Dannelsen av kovalente DNA-addukter av enzymatisk aktivert kreftfremkallende og narkotika In Vitro og deres vilje av 32P-postlabeling

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Vurderer styrken på miljømessige kjemikalier og farmakologiske, være enzymatisk bioactivated til mellomprodukter generere kovalente DNA-addukter, er et viktig felt i utviklingen av kreft og dens behandling. Metodene er beskrevet for sammensatte aktivisering skjemaet DNA-addukter, samt deres oppdagelse og kvantifisering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Stiborova, M. Formation of Covalent DNA Adducts by Enzymatically Activated Carcinogens and Drugs In Vitro and Their Determination by 32P-postlabeling. J. Vis. Exp. (133), e57177, doi:10.3791/57177 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kovalente DNA-addukter dannet av kjemikalier eller stoffer med kreftfremkallende styrke vurderes som en av de viktigste faktorene i Release fase av kreftfremkallende prosesser. Denne kovalente bindingen, som er årsaken til tumorigenesis, evalueres nå som en sentral dogme av kjemiske kreft. Her metodene er beskrevet ansette reaksjonene katalysert av cytochrome P450 og ekstra biotransformation enzymer å undersøke styrken av kjemikalier eller medisiner for aktivisering å metabolitter danner disse DNA-addukter. Prosedyrer blir presentert som beskriver isolering av mobilnettet fraksjoner besitter biotransformation enzymer (mikrosomale og cytosolic prøver med cytochromes P450 eller andre biotransformation enzymer, dvs., peroxidases, NADPH: cytochrome P450 oxidoreductase, NAD (P) H:quinone oxidoreductase eller xantin oksidase). Videre metodene er beskrevet som kan brukes for metabolske aktivering av analysert kjemikalier av disse enzymene samt for isolering av DNA. Videre riktig metodene kan oppdage og kvantifisere kjemiske/narkotika-avledet DNA-addukter, dvs.forskjellige modifikasjoner av 32P-postlabeling teknikk og ansettelse av radioaktivt-merket analysert kjemikalier, er vist i detalj.

Introduction

Metabolismen av xenobiotics (miljømessige kjemikalier eller medisiner) oppstår i to faser1. Faser I og II mål å gjengi den opprinnelig hydrofobe (ikke vannløselige) forbindelser mer hydrofile (vannløselige), dermed gjør dem lett excretable via urin, avføring eller svette. Fase I (functionalization) reaksjoner inkluderer oksidasjon, reduksjon, og hydroksylering katalysert av enzymer som cytochrome P450s (P450s, CYPs), peroxidases (dvs., cyclooxygenase, COX), aldo-keto reductases (AKRs), og mikrosomale Flavin inneholder monooxygenases (FMOs). Fase I omfatter også reduksjon reaksjoner, formidlet av en rekke reductases dvs mikrosomale NADPH: cytochrome P450 reduktase (POR) og cytosolic NAD (P) H:quinone oxidoreductase (NQO1), xantin oxidase (XO) og aldehyd oxidase (AO)1 . I den andre fasen (bøyning), de funksjonelle gruppene som fulgte i fase er jeg pleide å bøy små polare molekyler å ytterligere øke polaritet. Eksempler på enzymer anses å delta i reaksjonen av fase II inkluderer sulfotransferases (SULTs), N, O- acetyltransferases (NAT), methyltransferases som catechol -O- methyltransferase (COMT), glutation S- transferases (GSTs) og uridine diphosphate glucuronosyltransferases (UGTs)1. Klassifisering av enzymer i fase I eller II er, ikke rigid, og noen enzymer kan kanskje grupperes i hver kategori.

P450 enzymer (EC 1.14.14.1) er måltema inneholder proteiner i ulike organismer, som deltar i biotransformation av mange kjemikalier, utløse deres konvertering3,4. P450 enzymer katalysere hydroksylering av mange underlag, med en reaksjon der en atom av dioxygen føres inn molekyl av xenobiotics, mens andre atom oksygen er redusert til skjemaet vann reaksjon som krever to elektroner [ligningen (1 )]3,4:

RH + O2 + NADPH + H+ → ROH + H2O + NADP+ (1)

P450 enzymer lokalisert i endoplasmatiske retikulum membranen av pattedyrceller (mikrosomale P450 systemer) er medlemmer av multienzyme monooxygenase system, som inneholder ytterligere NADPH: cytochrome P450 reduktase (POR) og cytochrome b5 , underlaget av enzymet betegnet som NADH: cytochrome b5 reduktase. En allment aksepterte teori hypothesizes at giveren av to elektroner trengs for P450 er NADPH/POR systemet. Likevel kan cytochrome b5 også fungere som en donor av elektroner for P450, nemlig som giver av elektron å redusere P450 under andre reduksjon av syklusen reaksjon der den fungerer sammen med NADH: cytochrome b5 reduktase2,3,4.

Pattedyr utnytte ulike P450 enzymer (f.eks enzymer familier 5, 8, 11, 17, 19, 21, 24, 26 og 27) for syntese av verdifulle endogene forbindelser, som steroider, og bruke dem til katabolisme naturprodukter2,3 . Andre CYP pattedyr enzymer, som menneskelige CYP1A2, 2C 9, 2C 19, 2D 6 og 3A4, metabolismer eksogene kjemikalier som brukes som narkotika. 5 , 6 viktigste enzymer utløse metabolismen av narkotika er CYPs av 3A og, spesielt CYP3A4. Konverteringer av xenobiotics, for eksempel pro-kreftfremkallende og pro-giftstoffer, er formidlet av menneskelige CYP1A1, 1A2, 1B1, 2A6, 2E1 og 3A42,5. De fleste CYPS disse finnes i leveren (unntatt CYP1A1 og 1B1). Likevel, CYPs er også uttrykt i flere extrahepatic organer. Slike P450s kan være av stor betydning, hovedsakelig når delta de i bioactivation metabolismen av kjemikalier (narkotika) til reaktive mellomprodukter i disse organene7. Ulike P450s er indusert av flere stoffer som er deres underlag, men dette ikke er nødvendigvis tilfelle.

Mange P450 enzymer spiller en rolle i kjemikalier (legemiddel) toksisitet. De kan konvertere xenobiotics ikke bare til sine avrusning metabolitter, men også aktivere dem til reaktive arter, som endre endogene makromolekyler som i tillegg viser ulike biologiske egenskaper, vanligvis forårsaker giftigheten. DNA, lipider og proteiner kan være mål for endringen av reaktive elektrofiler og radikale generert fra aktivert kjemikalier. I tilfelle av DNA, å løse flere viktige genet svar og deres mekanismer er allerede kjent2,3,4,5.

Endringene i DNA kan føre til en nedgang i veksten cellekontroll, og dette fenomenet anses å være den dominerende faktoren som fører til utvikling av kreftfremkallende prosesser. Generering av kovalente DNA-addukter kjemikalier har kreftfremkallende styrke er vurdert som en av de viktigste trinnene i Release fase av kreftfremkallende prosesser8,9,10,11. Det ble demonstrert at relasjoner mellom dannelsen av DNA-addukter og tumorigenesis oppstår, mens en nedgang i DNA-addukter er ansvarlig for chemoprevention8,9,10, 11 , 12 , 13 , 14. dannelsen av kreftfremkallende/narkotika-avledet DNA-addukter avhenger av individuelle baser av DNA og påvirkes av sekvenser av disse baser i DNA. Reparasjonen av DNA-addukter er avhengige av deres plassering (på den transkribere eller ikke-transkribert DNA stranden) og typer endret nukleotid sekvenser8,11,12,15, 16.

I denne artikkelen beskriver vi prosedyrer utnytte konvertering enzym-katalysert av kjemikalier (narkotika) å undersøke deres styrke aktiveres i metabolitter som endret DNA (generere DNA-addukter). Kovalente DNA bindende, test sammensatte bør vanligvis være aktivert ved oksidativt eller reductive reaksjoner, avhengig av enkelte stoffer. Oksidativt eller reductive aktivisering testet kjemikalier er formidlet av en P450-avhengige enzymatisk system i mikrosomale subcellular brøken eller ved reduksjon med reductases presentere både i microsomes (POR, NADH: cytochrome b5 reduktase, P450 enzymer) og i mobilnettet cytosolic subcellular brøker (NQO1, XO, AO, peroxidase). Reaktiv metabolitter deretter binde til DNA danner DNA-addukter. Fordi både oksidativt og reductive reaksjoner er viktige for å aktivere flere legemidler til disse reaktive arter, er eksperimentelle prosedyrene ansette oksidasjon/reduksjon enzymatisk systemet beskrevet. Videre riktig metodene kan oppdage og kvantifisere disse DNA-addukter er beskrevet i detalj.

To uavhengige prosedyrer for å avgjøre om testen kjemisk, aktivert av enzymatiske systemer, er bundet til DNA anbefales: 32P-postlabeling teknikk og utnytte radioaktivt-merket sammensatte (f.eks., 3H eller 14 C). For første anbefales pilot, screening 32P-postlabeling analysen. Fastsettelse av DNA innholdet i løsninger, nettopp evalueres, må komme foran begge metodene.

De 32P-postlabeling teknikk benytter enzymatisk hydrolyse av DNA endret av ikke-radioaktivt kjemikalier (karsinogen/stoff) til 3´-phosphodeoxynucleosides, ekstra fosforylering med radioaktive fosfor (32P) på 5´- OH addukter posisjon og separasjon av kjemiske-deoxynucleotide fra normal (uendret) deoxynucleotides av kromatografi17 (figur 1). DNA endret av kjemisk forbindelse er hydrolyzed av en blanding av endonuclease, micrococcal nuclease og exonuclease, kjent som milt fosfodiesterase. Blandingen av hydrolyzed DNA som inneholder både normale (uendret) og endret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates er reagert med [γ -32P] ATP i nærvær av carrier (ikke-radioaktive) ATP og T4-polynucleotide kinase ved pH 9,5 til skjemaet 5´- 32P-merket 3´, 5´-bisphosphates ("standard" prosedyre i figur 1). Brukte alkaliske pH er i stand til å minimere enzymaktiviteten av T4-polynucleotide kinase til dephosphorylate deoxyribonucleoside 3´-monophosphates på posisjon 3´. Separasjon og oppløsning av 32P-merket addukter fra merket deoxynucleotides som ikke endres av kjemikalier er utført av retninger anion exchange tynt lag kromatografi (TLC) på polyethyleneimine (PEI) cellulose (figur 2 ). I første og andre elueringsrør trinnene (i D1 og D2 retninger) er merket normal (uendret) deoxynucleotides samt [32P] fosfat elut fra starten av TLC-PEI-cellulose platen med vann løsninger av elektrolytt på et kort stykke brukt kromatografiske papir brukes på TLC platen, mens deoxynucleotides som inneholder bundne kjemikalier viser hydrofobe egenskaper (karsinogen/narkotika-addukter) er opprettholdt på starten av PEI innen platen løses på i tillegg med flere ulike løsemiddel systemer i D3 og D4 retninger (figur 2). Lokalisering av addukter ved hjelp av skjermen forbedret autoradiography; den separerte addukter registreres som mørke gjenkjennelig flekker på X-ray filmer. Flekker er forbrukeravgift fra platen og brukt om å kvantifisere radioaktivitet av flytende scintillation eller Cerenkov teller. En lagring fosfor imaging metode som er tilpasset til kart og kvantifisere DNA-addukter på chromatograms oppdaget av den 32P-postlabeling analysen er nå også brukt. 18 the Instant Imager maskin er ofte brukt for slike deteksjon og kvantifisering av DNA-addukter. Denne metoden gir mer enn 10 ganger høyere følsomhet for å oppdage 32P enn teknikken av skjermen forbedret autoradiography19.

Mengder DNA-addukter er bestemt som verdier av relativ adduct merking (RAL), beregnet ved hjelp av formelen (2) som følger:

CPM. i adduct deoxynucleotides
RAL =---(2)
aktiviteten av 32P-ATP (cpm. / pmol) x pmol deoxynucleotides

Verdiene for RALs er forholdet mellom antall priser adducted deoxynucleotides over antall utbredelsen av totalt [adducted og normal (uendret) deoxynucleotides] deoxynucleotides20,21. Men denne beregningen er basert på like merking effektiviteten av addukter og normal deoxynucleotides22. Klassisk ("standard") prosedyren av 32P-postlabeling teknikk er passende for ulike DNA-addukter (omfangsrik og/eller ikke-klumpete addukter), men sin følsomhet er ikke tilfredsstillende å oppdage addukter finnes i små mengder i DNA. Bruker denne fremgangsmåten, er mengden av en adduct i 107 uendret deoxynucleotides i DNA (0,3 fmol adduct/µg DNA) synlig.

En rekke modifikasjoner av klassisk 32P-postlabeling prosedyren har vært benyttet for å heve sensitiviteten av teknikken. Opptil 10 - til 100-ganger høyere følsomhet til fastsettelse av addukter av 32P-merking er oppnådd begrensende nivåene [γ -32P] ATP (intensivering prosedyren). 23 , 24 en ytterligere prosedyren gir en økning i følsomhet av 32P-postlabeling metoden benytter en inkubering av fordøyd DNA inneholder addukter med nuclease P1 (fra penicillin citrinum)21 (figur 1). Dette enzymet foretrekker å dephosphorylate uforandret deoxyribonucleoside 3´-monophosphates, mens deoxynucleotides bundet kjemikalier (adducted nukleotider) er egentlig ikke underlag av dette enzymet. Derfor dephosphorylated deoxyribonucleoside 3´-monophosphates (dvs., deoxyribonucleosides) er ikke fosforylert av T4-polynucleotide kinase av [32P] fosfat fra γ -32P] ATP. Men noen av nukleotider hvor kjemikalier er bundet (adducted deoxynucleotides), som arylamine addukter erstattet på C8 av deoxyguanosine, kan bedephosphorylated av dette enzymet. I kontrast, de fleste andre addukter (f.eksaddukter erstattet N2 av deoxyguanosine) er ikke dephosphorylated av nuclease P1. Denne endringen av 32P-postlabeling gjør denne metoden betydelig mer følsomme, øke sensitiviteten av mer enn tre størrelsesordener. Dessuten, denne versjonen av 32P-postlabeling gir en metode der høyere mengder DNA (5-10 µg) og et overskudd av transportør-fri [γ - 32P] ATP kan benyttes.

En annen metoden å berike den addukter, beskrevet av Gupta25, utnytter den mekanisk-egenskapene for store deoxynucleotide addukter, som kan trekkes inn n-butanol i nærvær av en fase overføring agent tetrabutylammonium klor (TBA) (figur 1) før [32P] fosfat merking, mens uforandret deoxynucleotides pakkes dårlig av denne organiske løsemidler. Men mindre hydrofobe addukter, består for eksempel av deoxynucleotides endret med ikke-aromatiske store moieties eller liten alkyl rester, ikke effektivt er utvunnet med n-butanol. Derfor er de i hovedsak undetectable når analyseres av denne endringen av 32P-postlabeling metoden.

Begge de nevnte versjonene av 32P-postlabeling øker følsomheten og måling av DNA-addukter enormt (opptil tre størrelsesordener), å kunne oppdage en adduct per 109,10 vanlige nukleotider (0,3 - 3 amol/µg DNA). Disse to metodene anbefales for testing kjemikalier for deres effektivitet covalently binde til DNA, og derfor de er beskrevet i dette arbeidet i detaljer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til og bruk av forsøksdyr (311/1997, Landbruksdepartementet, Tsjekkia), som er i samsvar med erklæringen i Helsinki.

1. isolering av Hepatic mikrosomale og Cytosolic fraksjoner

  1. Forberede leveren subcellular brøker (microsomes rik på P450 enzymer og cytosols rik på reductases eller løselig peroxidases) fra rotter ved enkel differensial sentrifugering (105 000 x g).
    Merk: Det pellets og nedbryting tas som microsomes og cytosols, henholdsvis.
    1. Vask leveren prøvene (1-10 g) to ganger med 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 inneholder 150 mM KCl buffer (buffer 1) (10 ganger større mengder enn vekten av vevet, dvs 10-100 mL) og kuttet vev i små biter (av rundt på 2 x 2 mm størrelse).
    2. Homogenize vevet i nærvær av denne bufferen (> 3 volumet/vekten mL/g) i homogenizer ved 4 ° C i 5 minutter, og forkaste gjenværende ikke-homogenisert biter av vev av filtrering ved hjelp av filter papir. Sentrifuge homogenate 600 x g i 10 min på 4 ° C og overføre nedbryting til en annen sentrifugeringsrøret.
    3. Nytt homogenize pellets buffer 1 (1 mL per 1 g av vev), Gjenta trinn 1.1.3., og kast pellet. Sentrifuge grupperte supernatants på 15 000 x g for 20 min på 4 ° C. Overføre nedbryting til en annen sentrifugeringsrøret.
    4. Sentrifuge nedbryting 105 000 x g for 60 min på 4 ° C. Samle nedbryting (stoffer) og lagre den i dele (1-10 mL) på-80 ° C. Karakterisere stoffer for protein med metoden beskrevet av Bradford26.
    5. Å avbryte pellet 100 mM natrium fosfatbuffer, pH 7.4 (> 2 volumet/vekten mL/g), sentrifuger 105 000 x g for 60 min på 4 ° C. Kast nedbryting. Nytt homogenize pellets (microsomes) i 50 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4 inneholder 150 mM KCl og 20% glyserol (< 5 volumet/vekten mL/g) i homogenizer på 4 ° C. Lagre microsomes i 0,5 - 1 mL dele på-80 ° C. Kjennetegner microsomes for innhold av proteiner med metoden beskrevet av Bradford26.
    6. Bestemme konsentrasjonen av cytochrome P450 i microsomes.
      Merk: Konsentrasjonen av P450 enzymer i microsomes måles som beskrevet av Omuras og Sato27, bestemme absorpsjon av kompleks av redusert P450 med karbonmonoksid (CO). Karbonmonoksid er et giftig stoff, og må håndteres med forsiktighet og hette.

2. incubations Test kjemikalier (kreftfremkallende/narkotika) med DNA i nærvær av enzymatiske systemer

  1. Inkubasjon test kjemikalier (kreftfremkallende/narkotika) med DNA i nærvær av oksidativt enzymatiske systemer cytochromes P450
    1. Forberede inkubasjon blandinger som inneholder et endelig antall 0,75 mL i 4 ° C, følgende forbindelser og enzymatiske systemer.
      1. Bland 100 mM fosfatbuffer pH 7.4, (0.375 mL) med 10 mM NADPH eller NADPH-generering system (10 mM MgCl2, 10 mM D-glukose-6-fosfat, 10 mM NADP+, 1 U/mL D-glukose-6-fosfat dehydrogenase) (75 µL).
      2. Legg til denne blandingen microsomes eller ren rekombinant P450 i Supersomes, som er microsomes isolert fra insekt celler transfekterte med en baculovirus konstruksjon som inneholder cDNA av rekombinant P450 enzymer, 50 pmol P450 enzymer i 50 µL mikrosomale eller supersomal Forberedelse - hepatisk mikrosomale fraksjoner isolert i laboratoriet eller en kommersiell kilde.
      3. Legge til 1 mg kalv thymus DNA (0,3 mL av lagerløsning - 3.3 mg/mL i destillert vann) og riste på en vortex shaker 5 s.
      4. Til slutt legger 7.5 µL 0,1 mM test ellipticine narkotika oppløst i DMSO og 42,5 µL destillert vann for å nå et volum av inkubasjon blanding av 0,75 mL. Bruk kjemikalier merket med 3H eller 14C eller umerkede kjemikalier, avhengig av prosedyren for oppdagelsen av DNA-addukter.
      5. Riste på en vortex shaker for 5 s. Incubate i åpnet rør på 37 ° C i 30-60 minutter.
      6. Også forberede to kontroll incubations, men (i) uten en aktivere systemet (mikrosomale eksempler) eller (ii) med det, men uten testen sammensatte.
  2. Incubations test kjemikalier (kreftfremkallende/narkotika) med DNA i nærvær av reductive enzymatiske systemer
    1. Forberede inkubasjon blandinger som inneholder et endelig antall 0,75 mL i 4 ° C, følgende forbindelser og enzymatiske systemer.
      1. I 4 ° C, bland 100 mM Tris-HCl buffer, pH 7.4, 0,2 prosent mellom 20, (0.375 mL), 10 mM løsning av kofaktor av NQO1 reductive enzym (NADPH) (75 µL), cytosolic brøkdel (hepatic cytosolic fraksjoner - isolert i laboratoriet eller ved hjelp av cytosolic brøker isolert fra individuelle menneskelige givere de Hentet fra kommersielle kilden inneholder 1 mg protein (50 µL)).
      2. Legge til 1 mg kalv thymus DNA (0,2 mL lagerløsning - 3.3 mg/mL destillert vann) og riste på en shaker 5 s.
      3. Til slutt Legg 7,5 µL 0,1 mM test kjemiske (oppløst i destillert vann, metanol, etanol eller DMSO avhengig av Løseligheten av sammensatte) og 42,5 µL destillert vann til å nå et volum på 0,75 mL for inkubasjon blandingen. Bruk kjemikalier merket med 3H eller 14C eller umerkede kjemikalier, avhengig av prosedyren for oppdagelsen av DNA-addukter (se nedenfor).
      4. Tømme reaksjonsblandingen med argon i 1 riste på en shaker for 5 s. Incubate i lukket rør på 37 ° C i 30-60 minutter.
      5. Også forberede to kontroll incubations, men (i) uten en aktivere systemet (cytosolic brøkdeler) eller (ii) med det, men uten test kjemikalier.
  3. Utvinning av inkubasjon blandinger med organiske løsemidler å fjerne overflødig test kjemikalier
    1. Bland inkubasjon blandingen i et reagensrør med en lue med samme volum ethyl acetate (eller diethyl Eter eller Heksan) ved å legge til disse løsemidler. Riste innholdet av rør på en shaker til en emulsjon former.
    2. Spinn (3 min) på 1600 x g i en sentrifuge ved omgivelsestemperatur. Hvis organisk og vandig faser ikke er riktig atskilt, spinn igjen for en lengre periode eller på en høyere sentrifugering hastighet.
    3. Fjern den øvre, organiske fasen samler med en pipette. Hvis små volumer (< 400 µL) er brukt, utnytte en automatisk pipette utstyrt med et egnet tips. Kastet til side denne organisk fasen.
    4. Gjenta 2.3.1., 2.3.2., og 2.3.3. Fjern gjenværende organiske løsemidler med en strøm av nitrogen gass (minst 5-10 min av fjerning er nødvendig).
  4. Isolasjon av DNA fra incubations
    1. Utvinning av DNA fra løsninger med fenol/kloroform og dens nedbør med etanol
      1. Eliminere proteiner for å isolere DNA fra inkubasjon blandinger av utdrager proteiner fra løsninger av DNA med fenol, fenol/kloroform (1:1), og kloroform etter prosedyren nedenfor.
      2. Kombiner inkubasjon blandingen med samme mengde fenol eller fenol/kloroform (1:1) i en Falk eller Eppendorf rør med en cap. Rør blandingen til en emulsjon former.
      3. Spinn (3 min) på 1600 x g i en sentrifuge ved omgivelsestemperatur. Hvis organisk og vandig fasene ikke er riktig atskilt, spinn igjen for en lengre periode eller en høyere sentrifugering hastighet.
      4. Overføre den øvre fasen med en pipette til en ny polypropylen tube. Hvis små volumer (< 400 µL) er brukt, utnytte en automatiske pipetter utstyrt med et egnet tips. Fjerne protein grensesnittet med organisk fasen.
      5. Kombiner den øvre fasen med samme mengde en blanding av fenol og kloroform (1:1). Reprodusere trinn 2.4.1.2. -2.4.1.4.
      6. Kombiner den øvre fasen med samme mengde kloroform og gjentar trinn 2.4.1.2. -2.4.1.4. Gjenopprette DNA nedbør med 2 mengder kaldt (-20 ° C) etanol. Bestem volumet av DNA løsningen.
      7. Tilpasse konsentrasjonen av monovalent kasjoner ved tillegg av 5 M natriumklorid til finalen konsentrasjoner av 0,1 M. røre kraftig. Kombiner med 2 mengder kaldt (-20 ° C) etanol og bland riktig. Cool til-20° C.
      8. Lagre på 20 ° C til DNA bidrar. Når DNA er fragmentert i løpet av incubations (f.eks., ved dannelsen av oksygen radikaler under enzymatisk aktivisering reaksjonen) eller under isolasjon prosedyren størrelsen på DNA som er liten (< 1 kb) eller når DNA finnes i små mengder (< 0,1 mg / mL), tidspunktet for kjøling har økes og temperaturen reduseres til-70 ° C.
      9. Spinn (10 min) på 1600 x g ved 0 ° C i en sentrifuge. Hvis DNA finnes i lave konsentrasjoner eller i form av små fragmenter, spinn igjen for en lengre periode (30 minutter). Kast nedbryting.
      10. Fjerne enhver solutes (eller gjenværende spor av testen kjemiske) som kan være tilstede i utfelt DNA, vask DNA med 70% etanol og diethyl ether. Vask igangsatte DNA med kaldt (-20 ° C) 70% etanol. Spinn (10 min) på 1600 x g ved 0 ° C i en sentrifuge. Kast nedbryting.
      11. Gjenta trinn 2.4.1.10. Vask igangsatte DNA med kaldt (-20 ° C) 70% etanol. Spinn (10 min) på 1600 x g ved 0 ° C i en sentrifuge. Kast nedbryting.
      12. Gjenta trinn 2.4.1.10. Sett røret i en loddrett tilstand på tørkepapir for å fjerne gjenværende nedbryting. Vask DNA pellet ved å legge til 1 mL av diethyl Eter å forkaste potensielle rester av testen kjemiske fra isolert DNA. Spinn (10 min) på 1600 x g ved 0 ° C i en sentrifuge. Kast nedbryting.
      13. Oppløse DNA pellet i riktig volum (vanligvis i 100-400 µL å oppnå en DNA konsentrasjon på 0,5 - 1 µg/µL) destillert vann (eller 0.15 mM natriumsitrat og 1,5 mM natriumklorid). DNA løsningen kan stå på 4 ° C over natten, eller kan være oppvarmet til 37 ° C i 10-30 min å øke oppløsende DNA.
      14. Før lagring, dele DNA i små dele (10-20 µL), fordi gjentatt frysing og tining av DNA løsninger kan resultere i en reduksjon i adduct konsentrasjoner. Lagre på-80 ° C eller kaldere.
        Merk: Spektrofotometri fastsettelse av DNA: enkel og nøyaktig metoden, som er mye brukt til å måle hvor DNA i en forberedelse hvis prøven er ren (dvs.uten betydelige mengder forurensning som protein, fenol eller andre Nucleic syrer), absorberes Spektrofotometri måling av DNA av UV bestråling av baser (se prosedyrene som er beskrevet tidligere)28.
  5. Prosedyrer for oppdagelsen av DNA adduct formasjon
    1. 32 P-postlabeling analysen
      Merk: DNA hydrolyse benytter hydrolyse forberedt på dette stadiet for analyse av addukter (2.5.1.) i tillegg til normal (uendret) deoxynucleotides (2.5.7.).
      1. Oppløse micrococcal nuclease (MN) i vann i en konsentrasjon av ~ 450 enheter (U) / mL. Dialyze mot destillert vann og justere til 300 U/mL. Dialyze milt fosfodiesterase (SPD) løsning og justere 4 U/mL.
      2. Bland MN og SPD siste konsentrasjoner 150 mU/µL MN og 2,5 mU/µL SPD (MN/SPD løsning). Ta DNA løsning som inneholder 12.5 µg og fordampe til tørrhet i en fordamperen. Løses i 6,5 µL destillert vann.
      3. Legge til 5.0 µL MN/SPD løsning (siste konsentrasjonen av MN er 60 mU/µL, siste konsentrasjonen av SPD er 1 mU/µL) og 1.0 µL fordøyelsen buffer (siste konsentrasjonen av natrium succinate er 20 mM, siste konsentrasjonen av CaCl2 er 8 mM). Det siste bindet av blandingen er 12,5 µL. Bland og la reaksjoner for 3t på 37 ° C.
      4. Fjerne 2,5 µL (overføre til en annen tube) for ytterligere fortynning og analyse av uforandret deoxynucleotides (2.5.7.)
    2. Nuclease P1 berikelse prosedyre
      1. Den gjenværende 10,0 µL av hydrolyse, legge 0,65 µL natrium acetate buffer (siste konsentrasjon, 40 mM), 0,65 µL ZnCl2 løsning (siste konsentrasjon 0,1 mM), 1,25 µL NP1 løsning (siste konsentrasjon, 0.385 µg/µL) og 0,45 µL destillert vann. Det siste bindet av blandingen er 13 µL.
      2. La blandingen til å reagere for 30 min på 37 ° C, og avslutte reaksjon med tillegg av 3 µL Tris løsning.
    3. n-Butanol berikelse prosedyre
      1. Den gjenværende 10,0 µL av DNA hydrolyse, legge 215 µL 11,6 mM ammonium formiat løsning, pH 3,5 og 25 µL 10 mM TBA chloride løsning. Ekstra med 250 µL n-butanol (mettet med vann) av kraftig miksing. Spinn (3 min) på 1600 x g skille lag, og ta av det øvre n-butanol lag. Ekstra igjen med 250 µL n-butanol (mettet med vann), spinn, ta av det øvre n-butanol laget og kombinere med tidligere ekstrakt.
      2. Legge til 400 µL vann (mettet med n-butanol) til denne ekstra, og bland kraftig. Spinne skille lag og slette vandig botnlaget. Gjenta dette vask med 400 µL av vann (mettet med n-butanol). Legge til 3 µL av 250 mM Tris-HCl løsning, pH 9,5, n-butanol lag. Fordampe n-butanol til tørrhet i en fordamperen ved omgivelsestemperatur.
      3. Oppløse rester i 100 µL n-butanol, fordamper til tørrhet igjen, og oppløse rester i 16,0 µL vann.
    4. Merking av de addukter
      1. Legge til 1 µL av bicine buffer løsning (merking buffer) og 4,5 µL av en blanding som inneholder 100 µCi [γ -32P] ATP, 45 pmol kaldt ATP og 10.0 U av T4-PNK (T4-phosphonucleotide kinase) til 16,0 µL løsning fra NP1 eller butanol berikelse blanding. De endelige konsentrasjonene av reagensene blir følgende: 20 mM bicine, 10 mM MgCl2, 10 mM dithiotreitol, 0,5 mM spermidine og 0,5 U/µL T4-PNK, 3 µM ATP. Det totale volumet av blandingen er 20 µL.
      2. La blandingen til å reagere for 30 min ved romtemperatur. Bruke hele utvalget (dvs. 20 µL) på PEI innen TLC platen (2.5.6.).
    5. Evaluering av effekten av NP1 eller n -butanol styrke prosedyrer
      1. Vaske bunnen av røret med 50 µL vann. Bland godt i 30 s og spinn (1 min) på 1600 x g i en sentrifuge å etablere det er ingen forurensning på lokket. Spot 5 µL på en PEI innen TLC plate (20 x 20 cm). Chromatograph bruker en løsning 280 mM i (NH4)24 og 50 mM NaH2PO4, pH 6.8.
    6. TLC separasjon av adducted deoxynucleotides
      1. Forvask TLC plater med destillert vann. Anbefales særlig for hjemmelaget plater.
        Merk: Denne vask gjennomføres fjerne den gule fargen fra plater, en farge som kan heve bakgrunnen, særlig ved løsemiddel foran.
      2. Oppdage hele prøven på PEI innen TLC platen og starte kromatografi (2.5.4.); opprydding av addukter utføres av utvikling av platen i D1 og D2 retninger (figur 2).
      3. Utvikle platen D1 retning (figur 2). Bruk 1.7 M natrium fosfatbuffer, pH 6.8, slik at DNA-addukter er igjen i starten av TLC platen. Analogt, utvikle platen D2 retning bruker denne bufferen. For informasjon om mulig bufferne for prosedyrer, se løsninger på oppløsning av flere typer addukter20,28.
        Merk: Utvikling av platen D2 retning kan utelates.
      4. Vaske platen i deionisert vann etter Ture i ca 5 min i to påfølgende bad. Etter at tørr platene.
      5. Utvikle plater i D3 og D4 retning med 3,5 litium formiat buffer, pH 3,5, som inneholder 8,5 M urea D3 retning og 0,5 M Tris-HCl buffer, pH 8.0, som inneholder 0,8 M LiCl og 8,5 M urea D4 retning (figur 2). Løsemidlene må justeres for å utvikle de adduct stedene over TLC platen. For informasjon om mulig buffere for D3 og D4 utvikle prosedyrer, kan du se løsningene som beskrives for oppløsning av flere typer addukter23,24,25,28.
      6. For å unngå problemer i D4, etter utvikling i en D4 retning og en vann vask, utvikle plater (langs D4) i 1.7 M natrium fosfat, pH 6.0 (vanligvis tilordnes som utvikling i retning D5), til toppen av et papir wick (12 x 11.5 cm).
        Merk: D5 retning kan også utelates. I dette tilfellet er det nødvendig å åpne TLC tanken når løsemiddelet har nådd toppen av TLC, og tillate en kjøre for opptil 60 min. Denne metoden er enda bedre enn å legge en veke (metoden brukes ofte i mange laboratorier slette problemer i D4).
    7. Kvantifisering av normal (uendret) deoxynucleotides etter hydrolyse
      1. Fortynne en aliquot av hydrolyse (fra 2.5.1. beskriver DNA hydrolyse) med destillert vann, (dvs., 2,5 µL av fordøyelsen blandingen fra 2.5.1. justert til 250 µL og 10 µL av denne løsningen justert til 150 µL).
      2. Ta en 5 µL (10 pmol normalt deoxynucleotides) aliquot av denne oversikten, 2,5 µL 10 mM Tris-HCl buffer, pH 9.0 og etiketten som 2.5.4. (det siste bindet av blandingen er 10 µL). La reagere for 30 min ved romtemperatur.
      3. Ta en 4 µL aliquot av blandingen og fortynne til 750 µL med 10 mM Tris-HCl, pH 9.0. Blanding og spinn for å etablere det er ingen kontaminering av lokket. Bruk 5 µL en PEI innen TLC plate. Utvikle TLC platen i en løsning av 280 mM (NH4)24 og 50 mM NaH2PO4, pH 6,5. La tørke etter TLC.
      4. Bruk autoradiography som utføres for ca 45 min ved omgivelsestemperatur å lokalisere fire uforandret deoxynucleotide bis-fosfater. Kuttet sted for kvantifisering av flytende scintillation eller Cerenkov teller.
    8. Beregningen av relative adduct merking (RAL)
      1. Bestemme verdier i teller i de adduct stedene og teller i aliquot av merket uendret (normal) deoxynucleotides.
        Merk: Sistnevnte må bestemmes på 180.000 teller mindre materiale enn tidligere, en figur som er omregningsfaktoren gjelder greven av uendret (normal) deoxynucleotides for å evaluere RAL verdiene av adduct. RAL av DNA-addukter beregnes formelen (2) ovenfor.
    9. Oppdagelsen av binding av testen kreftfremkallende eller narkotika DNA bruke radioaktivt-merket stoff
      1. Vurdere 3H eller 14C radioaktivitet DNA endret med kjemikalier av flytende scintillation teller.
      2. Legge til 10-50 µL av DNA løsning 3 mL en scintillation løsning i scintillation ampullen. Bland godt. Måle radioaktiviteten bruker scintillation telleren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av protokoller beskrevet her for utnyttelse av enzym-katalysert aktivering (dvs. P450, peroxidase, reduktase) for å undersøke styrken av kjemikalier (kreftfremkallende/narkotika) for å være metaboliseres til mellomprodukter som resulterer i deres kovalente binding til DNA (generasjon av DNA-addukter), vi kunne løse (i) en roman mekanisme av farmakologiske handlingen av anticancer agent-ellipticine (for gjennomgang se,29,30,31), (ii) etiologien for to nephropathies assosiert med øvre urothelial skrift kreft forårsaket av anlegget alkaloidet aristolochic syre (Aristolochic acid nephropathy og Balkan endemisk nephropathy) (for en gjennomgang se,32,33,34, 35,36,37,38,39), og (iii) gentoksisk mekanismer av kreftfremkallende av flere kreftfremkallende stoffer som en luft forurensende 3 - nitrobenzanthrone (3-NBA)40,41,42,43,44,45 og reductive motpart, 3-aminobenzanthrone (3-ABA),46 ,47,48 plante alkaloidet aristolochic syre,32,33,34,35,36,37 , 38 , 39 og en aromatiske Amin o- anisidine. 49 , 50 , 51 , 52 videre enzymer bestemme biologiske effekter av disse kjemikaliene ble bestemt ansette metodene beskrevet.

Her representant resultater på oksidativt aktivering av ellipticine av P450s og peroxidases som resulterer i generasjon av kovalente addukter med DNA og reduksjon av 3-NBA å metabolitter som covalently endret DNA, vises.

Plante-alkaloidet ellipticine (5,11-dimethyl-6H- pyrido [4,3 -b] carbazole) og dets derivater er antitumor midler, som fungerer som DNA-ødeleggende stoffer gjennom flere mekanismer, inkludert i arrest cellen syklus og induksjon av apoptose (for en oversikt se29,30,31). Bruker protokollene beskrevet i dette arbeidet, vi viste at anticancer stoffet genererer kovalente DNA-addukter etter metabolske bioactivation katalysert av mikrosomale P450s (Figur 3) og peroxidases (Figur 4)29, 30 , 31 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59 , 60 , 61og dette forklarte sterk effektiviteten av denne agenten mot kreft celler30. [3H]-radiolabeled ellipticine og nuclease P1 versjon av 32P-postlabeling teknikk var hovedsakelig benyttet i den studier29,30,31,53 ,61. Bruke komplekse studien hemmere og ren enzymer i eksperimenter beskrevet protokollene, den dominerende P450 enzymer oksiderende ellipticine reaktive arter danner DNA-addukter og strukturer av subcellular enzym systemer disse reaktive arter var preget29,30,31,55. P450s undersøkt, er menneskelige CYP3A4 enzymet mest effektiv i ellipticine oksidasjon 12-hydroxyellipticine og 13-hydroxyellipticine, ellipticine metabolitter, som spontant brytes ned til ellipticine-12-ylium og ellipticine-13-ylium binding til DNA (figur 5). 55 , 61 the CYP enzymer også generere ytterligere metabolitter som 9-hydroxyellipticine, som regnes som en avgiftning metabolitten, 7-hydroxyellipticine og ellipticine N2-oksid, som dannes mindre ellipticine metabolitter. 9-hydroxyellipticine samt 7-hydroxyellipticine og ellipticine N2-oksid er hovedsakelig dannet av CYP1A1 og CYP2D6, henholdsvis. 55 , 57 , 58

Peroxidases (dvs.pepperrotperoksidase (HRP), lactoperoxidase (LPO), myeloperoxidase (MPO) og cyclooxygenases (COX-1 og COX-2)) forbrenne ellipticine for å generere det samme ellipticine-avledet DNA-addukter (Figur 4)61 ved mekanismer vist i figur 5.

Nitroaromatic 3-NBA (3-nitro-7H-benzdeanthracen-7-en) er en komponent av diesel eksos og finnes i luftbårne partikler62,63,64. Hovedmetabolitten denne forurensende 3-ABA,64,65 ble oppdaget i urin av arbeidstakere i salt gruver som var utsatt for diesel-utslipp for en lang tid63. Dette funnet har vist at disse arbeiderne ble utsatt for 3-NBA. Denne nitroaromatic fører lunge svulst i rotter etter intratracheal instillasjon67. 3-NBA fungerer også som en mutagen i Ames Salmonella typhimurium test (i belastning YG1024 overexpressing nitroreductase og O- acetyltransferase), genererer mer enn 6 millioner revertants per nanomole i denne belastningen62. Sin gentoksisk styrke ble også demonstrert av generasjon av kovalente addukter med DNA i vitro, etter aktivering av flere enzymer, ved hjelp av protokoller som beskrevet i dette arbeidet, og vivo i flere organer av gnager dyr (figur 6 )39,40,41,42,43,44,45,46,47 ,64,67,68.

3-NBA-avledet DNA-addukter dannet etter 3-NBA aktivisering med cytosolic reductases (dvs. NQO1) ble målt ved nuclease P1 og n-butanol berikelse metoder av 32P-postlabeling metoden beskrevet i protokoller presentert i denne studien. Resultatene indikerte dannelsen av opptil fem DNA-addukter (adduct stedene 1-5 i figur 7), og tre av dem var preget skal 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone (dA -N6-C2-ABA; adduct flekk 1), N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone (dG -N2-C2-ABA; adduct spot 3) og N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone (dG-C8 -N-ABA; adduct flekker 4. og 5) (figur 7 og Figur 8). Utnytte nuclease P1 versjon av 32P-postlabeling metoden, dG-C8 -N-ABA (adduct flekker 4 og 5) var undetectable (figur 7 og Figur 8). Dette resultatet understreking som noen begrensninger i denne versjonen av 32P-postlabeling oppstå, nemlig, lav (hvis noen) oppdagelsen av adducted deoxynucleotides som dephosphorylated av nuclease P1 (dvs. -addukter dannet under oksidasjon av arylamines eller ved reduksjon av aromatiske nitroderivatives for N- hydroxyarylamine-derivater erstattet på C8 av deoxyguanosine). Ligner studiet med ellipticine, utnytte komplekse studiet med subcellular enzym systemer, hemmere, ren enzymer og DNA adduct standarder i eksperimentene ansette protokollene beskrevet i dette arbeidet, den dominerende cytosolic reduksjon enzymer metabolizing 3-NBA å metabolitter genererer DNA-addukter, nemlig reaktive metabolitten dannet av reduksjon av 3-NBA (N-OH-ABA), og strukturer av tre DNA-addukter generert av 3-NBA var preget (figur 7 og Figur 8). I leveren, bioactivation 3-NBA i vitro ble funnet å være hovedsakelig skyldes menneskelige og rotte NQO1 (figur 7), mens menneskelige N,O- acetyltransferases (NAT), NAT2, NAT1, sulfotransferase (SULT), SULT1A1 og, til en mindre grad SULT1A2 er dominerende enzymer fase II aktivere 3-NBA42. Hepatic mikrosomale POR er også effektiv i aktivering av 3-NBA41, men i mus, 3-NBA er hovedsakelig bioactivated av NQO1 i stedet for denne mikrosomale POR42. Redusere 3-NBA til metabolitter genererer DNA-addukter i lungene, som er vevet for 3-NBA kreftfremkallende67, både NQO1 og XO. Men synes XO å fungere som en mindre 3-NBA aktivering enzym i denne orgel69.

Figure 1
Figur 1: Sammenhengen 32P-postlabeling analysen. De individuelle trinnene metoden for 32P-postlabeling og forbedret fremgangsmåtene vises. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: mønster av DNA adduct elueringsrør på PEI innen TLC plater. Den retninger kromatografi DNA-addukter på PEI innen plater vises. Kommer startoppstilling på PEI innen TLC tallerkenen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: 32P-postlabeling analyser av DNA-addukter dannet i kalv thymus DNA inkubert med ellipticine, NADPH og rotten (A) og (B) menneskelige hepatisk microsomes, (C) en kontroll prøve uten microsomes. -Addukter 1 og 2 av piler genereres i deoxyguanosine i DNA av ellipticine aktivert med microsomes. 32 P-postlabeling ble utført ansette nuclease P1 versjon av metoden (trinn 2.5.2.) Opprinnelsen er plassert i nederste venstre hjørnene (D3 fra nederst til øverst og D4 fra venstre til høyre). D2 ble utelatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: 32P-postlabeling analyser av ellipticine-mediert DNA-addukter. Adducts dannet kalv thymus DNA reagerte med ellipticine (100 µM) og pepperrotperoksidase (A), storfe lactoperoxidase (B), menneskelig myeloperoxidase (C), ovine cyclooxygenase-1 (D), menneskelige cyclooxygenase-2 ( E) (5 µg peroxidases var tilstede i incubations), fra leveren DNA av rotter behandlet med 40 mg ellipticine per kilo kroppsvekt (bw) (F), fra kalv thymus DNA reagerte med ellipticine og menneskelige CYP3A4 (G), med 13 - hydroxyellipticine(H), ellipticine N2-oksid (jeg) og 12-hydroxyelipticine (J). Eksperimenter som ble utført med nuclease P1 versjonen av analysen (trinn 2.5.2.) Opprinnelsen er i nederste venstre hjørnene (D3 fra nederst til øverst og D4 fra venstre til høyre). D2 ble utelatt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: oksidasjon av ellipticine av peroxidases og CYPs viser ellipticine metabolitter og de foreslo å generere DNA-addukter. Forbindelser i parentes har ikke fortsatt oppdaget under eksperimentelle forhold brukes i forsøkene, og de er Elektrofil metabolitter postulert som ultimate arter binding til DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: metabolske aktivering av og DNA adduct dannelsen av 3-nitrobenzanthrone. 3-NBA, 3-nitrobenzanthrone; NQO1, NAD (P) H:quinone oxidoreductase; NAT, N,O- acetyltransferases; SULT, sulfotransferase; CYP, cytochrome P450; POR, NADPH: cytochrome P450 oxidoreductase; HRP, pepperrotperoksidase; LPO, lactoperoxidase; MPO, myeloperoxidase; COX-1, cyclooxygenase-1. R = - COCH3 eller -så3H; dA -N6-ABA, 2-(2'-deoxyadenosin-N6-yl)-3-aminobenzanthrone; dG -N2-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-N2-yl)-3-aminobenzanthrone; dG-C8 -N-ABA, N-(2'-deoxyguanosin-8-yl)-3-aminobenzanthrone. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: 32P-postlabeling analyser av 3-NBA-avledet DNA-addukter. Nuclease P1-(venstre panel) og n-butanol utvinning versjoner (høyre panel) av metoden ble benyttet. Aen og Abaddukter dannet kalv thymus DNA reagert med 3-NBA (300 µM) etter aktivisering med rotte hepatisk cytosols. Ben og Bbaddukter dannet kalv thymus DNA, reagerte med 3-NBA (300 µM) etter aktivisering med menneskelige hepatic stoffer (gruppert brøkdel). Cen og Cbaddukter dannet kalv thymus DNA, reagerte med 3-NBA (300 µM) etter aktivisering med ren rotte hepatisk NQO1 (0.09 enheter). Den og Dbaddukter dannet kalv thymus DNA, reagerte med 3-NBA (30 µM) etter aktivisering med menneskelige rekombinant NQO1 (0,06 enheter). Een og Ebaddukter dannet laks testikkel DNA behandlet med N-OH-ABA. Fen og Fbaddukter dannet leveren DNA av vill-type littermates på C57BL/6 bakgrunn utsatt for 2 mg 3-NBA per kg b.w. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: 32P-postlabeling analyser av 3-NBA-avledet DNA adduct standarder [dG -N2-C2-ABA (A), dA -N6-C2-ABA (B) og dG-C8 -N-ABA (C)] (paneler en) og strukturer av 3-NBA og disse 3-NBA-DNA-addukter () paneler b). N-butanol utvinning versjon av metoden ble benyttet (panelene i en). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I denne utredningen er det demonstrert en allment tilgjengelig metode for å studere styrken av kjemikalier skal bioactivated til metabolske mellomprodukter, som resulterer i generasjon av kovalente DNA-addukter. Dette er et viktig spørsmål, fordi evaluering av styrken på miljømessige kjemikalier eller medisiner av enzymatisk aktivisering å metabolitter generere kovalente DNA-addukter er et viktig felt i utviklingen av kreft og dens behandling. Endring av DNA av kreftfremkallende vurdert årsaken til tumor utvikling vurderes nå som en sentral dogme av kreft forårsaket av kreftfremkallende. Dette forslaget er bekreftet av en rekke funn som fenomener som: (i) de kreftfremkallende egenskaper for ulike kreftfremkallende avhenger bioactivation av disse forbindelsene til metabolitter reagerer med nukleofil sentre i DNA; (ii) nivåer av DNA-addukter ofte tilsvarer mange kreftfremkallende svar; (iii) og mutasjon i visse tumor suppressor gener og aktivering av flere proto-oncogenes kan skyldes endringen med kjemikalier med kreftfremkallende potencies. Videre har kovalente endring av DNA av anticancer narkotika vist som en av de mest effektive DNA-ødeleggende effektene av disse stoffene, som resulterer i sin bruk i kreftbehandling.

Det er to kritiske punkter som bestemmer vellykket evalueringen av kjemikalier for gentoksisk egenskaper, i.e. deres potencies å danne kovalente DNA-addukter, spesielt: (i) å finne, løse og karakterisere effektiviteten av enzymatisk systemer som kan aktivere kreftfremkallende/legemidler Elektrofil arter binding nukleofil sentrum i DNA, og (ii) å utvikle og bruke de mest passende teknikkene, som kreftfremkallende/narkotika-DNA-addukter er funnet og strukturelt preget. Aktuelle metoder for begge funksjoner er beskrevet i denne studien.

Isolering prosedyrer for mobilnettet fraksjoner inneholder biotransformation enzymer (mikrosomale eller cytosolic eksempler besittelse P450s og ekstra bioactivating enzymer dvs peroxidases eller reductases POR, NQO1, XO og AO), protokollene for bioactivation test kreftfremkallende/narkotika ved den enzymatiske systemet (incubations med DNA) og deres bruk vises i dette arbeidet er angitt, som demonstrert av representant resultatene deres egnethet for evaluering av gentoksisk egenskaper av kjemikalier.

Videre metoder som er riktig for deteksjon og kvantifisering av addukter med DNA som to berikelse versjoner av 32P-postlabeling teknikken (de nuclease P1- og n -butanol utvinning prosedyrene) og bruk av radioactively-merket testet forbindelser ble vist å være passende for studier vurdere gentoksisitet av kreftfremkallende/stoffet xenobiotics.

Om fastsettelse av kovalente DNA-addukter, ikke bare disse to metodene, men også andre metoder som er egnet for deteksjon og måling av DNA-addukter har vært etablert8,70,71,72 ,73,74,75,76,77,78,79,80,81 , 82. til 1981, kvantifisering av DNA-addukter utnyttet radioaktivt kjemikalier (kreftfremkallende/narkotika), merket av 3H eller 14C, som er utarbeidet syntetisk. Slike metoder har vært benyttet nyttig for studier med ellipticine som beskrevet i dette arbeidet (se53,54). Likevel er det vanligvis vanskelig å forberede derivater med høy radioaktivitet deres vellykket Bruk73,80,81. Derfor, selv om denne fremgangsmåten brukes fremdeles, er det dessverre begrenset til i vitro eksperimenter ligner de som beskrives her. Andre teknikker, massespektrometri, elektron spray ionisering (ESI), matrix-assistert laser desorpsjon ionization (MALDI), gasspedalen massespektrometri (AMS), fluorescens, biologiske metoder som immunanalyse og 32 P-postlabeling beskrevet i denne studien i detalj, ble utviklet (for vurdering, kan du se8,16,70,71,72,73, 74,75,76,77,78,79,80,81,82).

32P-postlabeling analysen beskrevet i protokollen for dette arbeidet vises, som ikke bare har anvendelse i vitro eksperimenter (se representant resultater), nemlig, testing nye forbindelser gentoksisitet eller mekanistisk undersøkelser av kreftfremkallende/stoffet aktivisering, men har også videre bruk som evaluerer menneskelig eksponering for miljømessige kreftfremkallende, studier på mekanismer for tumor utvikling, overvåking reparasjon av DNA, å undersøke DNA skade av endogene forbindelser og oksidativt reaksjoner, og undersøke svaret av pasienter til cytotoksiske anticancer narkotika72,83.

Denne teknikken er, men ikke uten noen begrensninger73. Lesjoner i DNA, som ikke er stabil som monodeoxynucleotides, kan ikke fastslås pålitelig. De 32P-postlabeling metoden er ikke kan identifisere strukturer av DNA adduct. Derfor strukturelle karakteristikk av DNA-addukter ofte avhengig demonstrere deres co kromatografi syntetiske standarder kjent strukturer. Faktisk ble slik metode brukt i begge eksempler på representant resultatene som vises i dette arbeidet (ellipticine, 3-NBA).

Avslutningsvis protokollene vises i dette arbeidet kan betraktes som egnede metoder å vurdere styrken på miljømessige kjemikalier eller medisiner skal enzymatisk bioactivated til metabolitter generere kovalente DNA-addukter, en svært viktig prosess for den utvikling av kreft og dens behandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatteren har ikke noe å avsløre.

Acknowledgments

Denne studien ble støttet av tsjekkiske Science Foundation (GACR, gi 17-12816S).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Tris Sigma-Aldrich 252859
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9541
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Phenol Roth 0032.8
Phenol/Chloroform/Isoamylalcohol Roth A156.1
Ethanol Penta 70390-11000
Calf thymus DNA Sigma-Aldrich D4522
NADH Sigma-Aldrich N7004
NADP+ Sigma-Aldrich N5755
NADPH Sigma-Aldrich N7505
D-glucose 6-phosphate Sigma-Aldrich 7647001
D-glucose 6-phosphate dehydrogenase Sigma-Aldrich G6378
Supersomes Corning Gentest 456211, 456203, 456220, 456204, 456210, 456222, 456219, 456212, 456206, 456207, 456202
Human liver microsomes Corning Gentest 452172
Tween 20 Sigma-Aldrich P1379
Hypoxanthine Sigma-Aldrich 77662
2-Hydroxypyrimidine Sigma-Aldrich H56800
Ethyl acetate Sigma-Aldrich 437549
Diethyl ether Sigma-Aldrich 179272
Micrococcal nuclease from Staphylococcus aureus Sigma-Aldrich N3755
Spleen phosphodiesterase from calf spleen, Type II Calbiochem 524711
Nuclease P1 from Penicillium citrinum Sigma-Aldrich N8630
Bicine Sigma-Aldrich 163791
DL-Dithiotreitol Sigma-Aldrich D0632
Spermidine Sigma-Aldrich S2626
Tetrabutylammonium chloride Sigma-Aldrich 86870
n-Butanol Sigma-Aldrich 437603
T4-polynucleotide kinase USB Corp 70031Y
[γ-32P]ATP Hartman Analytic GmbH FP-201
PEI-impregnated cellulose TLC plates Macherey-Nagel 801053
Packard Instant Imager A202400 Packard G120337
Ellipticine Sigma-Aldrich 285730
3-Nitrobenzanthrone prepared (synthesized) as shown in ref. 40

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Croom, E. Metabolism of xenobiotics of human environments. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 112, 31-88 (2012).
  2. Guengerich, F. P. Common and uncommon cytochrome P450 reactions related to metabolism and chemical toxicity. Chem. Res. Toxicol. 14, (6), 611-650 (2001).
  3. Guengerich, F. P. Cytochrome P450 and chemical toxicology. Chem. Res. Toxicol. 21, (2), 70-83 (2008).
  4. Stiborova, M., et al. NADH:Cytochrome b5 Reductase and Cytochrome b5 Can Act as Sole Electron Donors to Human Cytochrome P450 1A1-Mediated Oxidation and DNA Adduct Formation by Benzo[a]pyrene. Chem. Res. Toxicol. 29, (8), 1325-1334 (2016).
  5. Rendic, S., Guengerich, F. P. Contributions of human enzymes in carcinogen metabolism. Chem. Res. Toxicol. 25, (7), 1316-1383 (2012).
  6. Wienkers, L. C., Heath, T. G. Predicting in vivo drug interactions from in vitro drug discovery data. Nat. Rev. Drug Discov. 4, (10), 825-833 (2005).
  7. Guengerich, F. P., Liebler, D. C. Enzymatic activation of chemicals to toxic metabolites. Crit. Rev. Toxicol. 14, (3), 259-307 (1985).
  8. Poirier, M. C. Linking DNA adduct formation and human cancer risk in chemical carcinogenesis. Environ. Mol. Mutagen. 57, (7), 499-507 (2016).
  9. Rappaport, S. M., Li, H., Grigoryan, H., Funk, W. E., Williams, E. R. Adductomics: characterizing exposures to reactive electrophiles. Toxicol. Lett. 213, (1), 83-90 (2012).
  10. Luch, A. Nature and nurture - lessons from chemical carcinogenesis. Nat. Rev. Cancer. 5, (2), 113-125 (2005).
  11. Nebert, D. W., Dalton, T. P. The role of cytochrome P450 enzymes in endogenous signalling pathways and environmental carcinogenesis. Nat Rev Cancer. 6, (12), 947-960 (2006).
  12. Phillips, D. H. Macromolecular adducts as biomarkers of human exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. Imperial College Press. London. 137-169 (2005).
  13. Phillips, D. H. DNA adducts as markers of exposure and risk. Mutat. Res. 577, (1-2), 284-292 (2005).
  14. Hemminki, K. DNA adducts, mutations and cancer. Carcinogenesis. 14, (10), 2007-2012 (1993).
  15. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, (12), 958-970 (2008).
  16. Geacintov, N. E., Broydem, S. Repair-resistant DNA lesions. Chem. Res. Toxicol. 30, (8), 1517-1548 (2017).
  17. Randerath, K., Reddy, M. V., Gupta, R. C. 32P-labeling test for DNA damage. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78, (10), PubMed ID: 7031643 6128-6129 (1981).
  18. Reichert, W. L., Stein, J. E., French, B., Goodwin, P., Vanarasi, U. Storage phosphor imaging technique for detection and quantitation of DNA adducts measured by the 32P-postlabeling assay. Carcinogensis. 13, (8), 1475-1479 (1992).
  19. Chang, L. W., Hsia, S. M. T., Chang, P. C., Hsieh, L. L. Macromolecular adducts - biomarkers for toxicity and carcinogenesis. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 34, 41-67 (1994).
  20. Gupta, R. C., Reddy, M. V., Randerath, K. 32P-post-labeling analysis of nonradioactive aromatic carcinogen DNA adducts. Carcinogenesis. 3, (9), 1081-1092 (1982).
  21. Reddy, M. V., Randerath, K. Nuclease-P1-mediated enhancement of sensitivity of 32P-postlabeling test for structurally diverse DNA adducts. Carcinogenesis. 7, (9), 1543-1551 (1986).
  22. Mourato, L. L., Beland, F. A., Marques, M. M. 32P-Postlabeling of N-(deoxyguanosin-8-yl)arylamine adducts: a comparative study of labeling efficiencies. Chem. Res. Toxicol. 12, (7), 661-669 (1999).
  23. Randerath, E., Agrawal, H. P., Weaver, J. A., Bordelon, C. B., Randerath, K. 32P-Postlabeling analysis of DNA adducts persisting for up to 42 weeks in the skin, epidermis and dermis of mice treated topically with 7,2-dimethylbez[a]anthracene. Carcinogenesis. 6, (8), 1117-1126 (1985).
  24. Everson, R. B., Randerath, E., Santella, R. M., Cefalo, R. C., Avits, T. A., Randerath, K. Detection of smoking-related covalent DNA adducts in human placenta. Science. 231, (4733), 57-65 (1986).
  25. Gupta, R. C. Enhanced sensitivity of 32P-postlabeling analysis of aromatic carcinogen-DNA adducts. Cancer Res. 45, (11 Pt 2), PubMed ID: 4053037 5656-5662 (1985).
  26. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  27. Omura, T., Sato, R. The carbon monoxide-binding pigment of liver microsomes. I. Evidence for its hemoprotein nature. J. Biol. Chem. 239, PubMed ID: 14209971 2370-2378 (1964).
  28. Stiborová, M., Asfaw, B., Frei, E., Schmeiser, H. H., Wiessler, M. Benzenediazonium ion derived from Sudan I forms an 8-(phenylazo)guanine adduct in DNA. Chem. Res. Toxicol. 8, (4), 489-498 (1995).
  29. Stiborova, M., Rupertova, M., Schmeiser, H. H., Frei, E. Molecular mechanisms of antineoplastic action of an anticancer drug ellipticine. Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky Olomouc Czech Repub. 150, (1), PubMed ID: 16936898 13-23 (2006).
  30. Stiborová, M., Rupertová, M., Frei, E. Cytochrome P450- and peroxidase-mediated oxidation of anticancer alkaloid ellipticine dictates its anti-tumor efficiency. Biochim. Biophys. Acta. 1814, (1), 175-185 (2011).
  31. Stiborova, M., Frei, E. Ellipticines as DNA-targeted chemotherapeutics. Current Med. Chem. 21, (5), 575-591 (2014).
  32. Arlt, V. M., Stiborova, M., Schmeiser, H. H. Aristolochic acid as a probable human cancer hazard in herbal remedies: a review. Mutagenesis. 17, (4), 265-277 (2002).
  33. Arlt, V. M., et al. Aristolochic acid mutagenesis: molecular clues to the aetiology of Balkan endemic nephropathy-associated urothelial cancer. Carcinogenesis. 28, (11), 2253-2261 (2007).
  34. Stiborová, M., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Metabolic activation of carcinogenic aristolochic acid, a risk factor for Balkan endemic nephropathy. Mutat. Res. 658, (1-2), 55-67 (2008).
  35. Stiborová, M., Frei, E., Schmeiser, H. H. Biotransformation enzymes in development of renal injury and urothelial cancer caused by aristolochic acid. Kidney Int. 73, (11), 1209-1211 (2008).
  36. Schmeiser, H. H., Stiborová, M., Arlt, V. M. Chemical and molecular basis of the carcinogenicity of Aristolochia plants. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 12, (1), PubMed ID: 19152223 141-148 (2009).
  37. Gökmen, M. R., et al. The epidemiology, diagnosis, and management of aristolochic acid nephropathy: a narrative review. Ann. Intern. Med. 158, (6), 469-477 (2013).
  38. Stiborová, M., Martínek, V., Frei, E., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Enzymes metabolizing aristolochic acid and their contribution to the development of aristolochic acid nephropathy and urothelial cancer. Curr. Drug Metab. 14, (6), 695-705 (2013).
  39. Stiborová, M., Arlt, V. M., Schmeiser, H. H. Balkan endemic nephropathy: an update on its aetiology. Arch. Toxicol. 90, (11), 2595-2615 (2016).
  40. Arlt, V. M., et al. Metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone by human acetyltransferases and sulfotransferase. Carcinogenesis. 23, (11), PubMed ID: 12419844 1937-1945 (2002).
  41. Arlt, V. M., Stiborova, M., Hewer, A., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H. Human enzymes involved in the metabolic activation of the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone: evidence for reductive activation by human NADPH:cytochrome P450 reductase. Cancer Res. 63, (11), PubMed ID: 12782579 2752-2761 (2003).
  42. Arlt, V. M., et al. Environmental pollutant and potent mutagen 3-nitrobenzanthrone forms DNA adducts after reduction by NAD(P)H:quinone oxidoreductase and conjugation by acetyltransferases and sulfotransferases in human hepatic cytosols. Cancer Res. 65, (7), 2644-2652 (2005).
  43. Osborne, M. R., et al. Synthesis, characterization, and 32p-postlabeling analysis of DNA adducts derived from the environmental contaminant 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 18, (6), 1056-1070 (2005).
  44. Arlt, V. M., et al. Identification of three major DNA adducts formed by the carcinogenic air pollutant 3-nitrobenzanthrone in rat lung at the C8 and N2 position of guanine and at the N6 position of adenine. Int. J. Cancer. 118, (9), 2139-2146 (2006).
  45. Stiborová, M., et al. Mechanisms of the different DNA adduct forming potentials of the urban air pollutants 2-nitrobenzanthrone and carcinogenic 3-nitrobenzanthrone. Chem. Res. Toxicol. 23, (7), 1192-1201 (2010).
  46. Arlt, V. M., Hewer, A., Sorg, B. L., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, forms DNA adducts after metabolic activation by human and rat liver microsomes: evidence for activation by cytochrome P450 1A1 and P450 1A2. Chem. Res. Toxicol. 17, (8), 1092-1101 (2004).
  47. Arlt, V. M., Henderson, C. J., Wolf, C. R., Schmeiser, H. H., Phillips, D. H., Stiborova, M. Bioactivation of 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone: evidence for DNA adduct formation mediated by cytochrome P450 enzymes and peroxidase. Cancer Lett. 234, (2), 220-231 (2006).
  48. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  49. Stiborová, M., Miksanová, M., Havlícek, V., Schmeiser, H. H., Frei, E. Mechanism of peroxidase-mediated oxidation of carcinogenic o-anisidine and its binding to DNA. Mutat. Res. 500, (1-2), 49-66 (2002).
  50. Stiborová, M., Miksanová, M., Sulc, M., Rýdlová, H., Schmeiser, H. H., Frei, E. Identification of a genotoxic mechanism for the carcinogenicity of the environmental pollutant and suspected human carcinogen o-anisidine. Int. J. Cancer. 116, (5), 667-678 (2005).
  51. Naiman, K., Martínková, M., Schmeiser, H. H., Frei, E., Stiborová, M. Human cytochrome-P450 enzymes metabolize N-(2-methoxyphenyl)hydroxylamine, a metabolite of the carcinogens o-anisidine and o-nitroanisole, thereby dictating its genotoxicity. Mutat. Res. 726, (2), 160-168 (2011).
  52. Naiman, K., et al. Formation, persistence, and identification of DNA adducts formed by the carcinogenic environmental pollutant o-anisidine in rats. Toxicol. Sci. 127, (2), 348-359 (2012).
  53. Stiborová, M., Bieler, C. A., Wiessler, M., Frei, E. The anticancer agent ellipticine on activation by cytochrome P450 forms covalent DNA adducts. Biochem. Pharmacol. 62, (12), 1675-1684 (2001).
  54. Stiborová, M., Stiborová-Rupertová, M., Borek-Dohalská, L., Wiessler, M., Frei, E. Rat microsomes activating the anticancer drug ellipticine to species covalently binding to deoxyguanosine in DNA are a suitable model mimicking ellipticine bioactivation in humans. Chem. Res. Toxicol. 16, (1), 38-47 (2003).
  55. Stiborová, M., et al. The anticancer drug ellipticine forms covalent DNA adducts, mediated by human cytochromes P450, through metabolism to 13-hydroxyellipticine and ellipticine N2-oxide. Cancer Res. 64, (22), 8374-8380 (2004).
  56. Kotrbová, V., et al. Cytochrome b5 shifts oxidation of the anticancer drug ellipticine by cytochromes P450 1A1 and 1A2 from its detoxication to activation, thereby modulating its pharmacological efficacy. Biochem. Pharmacol. 82, (6), 669-680 (2011).
  57. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 increases cytochrome P450 3A4-mediated activation of anticancer drug ellipticine to 13-hydroxyellipticine whose covalent binding to DNA is elevated by sulfotransferases and N,O-acetyltransferases. Chem. Res.Toxicol. 2, (5), 1075-1085 (2012).
  58. Stiborová, M., et al. Ellipticine oxidation and DNA adduct formation in human hepatocytes is catalyzed by human cytochromes P450 and enhanced by cytochrome b5. Toxicology. 302, (2-3), 233-241 (2012).
  59. Sulc, M., et al. Effectiveness of human cytochrome P450 3A4 present in liposomal and microsomal nanoparticles in formation of covalent DNA adducts by ellipticine. Neuro Endocrinol. Lett. 37, (Suppl 1), PubMed ID: 28263536 95-102 (2016).
  60. Stiborová, M., et al. Cytochrome b5 plays a dual role in the reaction cycle of cytochrome P450 3A4 during oxidation of the anticancer drug ellipticine. Monatsh. Chem. 148, (11), 1983-1991 (2017).
  61. Stiborová, M., Poljaková, J., Ryslavá, H., Dracínský, M., Eckschlager, T., Frei, E. Mammalian peroxidases activate anticancer drug ellipticine to intermediates forming deoxyguanosine adducts in DNA identical to those found in vivo and generated from 12-hydroxyellipticine and 13-hydroxyellipticine. Int. J. Cancer. 20, (2), 243-251 (2007).
  62. Enya, T., Suzuki, H., Watanabe, T., Hirayama, T., Hisamatsu, Y. 3-Nitrobenzanthrone, a powerful bacterial mutagen and suspected human carcinogen found in diesel exhausts and airborne particulates. Environ. Sci. Technol. 31, (10), 2772-2776 (1997).
  63. Seidel, A., Dahmann, D., Krekeler, H., Jacob, J. Biomonitoring of polycyclic aromatic compounds in the urine of mining workers occupationally exposed to diesel exhaust. Int. J. Hyg. Environ. Health. 204, (5-6), 333-338 (2002).
  64. Arlt, V. M. 3-Nitrobenzanthrone, a potential human cancer hazard in diesel exhaust and urban air pollution: a review of the evidence. Mutagenesis. 20, (6), 399-410 (2005).
  65. Hansen, T., Seidel, A., Borlak, J. The environmental carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its main metabolite 3-aminobenzanthrone enhance formation of reactive oxygen intermediates in human A549 lung epithelial cells. Toxicol. Appl. Pharmacol. 221, (2), 222-234 (2007).
  66. Stiborová, M., et al. 3-aminobenzanthrone, a human metabolite of the carcinogenic environmental pollutant 3-nitrobenzanthrone, induces biotransformation enzymes in rat kidney and lung. Mutat. Res. 676, (1-2), 93-101 (2009).
  67. Nagy, E., et al. DNA adduct and tumor formations in rats after intratracheal administration of the urban air pollutant 3-nitrobenzanthrone. Carcinogenesis. 26, (10), 1821-1828 (2005).
  68. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone and its human metabolite 3-aminobenzanthrone are potent inducers of rat hepatic cytochromes P450 1A1 and -1A2 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase. Drug Metab. Dispos. 34, (8), 1398-1405 (2006).
  69. Stiborová, M., et al. The environmental pollutant and carcinogen 3-nitrobenzanthrone induces cytochrome P450 1A1 and NAD(P)H:quinone oxidoreductase in rat lung and kidney, thereby enhancing its own genotoxicity. Toxicology. 247, (1), 11-22 (2008).
  70. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Nat. Rev. Cancer. 4, (8), 630-637 (2004).
  71. Poirier, M. C. Chemical-induced DNA damage and human cancer risk. Discov. Med. 14, (77), PubMed ID: 23114584 283-288 (2012).
  72. Phillips, D. H. Detection of DNA modifications by the 32P-postlabelling assay. Mutat. Res. 378, (1-2), 1-12 (1997).
  73. Phillips, D. H., et al. Methods of DNA adduct determination and their application to testing compounds for genotoxicity. Environ. Mol. Mutagen. 35, (3), 222-233 (2000).
  74. Phillips, D. H. Smoking-related DNA and protein adducts in human tissues. Carcinogenesis. 23, (12), 1979-2004 (2002).
  75. Phillips, D. H., Hewer, A., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 291, 3-12 (2005).
  76. Farmer, P. B., et al. DNA adducts: mass spectrometry methods and future prospects. Toxicol. Appl. Pharmacol. 207, (2 Suppl), 293-301 (2005).
  77. Singh, R., Farmer, P. B. Liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry: the future of DNA adduct detection. Carcinogenesis. 27, (2), 178-196 (2006).
  78. Phillips, D. H., Arlt, V. M. The 32P-postlabeling assay for DNA adducts. Nat. Protoc. 2, (11), 2772-2781 (2007).
  79. Phillips, D. H. On the origins and development of the (32)P-postlabelling assay for carcinogen-DNA adducts. Cancer Lett. 334, (1), 5-9 (2013).
  80. Phillips, D. H., Arlt, V. M. 32P-postlabeling analysis of DNA adducts. Methods Mol. Biol. 1105, 127-138 (2014).
  81. Stiborová, M., Frei, E., Bieler, C. A., Schmeiser, H. H. 32P-Postlabelling: a sensitive technique for the detection of DNA adducts. Chem. Listy. 92, 661-668 (1998).
  82. Stiborová, M., Rupertová, M., Hodek, P., Frei, E., Schmeiser, H. H. Monitoring of DNA adducts in humans and 32P-postlabelling methods. A review. Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 477-498 (2004).
  83. Beach, A. C., Gupta, R. C. Human biomonitoring and the 32P-postlabelling assay. Carcinogenesis. 13, 1053-1074 (1992).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics