效激活 3-nba41, 但在小鼠, 3-nba 主要是由 NQO1 而不是这个微粒 bioactivated42。在肺, 这是 3-nba 致癌性67的靶组织, NQO1 和 XO 将 3-nba 减少到产生 DNA 加合物的代谢产物。然而, XO 似乎作为一个小 3-NBA 激活酶在这个器官69

Figure 1
图 1: 32p-postlabeling 检测的方案。 32postlabeling 方法及其增强过程的各个步骤将显示出来。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 在裴纤维素薄层板上的 DNA 加合洗脱模式。给出了加合物纤维素板上 DNA 的多向色谱。起源是裴纤维素薄层板的起始位置。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 32对小牛胸腺 dna 加合物 ellipticine、postlabeling 和 (a) 大鼠和 (B) 人肝微粒 (C) 无微粒的对照样品进行了分析。由箭头分配的加合物1和2由微粒 ellipticine 激活的 DNA 中的脱氧生成。32对 postlabeling 进行了使用核酸酶 P1 版本的方法 (步骤 2.5.2)。起源位于左下角 (D3 从下到上, D4 从左向右)。D2 被省略了。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 32对 ellipticine 介导的 DNA 加合物的 p-postlabeling 分析。在小牛胸腺 DNA 中形成的加合物与 ellipticine (100 µM) 和辣根过氧化物酶(A)、牛乳过氧化物酶 (B)、人类髓 (C)、绵羊cyclooxygenase-1 (D)、人类 cyclooxygenase-2 (E) (5 µg 过氧化物存在于孵化中), 从用40毫克 ellipticine 每千克体重 (生物武器) (F) 处理的大鼠的肝 dna, 从小牛胸腺 DNA 反应 ellipticine 和人类 CYP3A4 (G), 13-hydroxyellipticine(H), ellipticine N2-氧化物 (I) 和 12-hydroxyelipticine (J)。实验是使用核酸酶 P1 版本的检测 (步骤 2.5.2) 进行的。起源是在左下角 (D3 从底部到顶端和 D4 从左向右)。D2 被省略了。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 过氧化物和 CYPs 的氧化 ellipticine, 显示 ellipticine 代谢物和建议生成 DNA 加合物。在实验条件下, 方括号内的化合物仍未被检测到, 它们是亲代谢产物, 被假定为与 DNA 结合的终极物种。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 3-nitrobenzanthrone 的代谢活化和 DNA 加成物的形成.3-NBA, 3-nitrobenzanthrone;NQO1 (P) H: 醌氧化还原酶;NAT, N,O-乙酰转移酶;夏洛蒂, 硫酸转移酶;CYP, 细胞色素 P450;细胞色素 P450 氧化还原酶;辣根过氧化物酶;乳过氧化物酶;过氧化物酶, 髓;COX-1, cyclooxygenase-1R =-COCH3或-所以3H;dAN6-ABA, 2-(2 '-deoxyadenosinN6基)-3-aminobenzanthrone;dG-N2-ABA, n-(2 '-deoxyguanosin-n2-基)-3-aminobenzanthrone;dG-C8-n-ABA, n-(2 '-deoxyguanosin-8 基)-3-aminobenzanthrone。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 7
图 7: 32对 3-NBA 衍生 DNA 加合物的 postlabeling 分析。使用该方法的核酸酶 P1 (左面板) 和 n 丁醇提取版本 (右面板). a b, 加合物在小牛胸腺 DNA 中形成, 与 3-NBA (300 µM) 在激活后与大鼠肝 cytosols 反应。B bb, 加合物在小牛胸腺 DNA 中形成, 与 3-NBA (300 µM) 在活化后与人肝细胞质 (汇集分数) 反应。C 和Cb, 加合物在小牛胸腺 DNA 中形成, 与 3-NBA (300 µM) 在活化后与纯大鼠肝 NQO1 (0.09 单位 ) 起反应。D一个Db, 加合物在小牛胸腺 DNA 中形成, 与 3-NBA (30 µM) 激活后与人类重组 NQO1 (0.06 个单位) 反应。E Eb, 加合物N OH ABA 处理的鲑鱼睾丸 DNA 中形成。F Fb, 加合物在 C57BL/6 背景下的野生型窝肝 DNA 中形成, 每公斤2毫克 3-NBA b.w. 请单击此处查看此图的较大版本。

Figure 8
图 8: 32对 3-NBA 衍生 DNA 加合标准的 postlabeling 分析 [dG-N2-C2-ABA (A), dAN6-C2-ABA (B) 和 dG-C8N-ABA (C))] (小组 A) 和结构 3-nba 和这 3-nba-脱氧核糖核酸加合物 (小组 b)。使用了该方法的n丁醇提取版本 (a 中的面板)。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

本文展示了一种广泛应用的方法来研究化学物质对代谢中间体 bioactivated 的效力, 从而产生共价 DNA 加合物。这是一个关键的问题, 因为评价环境化学物质或药物对产生共价 DNA 加合物的代谢产物的作用, 是癌症及其治疗发展的一个重要领域。致癌物质对 DNA 的修饰被认为是肿瘤发展的原因, 现在被判定为致癌物质引起的致癌的中心教条。这一建议得到了各种结果的证实, 例如: (一) 各种致癌物的致癌性质取决于这些化合物对与 DNA 中的亲核中心反应的代谢产物的 bioactivation;(二) DNA 加合物的水平经常与许多致癌反应相对应;(iii) 和某些抑癌基因的突变和几种原癌基因的活化可能是由化学物质与致癌效用的改变引起的。此外, 抗癌药物对 dna 的共价修饰已被证明是这些药物的最有效的 dna 损伤效应之一, 导致其在癌症治疗中的应用。

有两个关键点决定了化学物质对其毒性性能的成功评估,它们的效用形成共价键加合物, 特别是: (i) 寻找、解决和表征酶的效率能够激活致癌物/药物的系统, 以亲的物种结合 DNA 的亲核中心, (ii) 开发和使用最合适的技术, 其中致癌物/drug–DNA 加合物发现和结构特征。本研究介绍了这两种特性的适当方法。

含有 P450s 和附加 bioactivating 酶的细胞组分 (微粒体或胞浆样品) 的分离程序过氧化物或硝酸, NQO1, XO 和 AO), 协议bioactivation 的酶系统 (孵化与 DNA) 的测试致癌物/药物, 及其在这项工作中的使用表明, 如代表性的结果表明, 它们的适用性, 以评估化学品的毒性性质。

此外, 适用于检测和量化加合物的方法有 DNA, 如两个浓缩版本32 P-postlabeling 技术 (核酸酶P1和 n-丁醇萃取过程) 和使用放射性标记的测试化合物被证明适合于评估致癌物/药物外来化合物的遗传毒性的研究。

关于共价 dna 加合物的测定, 不仅这两种方法, 还有其他适合于 DNA 加合物检测和测量的方法已建立 8, 70, 71, 72 ,73,74,75,76, 77,78,79,80,81,82. 直到 1981, DNA 加合物的定量化利用了放射性化学物质 (致癌物/药物),3 H14 C 标记, 这些都是综合编制的。此类方法对 ellipticine 的研究有用, 如本工作中所述 (请参见5354)。然而, 通常很难为其成功使用而准备高放射性的衍生物73,80,81。因此, 尽管仍使用此过程, 但不幸的是, 它仅限于体外实验, 与此处描述的类似。其他技术, 质谱, 电子喷雾电离 (ESI), 基质辅助激光解吸电离 (MALDI), 加速器质谱 (AMS),荧光, 生物方法, 如免疫分析, 和32对 postlabeling 在本研究中详细描述, 被开发了 (为回顾, 看见8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82)。

这项工作的协议中描述的32p-postlabeling 检测结果显示, 这不仅在体外实验中具有适用性 (见代表性结果), 即测试新化合物的遗传毒性或机械研究致癌物/药物活化, 但也有进一步的利用, 如评估人类暴露于环境致癌物, 研究肿瘤的发展机制, 监测 dna 修复, 检测 dna 损伤的内源性化合物和氧化反应, 并调查患者对细胞毒性抗癌药物的反应72,83

但是, 此技术并非没有某些限制73。DNA 的损伤不稳定作为 monodeoxynucleotides, 不能可靠地确定。32p-postlabeling 方法无法识别 DNA 加合物的结构。因此, DNA 加合物的结构表征常常依赖于用已知结构的合成标准来证明它们的共色谱。事实上, 在这项工作中显示的代表性结果的两个例子中都使用了这种方法 (ellipticine, 3-NBA)。

总之, 这项工作中所显示的协议可以被认为是评估环境化学物质或药物酶 bioactivated 产生共价 DNA 加合物的代谢产物效力的适当方法, 这是一个非常重要的过程,癌症的发展及其治疗。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项研究得到了捷克科学基金会 (GACR, 格兰特 17-12816S) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

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