Isolation protokol af musen monocyt-afledte dendritiske celler og deres efterfølgende In Vitro aktivering med Tumor immunkomplekser

* These authors contributed equally
Cancer Research

Your institution must subscribe to JoVE's Cancer Research section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Monocyt-afledte DC (MoDC) kan føle mindre mængder af fare-associerede molekyler og er derfor let primet. Vi leverer en detaljeret protokol for dyrkning af MoDC fra blodet og tumorer og deres aktivering med immunkomplekser samtidig fremhæve vigtige forholdsregler, der bør overvejes for at undgå deres for tidlig aktivering.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Santana-Magal, N., Rasoulouniriana, D., Saperia, C., Gutwillig, A., Rider, P., Engleman, E. G., Carmi, Y. Isolation Protocol of Mouse Monocyte-derived Dendritic Cells and Their Subsequent In Vitro Activation with Tumor Immune Complexes. J. Vis. Exp. (135), e57188, doi:10.3791/57188 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Dendritiske celler (DC) er heterogene cellepopulationer, der adskiller sig i deres cellemembran markører, migrationsmønstre og distribution, og i deres antigen præsentation og T-celle aktivering kapacitet. Da de fleste vaccinationer af eksperimentelle tumor modeller kræver millioner af DC, er de meget isoleret fra knoglemarv eller milt. Disse DC varierer dog betydeligt fra blod og tumor DC i deres svar til immunkomplekser (IC), og formentlig til andre Syk-kombineret lektin receptorer. Vigtigere, givet følsomheden af DC til fare-associerede molekyler, tilstedeværelsen af endotoksiner eller antistoffer der bitmapgenkendelse aktivering receptorer i en af de isolere trin kunne resulterer i priming af DC og dermed påvirke parametrene, eller i det mindste dosering, krævede hen til aktivere dem. Derfor, her vi beskrive en detaljeret protokol til at isolere MoDC fra blodet og tumorer samtidig undgå deres for tidlig aktivering. Derudover tilbydes en protokol for MoDC aktivering med tumor IC, og deres efterfølgende analyser.

Introduction

Siden deres opdagelse, har dendritiske celler (DC) været fokus på omfattende forskning på grund af deres unikke evne til at vride T-celle differentiering1. Over de sidste mange årtier, har en omfattende forskningsindsats forsøgt at definere de forskellige DC delmængder og deres funktion under tumor progression og immunitet 2. DCs er sammensat af heterogene cellepopulationer, der adskiller sig fra hinanden i deres mønstergenkendelse receptorer, væv distribution, og vandrende og antigen præsentation kapaciteter3,4,5. Sammenlignet med andre DC delmængder, monocyt-afledte DC (MoDC) er langt mere rigelige i tumorer og nemt kan genereres fra cirkulerende eller tumor infiltrerer monocytter6,7. Derfor, mange kliniske forsøg søger at drage fordel af deres relative forekomst er baseret på i vivo og ex vivo manipulation af autologe MoDC for at fremkalde T-celle immunitet 8,9.

På samme måde, DC-baserede vaccination af eksperimentelle tumor modeller kræver 2-3 serie injektioner, 5-7 dages mellemrum, 1-2 x 106 aktiveret DC pulserende med tumor antigener. Derfor, for at opnå dette store antal DC, de fleste mus undersøgelser har primært brugt MoDC kulturperler fra knoglemarv (BM) prækursorer i GM-CSF for 7-9 dage (IL-4 ikke er påkrævet i indstillingen mus)10,11. Ikke desto mindre, givet at GM-CSF knockout mus er samlet normal DC rum 12,13, og givet de blandede befolkninger fremstillet af denne kultur,14 fysiologiske relevansen af disse DC har blevet draget i tvivl.

Alternativt kan DC være rutinemæssigt isoleret fra milt celler. Men DC omfatter kun omkring 0,3-0,8% af samlede milt celler (resulterer i ca 7 x 105 DC/milten), og af disse celler, kun CD103+ DC og MoDC kan vandre tilbage til lymfoid organer. Da MoDCs omfatter ca. 10-15% af milt DC populationer15,16, give de fleste isolation protokoller ca 1 x 105 MoDC pr. milt. Udvidelse af MoDC kan opnås ved at indsprøjte transfekteret B16 celler, der udskiller GM-CSF, hvilket resulterer i en 100-fold stigning i milt MoDC17. Men brug af MoDC til at udvikle DC vacciner er begrænset, da denne procedure ikke kan gøres i mennesker og de opnåede MoDC er allerede stærkt aktiveret.

Ud over at opnå tilstrækkelig antal DC, indebærer en anden udfordring for at udvikle effektive DC vacciner mod autolog kræftceller manglen på tilstrækkelige faresignaler i indstillingen tumor fuldt aktivere DC. Induktion af co-stimulatory signaler er normalt opnås gennem aktivering af mønstergenkendelse receptorer (PRR), eller c-type lektin signaling veje18,19,20,21. En yderligere tilgang for aktivering DC udnytter deres evne til at tage op antigener gennem interaktioner med overflade Fcγ receptorer (FcγR). En række vigtige håndskrifter har vist, at injektion af MoDC fra BM prækursorer aktiveret hos tumor-IgG IC kan forhindre tumorvækst i profylaktisk indstillinger, og kan føre til udryddelse af etablerede tumorer22,23 .

I to nylige papirer opdagede Carmi et al. , at i modsætning til BMDC og milt DC, MoDC fra blodet og tumorer ikke kan reagere på IgG IC uden yderligere stimuli. Dette blev anset for at være på grund af tilstedeværelsen af høje intracellulære niveauer af tyrosin fosfataser regulerer FcγR signalering24,25. Ved at definere et kritisk kontrolpunkt i DC, gav dette arbejde et vigtigt indblik i kravene til vellykket DC-baserede vaccination. Kravet om for ekstra stimuli for at aktiverer FcγR signalering, og formentlig signalering fra andre lektin receptorer udnytter en lignende fosforylering kaskade, understreger således behovet for at undgå priming af DC under deres isolation.

Derfor, denne protokol beskriver isolation af MoDC fra blodet og tumorer, som afviger markant fra BM og milt DC, og fremhæver forholdsregler værd at overveje i løbet af processen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollerne nedenfor henviser til isolering af mus MoDC, men de overordnede principper der kan gælde andre DC delmængder celler samt. 12 - 16-uge-forhenværende C57Bl/6j mus blev opretholdt i en American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care-akkrediteret animalske faciliteten. Alle protokollerne godkendtes ved Stanford University og Tel Aviv Universitet institutionelle Animal Care og brug udvalget.

1. isolering af Tumor forbundet monocyt-afledte DC

  1. I en laminar flow hætte, fjerne tumorer fra CO2 euthanized mus og placere tumorer i RPMI medium uden føtal bovint serum (FBS).
    Bemærk: Det anbefales stærkt at barbere mus og sprøjte dem med 70% ethanol før du fjerner tumorer, for at minimere mulige forureninger fra pels. Være sikker på, at svulsten ikke overstiger 25-40 mm2 da større tumorer har færre DC, som har tendens til at være skrøbelig og tilbøjelige til at gennemgå celledød. Hvis større antal DC er nødvendige, kan hver mus sprøjtes med tumorer celler på flere websteder.
  2. Under en steril laminar hætte, hugge tumorer ved hjælp af kirurgi saks i små stykker (ca 1 x 1 mm2).
    1. Tilføje alle tumor fragmenter fra en mus i en 30 mL sterilt flad bund tube med magnetiske rør, stænger, der indeholder 5 mL af Hanks afbalanceret saltopløsning (HBSS), 2 mg/mL collagenase IV og 0,01 mg/mL DNase jeg.
      Forsigtig: Myeloide celler producerer energi gennem glykosylering, selv under steady state. Derfor vil kun brug medier, der indeholder glucose (f.eks. HBSS, RPMI og DMEM), som glukose sult for så lidt som 10-15 min resultere i celledød og apoptose i 24 h. Brug kun lave endotoxin collagenase IV, som collagenase er produceret af Gram-positive bakterier (Clostridium histolyticum).
  3. Rør på omkring 200-400 rpm i en 37 oC kuvøse med en magnetomrører for 20-30 min.
  4. Der tilsættes 5 mL af komplette medier og genopslæmmes kraftigt.
  5. Filtrer celler gennem en 70 µm celle si. Der centrifugeres ved 4 oC 400 genbrugsfibre for 5-10 min at sammenpresse cellerne.
    Advarsel: Forsøg ikke at isolere cellerne direkte efter Enzymatisk nedbrydning, som nogle tumorer er nekrotiske og indeholder forholdsvis store mængder celle debris eller ekstracellulære matrix. Anvende celler på 15% tæthed gradient medium til at opnå kun celler.
  6. Suspendere 9 mL tæthed gradient medium med 1 mL 10 x PBS at justere osmolalitet og opnå 100% Percoll stamopløsning. Mix 1,5 mL tæthed gradient medium materiel løsning med 8,5 mL HBSS og bland det kraftigt med tumor-afledte celle pellet. Forsigtigt layer 2 mL af DMEM øverst på 15% tæthed gradient medium og centrifugeres ved 400 genbrugsfibre i 20 min. ved stuetemperatur. Kassér analysere, som cellerne vil danne en pellet i bunden af røret.
    1. Pelleted cellerne vaskes to gange af re suspendere dem i 10 mL HBSS, indeholdende 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin, og 10 mM EDTA (Isolation Buffer), og der centrifugeres på 4 oC 400 genbrugsfibre for 5-10 min for at sammenpresse cellerne.
    2. Tælle celler på en hemocytometer, der benytter trypan blå under et lysmikroskop.
  7. Genopslæmmes 1 x 108 celler i 1 mL isolation buffer og inkuberes dem ved 4 oC med 30 μL CD11b+ konjugeret magnetiske perler i 15 min.
    Forsigtig: Undgå brug af CD11c-konjugeret perler, da dette vil aktivere DC og fremkalde celledød. Forsøg ikke at blokere FcγRII og FcγRIII med anti-CD16/32 antistoffer. Blokering antistoffer ligate FcγR og fremkalde stærke fosforylering af kort kinaser og prime DC.
    1. Fjern de overskydende ubundne perler ved at tilføje 9 mL isolation buffer og centrifugeres celler på 400 genbrugsfibre for 5-10 min. ved 4oC.
  8. Opsug supernatanten og genopslæmmes celler i 1 mL isolation buffer. Anvendelse af celler på en forrenset magnetiske kolonne. Kolonnen udvaskes to gange med 3 mL af isolation buffer.
    1. Fjern kolonnen fra magneten. Der afpipetteres 6 mL af isolation buffer over på kolonnen og skylle de magnetisk mærket celler ind i en steril indsamling rør ved at skubbe stemplet. Centrifuge celler på 400 genbrugsfibre for 5-10 min. ved 4 oC.
    2. Genopslæmmes celler på 100 μl pr. 1 x 107 celler og plette med følgende fluorophore-konjugerede antistoffer: Linage negative (TCRb, Siglec F, B220, CD19, FceRI og Ly6G), MHCII, Ly - 6 C.
  9. Sortere cellerne efter gating de små celler, ved hjælp af side scatter (SSC) og videresende scatter (FSC) og kultur i komplet medium suppleret med 5 ng/mL GM-CSF. Inkuber celler i 1 time ved 3 7 oC for at tillade makrofager at fastholde pladen. Derefter, overføre den løst og ikke-tilhænger celler til en ny kultur fad.
    Bemærk: Mus MoDC er defineret som CD11b+/CD11c+/MHCIIHej/Ly6Clo/int 7,26,27. Udtryk for Ly6C kan variere drastisk mellem tumor modeller, og i nogle modeller (fx LMP) MoDCs helt mangler Ly6C udtryk. Alt i alt, en 100 mm3 B16F10 tumor indeholder typisk 5 x 104 i DC, hvilket resulterer i ca 4-5 x 106 samlede celler. Af disse celler, 10-15% er immunceller og 8-10% er MoDC. Stigende DC numre kan opnås ved at indsprøjte mus med tumorer på flere websteder. Sorter kun små SSC/FCS celler, som andre myeloide celler kan udtrykke markører som CD11c og Ly6C.
    Valgfrit: Sortere tumor infiltrerer monocyt som små SSC/FSC celler, der udtrykker Ly6CHej og er negative for MHCII. Bagefter, kultur monocytter i vitro med 50 ng/mL GM-CSF at opnå DC.

2. isolering af monocyt-afledte DC fra perifert blod

Bemærk: Da modne MoDCs er relativt sjældne i mus blod, protokollen nedenfor henviser til deres afledning i vitro for fra sorterede monocytter.

  1. For at øge niveauet af monocytter i blod, bedøver mus med 4% isofluran og sprøjt dem subkutant (s.c.) med 1 μg af GM-CSF i 50 μL PBS.
  2. Efter 1-2 h, ofre mus ved hjælp af CO2.
    Forsigtig: Ikke ofre mus af cervikal dislokation, da dette vil medføre indre blødninger.
  3. Umiddelbart efter euthanization, spray musen med 70% ethanol og fjerne den hud, der dækker hjertet ved hjælp af kirurgiske saks, under en steril laminar flow hætte. Ren saks med ethanol og skære den højre atrium i hjertet. Langsomt, skylle hjertet gennem højre hjertekammer med 20 mM EDTA HBSS ved hjælp af en 10-mL sprøjte og 25-G kanyle.
    1. Indsamle blod med en steril sprøjte fra den pleural hulrum i en steril rør indeholdende heparan sulfat og EDTA. Fortsætte med at skylle hjertet indtil leveren og lungerne bliver pink eller hvid.
  4. Anvende blod på en tæthed gradient mediumand centrifuge på 400 genbrugsfibre ved stuetemperatur i 15 min. med lav bremse.
    Forsigtig: Brug endotoxin-fri tæthed gradient medium (normalt mindre end 0,12 EU per mL).
    1. Indsamle mononukleære celler ind i en ny tube. Cellerne vaskes af igen suspension i 10 mL HBSS, indeholdende 2% FBS, 1% penicillin/streptomycin og 10 mM EDTA (isolation buffer) og derefter centrifugering på 4 oC 400 genbrugsfibre for 5-10 min at sammenpresse cellerne.
      Forsigtig: Brug kun medier, der indeholder mindst 1 g/L af glukose.
  5. For CD11b positiv udvælgelse, genopslæmmes 1 x 108 celler i 1 mL isolation buffer og Inkuber dem i 15 min med 50 μL af CD11b-konjugeret magnetiske perler på 4 oC.
    1. Vaske overskydende perler ved at tilføje 9 mL af isolation buffer og centrifugering på 400 genbrugsfibre for 5-10 min. ved 4 oC. aspirat at analysere og genopslæmmes celler i 1 mL isolation buffer. Anvende cellerne på en forrenset magnetiske kolonne ifølge producentens anvisninger.
    2. Fjern kolonnen fra magneten, afpipetteres 6 mL af isolation buffer over på kolonnen og skylle de magnetisk mærket celler ind i en steril indsamling rør ved at skubbe stemplet. Der centrifugeres celler på 400 genbrugsfibre for 5-10 min. ved 4 oC. Wash kolonnen to gange med 3 mL af isolation buffer.
    3. Genopslæmmes celler på 1 x 107 celler/100 μL isolation buffer og pletten med følgende fluorophore-konjugerede antistoffer: 0,1 μg CD115, 0,25 μg MHCII og 0,1 μg Ly-6 C/1 x 106 celler.
  6. Sortere cellerne efter gating på små side scatter (SSC) og small forward scatter (FSC) celler.
    NOTE: Mus inflammatoriske monocytter defineres generelt som CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6CHej, og patruljerer monocytter defineres som CD115+/MHCIIlo/neg/Ly6Cneg 4,5. I tilfælde hvor ingen adskillelse mellem de to delmængder er nødvendigt, i alt SSClo/FCSlo/CD115+/MHCIIlo celler kan sorteres. Både naive og tumor-bærende mus indeholde ca 5-8 x 104 MoDC per 1 mL af blodet og op til 4-5 x 105 MoDC følgende injektion af GM-CSF. Af dem, ca. 70% er inflammatoriske monocytter og 30% patruljerer monocytter.
  7. Plade celler i en koncentration på 1 x 106 celler/mL i en komplet media suppleret med 20 ng/mL GM-CSF. Efter 1 dag, overføre ikke-tilhænger og løst vedhængende cellerne til en ny plade og kultur for yderligere 4-5 dage.
    Forsigtig: DC medier bør ikke suppleres med pyruvat.

3. forberedelse af Tumor-IgG immunkomplekser

  1. Kultur tumorceller i 75 cm2 kultur kolbe til 70% sammenløbet i komplet DMEM medier.
    1. Der tilsættes 2 mL 0,25% trypsin/EDTA Adskil celler fra kultur kolbe og overvåge celle morfologi under et lysmikroskop at undgå overdreven trypsinization.
    2. Tilføje 8 mL af komplette medier (pr. 2 mL trypsin) for at hæmme trypsin fordøjelse, og der centrifugeres ved 4 oC, 400 genbrugsfibre for 5-10 min at sammenpresse cellerne.
      Bemærk: Sørg for at tjekke tumorceller for Mycoplasma ved hjælp af en kommerciel PCR kit. Test for forekomst af Gram-negative bakterier og svampe endotoksiner bruger Limulus Amebocyte Lysate (LAL) assay28). Serum skal filtreres gennem 0,22 μM og testet for 9 Code of Federal Regulations virus. Desuden teste dyrkningsmedier og sera ved at droppe 100-200 μl på LB-agar eller bouillon og kultur i 2 dage ved 37 oC.
    3. Vaske cellerne igen fra trypsin og serum resterne af re suspendere dem i 10 mL PBS og centrifuger på 400 genbrugsfibre i 5-10 min. aspirat supernatanten og Gentag vask 2 gange.
  2. Fix celler i 1,8% buffered PARAFORMALDEHYD i 10 min ved stuetemperatur.
    1. Cellerne vaskes af igen suspendere dem i 10 mL PBS og centrifugeres ved 4 oC 400 genbrugsfibre i 5-10 min.
    2. Aspirat analysere og Gentag vaskes to gange mere.
      Valgfrit: For tumor optagelse assays, celler kan mærkes ved at inkubere dem i 5 min på 37 oC i PBS, som indeholder 1 μM carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE). CFSE er derefter slukkes med komplet media for 10 min i isen. Cellerne vaskes grundigt i PBS indeholdende 2% serum til at fjerne resterende farvestof.
  3. Genopslæmmes celler i FACS buffer (PBS suppleret med 2% FCS + 5 mM EDTA) og 0,5 μg/mL af anti-CD16/32 for at blokere potentielle ikke-specifik protein-protein interaktioner. Plade i en U-form 96 brønde/plade i en koncentration på 1 x 105 celler pr. 100 μL.
    1. Tilføje forskellige fortyndinger af tumor-bindende antistoffer spænder fra 5 μg - 5 ng/1 x 105 celler. Inkuber plade på isen til 15-20 min.
      Bemærk: IgG antistoffer var isoleret fra serum fra dyr af naive 20-24 uger gamle hunmus på protein A kolonner, som beskrevet24.
  4. Vaske cellerne ved at tilføje 150 μl af PBS og centrifugering plade på 4 oC 400 genbrugsfibre for 5-10 min.
    1. Kassér analysere og Gentag vask to gange. Genopslæmmes celler i 100 μL FACS buffer indeholdende fluorophore-konjugeret sekundær antistof. Inkuber plade på isen i 20 min.
    2. Vaske cellerne ved at tilføje 200 μl af FACS buffer og centrifugering pladen på 400 genbrugsfibre for 5-10 min. kassere analysere og Gentag vask.
    3. Analysere tumor bindende ved flowcytometri og bestemme den minimale koncentration, der kræves til pels cellerne.
      Bemærk: Antistoffer, der ikke øger betyde fluorescens intensitet (MFI) af bejdset tumorceller ved mindst femdoblet isotype kontrol bør ikke anvendes i efterfølgende funktionelle assays.

4. aktivering af MoDC med Tumor-IgG IC

  1. Coat tumorceller med minimal IgG koncentration, som beskrevet i afsnit 3.1 gennem 3.4.3
    1. En dag før aktivering MoDC med tumor IC, erstatte MoDC Kulturmedier, som indeholder GM-CSF. Det gør du forsigtigt Aspirér medierne og vaske cellerne en gang med pre varmede komplet dyrkningsmedier.
      Bemærk: Isolerede modne tumor-associerede MoDC bør være kulturperler i mindst 2-3 h (eller endda natten over) efter sortering i komplet medier uden GM-CSF, og før du aktiverer dem med IC.
    2. Tumor optagelse analyser, tilføje CFSE-mærket tumor IC til MoDC på et forhold på 1:5 (IC:MoDC) og der inkuberes natten over for 12-16 h i 1 mL af komplette medier pr. 1 x 106 DC.
    3. FACS analyser af MoDC aktivering eksperimenter, tilføje tumor-IC på 1:1 (IC:MoDC) forholdet og der inkuberes natten over for 12-16 h.
      Bemærk: Det anbefales stærkt at medtage en positiv kontrol, i hvilken MoDC er stimuleret med 1 μg/mL af LP'ER eller andre TLR agonister.
    4. Efter overnatning aktivering, Opsug analysere og vask celler forsigtigt tre gange med isolation buffer, eller 10 mM EDTA HBSS.
    5. For at frigøre DC fra pladen, inkuberes celler i 2-3 min. i 1 mL HBSS indeholdende 10 mM EDTA og frigør celler ved kraftig pipettering.
    6. Centrifugeres celler på 400 genbrugsfibre og genopslæmmes 1 x 106 DC i 90 μL PBS suppleret med 2% FCS, 5 mM EDTA (FACS buffer) og 0,5 μg blokere antistoffer. Der inkuberes i isbad i 5-10 min.
    7. Der tilsættes 10 μL farvning antistoffer blanding til cellerne og inkuberes i isbad i 15 min.
    8. Tilføje 2 mL FACS buffer til celler og centrifugeres ved 4 oC 400 genbrugsfibre i 5-10 min.
  2. Genopslæmmes celler i 200 μl FACS buffer.
    1. Tilføje 0,5 - 1 μg/mL DAPI 1-2 min før du kører prøver for at udelukke døde celler fra analyser. Ikke over Inkuber DAPI, som MoDC vil tage det i 10-15 min.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi sammenlignede oprindeligt antistoffer fra naiv syngeneic og allogen mus evne til at binde til tumorceller. Med henblik herpå, blev B16F10 og LMP tumor cellelinjer fast i PARAFORMALDEHYD og vasket grundigt. B16F10 er et melanom cellelinie, som blev oprindeligt isoleret fra lungemetastaser i C57Bl/6 mus. LMP er en pancreas tumor celle, der blev isoleret fra KrasG12D / + LSL-Trp53R172H / + og Pdx-1-Cre mus, og vokser støt i 129F1 mus. For at opnå IC, blev tumorceller udruget i 20 min. på isen med 2 μg af syngeneic eller allogene IgG pr. 1 x 105 tumorceller. IgG og IgM antistoffer var isoleret fra omsætning af naive 20-24 uge gamle mus på protein A, efterfulgt af størrelse-udelukkelse kromatografi som beskrevet24. Celler blev derefter vaskes og farves med PE-konjugeret rotte anti-mus IgG sekundær antistof, og den gennemsnitlige fluorescerende intensitet blev analyseret i et flow Flowcytometret. Som anført i figur 1A, bundet IgG antistoffer fra C57Bl/6 allogene mus LMP tumor celler ex vivo langt mere effektivt end antistoffer fra 129S1 syngeneic mus. Ligeledes var farvning af fast B16F10 med 129S1 allogene IgG mere end tidoblet højere, i forhold til farvning med syngeneic IgG fra naiv C57Bl/6 mus. Interessant, undladt mus forsynet med B16 tumorer at producere antistoffer med lignende bindende kapacitet til at af allogene mus, selv under tumor progression (figur 1B).

Dernæst søgte vi at sammenligne IC svar af MoDC fra blodet og tumorer som DC fra milt og BM. For at isolere tumor-associerede MoDC, var B16F10 tumorer enzymatisk adskilles for at få enkelt celle suspensioner. Immunceller blev beriget med CD45-magnetiske perler, og MoDC blev yderligere sorteret i VSKlo/FSClo/CD11c+/MHCII+/Ly6Clo af FACS (figur 2A). Det er bemærkelsesværdigt, at forskellige tumor DC kan have forskellige markører, der definerer dem. For at isolere MoDC fra blodet, cirkulerende monocytter blev beriget med CD11b-konjugeret magnetiske perler og yderligere sorteret som VSKlo/FSClo/ CD115+/MHCIIneg/lo. Celler blev derefter kulturperler i 1 dag i GM-CSF, og de ikke-tilhænger og løst vedhængende celler blev overført til en ny plade og kulturperler for yderligere 4-5 dage til at få MoDC (figur 2B). Som et referencepunkt, vi brugte BMDC, der tjener som den "gyldne standard" DC for mange funktionelle assays, samt milt MoDC, som afspejler en mere fysiologisk DC undersæt. BMDC blev opnået ved at sortere BM pro-monocytter (CD11b+/Ly6CHej/CD115Hej/MHCIIneg), efterfulgt af deres dyrkning i 7 dage med GM-CSF, som beskrevet24. Milt MoDC blev isoleret fra enkelt cellesuspension, fremstillet ved mase milten gennem en celle si (præ-inkubation med collagenase er ikke påkrævet for milt MoDC), efterfulgt af berigelse med CD11b-konjugeret magnetiske perler. Celler blev derefter sorteret som VSKlo/B220neg/NKp46neg/CD3neg/Gr1neg/F4/80neg/MHCIIHej/CD11cHej og kulturperler i 1 time i komplet RPMI på 37oC til gendanne oprindelige aktivitet.

For at undersøge effekten af IgG IC på MoDC aktivitet, rugede vi de isolerede DC delmængder natten med faste tumorceller eller med fast tumorceller overfladebelagt med allogen IgG. Aktivering af BMDC eller milt DC med IC resulteret i øget CD86 og MHCII udtryk, i modsætning til MoDC, eller tumor-associerede MoDC (figur 3A). Evnen til at optagelse CFSE-farvede tumor-afledte proteiner, med eller uden allogene IgG, blev også sammenlignet. Som bemærket af Konfokal mikroskopi, viste milt DC overlegne evne til at internalisere de tumor-afledte proteiner (figur 3B).

Taget sammen, tyder disse resultater på, at tumor DC og MoDC reagere anderledes end milt DC og BMDC til aktivering med alloIgG-IC. Derfor vaccinationsstrategier som ønsker at aktivere tumor DC ikke kan baseres udelukkende på aktivisering mønstrene af BMDC.

Figure 1
Figur 1: allogene mus har naturligt forekommende tumor-bindende IgG antistoffer i deres omløb: A. betyde fluorescens intensitet (MFI) af LMP tumorceller farves med IgG antistoffer isoleret fra syngeneic (129S1) og allogene (C57Bl/6) naive mus blod. B. mener fluorescens intensitet (MFI) af B16F10 tumorceller inkuberes med IgG antistoffer isoleret fra omsætning af syngeneic tumor-bærende mus (C57Bl/6), eller allogene (129S1) naive mus. Dette tal er blevet ændret fra udvidede data 2A og 2B Carmi Y mfl. Natur 521 7550:99-104, 201524.

Figure 2
Figur 2: sortering ordning af mus MoDC fra blodet og B16 tumorer. A. Isolation og sortering ordningen af MoDC kulturperler fra mus monocytter. Konfokal mikroskopi DIC billede af inflammatoriske og afpatruljeringen monocytter efter 4 dage i kultur (x400). B. Isolation og sortering ordning af tumor-associerede MoDC fra B16 tumorer. Repræsentative konfokalmikroskopi DIC billede af MoDC isoleret fra B16 tumorer efter natten kultur (x400). Dette tal er blevet ændret fra tillægs figur 1 Carmi Y et al. JCI indsigt 1:18:e89020, 201625. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: MoDC fra milten og BM vise forskellige mønstre af aktivering end tumor og blod MoDC efter inkubation med IC. A. Flow cytometric analyse af MHCII og CD86 udtryk af DC inkuberes natten over med tumor-IgG IC. B. Konfokal Immunhistokemi tumor optagelse (grøn) og MHCII udtryk (rød) af DC inkuberes natten over med CFSE-mærket tumor IC. Dette tal er blevet ændret fra tal 3A og 3DCarmi Y et al. Akt og SHP-1 er DC-iboende checkpoints for tumor immunitet. JCI indsigt 1:18:e89020, 201625. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Betragtning af det store antal DC kræves for vaccinering mus (ca 2-4 x 106 DC pr. en mus), de fleste af vaccination strategier i mus er baseret på dyrkning af DC fra BM og milt efterfulgt af deres ex vivo -aktivering. Men forsøg at aktivere tumor DC i vivo, ved hjælp af de samme betingelser for aktivering af milt og BM DC, ofte har været mislykket i at fremstille effektive immunitet. I de to efterfølgende publikationer, Carmi mfl. har fundet, at blod og tumor MoDC afviger betydeligt fra milt og BM DC, eftersom at de bærer naturligvis høj iboende niveauer af tyrosin phosphatase og kræver priming før aktivering med IC24,25. Desuden, disse resultater yderligere stress behovet for at tage ekstra forholdsregler for at bevare DC aktivisering status som bedre afspejler deres fysiologiske status. Derfor søger denne protokol til at give en detaljeret beskrivelse af isolation processen med MoDC fra tumorer og omsætning, og for at fremhæve de skridt, der kan resultere i deres for tidlig aktivering.

Først, for at opnå tilstrækkelig antal DC fra blod og tumorer, der er behov for et langt større antal af mus sammenlignet med protokoller til isolering af BMDC. For at øge udbyttet af DC vi bruge 16 uger gamle mus, som har større blod diskenheder og overordnede celle tæller. Vi rutinemæssigt får 5-8 x 104 MoDC per 1 mL blod uden injektion af GM-CSF, og 4-5 x 105 MoDC følgende injektion. For tumor DC, vi får ca 6-8 x 104 MoDC fra en 100 mm3 tumor, selv om antallet kan variere mellem individuelle mus og tumor modeller. Stigende tumor størrelse resulterer i et lavere DC udbytte, som et 1.000 mm3 tumor vil have kun omkring 5.000 DC. I stedet, vi injicere mus med tumorceller på flere websteder (typisk 4-6), derved at opnå op til 4 x 105 MoDC pr. mus.

Derudover anbefales det, at før deres eksperimentelle brug, antistoffer, cellelinjer, rør og generelle lab reagenser skal testes for endotoksiner ved LAL assay og ved plettering medier på AC bakteriel agar. Tumor cellelinier er ofte inficeret med Mycoplasma og bør derfor prøves ved PCR før deres inkubering med DC. Brugen af rå collagenase præparater, såsom typer 1 og 4, er den primære kilde til endotoksiner på grund af isolation af collagenases fra Clostridium histolyticum. Standard præparater af collagenase kan indeholde så meget som 10 EU/mg af endotoksiner, hvilket er omkring 1-2 ng af endotoxin pr. mL af fordøjelsen blanding. Jahr et al. har fundet at collagenase præparater indeholdende 2,7-6.7 ng/mL af endotoksiner vil fremkalde 1,415-3,967 ng/mL af IL-1β efter kultur med PBMC29. Faktisk, priming af DC sker rutinemæssigt med 1 ng af LP'ER pr. mL medier, men så lidt som 100 picogram/mL er tilstrækkelig til at prime dem30,31,32. En anden potentiel kilde til endotoksiner er FBS, som kan indeholde 25 EU/mL eller mere af endotoksiner, eller mindre end 10 EU/mL. Under forudsætning af at dyrkningsmedier indeholder 10% kunne FBS, endotoxin belastning nå 0,5 ng/mL, hvilket er tilstrækkeligt til at prime DC.

Derudover bruge mange protokoller anti-CD16/32 antistoffer til at blokere Fc receptorer som et middel til at øge deres antistof panel før sortering specificitet. Ikke desto mindre fører cross-linking af FcγRIII (CD16) til fosforylering af Syk/ZAP-70 og PLC-γ, frigivelse af intracellulære Ca2 + 33og fosforylering af P38 og ERK1/2 i både menneskelige34 og mus monocytter35. I vores hænder inducerer tilsætning af anti-CD16/32 til MoDC kulturer konsekvent en stærk fosforylering af P38 og ERK1/2 kinaser i DC inden for et minut af eksponering. Derfor anbefaler vi, kraftigt, at undgå brugen af anti-CD16/32 når isolere MoDC for in vitro- funktionelle assays.

En anden fælles protokol bruger berigelse af DC af CD11c magnetiske perler før deres sortering efter FACS. CD11c er en type jeg transmembrane glycoprotein, der genkender en lang række ligander, herunder fibrinogen, LP'ER, type I-kollagen og inaktiveret C3b subunit. Rezzonico et al. har vist at ligatur af CD11c med antistoffer inducerer potent NFκB aktivering og sekretion af kemokiner36. Vores erfaring fremkalde immobiliserede anti-CD11c antistoffer celle aktivering og apoptose, mens brugen af deres opløselig form i FACS sortering ikke fremkalde fosforylering af enten P38 eller ERK1/2.

Samlet set er denne protokol designet til at opnå isolation af MoDC med så lidt aktivering som muligt, således at deres efterfølgende aktivering in vitro afspejler de nødvendige betingelser for deres aktivering i vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfatterne erklærer de har nogen interessekonflikt, og at de ikke har noget at oplyse.

Acknowledgments

Ingen

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque PREMIUM GE-Healthcare 17-5442-02
OptiPrep StemCell Technologies 07820
CD45 MicroBeads Miltenyi 130-052-301
EasySep Monocyte Isolation Kit StemCell Technologies 19861
Collagenase IV Sigma C9697-50MG Test each lot for endotoxin
DNase I Sigma DN25-10MG
HBSS ThermoFisher 14025092
FBS ThermoFisher 16140071 Test each lot for endotoxin
PE-CD11c Biolegend 117307
APC-CD11b Biolegend 101211
Brilliant Violet 650 MHCII Biolegend 107641
AF48- CD86 Biolegend 105017
APC/Cy7-Ly-C6 Biolegend 108423
PE/Cy7-CD15 Biolegend 135523

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Steinman, R. M., Banchereau, J. Taking dendritic cells into medicine. Nature. 449, (7161), 419-426 (2007).
  2. Palucka, K., Banchereau, J. Dendritic-cell-based therapeutic cancer vaccines. Immunity. 39, (1), 38-48 (2013).
  3. Mildner, A., Jung, S. Development and function of dendritic cell subsets. Immunity. 40, (5), 642-656 (2014).
  4. Merad, M., Sathe, P., Helft, J., Miller, J., Mortha, A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annual review of immunology. 31, 563-604 (2013).
  5. Guilliams, M., et al. Dendritic cells, monocytes and macrophages: a unified nomenclature based on ontogeny. Nature reviews. Immunology. 14, (8), 571-578 (2014).
  6. Spitzer, M. H., et al. Systemic Immunity Is Required for Effective Cancer Immunotherapy. Cell. 168, (3), 487-502 (2017).
  7. Guilliams, M., et al. Unsupervised High-Dimensional Analysis Aligns Dendritic Cells across Tissues and Species. Immunity. 45, (3), 669-684 (2016).
  8. Anguille, S., Smits, E. L., Lion, E., van Tendeloo, V. F., Berneman, Z. N. Clinical use of dendritic cells for cancer therapy. Lancet Oncol. 15, (7), e257-e267 (2014).
  9. Wimmers, F., Schreibelt, G., Skold, A. E., Figdor, C. G., De Vries, I. J. Paradigm Shift in Dendritic Cell-Based Immunotherapy: From in vitro Generated Monocyte-Derived DCs to Naturally Circulating DC Subsets. Front Immunol. 5, 165 (2014).
  10. Banchereau, J., Palucka, A. K. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nature reviews. Immunology. 5, (4), 296-306 (2005).
  11. Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. Chapter 3 Unit 3 7 (2001).
  12. Greter, M., et al. GM-CSF controls nonlymphoid tissue dendritic cell homeostasis but is dispensable for the differentiation of inflammatory dendritic cells. Immunity. 36, (6), 1031-1046 (2012).
  13. Vremec, D., et al. The influence of granulocyte/macrophage colony-stimulating factor on dendritic cell levels in mouse lymphoid organs. Eur J Immunol. 27, (1), 40-44 (1997).
  14. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, (6), 1197-1211 (2015).
  15. Dong, M. B., Rahman, M. J., Tarbell, K. V. Flow cytometric gating for spleen monocyte and DC subsets: differences in autoimmune NOD mice and with acute inflammation. J Immunol Methods. 432, 4-12 (2016).
  16. Drutman, S. B., Kendall, J. C., Trombetta, E. S. Inflammatory spleen monocytes can upregulate CD11c expression without converting into dendritic cells. J Immunol. 188, (8), 3603-3610 (2012).
  17. Hanada, K., Tsunoda, R., Hamada, H. GM-CSF-induced in vivo expansion of splenic dendritic cells and their strong costimulation activity. J Leukoc Biol. 60, (2), 181-190 (1996).
  18. Gilboa, E. DC-based cancer vaccines. J Clin Invest. 117, (5), 1195-1203 (2007).
  19. Melief, C. J., van der Burg, S. H. Immunotherapy of established (pre)malignant disease by synthetic long peptide vaccines. Nat Rev Cancer. 8, (5), 351-360 (2008).
  20. Palucka, K., Banchereau, J. Cancer immunotherapy via dendritic cells. Nat Rev Cancer. 12, (4), 265-277 (2012).
  21. Bol, K. F., Schreibelt, G., Gerritsen, W. R., de Vries, I. J., Figdor, C. G. Dendritic Cell-Based Immunotherapy: State of the Art and Beyond. Clin Cancer Res. 22, (8), 1897-1906 (2016).
  22. Rafiq, K., Bergtold, A., Clynes, R. Immune complex-mediated antigen presentation induces tumor immunity. J Clin Invest. 110, (1), 71-79 (2002).
  23. Schuurhuis, D. H., et al. Immune complex-loaded dendritic cells are superior to soluble immune complexes as antitumor vaccine. J Immunol. 176, (8), 4573-4580 (2006).
  24. Carmi, Y., et al. Allogeneic IgG combined with dendritic cell stimuli induce antitumour T-cell immunity. Nature. 521, (7550), 99-104 (2015).
  25. Carmi, Y., et al. Akt and SHP-1 are DC-intrinsic checkpoints for tumor immunity. JCI Insight. 1, (18), e89020 (2016).
  26. Kenkel, J. A., et al. An Immunosuppressive Dendritic Cell Subset Accumulates at Secondary Sites and Promotes Metastasis in Pancreatic Cancer. Cancer Res. 77, (15), 4158-4170 (2017).
  27. Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, (4), 924-938 (2016).
  28. Roslansky, P. F., Novitsky, T. J. Sensitivity of Limulus amebocyte lysate (LAL) to LAL-reactive glucans. J Clin Microbiol. 29, (11), 2477-2483 (1991).
  29. Jahr, H., Pfeiffer, G., Hering, B. J., Federlin, K., Bretzel, R. G. Endotoxin-mediated activation of cytokine production in human PBMCs by collagenase and Ficoll. J Mol Med (Berl). 77, (1), 118-120 (1999).
  30. Zhang, X., Morrison, D. C. Lipopolysaccharide-induced selective priming effects on tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production in mouse peritoneal macrophages. J Exp Med. 177, (2), 511-516 (1993).
  31. Hirohashi, N., Morrison, D. C. Low-dose lipopolysaccharide (LPS) pretreatment of mouse macrophages modulates LPS-dependent interleukin-6 production in vitro. Infect Immun. 64, (3), 1011-1015 (1996).
  32. Deng, H., Maitra, U., Morris, M., Li, L. Molecular mechanism responsible for the priming of macrophage activation. J Biol Chem. 288, (6), 3897-3906 (2013).
  33. Cella, M., et al. A novel inhibitory receptor (ILT3) expressed on monocytes, macrophages, and dendritic cells involved in antigen processing. J Exp Med. 185, (10), 1743-1751 (1997).
  34. Kramer, P. R., Winger, V., Reuben, J. PI3K limits TNF-alpha production in CD16-activated monocytes. Eur J Immunol. 39, (2), 561-570 (2009).
  35. Rose, D. M., et al. Fc gamma receptor cross-linking activates p42, p38, and JNK/SAPK mitogen-activated protein kinases in murine macrophages: role for p42MAPK in Fc gamma receptor-stimulated TNF-alpha synthesis. J Immunol. 158, (7), 3433-3438 (1997).
  36. Rezzonico, R., Imbert, V., Chicheportiche, R., Dayer, J. M. Ligation of CD11b and CD11c beta(2) integrins by antibodies or soluble CD23 induces macrophage inflammatory protein 1alpha (MIP-1alpha) and MIP-1beta production in primary human monocytes through a pathway dependent on nuclear factor-kappaB. Blood. 97, (10), 2932-2940 (2001).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics