माउस Monocyte के आइसोलेशन प्रोटोकॉल-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं और उनके बाद में ट्यूमर प्रतिरक्षा परिसरों के साथ इन विट्रो सक्रियण

* These authors contributed equally
Cancer Research

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Summary

Monocyte-व्युत्पंन डीसी (MoDC) खतरे से जुड़े अणुओं की मामूली मात्रा में समझ सकते है और इसलिए आसानी से प्रधानमंत्री हैं । हम रक्त और ट्यूमर और प्रतिरक्षा परिसरों के साथ उनके सक्रियण से MoDC के अलगाव के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हुए प्रमुख सावधानियों है कि क्रम में उनके समयपूर्व सक्रियण से बचने के लिए विचार किया जाना चाहिए पर प्रकाश डाला ।

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Santana-Magal, N., Rasoulouniriana, D., Saperia, C., Gutwillig, A., Rider, P., Engleman, E. G., Carmi, Y. Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes. J. Vis. Exp. (135), e57188, doi:10.3791/57188 (2018).

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Abstract

वृक्ष कोशिकाओं (डीसी) विषम कोशिका आबादी है कि उनके सेल झिल्ली मार्करों में अलग हैं, प्रवास के पैटर्न और वितरण, और उनके प्रतिजन प्रस्तुति और टी सेल सक्रियण क्षमता में । प्रयोगात्मक ट्यूमर मॉडल के अधिकांश टीकाकरण डीसी के लाखों की आवश्यकता के बाद से, वे व्यापक रूप से अस्थि मज्जा या तिल्ली से अलग कर रहे हैं. हालांकि, इन डीसी काफी प्रतिरक्षा परिसरों (आईसी) को अपनी प्रतिक्रियाओं में रक्त और ट्यूमर डीसी से अलग है, और संभवतः अंय Syk-युग्मित लेक्टिन रिसेप्टर्स के लिए । महत्वपूर्ण बात, खतरे के लिए डीसी की संवेदनशीलता को देखते हुए जुड़े अणुओं, endotoxins या एंटीबॉडी की उपस्थिति है कि crosslink सक्रियकरण रिसेप्टर्स अलग कदम में से एक में डीसी की भड़काना में परिणाम सकता है और इस तरह के मापदंडों को प्रभावित, या कम से खुराक, उन्हें सक्रिय करने के लिए आवश्यक. इसलिए, यहां हम रक्त और ट्यूमर से MoDC अलग करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हुए उनके समयपूर्व सक्रियण से परहेज । इसके अलावा, एक प्रोटोकॉल ट्यूमर आईसी के साथ MoDC सक्रियण के लिए प्रदान की जाती है, और उनके बाद विश्लेषण ।

Introduction

उनकी खोज के बाद से, वृक्ष कोशिकाओं (डीसी) अपने अद्वितीय टी सेल भेदभाव को तिरछा करने की क्षमता के कारण व्यापक अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है1। पिछले कई दशकों में, एक व्यापक अनुसंधान के प्रयास के लिए विभिंन डीसी सबसेट और उनके समारोह ट्यूमर प्रगति और प्रतिरक्षा 2के दौरान परिभाषित करने की मांग की है । dc विषम कोशिका आबादी है कि उनके पैटर्न में एक दूसरे से अलग पहचान रिसेप्टर्स, ऊतक वितरण, और प्रवासी और प्रतिजन प्रस्तुति क्षमताओं3,4,5से बना रहे हैं । अन्य डीसी सबसेट की तुलना में, monocyte-व्युत्पन्न डीसी (MoDC) ट्यूमर में कहीं अधिक प्रचुर मात्रा में हैं और आसानी से परिसंचारी या ट्यूमर घुसपैठ monocytes6,7से उत्पन्न किया जा सकता है. इसलिए, कई नैदानिक अपने रिश्तेदार की व्यापकता का लाभ लेने की मांग परीक्षण vivo में पर आधारित है और ऑटोलॉगस MoDC के पूर्व vivo हेरफेर के लिए टी सेल उन्मुक्त 8,9में ।

इसी तरह, प्रायोगिक ट्यूमर मॉडलों के डीसी आधारित टीकाकरण 2-3 सीरियल इंजेक्शन, 5-7 दिन के अलावा, 1-2 x 106 सक्रिय डीसी ट्यूमर एंटीजन के साथ स्पंदित की आवश्यकता है । इसलिए, डीसी के इस बड़ी संख्या को प्राप्त करने के लिए, सबसे माउस अध्ययन मुख्यतः अस्थि मज्जा (बी. ए.) जीएम-सीएसएफ से 7-9 दिनों के लिए (IL-4 माउस की स्थापना में आवश्यक नहीं है) में MoDC संस्कृति का इस्तेमाल किया है10,11। बहरहाल, यह देखते हुए कि जीएम सीएसएफ नॉकआउट चूहों समग्र सामांय डीसी डिब्बे 12,13है, और मिश्रित है कि संस्कृति से प्राप्त की आबादी,14 इन डीसी के शारीरिक प्रासंगिकता सवाल में कहा गया है दिया ।

वैकल्पिक रूप से, डीसी नियमित रूप से तिल्ली कोशिकाओं से अलग किया जा सकता है । हालांकि, dc केवल के बारे में 0.3-0.8% कुल तिल्ली कोशिकाओं (लगभग 7 x 105 dc/तिल्ली), और इन कोशिकाओं के, केवल CD103+ dc और MoDC वापस लसीकावत् अंगों के लिए माइग्रेट कर सकते हैं में शामिल हैं । चूंकि MoDCs प्लीहा डीसी की आबादी के लगभग 10-15% शामिल15,16, सबसे अलगाव प्रोटोकॉल लगभग 1 x 10 तिल्ली प्रति5 MoDC उपज । MoDC का विस्तार transfected B16 कोशिकाओं है कि जीएम सीएसएफ स्रावित इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, एक १०० प्लीहा MoDC में वृद्धि गुना में जिसके परिणामस्वरूप17। हालांकि, डीसी टीके के विकास के लिए MoDC के उपयोग के बाद से इस प्रक्रिया मनुष्यों में नहीं किया जा सकता है और प्राप्त MoDC पहले से ही उच्च सक्रिय है सीमित है ।

डीसी की पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के अलावा, ऑटोलॉगस कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ प्रभावी डीसी टीके के विकास के लिए एक और चुनौती ट्यूमर सेटिंग में पर्याप्त खतरे संकेतों की कमी को पूरी तरह से सक्रिय डीसी शामिल है । सह stimulatory संकेतों की प्रेरण आमतौर पर पैटर्न पहचान रिसेप्टर्स (पीआरआर), या सी प्रकार लेक्टिन संकेतन रास्ते18,19,20,21के सक्रियण के माध्यम से प्राप्त की है । डीसी सक्रिय करने के लिए एक और दृष्टिकोण अपने एंटीजन को सतह Fcγ रिसेप्टर्स (FcγR) के साथ बातचीत के माध्यम से लेने की क्षमता कारनामे । दरअसल, महत्वपूर्ण पांडुलिपियों के एक नंबर है कि ट्यूमर के साथ सक्रिय बीएम पुरोगामी से MoDC के इंजेक्शन आईजीजी आईसी नियत्रंण सेटिंग्स में ट्यूमर के विकास को रोका जा सकता है पता चला है, और स्थापित ट्यूमर के उंमूलन के लिए नेतृत्व कर सकते है22,23 .

हाल के दो पत्रों में, कर्ंमी एट अल. पता चला है कि इसके विपरीत में BMDC और तिल्ली डीसी, रक्त और ट्यूमर से MoDC अतिरिक्त उत्तेजनाओं के बिना आईजीजी आईसी का जवाब नहीं कर सकते । यह FcγR संकेतन24,25को विनियमित करने के tyrosine phosphatases के उच्च intracellular स्तर की उपस्थिति के कारण पाया गया । डीसी में एक महत्वपूर्ण चौकियों को परिभाषित करके, यह काम सफल डीसी आधारित टीकाकरण के लिए आवश्यकताओं में एक महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है । अतिरिक्त उत्तेजनाओं के लिए आवश्यकता FcγR संकेतन सक्षम करने के लिए, और संभवतः अंय लेक्टिन एक समान फास्फारिलीकरण झरना का उपयोग रिसेप्टर्स से संकेत, इस प्रकार अपने अलगाव के दौरान डीसी की भड़काना से बचने के लिए की जरूरत को रेखांकित करता है ।

इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल रक्त और ट्यूमर से MoDC के अलगाव का वर्णन करता है, जो बीएम और तिल्ली डीसी से स्पष्ट रूप से अलग है, और इस प्रक्रिया के दौरान विचार करने के काबिल सावधानियों पर प्रकाश डाला गया ।

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Protocol

नीचे प्रोटोकॉल माउस MoDC के अलगाव को देखें, अभी तक समग्र सिद्धांतों अंय डीसी सबसेट कोशिकाओं पर लागू होते हैं, के रूप में अच्छी तरह से कर सकते हैं । 12-16-सप्ताह पुराने C57Bl/6j चूहों प्रयोगशाला पशु देखभाल की मांयता के लिए एक अमेरिकी संघ में बनाए रखा गया था-मांयता प्राप्त पशु सुविधा । सभी प्रोटोकॉल स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय और तेल अवीव विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया ।

1. ट्यूमर से जुड़े अलगाव Monocyte-व्युत्पन्न डीसी

  1. एक लामिना फ्लो हुड में, सह2 euthanized चूहों और RPMI माध्यम में भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के बिना ट्यूमर जगह से ट्यूमर को हटा दें ।
    नोट: यह अत्यधिक चूहों दाढ़ी और ट्यूमर को हटाने से पहले उन्हें ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे करने के लिए सिफारिश की है, फर से संभावित संदूषणों को कम करने के लिए. निश्चित है कि ट्यूमर 25-40 mm से अधिक नहींहै 2 के बाद से बड़ा ट्यूमर कम डीसी है कि नाजुक हो जाते है और कोशिका मृत्यु से गुजरना प्रवण । यदि डीसी की बड़ी संख्या की जरूरत है, प्रत्येक माउस एकाधिक साइटों पर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन किया जा सकता है ।
  2. एक बाँझ लामिना हूड के तहत, छोटे टुकड़ों में सर्जरी कैंची का उपयोग ट्यूमर काटना (लगभग 1 x 1 मिमी2) ।
    1. एक माउस से एक 30 मिलीलीटर बाँझ फ्लैट नीचे ट्यूब में सभी ट्यूमर टुकड़े जोड़ें चुंबकीय हलचल सलाखों के साथ, जो है हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) के 5 मिलीलीटर, 2 मिलीग्राम/एमएल collagenase चतुर्थ, और ०.०१ मिलीग्राम/एमएल DNase मैं ।
      चेतावनी: माइलॉयड कोशिकाओं glycosylation के माध्यम से ऊर्जा का उत्पादन, यहां तक कि स्थिर राज्य के तहत । इसलिए, केवल ग्लूकोज (जैसे HBSS, RPMI, और DMEM), ग्लूकोज भुखमरी के रूप में के रूप में कम के रूप में 10-15 मिनट सेल मौत और apoptosis में 24 घंटे के भीतर परिणाम होगा कि मीडिया का उपयोग केवल एक कम endotoxin collagenase IV का उपयोग करें, के रूप में collagenase ग्राम द्वारा उत्पादित है-सकारात्मक बैक्टीरिया (क्लोस्ट्रीडियम histolyticum)
  3. 20-30 मिनट के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी के साथ एक ३७ सी मशीन में के बारे में २००-४०० rpm पर हिलाओ ।
  4. पूरा मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें और फिर से सख्ती से निलंबित ।
  5. एक ७०-µm सेल छलनी के माध्यम से फ़िल्टर कोशिकाओं । 5-10 मिनट के लिए 4ओ सी ४०० आरसीएफ पर कोशिकाओं गोली करने के लिए ।
    चेतावनी: एंजाइमी पाचन के बाद सीधे कोशिकाओं को अलग करने का प्रयास नहीं करते, कुछ ट्यूमर के रूप में गल रहे हैं और सेल मलबे या extracellular मैट्रिक्स की अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में होते हैं. केवल कक्षों को प्राप्त करने के लिए 15% घनत्व ग्रेडिएंट माध्यम पर कक्ष लागू करें ।
  6. परासरणीयता समायोजित करने के लिए, और १००% Percoll शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए 10x पंजाबियों की 1 मिलीलीटर के साथ घनत्व ढाल माध्यम के 9 मिलीलीटर निलंबित । ८.५ मिलीलीटर HBSS के साथ १.५ मिलीलीटर घनत्व ढाल मध्यम शेयर समाधान मिश्रण और यह ट्यूमर-व्युत्पन्न सेल गोली के साथ जोरदार मिश्रण । धीरे 15% घनत्व ढाल मध्यम के शीर्ष पर DMEM के 2 मिलीलीटर परत और 20 मिनट के लिए ४०० आरसीएफ में कमरे के तापमान पर केंद्रापसारक । supernatants त्यागें, के रूप में कोशिकाओं ट्यूब के तल पर एक गोली फार्म जाएगा ।
    1. 2% FBS, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, और 10 मिमी EDTA (आइसोलेशन बफर) से युक्त 10 मिलीलीटर HBSS में फिर से निलंबित करके दो बार छर्रों कोशिकाओं को धो लें, और 5-10 मिनट के लिए 4 oC ४०० आरसीएफ में कोशिकाओं को गोली करने के लिए ।
    2. एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत trypan नीले का उपयोग कर एक hemocytometer पर कोशिकाओं की गणना.
  7. 1 एमएल आइसोलेशन बफर में 1 एक्स 108 कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 15 मिनट के लिए CD11b+ संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की 30 μL के साथ 4 सी पर उन्हें मशीन ।
    चेतावनी: CD11c-संयुग्मित मोतियों के उपयोग से बचें, के रूप में इस डीसी को सक्रिय करने और सेल मौत प्रेरित करेगा । विरोधी CD16/32 एंटीबॉडी के साथ FcγRII और FcγRIII ब्लॉक करने का प्रयास न करें । एंटीबॉडी ligate FcγR अवरुद्ध और नक्शे kinases और प्रधानमंत्री डीसी के मजबूत फास्फारिलीकरण प्रेरित.
    1. अलगाव बफर के 9 मिलीलीटर जोड़कर अतिरिक्त असीम मोतियों को हटा दें और ४०० आरसीएफ पर 5-10 मिनट के लिए4ओ सी पर कोशिकाओं केंद्रापसारक
  8. महाप्राण supernatant और पुन: निलंबित कक्ष 1 एमएल आइसोलेशन बफ़र में है । एक धुल चुंबकीय कॉलम पर कोशिकाओं को लागू करें । स्तंभ को दो बार आइसोलेशन बफ़र के 3 मिलीलीटर के साथ धोएं ।
    1. चुंबक से कॉलम निकालें । पिपेट स्तंभ पर अलगाव बफर के 6 मिलीलीटर और गोताख़ोर धक्का द्वारा एक बाँझ संग्रह ट्यूब में चुंबकीय लेबल कोशिकाओं बाहर फ्लश । 4 सी में 5-10 मिनट के लिए ४०० आरसीएफ पर कोशिकाओं केंद्रापसारक
    2. १०० μL प्रति 1 x 107 कोशिकाओं और दाग के साथ निंनलिखित fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी: Linage नकारात्मक (TCRb, Siglec एफ, B220, CD19, FceRI और Ly6G), MHCII, में कोशिकाओं को फिर से निलंबित 6C ।
  9. छोटी कोशिकाओं को गेटिंग द्वारा क्रमबद्ध करें, साइड स्कैटर (एसएससी) और फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) और पूर्ण माध्यम में संस्कृति का उपयोग करके 5 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ के साथ पूरक । मैक्रोफेज प्लेट का पालन करने के लिए अनुमति देने के क्रम में ३ ७ ओ सी पर 1 घंटे के लिए कोशिकाओं की मशीन । फिर, लचर और गैर-अनुयाई कोशिकाओं को एक नई कल्चरल डिश में ट्रांसफर करें ।
    नोट: माउस MoDC CD11b+/CD11c+/MHCIIhi/Ly6Clo/int 7,26,27के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । Ly6C की अभिव्यक्ति नाटकीय रूप से ट्यूमर मॉडल के बीच भिन्न हो सकते हैं, और कुछ मॉडलों में (जैसे LMP) MoDCs पूरी तरह से अभिव्यक्ति Ly6C कमी. कुल मिलाकर, १ १०० mm 3 B16F10 ट्यूमर आमतौर पर 5 एक्स डीसी के 10 4, लगभग 4-5 x 10 6 कुल कोशिकाओं में जिसके परिणामस्वरूप होता है । इन कोशिकाओं की, 10-15% प्रतिरक्षा कोशिकाओं रहे है और 8-10% MoDC हैं । डीसी संख्या में वृद्धि कई साइटों पर ट्यूमर के साथ चूहों इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । केवल छोटे एसएससी/FCS कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें, के रूप में अन्य माइलॉयड कोशिकाओं CD11c और Ly6C जैसे मार्करों व्यक्त कर सकते हैं ।
    वैकल्पिक: छोटी एसएससी/FSC कोशिकाओं के रूप में ट्यूमर घुसपैठ monocyte तरह कि एक्सप्रेस Ly6Cहाय और MHCII के लिए नकारात्मक हैं । इसके बाद, संस्कृति डीसी प्राप्त करने के लिए ५० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ के साथ इन विट्रो में monocytes ।

2. Monocyte के अलगाव-परिधीय रक्त से डीसी व्युत्पंन

नोट: के बाद से परिपक्व MoDCs माउस रक्त में अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं, नीचे प्रोटोकॉल हल monocytes से इन विट्रो में व्युत्पत्ति को संदर्भित करता है ।

  1. रक्त में monocytes के स्तर को बढ़ाने के लिए, anesthetize चूहों 4% isoflurane के साथ और उन्हें (एस॰सी॰) ५० μg पंजाब में जीएम-सीएसएफ के 1 μL के साथ इंजेक्शन.
  2. 1-2 h के बाद, सह2का उपयोग करते हुए चूहों को कुर्बान करें ।
    चेतावनी: गर्भाशय ग्रीवा विस्थापन द्वारा चूहों का बलिदान नहीं है, क्योंकि यह आंतरिक रक्तस्राव का कारण होगा ।
  3. तुरंत euthanization के बाद, ७०% इथेनॉल के साथ माउस स्प्रे और त्वचा है कि शल्य चिकित्सा कैंची का उपयोग कर दिल को शामिल निकाल, एक बाँझ लामिना प्रवाह हुड के तहत । इथेनॉल के साथ कैंची को साफ करें और दिल के सही atrium को काट लें । धीरे, 20 मिमी EDTA HBSS के साथ सही निलय के माध्यम से दिल फ्लश एक 10 मिलीलीटर सिरिंज और 25-जी सुई का उपयोग कर.
    1. heparan सल्फेट और EDTA युक्त बाँझ ट्यूब में फुफ्फुस गुहा से एक बाँझ सिरिंज के साथ रक्त ले लीजिए. दिल को फ्लश करने के लिए जारी रखें जब तक जिगर और फेफड़ों गुलाबी या सफेद हो जाते हैं ।
  4. कम ब्रेक के साथ 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ४०० आरसीएफ में एक घनत्व ढाल mediumand केंद्रापसारक पर रक्त लागू करें ।
    चेतावनी: का प्रयोग करें endotoxin-मुक्त घनत्व ढाल मध्यम (आमतौर पर कम से ०.१२ यूरोपीय संघ प्रति एमएल) ।
    1. एक नई ट्यूब में mononuclear कोशिकाओं को इकट्ठा । HBSS 2% FBS, 1% पेनिसिलिन/streptomycin और 10 मिमी EDTA (आइसोलेशन बफर), और फिर 4 oC ४०० आरसीएफ के लिए 5-10 मिनट के लिए कोशिकाओं को गोली से युक्त 10 मिलीलीटर में पुनः सस्पैंड द्वारा कोशिकाओं को धो लें ।
      सावधानी: केवल मीडिया का उपयोग करें जिसमें ग्लूकोज के कम से 1 g/
  5. CD11b सकारात्मक चयन के लिए, 1 एमएल अलगाव बफर में 1 एक्स 108 कोशिकाओं को फिर से निलंबित और 4 सी पर CD11b-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों की ५० μL के साथ 15 मिनट के लिए उन्हें मशीन ।
    1. अलगाव बफर के 9 मिलीलीटर जोड़ने और 4 C. महाप्राण पर 5-10 मिनट के लिए ४०० आरसीएफ पर केंद्रापसारक जोड़कर अतिरिक्त मोती धो supernatants और फिर से 1 मिलीलीटर आइसोलेशन बफर में कोशिकाओं को निलंबित । निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक धुल चुंबकीय स्तंभ पर कोशिकाओं को लागू करें ।
    2. चुंबक से कॉलम निकालें, पिपेट 6 अलगाव बफर की मिलीलीटर कॉलम पर, और बाहर फ्लश चुंबकीय-लेबल एक बाँझ संग्रह ट्यूब में गोताख़ोर धक्का द्वारा कोशिकाओं । ४०० आरसीएफ के लिए 5-10 मिनट पर 4 में कोशिकाओं केंद्रापसारक हेC. दो बार अलगाव बफर के 3 मिलीलीटर के साथ कॉलम धो लो ।
    3. 1 x 107 कक्षों/100 μL आइसोलेशन बफ़र और दाग के साथ निंन fluorophore-संयुग्मित एंटीबॉडी: ०.१ μg CD115, ०.२५ μg MHCII, और ०.१ μg-6C/1 x 106 कोशिकाओं पर कोशिकाओं को पुनः निलंबित ।
  6. छोटी साइड स्कैटर (SSC) और छोटे फॉरवर्ड स्कैटर (FSC) कोशिकाओं पर गेटिंग द्वारा क्रमबद्ध कोशिकाओं.
    नोट: माउस भड़काऊ monocytes आम तौर पर परिभाषित कर रहे है के रूप में CD115+/MHCIIlo/नेग/Ly6Cहाय, और गश्त monocytes CD115+/MHCIIलो/नेग/Ly6Cनेग 4, 5के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । मामलों में जहां दो उपसेटों के बीच कोई जुदाई की जरूरत है, टोटल SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo सेल को सुलझाया जा सकता है. दोनों भोली और ट्यूमर असर चूहों लगभग 5-8 x10 4 MoDC प्रति 1 मिलीलीटर रक्त और अप करने के लिए 4-5 x 10 5 MoDC जीएम-सीएसएफ का पालन इंजेक्शन शामिल हैं । उनमें से, लगभग ७०% भड़काऊ monocytes और 30% monocytes गश्त कर रहे हैं ।
  7. प्लेट एक पूर्ण मीडिया में 1 x 106 कोशिकाओं/एमएल के एक एकाग्रता पर 20 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ के साथ पूरक । 1 दिन के बाद, गैर अनुयाई और ढीले अनुयाई कोशिकाओं एक नई थाली और संस्कृति के लिए एक अतिरिक्त 4-5 दिनों के लिए स्थानांतरण ।
    चेतावनी: डीसी मीडिया पाइरूवेट के साथ पूरक नहीं होना चाहिए ।

3. ट्यूमर की तैयारी-आईजीजी प्रतिरक्षा परिसरों

  1. ७५ सेमी2 संस्कृति कुप्पी में संस्कृति ट्यूमर कोशिकाओं को पूरा DMEM मीडिया में ७०% संगम ।
    1. ०.२५% trypsin/EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें संस्कृति कुप्पी से कोशिकाओं को अलग करने और एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत सेल आकृति विज्ञान की निगरानी के लिए ओवर-trypsinization से बचने के लिए ।
    2. पूरा संस्कृति मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें (प्रति trypsin के 2 मिलीलीटर) trypsin पाचन को बाधित करने के लिए, और 4 सी, 5-10 मिनट के लिए ४०० आरसीएफ पर केंद्रापसारक कोशिकाओं गोली ।
      नोट: एक वाणिज्यिक पीसीआर किट का उपयोग कर माइकोप्लाज्मा के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की जांच करने के लिए सुनिश्चित करें । चने की मौजूदगी के लिए टेस्ट-नेगेटिव बैक्टीरिया और फंगल endotoxins का प्रयोग Limulus Amebocyte Lysate (LAL) परख28). सीरम ०.२२ माइक्रोन के माध्यम से फ़िल्टर किया जाना चाहिए और संघीय विनियमों के वायरस के 9 कोड के लिए परीक्षण. इसके अतिरिक्त, १००-२०० μL पौंड आगर या शोरबा, और संस्कृति पर 2 दिनों के लिए ३७ सी पर छोड़ने के द्वारा संस्कृति मीडिया और सीरम परीक्षण
    3. trypsin और सीरम से फिर से कोशिकाओं को धो रहता है फिर से 10 मिलीलीटर पंजाबियों में उंहें सस्पैंड और 5-10 min. महाप्राण supernatant के लिए ४०० आरसीएफ पर केंद्रापसारक और धो 2 अधिक बार दोहराएं ।
  2. कक्ष के तापमान पर 10 मिनट के लिए १.८% बफ़र्ड paraformaldehyde में कक्षों को ठीक करें ।
    1. पुनः द्वारा कोशिकाओं को धो 10 मिलीलीटर पंजाबियों में उंहें सस्पैंड और 5-10 मिनट के लिए 4ओ सी ४०० आरसीएफ पर केंद्रापसारक ।
    2. महाप्राण supernatants और दो बार धोने दोहराएं ।
      वैकल्पिक: ट्यूमर के बारे में अधिक परख के लिए, कोशिकाओं उंहें 1 माइक्रोन carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) युक्त पंजाब में ३७ सी पर 5 मिनट के लिए उंहें मशीन द्वारा लेबल किया जा सकता है । CFSE तो बर्फ में 10 मिनट के लिए पूरा मीडिया के साथ बुझती है । कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर 2% सीरम युक्त पंजाब में धोया जाना चाहिए अवशिष्ट डाई हटाने के लिए ।
  3. FACS बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित (पंजाबियों 2% FCS + 5 मिमी EDTA के साथ पूरक) और ०.५ μg/एमएल विरोधी CD16/32 के क्रम में संभावित गैर विशिष्ट प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत को ब्लॉक करने के लिए । थाली में एक U-आकार ९६ कुओं/प्लेट 1 x 105 कोशिकाओं प्रति १०० μL की एकाग्रता पर ।
    1. 5 μg-5 एनजी/1 x 105 कोशिकाओं से लेकर ट्यूमर बाध्यकारी एंटीबॉडी के विभिन्न कमजोर पड़ने जोड़ें । 15-20 मिनट के लिए बर्फ पर थाली मशीन ।
      नोट: आईजीजी एंटीबॉडी के सीरम से अलग थे भोले 20-24 सप्ताह पुरानी मादा चूहों पर प्रोटीन एक कॉलम, जैसा कि24बताया गया है ।
  4. पंजाब के १५० μL जोड़कर कोशिकाओं को धोने और 4 oC ४०० आरसीएफ पर प्लेट केंद्रापसारक 5-10 मिनट के लिए ।
    1. supernatants को त्यागें और धो दो बार दोहराएं । १०० μL FACS बफ़र युक्त fluorophore-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी में कक्ष पुन: निलंबित । 20 मिनट के लिए बर्फ पर थाली मशीन ।
    2. FACS बफर के २०० μL जोड़कर और 5-10 मिनट के लिए ४०० आरसीएफ में प्लेट केंद्रापसारक की कोशिकाओं को धोएं । supernatants को त्यागें और दोहराएं धोएं ।
    3. प्रवाह cytometry द्वारा ट्यूमर बाध्यकारी विश्लेषण और ंयूनतम कोट कोशिकाओं को आवश्यक एकाग्रता निर्धारित करते हैं ।
      नोट: एंटीबॉडी का मतलब है कि वृद्धि नहीं प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) से सना हुआ ट्यूमर कोशिकाओं के isotype नियंत्रण पर कम से पंचगुना बाद कार्यात्मक परख में इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए ।

4. ट्यूमर के साथ MoDC के सक्रियकरण-आईजीजी आईसी

  1. 3.4.3 के माध्यम से ३.१ वर्गों में वर्णित के रूप में, न्यूनतम आईजीजी एकाग्रता के साथ कोट ट्यूमर कोशिकाओं
    1. ट्यूमर आईसी के साथ MoDC सक्रिय करने से पहले एक दिन, MoDC संस्कृति मीडिया, जो जीएम-सीएसएफ शामिल बदलें । ऐसा करने के लिए, धीरे से मीडिया महाप्राण और पूर्व गर्म पूरा संस्कृति मीडिया के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
      नोट: पृथक परिपक्व ट्यूमर-संबद्ध MoDC कम से 2-3 ज (या यहां तक कि रातोंरात) के लिए कल्चरित किया जाना चाहिए जीएम सीएसएफ के बिना पूरा मीडिया में छंटाई के बाद, और उंहें आईसी के साथ सक्रिय करने से पहले ।
    2. ट्यूमर के बारे में अधिक विश्लेषण के लिए, 1:5 के अनुपात में CFSE-लेबल ट्यूमर आईसी MoDC (आईसी: MoDC) और 1 x 106 डीसी के प्रति पूरा मीडिया के 1 मिलीलीटर में 12-16 h के लिए रात भर गर्मी जोड़ें ।
    3. MoDC सक्रियकरण प्रयोगों के FACS विश्लेषण के लिए, 1:1 (आईसी: MoDC) अनुपात और 12-16 एच के लिए रातोंरात गर्मी में ट्यूमर-आईसी जोड़ें ।
      नोट: यह अत्यधिक एक सकारात्मक नियंत्रण को अच्छी तरह से शामिल करने की सिफारिश की है, जिसमें MoDC 1 μg/एमएल एलपीएस या अंय TLR एगोनिस्ट के साथ उत्तेजित कर रहे हैं ।
    4. रात भर सक्रियण के बाद, महाप्राण supernatants और धोने कोशिकाओं धीरे अलगाव बफर, या 10 मिमी EDTA HBSS के साथ तीन बार ।
    5. थाली से डीसी अलग करने के लिए, 10 मिमी EDTA युक्त 1 मिलीलीटर HBSS में 2-3 मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन, और जोरदार pipetting द्वारा अलग कोशिकाओं ।
    6. ४०० आरसीएफ में कोशिकाओं के केंद्रापसारक और फिर से निलंबित 1 एक्स 106 डीसी ९० μL पंजाब में 2% FCS, 5 मिमी EDTA (FACS बफर) और एंटीबॉडी अवरुद्ध के ०.५ μg के साथ पूरक । 5-10 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
    7. कोशिकाओं को धुंधला एंटीबॉडी मिश्रण के 10 μL जोड़ें और 15 मिनट के लिए बर्फ पर गर्मी ।
    8. कोशिकाओं को 2 मिलीलीटर FACS बफर जोड़ें और 5-10 मिनट के लिए 4ओ सी ४०० आरसीएफ पर केंद्रापसारक ।
  2. २०० μL FACS बफ़र में कक्ष पुन: निलंबित ।
    1. नमूने को चलाने से पहले DAPI 1-2 मिनट के ०.५-1 μg/एमएल जोड़ें, विश्लेषण से मृत कोशिकाओं को बाहर करने के लिए । अधिक नहीं-मशीन DAPI, के रूप में MoDC यह 10-15 मिनट के भीतर ले जाएगा ।

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Representative Results

हम शुरू में भोले syngeneic और allogeneic चूहों से एंटीबॉडी की क्षमता की तुलना करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं को बांध । इस अंत करने के लिए, B16F10 और LMP ट्यूमर कोशिका लाइनों paraformaldehyde में तय की और बड़े पैमाने पर धोया गया । B16F10 एक मेलेनोमा सेल लाइन है, जो मूलतः C57Bl/6 चूहों में फेफड़े मेटास्टेसिस से पृथक किया गया था । LMP एक अग्नाशय ट्यूमर कोशिका है कि KrasG12D से अलग किया गया था/+, LSL-Trp53R172H/+, और Pdx-1-Cre चूहों, और 129F1 चूहों में तेजी से बढ़ता है. आईसी प्राप्त करने के लिए, ट्यूमर कोशिकाओं 1 x 105 ट्यूमर कोशिकाओं के प्रति syngeneic या allogeneic आईजीजी के 2 μg के साथ बर्फ पर 20 मिनट के लिए मशीन थे । आईजीजी और आईजीएम एंटीबॉडी भोले 20-24 के संचलन से अलग थे-सप्ताह के प्रोटीन ए पर पुराने चूहों, आकार के बाद अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी के रूप में वर्णित24। कोशिकाओं को धोया और पीई-संयुग्मित चूहा विरोधी माउस आईजीजी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ दाग थे, और मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता एक प्रवाह cytometer में विश्लेषण किया गया था । के रूप में चित्रा 1aमें संकेत दिया, C57Bl/6 allogeneic चूहों से आईजीजी एंटीबॉडी LMP ट्यूमर कोशिकाओं पूर्व vivo 129S1 syngeneic चूहों से एंटीबॉडी से कहीं अधिक प्रभावी ढंग से. इसी प्रकार, 129S1 allogeneic आईजीजी के साथ फिक्स्ड B16F10 का दाग दस गुना से syngeneic आईजीजी के साथ दाग की तुलना में अधिक अधिक था, C57Bl/6 चूहों । दिलचस्प है, चूहों B16 ट्यूमर असर allogeneic चूहों के लिए समान बाध्यकारी क्षमता के साथ एंटीबॉडी का उत्पादन करने में विफल रहा है, यहां तक कि ट्यूमर प्रगति के दौरान (चित्र 1b) ।

हम अगले के लिए रक्त और ट्यूमर से MoDC की आईसी प्रतिक्रिया की तुलना की मांग की तिल्ली और बीएम से डीसी की है । ट्यूमर से जुड़े MoDC को अलग करने के लिए, B16F10 ट्यूमर एकल सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए enzymatically असंबद्ध थे । प्रतिरक्षा कोशिकाओं CD45-चुंबकीय मोतियों का उपयोग कर समृद्ध थे, और MoDC आगे SSClo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6Cलो द्वारा FACS (चित्रा 2a) के रूप में हल किया गया । यह अलग ट्यूमर डीसी उन्हें परिभाषित कि विभिन्न मार्करों हो सकता है कि उल्लेखनीय है । रक्त से MoDC को अलग करने के लिए, परिसंचारी monocytes CD11b-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों से समृद्ध थे और आगे SSClo/FSClo/CD115+/MHCIIनेग/ कोशिकाओं को तो जीएम-सीएसएफ में 1 दिन के लिए, और संस्कृति थे गैर अनुयाई और शिथिल अनुयाई कोशिकाओं को एक नई थाली में स्थानांतरित कर रहे थे और एक अतिरिक्त 4-5 दिनों के लिए MoDC (चित्रा 2 बी) प्राप्त करने के लिए प्रसंस्कृत । एक संदर्भ बिंदु के रूप में हम BMDC इस्तेमाल किया, "सोने के मानक" कई कार्यात्मक परख के लिए डीसी के रूप में सेवारत, साथ ही साथ प्लीहा MoDC, जो एक अधिक शारीरिक डीसी सबसेट को प्रतिबिंबित । BMDC की छंटाई द्वारा प्राप्त किए गए थे बीएम प्रो-monocytes (CD11b+/Ly6Chi/CD115hi/MHCIIनेग), उनके संवर्धन द्वारा जीएम-सीएसएफ के साथ 7 दिनों के लिए, के रूप में वर्णित के रूप में24. प्लीहा MoDC एकल कोशिका निलंबन से अलग किया गया था, एक सेल छलनी के माध्यम से तिल्ली मैश करके प्राप्त (collagenase के साथ पूर्व-मशीन प्लीहा MoDC के लिए आवश्यक नहीं है), CD11b-संयुग्मित चुंबकीय मोतियों के साथ संवर्धन के बाद. कक्षों को तब सुलझाया गया था जैसे SSClo/B220नेग/NKp46नेग/CD3नेग/Gr1नेग/F4/80नेग/MHCIIhi/CD11chi और cultureed in complete RPMI में 1 घंटे के लिए ३७oC से आधारभूत गतिविधि पुनर्स्थापित करें ।

MoDC गतिविधि पर आईजीजी आईसी के प्रभाव की जांच करने के लिए, हम स्थिर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ या निश्चित ट्यूमर कोशिकाओं पूर्व allogeneic आईजीजी के साथ लेपित के साथ रातोंरात सेट पृथक डीसी उपसमुच्चय । BMDC या प्लीहा डीसी के आईसी के साथ सक्रियकरण वृद्धि हुई CD86 और MHCII अभिव्यक्ति, के विपरीत MoDC, या ट्यूमर से जुड़े MoDC (चित्रा 3) के परिणामस्वरूप । allogeneic आईजीजी के साथ या बिना CFSE-दाग ट्यूमर व्युत्पंन प्रोटीन, की क्षमता भी तुलना की गई थी । के रूप में फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा मनाया, प्लीहा डीसी ट्यूमर व्युत्पंन प्रोटीन internalize करने के लिए बेहतर करने की क्षमता दिखाया (चित्र बी) ।

एक साथ लिया, इन परिणामों का सुझाव है कि ट्यूमर डीसी और MoDC प्लीहा डीसी और alloIgG-आईसी के साथ सक्रियण के लिए BMDC से अलग जवाब । इसलिए, टीकाकरण रणनीतियों कि ट्यूमर डीसी को सक्रिय करना चाहते है केवल BMDC के सक्रियकरण पैटर्न पर आधारित नहीं किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1: Allogeneic चूहों उनके संचलन में स्वाभाविक रूप से होने वाली ट्यूमर बाध्यकारी आईजीजी एंटीबॉडी है: मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) LMP ट्यूमर कोशिकाओं के syngeneic (129S1) और allogeneic (C57Bl) भोले चूहों के रक्त से अलग आईजीजी एंटीबॉडी के साथ दाग । B. मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (MFI) B16F10 ट्यूमर कोशिकाओं के syngeneic ट्यूमर असर चूहों (C57Bl/6), या allogeneic (129S1) भोले चूहों के संचलन से अलग आईजीजी एंटीबॉडी के साथ मशीन । यह आंकड़ा विस्तारित डेटा 2a और b कर्ंमी Y एट अलसे संशोधित किया गया है । प्रकृति ५२१ 7550:99-104, २०१५24.

Figure 2
चित्रा 2: रक्त और B16 ट्यूमर से माउस MoDC की छंटाई योजना. A. आइसोलेशन और सॉर्टिंग योजना MoDC cultureed from माउस monocytes. संस्कृति (x400) में 4 दिनों के बाद भड़काऊ और गश्त monocytes के फोकल माइक्रोस्कोपी उद्योग की छवि । B16 ट्यूमर से ट्यूमर से जुड़े MoDC की अलगाव और छंटाई योजना बी. प्रतिनिधि फोकल माइक्रोस्कोपी MoDC की छवि रातोंरात संस्कृति (x400) के बाद B16 ट्यूमर से पृथक । यह आंकड़ा supplement figure 1 कर्ंमी Y एट अल JCI इनसाइट 1:18: e89020, २०१६25से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: तिल्ली और बीएम से MoDC ट्यूमर और रक्त आईसी के साथ मशीन के बाद MoDC से सक्रियण के विभिंन पैटर्न प्रदर्शित । डीसी द्वारा MHCII और CD86 अभिव्यक्ति के A. प्रवाह cytometric विश्लेषण-ट्यूमर आईजीजी आईसी के साथ रात भर की मशीन । B. immunohistochemistry ट्यूमर के ऊपर (हरा) और MHCII अभिव्यक्ति (लाल) डीसी द्वारा CFSE-लेबल ट्यूमर आईसी के साथ रातोंरात मशीन । यह आंकड़ा 3 ए और 3DCarmi वाई एट अल से संशोधित किया गया है । एकेटी और SHP-1 ट्यूमर प्रतिरक्षण के लिए डीसी-आंतरिक चौकियों हैं । JCI इनसाइट 1:18: e89020, २०१६25. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

डीसी की बड़ी संख्या को देखते हुए टीका लगाने चूहों के लिए आवश्यक (लगभग 2-4 x 10 6 एक माउस प्रति डीसी), चूहों में टीकाकरण रणनीतियों के अधिकांश बीएम और उनके पूर्व vivo सक्रियण द्वारा पीछा तिल्ली से डीसी के अलगाव पर आधारित हैं । हालांकि, vivo मेंट्यूमर डीसी को सक्रिय करने के प्रयास, तिल्ली और बीएम डीसी को सक्रिय करने के लिए एक ही स्थिति का उपयोग, अक्सर प्रभावी प्रतिरक्षा उत्पादन में असफल रहा है । बाद के दो प्रकाशनों में, कर्ंमी एट अल। पाया है कि रक्त और ट्यूमर MoDC काफी तिल्ली और बीएम डीसी से अलग, यह देखते हुए कि वे स्वाभाविक रूप से tyrosine फॉस्फेट के उच्च आंतरिक स्तर सहन और आईसी24,25के साथ सक्रियण से पहले भड़काना की आवश्यकता है । इसके अलावा, इन परिणामों को आगे अतिरिक्त सावधानियों लेने के लिए एक सक्रियकरण राज्य है कि बेहतर उनके शारीरिक स्थिति को दर्शाता में डीसी बनाए रखने के लिए की जरूरत पर बल दिया । इसलिए, वर्तमान प्रोटोकॉल ट्यूमर और संचलन से MoDC के अलगाव की प्रक्रिया का एक विस्तृत विवरण प्रदान करने के लिए, और उनके समयपूर्व सक्रियण में परिणाम हो सकता है कि चरणों को हाइलाइट करने के लिए चाहता है ।

सबसे पहले, आदेश में रक्त और ट्यूमर से डीसी के पर्याप्त संख्या प्राप्त करने के लिए, वहां BMDC अलग करने के लिए प्रोटोकॉल की तुलना में चूहों की एक बहुत अधिक संख्या के लिए एक की जरूरत है । डीसी की उपज बढ़ाने के लिए हम 16 सप्ताह पुराने चूहों, जो बड़ा रक्त की मात्रा और समग्र कोशिका गिनती है का उपयोग करें । हम नियमित रूप से जीएम-सीएसएफ के इंजेक्शन के बिना रक्त की 1 मिलीलीटर के प्रति 5-8 x 104 MoDC, और 4-5 x 105 MoDC निम्नलिखित इंजेक्शन मिलता है । ट्यूमर डीसी के लिए, हम एक १०० मिमी3 ट्यूमर से लगभग 6-8 x 104 MoDC प्राप्त करते हैं, हालांकि संख्या व्यक्तिगत चूहों के बीच और ट्यूमर मॉडल के बीच भिन्न हो सकते हैं. एक कम डीसी उपज में ट्यूमर के आकार में वृद्धि परिणाम, के रूप में एक १,००० mm3 ट्यूमर के बारे में केवल ५,००० डीसी होगा । इसके बजाय, हम कई साइटों पर ट्यूमर कोशिकाओं के साथ चूहों इंजेक्षन (आमतौर पर 4-6), जिससे माउस प्रति 4 एक्स 105 MoDC को प्राप्त करने.

इसके अलावा, हम अनुशंसा करते है कि उनके प्रयोगात्मक उपयोग करने से पहले, एंटीबॉडी, सेल लाइनों, ट्यूबों और जनरल लैब रिएजेंटों लाल परख द्वारा endotoxins के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए, और एसी जीवाणु आगर पर मीडिया चढ़ाना द्वारा । ट्यूमर सेल लाइनों अक्सर माइकोप्लाज्मा से संक्रमित होते है और इसलिए डीसी के साथ उनकी मशीन से पहले पीसीआर द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए । क्रूड collagenase की तैयारी का प्रयोग करें, जैसे कि 1 और 4 प्रकार, collagenases से अलगाव के कारण endotoxins का एक प्राथमिक स्रोत है क्लोस्ट्रीडियम histolyticum। collagenase के मानक तैयारियों के रूप में ज्यादा के रूप में 10 यूरोपीय संघ/मिलीग्राम endotoxins, जो के बारे में 1-2 है endotoxin के प्रति मिलीलीटर पाचन मिश्रण के एनजी शामिल हो सकते हैं । Jahr एट अल. पाया है कि collagenase तैयारियों से युक्त 2.7-6.7 endotoxins के एनजी/एमएल के 1415-3967 एनजी/एमएल 1β के साथ PBMC के साथ संस्कृति का पालन करेंगे29। वास्तव में, डीसी के भड़काना नियमित रूप से एमएल मीडिया प्रति एलपीएस के 1 एनजी के साथ किया जाता है, अभी तक १०० picograms/एमएल के रूप में छोटे के रूप में उंहें30,31के लिए पर्याप्त है,३२। endotoxins का एक अंय संभावित स्रोत FBS है, जिसमें 25 यूरोपीय संघ/एमएल या अधिक endotoxins, या 10 से कम यूरोपीय संघ/एमएल शामिल हो सकते हैं । यह मानते हुए कि संस्कृति मीडिया 10% FBS होते हैं, endotoxin लोड तक पहुंच सकता है ०.५ एनजी/एमएल, जो प्रधानमंत्री डीसी के लिए पर्याप्त है ।

इसके अलावा, कई प्रोटोकॉल विरोधी CD16/32 एंटीबॉडी का उपयोग करने के लिए अपने एंटीबॉडी पैनल की विशिष्टता को बढ़ाने के एक साधन के रूप में एफसी रिसेप्टर्स ब्लॉक छंटाई से पहले । फिर भी, पार FcγRIII (CD16) के जोड़ने के Syk के फास्फारिलीकरण की ओर जाता है जैप-70 और पीएलसी-γ, intracellular Ca के रिलीज2 + ३३, और फास्फारिलीकरण के P38 और ERK1/2in दोनों मानव३४ और माउस monocytes३५। हमारे हाथ में, विरोधी CD16/32 के अलावा MoDC संस्कृतियों लगातार जोखिम के एक मिनट के भीतर डीसी में P38 और ERK1 के एक मजबूत फास्फारिलीकरण/ हम, इसलिए, दृढ़ता से विरोधी CD16/32 के उपयोग से परहेज जब इन विट्रो कार्यात्मक परख के लिए MoDC अलग सुझाव देते हैं ।

एक अंय आम प्रोटोकॉल CD11c चुंबकीय मोतियों से FACS द्वारा अपनी छंटाई से पहले डीसी के संवर्धन का उपयोग करता है । CD11c एक प्रकार मैं transmembrane ग्लाइकोप्रोटीन कि लाइगैंडों की एक किस्म है, फाइब्रिनोजेन, एलपीएस, प्रकार मैं कोलेजन, और निष्क्रिय C3b उपइकाई सहित पहचानता है । Rezzonico एट अल. दिखाया गया है कि एंटीबॉडी के साथ CD11c के बंधाव प्रबल NFκB सक्रियण और chemokines३६के स्राव लाती है । हमारे अनुभव में, मैटीरियल विरोधी CD11c एंटीबॉडी सेल सक्रियण और apoptosis प्रेरित है, जबकि FACS छंटाई में अपने घुलनशील रूप का उपयोग या तो P38 या ERK1 के फास्फारिलीकरण प्रेरित नहीं/

कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल को संभव के रूप में थोड़ा सक्रियण के साथ MoDC के अलगाव को प्राप्त करने के लिए डिज़ाइन किया गया है, ताकि उनके बाद सक्रियकरण इन विट्रो में vivo मेंउनके सक्रियण के लिए आवश्यक शर्तों को दर्शाता है ।

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Disclosures

सभी लेखकों ने घोषणा की कि उनके पास हितों का कोई टकराव नहीं है और उनका खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोई

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PREMIUM GE-Healthcare 17-5442-02
OptiPrep StemCell Technologies 07820
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-052-301
EasySep Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19861
Collagenase IV Sigma C9697-50MG Test each lot for endotoxin
DNase I Sigma DN25-10MG
HBSS ThermoFisher 14025092
FBS ThermoFisher 16140071 Test each lot for endotoxin
PE-CD11c Biolegend 117307
APC-CD11b Biolegend 101211
Brilliant Violet 650 MHCII Biolegend 107641
AF48- CD86 Biolegend 105017
APC/Cy7-Ly-C6 Biolegend 108423
PE/Cy7-CD15 Biolegend 135523

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