Dannelsen af kovalent DNA adukter af enzymatisk aktiveret kræftfremkaldende stoffer og narkotika In Vitro og deres bestemmelse af 32P-postlabeling

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vurdere styrken af miljømæssige kemikalier og lægemidler, er enzymatisk bioactivated til mellemprodukter generere kovalente DNA adukter, er et vigtigt felt i udviklingen af kræft og dens behandling. Metoder er beskrevet for sammensatte aktivering til at danne DNA adukter, samt teknikker til deres påvisning og kvantificering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kovalente DNA adukter dannet af kemikalier eller stoffer med kræftfremkaldende potens er bedømt som en af de vigtigste faktorer i indledningen fase af kræftfremkaldende processer. Denne kovalent binding, der betragtes som årsag til tumordannelse, vurderes nu som en central dogme af kemiske carcinogenese. Her metoder er beskrevet beskæftiger de reaktioner, der katalyseres af cytochrom P450 og yderligere biotransformation enzymer til at undersøge styrken af kemikalier eller lægemidler til deres aktivering til metabolitter danner disse DNA adukter. Procedurer er præsenteret beskriver isolation af cellulære fraktioner besidder biotransformation enzymer (mikrosomale og cytosole prøver med cytokromer, der P450 eller andre biotransformation enzymer, dvs., peroxidases, NADPH: cytokrom P450 oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase, eller xanthin oxidase). Derudover metoder er beskrevet som kan bruges til metabolisk aktivering af analyseret kemikalier af disse enzymer samt dem til isolering af DNA. Yderligere, de relevante metoder i stand til at påvise og kvantificere kemiske/stof-afledte DNA adukter dvs., forskellige modifikationer af 32P-postlabeling teknik og beskæftigelse af radioaktivt mærket analyseret kemikalier, er vist i detaljer.

Introduction

Metabolismen af fremmedstoffer (Miljøkontaminanter eller narkotika) forekommer i to faser1. Faser I og II har til formål at gøre de oprindeligt hydrofobe (ikke vandopløselig) forbindelser mere hydrofile (vandopløselige), hvilket gør dem let excretable via urin, afføring eller sved. Fase I (functionalization) reaktioner omfatter oxidation, reduktion, og hydroxylering katalyseres af enzymer såsom cytokrom P450s (P450s, CYPs), peroxidases (dvs., cyclooxygenase, COX), aldo-keto reductases (AKRs), og mikrosomalt Flavin-holdige monooxygenases (FMO'er). Fase I indeholder også reduktion reaktioner, medieret af en række reductases dvs mikrosomale NADPH: cytokrom P450 reduktase (POR) og cytosole NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), xanthin oxidase (XO) og aldehyd oxidase (AO)1 . I den anden fase (konjugering), funktionelle grupper, der var fastgjort i fase brugte jeg konjugat små polære molekyler for at øge polaritet. Eksempler på enzymer anses for at deltage i fase II omfatter sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT'er), methyltransferases såsom catechol -O- methyltransferase (COMT), glutathion S- reaktion transferaser (GSTs), og uridine ud glucuronosyltransferases (UGTs)1. Klassificering af enzymer i fase I eller II er, dog, ikke stive, og nogle enzymer kan velsagtens grupperes i enten kategori.

P450 enzymer (EF 1.14.14.1) er hæm indeholdende proteiner til stede i forskellige organismer, der deltager i biotransformation af mange kemikalier, katalysere deres konvertering3,4. P450 Enzymer katalyserer hydroxylering af mange substrater, med en reaktion, hvor ét atom af dioxygen er indført i molekyle af fremmedstoffer, mens det andet atom ilt, er reduceret til form vand ved den reaktion, der kræver to elektroner [ligningen (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450 enzymer lokaliseret i det endoplasmatiske reticulum membran af mammale celler (mikrosomale P450 systemer) er medlemmer af multienzyme monooxygenase system, hvilket yderligere indeholder NADPH: cytokrom P450 reduktase (POR) og cytokrom b5 , substrat enzymet betegnes som NADH: cytokrom b5 reduktase. En generelt accepteret teori hypothesizes, at donor af to elektroner til P450 er NADPH/POR system. Ikke desto mindre kan cytokrom b5 også fungere som en donor af elektroner for P450, nemlig som en donor af elektron reduktion P450 under anden reduktion af sin reaktion cyklus, hvor det fungerer sammen med NADH: cytokrom b5 reduktase2,3,4.

Pattedyr udnytte forskellige P450 enzymer (f.eks. enzymer familier 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 og 27) til syntese af værdifulde endogene stoffer, såsom steroider, og bruge dem til katabolisme af naturprodukter2,3 . De andre CYP pattedyr enzymer, såsom menneskelige CYP1A2, 2 c 9, 2 c 19, 2D 6 og 3A4, nedbryde eksogene kemikalier, der anvendes som lægemidler. 5 , 6 de mest vigtige enzymer katalysere metabolisme af narkotika er CYPs af 3A underfamilie, især CYP3A4. Konverteringer af fremmedstoffer, som pro-kræftfremkaldende og pro-giftstoffer, er medieret af menneskelig CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 og 3A42,5. De fleste af disse CYPs findes i leveren (undtagen CYP1A1 og 1B1). Ikke desto mindre, CYPs er også udtrykt i flere ekstrahepatisk organer. Sådanne P450s kunne være af stor betydning, overvejende når deltager de i bioactivation metabolisme af kemikalier (narkotika) til reaktiv mellemprodukter i disse organer7. Forskellige P450s er fremkaldt af flere forbindelser, der er deres substrater, selv om dette ikke nødvendigvis er tilfældet.

Mange P450 enzymer spiller en rolle i kemiske (narkotika) toksicitet. De kan konvertere fremmedstoffer ikke kun i deres metabolitter, afgiftning, men også aktivere dem reaktive arter, som ændrer endogene makromolekyler, der desuden udstiller forskellige biologiske egenskaber, normalt forårsager deres toksicitet. DNA, lipider og proteiner kan være mål for deres ændring af reaktive electrophiles og radikaler genereret fra aktiveret kemikalier. I tilfælde af DNA, løse flere vigtige gen svar og deres mekanismer er allerede kendt2,3,4,5.

Ændringer i DNA kan resultere i en nedgang i celle vækst kontrol, og dette fænomen er anset for at være den dominerende faktor, der fører til udvikling af kræftfremkaldende processer. Generation af kovalent DNA adukter med kemikalier med kræftfremkaldende potens er bedømt som en af de vigtigste skridt i indledningen fase af kræftfremkaldende processer8,9,10,11. Det blev påvist, at relationer mellem dannelsen af DNA adukter og tumordannelse opstår, mens et fald i mængden af DNA adukter er ansvarlig for naturstoffers8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. dannelsen af kræftfremkaldende/stof-afledte DNA adukter afhænger af enkelte baser i DNA, og påvirkes af sekvenser af disse baser i DNA. Reparationer af DNA adukter er afhængig af deres placering (på den transskriberede eller ikke-transskriberede DNA streng) og typer af modificerede nukleotid-sekvenser8,11,12,15, 16.

I denne artikel vil vi beskrive procedurer udnytter de enzym-katalyserede konvertering af kemikalier (medicin) at undersøge deres potens skal aktiveres i metabolitter, som er modificeret DNA (generere DNA adukter). Kovalente DNA bindende, testforbindelsen bør normalt være aktiveret enten af oxidative eller reduktiv reaktioner, afhængigt af individuelle narkotika. Oxidative eller reduktiv aktivering af testede kemikalier er medieret af et P450-afhængige enzymatisk system i de mikrosomale subcellulært brøkdel eller ved reduktion med reductases findes både i microsomes (POR, NADH: cytokrom b5 reduktase, P450 enzymer) og i cellulære cytosole subcellulært fraktioner (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reaktive metabolitters derefter binde til DNA danner DNA adukter. Fordi både oxidative og reduktiv reaktioner er vigtigt at aktivere flere lægemidler til disse reaktive arter, er de eksperimentelle procedurer beskæftiger oxidation/reduktion af enzymatiske systemet beskrevet. Ydermere, egnede metoder i stand til at påvise og kvantificere disse DNA adukter er beskrevet i detaljer.

To uafhængige procedurer til at bestemme, om teststoffet, aktiveres ved enzymatisk systemer, er bundet til DNA anbefales: 32P-postlabeling teknik og udnytte radioaktivt mærket stof (fx., 3H eller 14 C). For først anbefales pilot, screening 32P-postlabeling assay. Fastlæggelsen af DNA-indhold i løsninger, netop evalueret, skal gå forud for begge metoder.

32P-postlabeling teknikken udnytter enzymatisk hydrolyse af DNA modificeret af ikke-radioaktive kemikalier (kræftfremkaldende/narkotika) til 3´-phosphodeoxynucleosides, ekstra fosforylering med radioaktivt fosfor (32P) på 5´- ÅH adukter holdning og adskillelse af kemikalie-deoxynucleotide fra normal (uændrede) deoxynucleotides ved kromatografi17 (figur 1). DNA modificeret ved kemisk forbindelse er hydrolyseret af en blanding af endonuklease, micrococcal nukleasen og exonuclease, kendt som milt phosphodiesterase. Blandingen af hydrolyseret DNA indeholdende både almindelig (uændrede) og ændret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates er reagerede med [γ -32P] ATP i overværelse af carrier (ikke-radioaktive) ATP og T4-polynucleotide kinase ved pH 9.5 til form 5´- 32P-mærket 3´, 5´-bisphosphates ("standard" procedure i figur 1). Den anvendte basisk pH er i stand til at minimere enzymaktiviteten i T4-polynucleotide kinase til dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates på position 3´. Adskillelse og opløsning på 32P-mærket adukter fra mærket deoxynucleotides, ikke som ændres af kemikalier er udført af flerstrenget anion-exchange tyndtlagskromatografi (TLC) på polyethyleneimine (PEI) cellulose (figur 2 ). I de første og anden eluering trin (i D1 og D2 retning), er mærket normal (uændrede) deoxynucleotides samt [32P] phosphat elueret fra starten af TLC-PEI-cellulose pladen ved hjælp af vand løsninger af elektrolyt på en kort stykke af kromatografiske papir anvendes på toppen af TLC-pladen, der henviser til, at de deoxynucleotides, der indeholder bundet kemikalier udstiller hydrofobe egenskaber (kræftfremkaldende/stof-adukter) vedligeholdes ved starten af PEI-cellulose plade skal desuden løses med flere forskellige opløsningsmiddel systemer i D3 og D4 retninger (figur 2). Lokalisering af adukter udføres ved hjælp af skærmen forbedret Autoradiografi; den adskilte adukter registreres som mørke genkendelige pletter på X-ray film. Områderne af steder er skåret ud fra pladen og bruges til at kvantificere radioaktivitet af flydende scintillation eller Cerenkov tælle. En storage phosphor billedbehandling metode, der er blevet tilpasset til at kortlægge og kvantificere DNA adukter på kromatogrammer opdaget af 32P-postlabeling assay er nu også bruges. 18 den Instant Imager maskine er ofte udnyttet til sådan påvisning og kvantificering af DNA adukter. Denne metode giver mere end 10 - gange højere følsomhed til at afsløre 32P end teknikken med skærmen forbedret Autoradiografi19.

Mængder af DNA adukter bestemmes som værdier af relativ addukt mærkning (RAL), beregnes ved hjælp af ligningen (2) som følger:

CPM. i addukt deoxynucleotides
RAL =---(2)
specifikke aktivitet af 32P-ATP (i cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

Værdierne af uindfriede forpligtelser er forholdet mellem tæller satser af adduceret deoxynucleotides over tæller satser for alt [adduceret og normal (uændrede) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21. Denne beregning er imidlertid baseret på lige mærkning virkningsgrader adukter og normal deoxynucleotides22. Klassisk ("standard") proceduren for 32P-postlabeling teknik er passende for forskellige DNA adukter (pladskrævende og/eller ikke-pladskrævende adukter), men dets følsomhed er ikke tilfredsstillende at opdage adukter findes i små mængder i DNA. Brug denne procedure, kan mængden af en adduct i 107 uændrede deoxynucleotides i DNA (0,3 fmol adduct/µg DNA) påvises.

En række ændringer af denne klassiske 32P-postlabeling procedure har været udnyttet til at ophøje følsomheden af teknikken. Op til 10 til 100 gange højere følsomhed for bestemmelse af adukter af 32P-mærkning er opnået ved hjælp af begrænsende niveauer af [γ -32P] ATP (intensivering procedure). 23 , 24 en yderligere procedure giver en stigning i følsomheden af 32P-postlabeling metode udnytter en inkubation af fordøjet DNA indeholdende adukter med nukleasen P1 (fra Penicillium citrinum)21 (figur 1). Dette enzym foretrækker at dephosphorylate uændret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, hvorimod deoxynucleotides med bundne kemikalier (adduceret nukleotider) er stort set ikke substrater af dette enzym. Derfor defosforyleret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (dvs., deoxyribonucleosides) er ikke fosforyleret af T4-polynucleotide kinase af [32P] fosfat fra γ -32P] ATP. Men nogle af nukleotider hvor kemikalier er bundet (adduceret deoxynucleotides), som arylamine adukter substitueret på C8 af deoxyguanosine, kan bedephosphorylated af dette enzym. I modsætning hertil er de fleste andre adukter (fxadukter substitueret på N2 i deoxyguanosine) er ikke defosforyleret af nukleasen P1. Denne ændring af 32P-postlabeling gør denne metode betydeligt mere følsomme, øge sin følsomhed ved mere end tre størrelsesordener. Desuden, denne version af 32P-postlabeling giver en metode hvor højere mængder DNA (5-10 µg) og et overskud af carrier-fri [γ - 32P] ATP kan blive udnyttet.

En anden metode til at berige den adukter, beskrevet af Gupta25, udnytter de fysisk-kemiske egenskaber af pladskrævende deoxynucleotide adukter, der kan udtrækkes til n-butanol i overværelse af en fase transfer agent tetrabutylammonium chlorid (TBA) (figur 1) før [32P] phosphat mærkning, hvorimod umodificeret deoxynucleotides er dårligt udvundet af denne organisk opløsningsmiddel. Men mindre hydrofobe adukter, består for eksempel på deoxynucleotides modificerede med ikke-aromatiske pladskrævende fraspaltning eller små alkyl restkoncentrationer, er ikke effektivt ekstraheret med n-butanol. De er derfor hovedsagelig målbart når analyseres af denne ændring af 32P-postlabeling metode.

Begge de tidligere nævnte versioner af 32P-postlabeling øget følsomhed og kvantificering af DNA adukter enormt (op til tre størrelsesordener), at være i stand til at opdage en addukt pr. 109,10 normale nukleotider (0,3 - 3 Jørgen/µg DNA). Disse to metoder er anbefalet til testning kemikalier til deres effektivitet kovalent binding til DNA, og derfor, de er beskrevet i dette værk i detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med reglerne for pleje og anvendelse af forsøgsdyr (311/1997, Ministeriet for landbrug, Tjekkiet), som er i overensstemmelse med Helsinki-erklæringen.

1. isolering af hepatisk mikrosomale og cytosole fraktioner

  1. Forberede lever subcellulært fraktioner (microsomes rig på P450 enzymer eller cytosols rige i reductases eller opløselige peroxidases) fra rotter ved simpel differential centrifugering (105.000 x g).
    Bemærk: Pellet og supernatanten er taget som microsomes og cytosols, henholdsvis.
    1. Vaske de lever prøver (1-10 g) to gange med 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4 indeholdende 150 mM KCl buffer (buffer 1) (10-gange højere mængder end vægten af væv, dvs 10-100 mL) og skære væv i små stykker (af omkring 2 x 2 mm størrelse).
    2. Homogeniseres væv i denne buffer (> 3 volumen/vægt mL/g) i homogeniseringsapparat ved 4 ° C i 5 min, og kassér resterende ikke-homogeniseret stykker af væv ved filtrering ved hjælp af Filtrer papir. Centrifugeres homogenatet ved 600 x g i 10 min. ved 4 ° C og overføre supernatanten til et andet centrifugering rør.
    3. Re homogeniseres pellet i buffer 1 (1 mL pr. 1 gram væv), Gentag trin 1.1.3., og kassér pelleten. Centrifugeres poolede analysere på 15.000 x g i 20 min. ved 4 ° C. Overføre supernatanten til et andet centrifugering rør.
    4. Centrifugeres supernatanten ved 105.000 x g i 60 min. ved 4 ° C. Indsamle supernatanten (cytosol) og gemme det i delprøver (1-10 mL) ved-80 ° C. Karakterisere cytosol for mængden af protein ved hjælp af metoden beskrevet af Bradford26.
    5. Genopslæmmes pellet i 100 mM natrium fosfat buffer, pH 7,4 (> 2 volumen/vægt mL/g), centrifuge på 105.000 x g for 60 min. ved 4 ° C. Supernatanten. Re homogeniseres pellet (microsomes) i 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4 indeholdende 150 mM KCl og 20% glycerol (< 5 volumen/vægt mL/g) i homogeniseringsapparat ved 4 ° C. Opbevar microsomes i 0,5 - 1 mL alikvoter ved-80 ° C. Karakterisere microsomes for indholdet af proteiner ved hjælp af metoden beskrevet af Bradford26.
    6. Bestemme koncentrationen af cytokrom P450 i microsomes.
      Bemærk: Koncentrationen af P450 enzymer i microsomes er målt som beskrevet af Omura og Sato27, bestemmelse af optagelsen af komplekset af reduceret P450 med kulilte (CO). Kulilte er en giftig sammensatte, og skal håndteres med omhu og i en hætte.

2. inkubationer Test kemikalier (kræftfremkaldende stoffer/narkotika) med DNA i overværelse af enzymatisk systemer

  1. Inkubation af prøve kemikalier (kræftfremkaldende stoffer/narkotika) med DNA i overværelse af oxidative enzymatisk systemer indeholdende cytokromer, der P450
    1. Forberede inkubation blandinger indeholdende, i en endelige mængden af 0,75 mL ved 4 ° C, følgende forbindelser og enzymatiske systemer.
      1. Blandes 100 mM fosfat buffer, pH 7,4, (0.375 mL) med 10 mM NADPH eller NADPH-genererende system (10 mM MgCl2, 10 mM D-glucose 6-phosphat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glucose-6-fosfat dehydrogenase) (75 µL).
      2. Tilføj til denne blanding microsomes eller ren rekombinant P450 i Supersomes, som er microsomes isoleret fra insekt celler transfekteret med en baculovirus konstruktion der indeholder cDNA af rekombinant P450 enzymer, 50 pmol P450 enzymer i 50 µL mikrosomale eller supersomal præparater - hepatiske mikrosomale fraktioner isoleret i laboratoriet eller fra en kommerciel kilde.
      3. Tilsæt 1 mg kalv thymus DNA (0,3 mL af stamopløsningen - 3,3 mg/mL i destilleret vand), og ryst på en vortex shaker til 5 s.
      4. Endelig, tilføje 7.5 µL 0.1 mM test ellipticine stof opløst i DMSO og 42,5 µL destilleret vand for at nå til et volumen på inkubation blanding af 0,75 mL. Brug kemikalier mærket med 3H eller 14C eller umærkede kemikalier, afhængigt af proceduren for påvisning af DNA adukter.
      5. Ryste på en vortex shaker til 5 s. Incubate i åbnede rør ved 37 ° C i 30-60 min.
      6. Også forberede to kontrol inkubationer ligeledes, men (jeg) uden en aktiverende system (mikrosomale prøver) eller (ii) med det, men uden den sammensatte prøve.
  2. Inkubationer test kemikalier (kræftfremkaldende stoffer/narkotika) med DNA i overværelse af reduktiv enzymatisk systemer
    1. Forberede inkubation blandinger indeholdende, i en endelige mængden af 0,75 mL ved 4 ° C, følgende forbindelser og enzymatiske systemer.
      1. Ved 4 ° C, blandes 100 mM Tris-HCl buffer, pH 7,4, indeholdende 0,2% Tween 20, (0.375 mL), 10 mM løsning af cofaktor for NQO1 reduktiv enzym (NADPH) (75 µL), cytosole brøkdel (hepatisk cytosole fraktioner - isoleret i laboratoriet eller ved hjælp af det cytosole brøker isoleret fra individuelle menneskelige donorer de blev indhentet fra de kommercielle kilde indeholdende 1 mg protein (50 µL)).
      2. Tilsæt 1 mg kalv thymus DNA (0,2 mL af stamopløsningen - 3,3 mg/mL destilleret vand), og ryst på en shaker til 5 s.
      3. Endelig, tilføje 7,5 µL 0.1 mM teststoffet (opløses i destilleret vand, methanol, ethanol eller DMSO, afhængigt af opløseligheden af sammensat) og 42,5 µL destilleret vand for at nå til et volumen på 0,75 mL til inkubation blanding. Brug kemikalier mærket med 3H eller 14C eller umærkede kemikalier, afhængigt af proceduren for påvisning af DNA adukter (se nedenfor).
      4. Rense reaktionsblandingen med argon i 1 min. Ryst på en shaker til 5 s. Incubate i lukkede rør ved 37 ° C i 30-60 min.
      5. Også forberede to kontrol inkubationer ligeledes, men (jeg) uden en aktiverende system (cytosole brøker) eller (ii) med det, men uden test kemikalier.
  3. Udvinding af inkubation blandinger med organiske opløsningsmidler til at fjerne overskydende af test kemikalier
    1. Bland inkubation blandingen i et reagensglas med en kasket med den samme mængde af ethylacetat (eller diethylether eller hexan) ved at tilføje disse opløsningsmidler. Ryst indholdet af røret på en shaker indtil en emulsion former.
    2. Spin (3 min) på 1.600 x g i en centrifuge ved omgivelsestemperatur. Hvis den økologiske og vandig fase ikke er korrekt separeret, spin en gang mere for en længere periode eller med en højere hastighed, centrifugering.
    3. Fjern den øverste, organiske fase indsamling med en pipette. Hvis små mængder (< 400 µL) er brugt, udnytte en automatisk pipette forsynet med en egnet spids. Kaste denne organiske fase.
    4. Gentag trin 2.3.1., 2.3.2., og 2.3.3. Fjerne resterende organiske opløsningsmidler ved en strøm af nitrogen gas (mindst 5-10 min af fjernelse er påkrævet).
  4. Isolering af DNA fra inkubationer
    1. Udvinding af DNA fra løsninger med fenol/kloroform og dens nedbør med ethanol
      1. Fjerne proteiner for at isolere DNA fra inkubation blandinger af uddrager proteiner fra løsninger af DNA med phenol, fenol/chloroform (1:1), og chloroform ved den procedure, der er vist nedenfor.
      2. Kombinere inkubation blanding med den samme mængde af phenol eller phenol/chloroform (1:1) i en Falk eller Eppendorf rør med en fælles landbrugspolitik. Blandingen omrøres indtil en emulsion former.
      3. Spin (3 min) på 1.600 x g i en centrifuge ved omgivelsestemperatur. Hvis den økologiske og vandig fase ikke adskilles ordentligt, spin en gang mere for en længere periode eller med en højere hastighed, centrifugering.
      4. Overføre den øverste vand fase med en pipette til en ny polypropylen tube. Hvis små mængder (< 400 µL) er brugt, udnytte en automatisk pipette forsynet med en egnet spids. Fjerne grænsefladen protein sammen med den organiske fase.
      5. Kombiner den øverste vand fase med det samme beløb af en blanding af phenol og kloroform (1:1). Reproducere trin 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Kombiner den øverste vand fase med det samme beløb af chloroform og gentage trin 2.4.1.2. -2.4.1.4. Genskab DNA ved fældning med 2 bind af kold (-20 ° C) ethanol. Bestemme mængden af DNA-løsning.
      7. Tilpasse koncentrationen af monovalent kationer ved tilsætning af 5 M natriumklorid til finalen koncentrationer på 0,1 M. rør kraftigt. Kombiner med 2 bind af kold (-20 ° C) ethanol og bland ordentligt. Afkøles til-20° C.
      8. Opbevar ved-20 ° C, indtil DNA er fældet. Hvornår DNA er fragmenteret under inkubationer (fx., ved dannelse af ilt radikaler under den enzymatiske aktivering reaktion) eller under isolation procedure til størrelsen af DNA, der er lille (< 1 kb) eller når DNA er til stede i små mængder (< 0,1 mg / mL), tidspunktet for køling har skal øges og temperaturen faldt til-70 ° C.
      9. Spin (10 min) på 1.600 x g ved 0 ° C i en centrifuge. Hvis DNA er til stede ved lave koncentrationer eller i form af små fragmenter, dreje en gang mere for en længere periode (30 min). Supernatanten.
      10. For at fjerne eventuelle opløste stoffer (eller resterende spor af den kemiske test) som kan være til stede i udfældes DNA, vask DNA med 70% ethanol og diethylether. Vask udfældes DNA med koldt (-20 ° C) 70% ethanol. Spin (10 min) på 1.600 x g ved 0 ° C i en centrifuge. Supernatanten.
      11. Gentag trin 2.4.1.10. Vask udfældes DNA med koldt (-20 ° C) 70% ethanol. Spin (10 min) på 1.600 x g ved 0 ° C i en centrifuge. Supernatanten.
      12. Gentag trin 2.4.1.10. Lægge røret i en lodret stat på absorberende papir til at fjerne de resterende supernatanten. Vask DNA pellet ved tilsætning af 1 mL dietylaeter kassere de potentielle rester af kemiske fra isolerede DNA test. Spin (10 min) på 1.600 x g ved 0 ° C i en centrifuge. Supernatanten.
      13. Opløse DNA pellet i den passende mængde (normalt i 100-400 µL til at opnå en DNA koncentration på 0,5 - 1 µg/µL) destilleret vand (eller i 0,15 mM natriumcitrat og 1,5 mM natriumchlorid). DNA-løsning kan stå ved 4 ° C natten over, eller kan være opvarmet til 37 ° C i 10-30 min at øge opløse DNA.
      14. Før opbevaring, adskille DNA i små prøver (10-20 µL), fordi gentagen nedfrysning og optøning af DNA løsninger kan resultere i et fald i addukt koncentrationer. Opbevares ved-80 ° C eller koldere.
        Bemærk: Spektrofotometrisk bestemmelse af DNA: den simpel og præcis metode, som er almindeligt anvendt til at måle mængden af DNA i et præparat, hvis prøven er ren (dvs.uden betydelige mængder af forurenende stoffer, såsom protein, phenol, eller andre nukleinsyrer), absorberes spektrofotometrisk måling af mængden af DNA af UV-bestråling af baser (se de procedurer, der er beskrevet tidligere)28.
  5. Procedurer for påvisning af DNA addukt dannelse
    1. 32 P-postlabeling analyse
      Bemærk: DNA hydrolyse udnytter hydrolysat forberedt på dette stadium for analysen af adukter (2.5.1.) samt af normal (uændrede) deoxynucleotides (2.5.7.).
      1. Opløs micrococcal nukleasen (MN) i vand ved en koncentration på ~ 450 enheder (U) / mL. Dialyze mod destilleret vand og justere til 300 U/mL. Dialyze milt phosphodiesterase (SPD) løsning og tilpasse sig til 4 U/mL.
      2. Bland MN og SPD at endelige koncentrationer 150 mU/µL MN og 2,5 mU/µL SPD (MN/SPD løsning). Tage DNA løsning indeholdende 12,5 µg, og inddampes til tørhed i en fordamper. Opløses i 6,5 µL destilleret vand.
      3. Tilføje 5.0 µL MN/SPD løsning (endelig koncentration af MN er 60 mU/µL, endelige koncentration af SPD er 1 mU/µL), og 1,0 µL fordøjelsen buffer (endelig koncentration af natrium succinat er 20 mM, endelige koncentration af CaCl2 er 8 mM). Den endelige volumen af blandingen er 12,5 µL. Mix og tillade reaktioner i 3 timer ved 37 ° C.
      4. Fjerne 2,5 µL (overførsel til et andet rør) for yderligere fortynding og analyse af uændrede deoxynucleotides (2.5.7.)
    2. Nukleasen P1 berigelse procedure
      1. De resterende 10,0 µL af hydrolysat, tilføje 0,65 µL natrium acetat buffer (endelig koncentration, 40 mM), 0,65 µL ZnCl2 løsning (endelig koncentration 0,1 mM), 1,25 µL NP1 løsning (endelig koncentration, 0.385 µg/µL) og 0,45 µL destilleret vand. Den endelige volumen af blandingen er 13 µL.
      2. Lad blandingen reagere i 30 minutter ved 37 ° C, og afslutte reaktion med tilsætning af 3 µL af Tris løsning.
    3. n-Butanol berigelse procedure
      1. De resterende 10,0 µL DNA hydrolysat, tilføje 215 µL af 11,6 mM ammonium formate løsning, pH 3,5 og 25 µL 10 mM TBA chloridopløsning. Uddrag med 250 µL n-butanol (mættet med vand) ved energisk blanding. Spin (3 min) på 1.600 x g til separate lag, og tage de øverste n-butanol lag. Udtrække en gang mere med 250 µL n-butanol (mættet med vand), spin, tage ud de øverste n-butanol lag, og kombinere med tidligere ekstrakt.
      2. Tilsæt 400 µL vand (mættet med n-butanol) til dette uddrag, og bland kraftigt. Spin for at adskille lag og slette det nederste vandige lag. Gentag denne vask procedure ved hjælp af 400 µL vand (mættet med n-butanol). Tilføje 3 µL af 250 mM Tris-HCl løsning, pH 9.5, n-butanol lag. Fordampe n-butanol til tørhed i en fordamper ved stuetemperatur.
      3. Remanensen opløses i 100 µL n-butanol, inddampes til tørhed igen, og Remanensen opløses i 16,0 µL vand.
    4. Mærkning af de adukter
      1. Tilføj 1 µL bicine bufferopløsning (mærkning buffer) og 4,5 µL af en blanding indeholdende 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol af kolde ATP og 10,0 U af T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinase) til 16,0 µL løsning fra NP1 eller butanol berigelse mix. De endelige koncentrationen af reagenserne vil være følgende: 20 mM bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 0,5 mM spermidine og 0,5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Det samlede volumen af blandingen er 20 µL.
      2. Lad blandingen reagere i 30 min. ved stuetemperatur. Gælder hele prøven (dvs. 20 µL) på PEI-cellulose TLC-pladen (2.5.6.).
    5. Evaluering af effekten af NP1 eller n -butanol styrke procedurer
      1. Vaske bunden af røret med 50 µL vand. Mix kraftigt i 30 s og spin (1 min) på 1.600 x g i en centrifuge at etablere der er ingen forurening på låget. Spot 5 µL på en PEI-cellulose TLC plade (20 x 20 cm). Chromatografen bruger en løsning med 280 mM i (NH4)24 og 50 mM NaH2PO4, pH 6,8.
    6. TLC adskillelse af adduceret deoxynucleotides
      1. Forvask TLC-plader med destilleret vand. Det anbefales især for hjemmelavede plader.
        Bemærk: Denne vask bør der foretages til at fjerne den gule farve fra plader, en farve, der kan løfte baggrund, især på væskefronten.
      2. Spot hele prøven på PEI-cellulose TLC-pladen og starte kromatografi (2.5.4.); oprydning af adukter udføres ved at udvikle plade i D1 og D2 retninger (figur 2).
      3. Udvikle plade i retningen D1 (figur 2). Brug 1,7 M natrium fosfat buffer, pH 6,8, at sikre, at DNA adukter er tilbage i starten af TLC-pladen. Analogt, udvikle plade i D2 retning ved hjælp af denne buffer. Oplysninger om mulige buffere for procedurer, se løsninger beskrives for opløsning af flere typer af adukter20,28.
        Bemærk: Udvikling af plade i retningen D2 kan udelades.
      4. Vask plade i ionbyttet vand efter kromatografi i ca 5 min i to på hinanden følgende bade. Efter at tørre pladerne.
      5. Udvikle plader i D3 og D4 retning ved hjælp af 3,5 M lithium formate buffer, pH 3,5, som indeholder 8,5 M urinstof til D3 retning og 0,5 M Tris-HCl buffer, pH 8,0, indeholdende 0,8 M LiCl og 8,5 M urinstof til D4 retning (figur 2). Opløsningsmidler skal justeres for at udvikle adduct pletter over TLC-pladen. Oplysninger om mulige buffere for D3 og D4 udvikle procedurer, finder de løsninger, der er beskrevet for opløsning af flere typer af adukter23,24,25,28.
      6. For at undgå eventuelle problemer i D4, efter udvikling i et D4 retning og en vand vask, udvikle plader (langs D4) i 1,7 M natrium fosfat, pH 6.0 (sædvanligvis tildeles som en udvikling i retning D5), til toppen af et papir væge (12 x 11,5 cm).
        Bemærk: D5 retning kan også udelades. I dette tilfælde er det nødvendigt at åbne TLC tank, når opløsningsmidlet har nået toppen af TLC, og tillade en køre for op til 60 min. Denne metode er endnu bedre end at tilføje en væge (metoden ofte anvendes i mange laboratorier til at slette eventuelle problemer i D4).
    7. Kvantificering af normal (uændrede) deoxynucleotides efter hydrolyse
      1. Fortynde en alikvot af hydrolysat (fra 2.5.1. der beskriver DNA hydrolyse) med destilleret vand, (dvs., 2,5 µL af fordøjelsen blandingen fra 2.5.1. justeret til 250 µL, og 10 µL af denne løsning tilpasset 150 µL).
      2. Tag en 5 µL (10 pmol normale deoxynucleotides) alikvot af denne digest, tilføje 2,5 µL 10 mM Tris-HCl buffer, pH 9,0 og etiket som i 2.5.4. (det endelige rumfang af blandingen er 10 µL). Gør det muligt for at reagere i 30 min. ved stuetemperatur.
      3. Tage en 4 µL alikvot af blandingen og fortyndes op til 750 µL med 10 mM Tris-HCl, pH 9,0. Mix og spin at etablere der er ingen forurening af låget. Anvende 5 µL på en PEI-cellulose TLC-pladen. Udvikle TLC-pladen i en opløsning af 280 mM (NH4)24 og 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. Tillad for at tørre efter TLC.
      4. Bruge Autoradiografi, der er udført i ca 45 min ved stuetemperatur til at lokalisere de fire umodificeret deoxynucleotide bis-fosfater. Skære spot for kvantificering af enten flydende scintillation eller Cerenkov tælle.
    8. Beregning af relative addukt mærkning (RAL)
      1. Bestemme værdierne af tæller i adduct steder og tæller i alikvot af mærket uændret (normal) deoxynucleotides.
        Bemærk: Sidstnævnte har fastsættes på 180.000 tæller mindre materiale end tidligere, hvilket er omregningsfaktoren gælde for Greven af uændrede (normal) deoxynucleotides for evaluering af RAL værdier af adduct niveauer. RAL af DNA adukter beregnes efter ligning (2) vist ovenfor.
    9. Påvisning af bindingen af test kræftfremkaldende stoffer eller stoffer til DNA ved hjælp af radioaktivt mærket stof
      1. Evaluere 3H og 14C radioaktivitet i DNA ændres med kemikalier af væskescintillationstælling.
      2. Tilføje 10-50 µL DNA løsning til 3 mL af scintillation opløsning i scintillation hætteglas. Bland godt. Måle radioaktivitet ved hjælp af tælleren scintillation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet her for udnyttelsen af enzym-katalyserede aktivering (dvs, P450, peroxidase, reduktase) for at undersøge potens af kemikalier (kræftfremkaldende stoffer/narkotika) for at blive metaboliseret til mellemprodukter resulterer i deres kovalente binding til DNA (generation af DNA adukter), vi var i stand til at løse en roman mekanisme i den farmakologiske virkning af anticancer agent ellipticine (for en gennemgang under29,30,31), (ii) ætiologien af to nephropathies forbundet med øverste urothelial tarmkanalen kræft forårsaget af plante alkaloid Aristolochiasyre (Aristolochiasyre syre nefropati og Balkan endemiske nefropati) (for en anmeldelse se,32,33,34, 35,36,37,38,39), og (iii) genotoksiske mekanismer af carcinogenicitet af flere kræftfremkaldende stoffer såsom en luftforurenende 3 - nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 og dens reduktiv modstykke, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48 plante alkaloid Aristolochiasyre syre,32,33,34,35,36,37 , 38 , 39 og en aromatisk Amin o- anisidine. 49 , 50 , 51 , 52 yderligere, enzymer bestemmelse af biologiske virkninger af disse kemikalier blev fastsat beskæftiger de beskrevne metoder.

Her, repræsentative resultater på oxidative aktivering af ellipticine af P450s og peroxidases resulterer i generation af kovalent adukter med DNA og på reduktion af 3-NBA til metabolitter, der kovalent modificeret DNA, er vist.

Plante alkaloid ellipticine (5,11-dimethyl-6H- pyrido [4,3 -b] carbazol) og derivater er antitumor agenter, der fungerer som DNA-skadelige stoffer gennem flere mekanismer, inkluderet i anholdelsen af cellecyklus og induktion af apoptose (for en oversigt se29,30,31). Bruger de protokoller er beskrevet i dette arbejde, vi viste at den anticancer lægemiddel genererer kovalente DNA adukter efter metabolisk bioactivation katalyseret af mikrosomalt P450s (figur 3) og peroxidases (figur 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61og dette forklarede de stærke effektivitet af denne agent mod kræft celler30. [3H]-radiolabeled ellipticine og nukleasen P1 version af 32P-postlabeling teknik var overvejende udnyttes i studier29,30,31,53 ,61. Ved hjælp af den komplekse undersøgelse med subcellulært enzymsystemer, enzymhæmmere og ren enzymer i eksperimenter udnytter de beskrevne protokoller, den fremherskende P450 enzymer oxiderende ellipticine reaktive arter danner DNA adukter og strukturer af disse reaktive arter var karakteriseret29,30,31,55. Af P450s undersøgt, er det menneskelige CYP3A4 enzym mest effektiv i ellipticine oxidation til 12-hydroxyellipticine og 13-hydroxyellipticine, ellipticine metabolitter, som spontant nedbrydes til ellipticine-12-ylium og ellipticine-13-ylium binding til DNA (figur 5). 55 , 61 den CYP enzymer også generere yderligere metabolitter som 9-hydroxyellipticine, der betragtes som en afgiftning-metabolit, 7-hydroxyellipticine og ellipticine N-2-oxid, som dannes som mindreårige ellipticine metabolitter. 9-hydroxyellipticine samt 7-hydroxyellipticine og ellipticine N2-oxid dannes hovedsagelig af CYP1A1 og CYP2D6, henholdsvis. 55 , 57 , 58

Peroxidases (dvs.peberrodsperoxidase (HRP), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidase (MPO) og cyclooxygenases (COX-1 og COX-2)) metabolisere ellipticine for at generere den samme ellipticine-afledte DNA adukter (figur 4)61 af de mekanismer, der er vist i figur 5.

Nitroaromatic 3-NBA (3-nitro-7H-benzdeanthracen-7-en) er en komponent af diesel-udstødningsgas og findes i luftbårne partikler62,63,64. De vigtigste metabolit af dette forurenende stof, 3-ABA,64,65 blev opdaget i urinen hos arbejdstagere i saltminer, som blev udsat for diesel emissioner for en lang tid63. Denne konstatering, viste, at disse arbejdstagere blev udsat for 3-NBA. Denne nitroaromatic forårsager lunge tumorer hos rotter efter intratrakeal instillation67. 3-NBA fungerer også som et mutagen i Ames Salmonella typhimurium test (i stamme YG1024 overekspression nitroreductase og O- acetyltransferase), generere mere end 6 millioner revertants pr. nanomole i denne stamme62. Dens genotoksiske potens blev også demonstreret gennem generation af kovalent adukter med DNA in vitro, efter aktivering af flere enzymer, ved hjælp af de protokoller, der er beskrevet i dette arbejde, og vivo i flere organer af gnaver dyr (figur 6 )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,64,67,68.

Den 3-NBA-afledte DNA adukter dannet efter 3-NBA aktivering med cytosole reductases (dvs. NQO1) blev målt ved nukleasen P1 og n-butanol berigelse metoder til 32P-postlabeling metode beskrevet i protokollerne præsenteret i denne undersøgelse. Resultaterne er angivet dannelsen af op til fem DNA adukter (addukt steder 1-5 i figur 7), og tre af dem var kendetegnet for at være 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone (dA -N6-C2-ABA; addukt spot 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (GD -N2-C2-ABA; addukt spot 3) og N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (GD-C8 -N-ABA; addukt steder 4. og 5) (figur 7 og figur 8). Udnytte nukleasen P1 versionen af 32P-postlabeling metode, GD-C8 -N-ABA (addukt pletter, 4 og 5) blev målbart (figur 7 og figur 8). Dette resultatet understreger, at nogle begrænsninger af denne version af 32P-postlabeling sker, nemlig, lav (hvis nogen) påvisning af adduceret deoxynucleotides, der er defosforyleret af nukleasen P1 (dvs. adukter dannet under oxidation af arylamines eller ved reduktion af aromatiske nitroderivatives til N- hydroxyarylamine-derivater substitueret på C8 af deoxyguanosine). Lig undersøgelse med ellipticine, udnytte den komplekse undersøgelse med subcellulært enzymsystemer, enzymhæmmere, ren enzymer og DNA addukt standarder i de eksperimenter, beskæftiger de protokoller er beskrevet i dette arbejde, den fremherskende cytosole reduktion af enzymer metaboliske 3-NBA til metabolitter generere DNA adukter, nemlig den reaktive metabolit dannet ved reduktion af 3-NBA (N-OH-ABA), og strukturer af tre DNA adukter genereret af 3-NBA blev præget (figur 7 og Figur 8). I leveren, bioactivation af 3-NBA i vitro blev anset for at være hovedsagelig tilskrives menneskelige og rotte NQO1 (figur 7), mens menneskelige N,O- acetyltransferases (NAT'er), NAT2, NAT1, sulfotransferase (SULT), SULT1A1 og til en mindre grad, SULT1A2 er de fremherskende enzymer i fase II aktivering 3-NBA42. Hepatisk mikrosomale POR er også effektiv i aktivering 3-NBA41, men i mus, 3-NBA er hovedsageligt bioactivated af NQO1 snarere end denne mikrosomale POR42. I lunge, som er målvæv for 3-NBA carcinogenicitet67, reducere både NQO1 og XO 3-NBA til metabolitter generere DNA adukter. XO synes imidlertid at fungere som en mindre 3-NBA aktiverende enzym i dette organ69.

Figure 1
Figur 1: Ordning af 32P-postlabeling assay. De enkelte trin 32P-postlabeling metode og forbedrede procedurer er vist. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: mønster af DNA addukt eluering på PEI-cellulose TLC plader. Flerstrenget kromatografien DNA adukter på PEI-cellulose plader er vist. Stammer fra en startposition på PEI-cellulose TLC-pladen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: 32P-postlabeling analyser af DNA adukter dannet i læggen thymus DNA inkuberes med ellipticine, NADPH og a rotte og (B) menneskelige hepatisk microsomes, (C) en kontrol prøve uden microsomes. Adukter 1 og 2 tildelt af pile er genereret i deoxyguanosine i DNA af ellipticine aktiveret hos microsomes. 32 P-postlabeling blev udført beskæftiger nukleasen P1 version af metoden (trin 2.5.2.) Oprindelsen er placeret på den nederste venstre hjørner (D3 fra bund til top og D4 fra venstre til højre). D2 var udeladt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: 32P-postlabeling analyser af ellipticine-medieret DNA adukter. Adducts dannet i læggen thymus DNA reagerede med ellipticine (100 µM) og peberrodsperoxidase (A), kvæg lactoperoxidase (B), human myeloperoxidase (C), får cyclooxygenase-1 (D), menneskelige cyclooxygenase-2 ( E) (5 µg peroxidases var til stede i inkubationer), fra leveren DNA af rotter behandlet med 40 mg ellipticine pr. kg legemsvægt (LGV) (F), fra kalv thymus DNA reageret med ellipticine og menneskelige CYP3A4 (G), med 13 - hydroxyellipticine()Hansen), ellipticine N2-oxid (jeg) og 12-hydroxyelipticine (J). Eksperimenter blev udført ved hjælp af nukleasen P1 version af assay (trin 2.5.2.) Oprindelsen er på den nederste venstre hjørner (D3 fra bund til top og D4 fra venstre til højre). D2 var udeladt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: iltning af ellipticine af peroxidases og CYPs viser ellipticine metabolitter og dem, der foreslog at generere DNA adukter. Forbindelser i parentes har ikke endnu blevet opdaget de eksperimentelle betingelser anvendes i eksperimenter, og de er elektrofil metabolitter postuleret som ultimate arter binding til DNA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: metabolisk aktivering af og DNA addukt dannelse af 3-nitrobenzanthrone. 3-NBA, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) H:quinone oxidoreductase; NAT, N,O- acetyltransferases; SULT, sulfotransferase; CYP, cytokrom P450; POR, NADPH: cytokrom P450 oxidoreductase; HRP, peberrodsperoxidase; LPO, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidase; COX-1, cyclooxygenase-1. R = - COCH3 eller -SO3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; GD -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; GD-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: 32P-postlabeling analyser af 3-NBA-afledte DNA adukter. Nukleasen P1-(venstre paneler) og n-butanol udvinding versioner (højre paneler) af metoden, der blev udnyttet. Aen og Ab, adukter dannet i læggen thymus DNA reagerede med 3-NBA (300 µM) efter aktivering med rotte hepatisk cytosols. Ben og Bb, adukter dannet i læggen thymus DNA, reagerede med 3-NBA (300 µM) efter aktivering med menneskelige leverens cytosol (poolede brøkdel). Cen og Cb, adukter dannet i læggen thymus DNA, reagerede med 3-NBA (300 µM) efter aktivering med ren rotte hepatisk NQO1 (0,09 enheder). Den og Db, adukter dannet i læggen thymus DNA, reagerede med 3-NBA (30 µM) efter aktivering med humane rekombinante NQO1 (0,06 enheder). Een og Eb, adukter dannet i laks testis DNA behandlet med N-OH-ABA. Fen og Fb, adukter dannes i leveren DNA af vildtype littermates på C57BL/6 baggrund udsat for 2 mg 3-NBA pr. kg b.w. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: 32P-postlabeling analyser af 3-NBA-afledte DNA addukt standarder [GD -N2-C2-ABA (A), dA -N6-C2-ABA (B) og GD-C8 -N-ABA c] (paneler en) og strukturer af 3-NBA og disse 3-NBA-DNA adukter () paneler b). N-butanol udvinding version af metoden blev udnyttet (paneler i et). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I dette papir, er det påvist, bredt tilgængelige metoder til at studere styrken af kemikalier til at være bioactivated til metaboliske mellemprodukter, hvilket resulterer i generation af kovalent DNA adukter. Dette er et afgørende spørgsmål, fordi vurdering af styrken af miljømæssige kemikalier eller lægemidler af deres enzymatiske aktivering til metabolitter generere kovalente DNA adukter er et vigtigt felt i udviklingen af kræft og dens behandling. Ændring af DNA af kræftfremkaldende stoffer betragtes som årsag til tumor udvikling er nu dømt som et centralt dogme af carcinogenese forårsaget af kræftfremkaldende stoffer. Dette forslag er blevet bekræftet af en række resultater, som fænomenerne som: (i) de kræftfremkaldende egenskaber af forskellige kræftfremkaldende stoffer afhænger bioactivation af disse forbindelser til metabolitter reagerer med nukleofil centre i DNA; (ii) niveauer af DNA adukter ofte svarer til mange kræftfremkaldende svar; (iii) og mutation i visse tumor suppressor gener og aktivering af flere protooncogener kan være forårsaget af deres modifikation med kemikalier med kræftfremkaldende potenseringsniveau. Desuden har kovalent ændring af DNA af anticancer narkotika vist sig som en af de mest effektive DNA-skadelige virkninger af disse narkotika, hvilket resulterer i deres brug i kræftbehandling.

Der er to kritiske punkter, der bestemmer den succesfulde evaluering af kemikalier til deres genotoksiske egenskaber, nemlig deres kræfter til at danne kovalente DNA adukter, specifikt: (i) at finde, løse, og karakterisere effektiviteten af enzymatisk systemer i stand til at aktivere kræftfremkaldende stoffer/narkotika til elektrofil arter bindende nukleofil centre for DNA, og (ii) at udvikle og bruge de bedst egnede teknikker, som kræftfremkaldende/stof-DNA adukter er fundet og strukturelt karakteriseret. De egnede metoder for begge funktioner er beskrevet i denne undersøgelse.

Isolationsprocedurer for cellulære fraktioner der indeholder biotransformation enzymer (mikrosomale eller cytosole prøver af P450s og ekstra bioactivating enzymer dvs. peroxidases eller reductases POR, NQO1, XO og AO), protokoller for bioactivation af test kræftfremkaldende stoffer/narkotika ved de enzymatiske systemer (inkubationer med DNA), og deres brug vist i dette arbejde er angivet, som det fremgår af de repræsentative resultater, deres egnethed til vurdering af kemikaliers genotoksiske egenskaber.

Yderligere, metoder til påvisning og kvantificering af adukter med DNA som to berigelse versioner af 32P-postlabeling teknik (nukleasen P1- og n -butanol ekstraktion procedurer) og brug af radioaktivt mærket testet forbindelser blev vist sig at være relevante for undersøgelser evaluering genotoksicitet af kræftfremkaldende/drug fremmedstoffer.

Om fastsættelse af de kovalente DNA adukter, ikke kun disse to metoder, men også andre metoder, der er egnet til påvisning og måling af DNA adukter har været etableret8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. indtil 1981, kvantificering af DNA adukter udnyttede radioaktive kemikalier (kræftfremkaldende stoffer/narkotika), mærket af 3H og 14C, der har fremstillet syntetisk. Sådanne metoder har udnyttet med fordel for studier med ellipticine som beskrevet i dette arbejde (Se53,54). Det er dog normalt svært at forberede derivater med høj radioaktivitet til deres succesfulde skik73,80,81. Derfor, selv om denne procedure bruges stadig, det er desværre begrænset til in vitro- eksperimenter svarende til dem, der beskrives her. Af andre teknikker, massespektrometri, spray elektron ionisering (ESI), matrix assisted laser desorption ionisering (MALDI), accelerator massespektrometri (AMS), fluorescens, biologiske metoder såsom immunassay og 32 P-postlabeling beskrevet i denne undersøgelse i detaljer, blev udviklet (til gennemsyn, se8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

32P-postlabeling analysen beskrives i protokollen for dette arbejde er vist, som ikke kun har anvendelighed i in vitro- eksperimenter (Se repræsentant resultater), nemlig, test for genotoksicitet eller mekanistiske nye forbindelser undersøgelserne af kræftfremkaldende/drug aktivering, men har også yderligere opkoebere som evaluering af menneskers eksponering for miljømæssige kræftfremkaldende, undersøgelser om mekanismerne af tumor udvikling, overvågning reparation af DNA, undersøge DNA skade af endogene forbindelser og oxidativ reaktioner, og undersøger den svar af patienter til cytotoksiske anticancer narkotika72,83.

Denne teknik er imidlertid ikke uden nogle begrænsninger73. Læsioner i DNA, som ikke er stabil som monodeoxynucleotides, kan ikke fastsættes pålideligt. 32P-postlabeling metode er ikke i stand til at identificere strukturerne af DNA addukt. Derfor, strukturel karakterisering af DNA adukter ofte afhængig af demonstrere deres co-kromatografi med syntetisk standarder af kendte strukturer. Faktisk, en sådan metode blev brugt i begge eksempler på repræsentative resultaterne vist i dette arbejde (ellipticine, 3-NBA).

Til sidst, de protokoller, der er vist i dette arbejde kan betragtes som egnede metoder til at vurdere styrken af Miljøkontaminanter eller narkotika skal enzymatisk bioactivated til metabolitter generere kovalente DNA adukter, en meget vigtig proces for den udvikling af kræft og dens behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har intet at videregive.

Acknowledgments

Denne undersøgelse blev støttet af Czech Science Foundation (GACR, grant 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14, (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21, (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29, (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25, (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14, (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57, (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213, (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5, (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6, (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577, (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14, (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30, (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13, (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3, (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7, (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12, (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6, (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231, (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45, (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8, (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150, (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814, (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21, (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17, (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28, (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658, (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73, (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158, (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14, (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90, (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23, (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63, (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65, (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18, (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118, (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23, (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17, (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234, (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500, (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116, (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726, (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127, (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62, (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16, (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64, (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82, (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2, (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302, (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37, (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148, (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20, (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31, (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204, (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20, (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221, (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26, (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34, (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247, (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4, (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14, (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378, (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35, (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23, (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207, (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27, (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2, (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334, (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics