التصور للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالتصوير المقطعي الفولت العالي Cryo-إلكترون

Biology
 

Summary

ويصف هذا البروتوكول كيفية تصور الضغط الحمض النووي عابر في البكتيريا الزرقاء. زراعة متزامنة، رصد المجهري الأسفار، والتجميد السريع، وعالية تستخدم التصوير المقطعي الإلكترون البرد الجهد. ويرد بروتوكول لهذه المنهجيات، وتناقش التطورات والتطبيقات المستقبلية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Murata, K., Kaneko, Y. Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography. J. Vis. Exp. (137), e57197, doi:10.3791/57197 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

ويصف هذا البروتوكول كيفية تصور الضغط الحمض النووي عابر في البكتيريا الزرقاء. انضغاط الحمض النووي حدث هيولى مثيرة مؤخرا أنها تحدث في بعض البكتيريا الزرقاء قبل انقسام الخلية. ومع ذلك، نظراً لحجم الخلية الكبيرة والطابع عابر، من الصعب التحقيق في هيكل بالتفصيل. للتغلب على الصعوبات، أولاً، انضغاط الحمض النووي هو تكاثر في سيانوباكتيريوم الونجاتوس سينيتشوكوككوس PCC 7942 التي تنتجها الثقافة متزامن باستخدام 12 ح كل دورة الضوء/الظلام. الثاني، ضغط الحمض النووي تخضع للفحص المجهري الأسفار واستولت عليها التجميد السريع. ثالثا، ضغط مفصلة بنية الحمض النووي الخلايا هو متصور في الأبعاد الثلاثة (3D) بالتصوير المقطعي الإلكترون البرد الجهد العالي. هذه المجموعة من الأساليب التطبيق على نطاق واسع التحقيق فيها الهياكل عابر في البكتيريا، مثل انقسام الخلية، العزل الصبغي، والعدوى بالعاثية إلخ.، التي تخضع للفحص المجهري الأسفار وتصور مباشرة من التصوير المقطعي بالبرد-إلكترون عند نقطة في الوقت المناسب.

Introduction

انضغاط الحمض النووي هو حدث هيولى مثيرة التي تم تحديدها في بعض البكتيريا. وتشير1عندما الونجاتوس سينيتشوكوككوس وكان مثقف تحت 12 ح كل دورة الضوء/الظلام، الحمض النووي يبدو مكثف في نهاية فترة الضوء، الذي كان واضحا مختلفاً عن مظهره وقت آخر. قيل أن هذه العملية يسيطر على مدار ساعة الإيقاعية استناداً إلى البروتينات كاي2. أفادت سيكي et al. أن الحمض النووي ملطخة هويشت 33342 ضغط في الخلايا الونجاتوس س. نهاية فترة الخفيفة وأظهرت شكل قضيب مائج تحت مجهر الأسفار. ثم فصل الحمض النووي المضغوطة إلى قسمين في مركز قضيب كخلية مقسمة، وعاد أخيرا إلى توزيع موحدة عادية في كل خلية ابنه3. ولكن طبيعته عابر والحجم الكبير الميكروسكوب الإلكتروني تعوق التحليل الهيكلي. موراتا et al. الجمع بين عدة طرق، بما في ذلك الثقافة متزامن ومجهرية الأسفار، والتجميد السريع وعالية الجهد إلكترون cryo-التصوير المقطعي (cryo-هفت)، ونجحت في تحديد هيكل عابر الحمض النووي الضغط، بما في ذلك حركية وميلامين متعدد الفوسفات الهيئات (المدنيتين)4. المخطوطة شرح البصرية لمادة صعبة بالتفصيل حسب الجمع بين الإجراءات التجريبية.

الونجاتوس س. وقد شكل كبسولة، بطول من 2 إلى 5 ميكرون وعرض حول 0.5 ميكرومتر وانضغاط الحمض النووي الكمال يظهر في الخلايا الحية إلا لفترة زمنية قصيرة جداً. ولذلك، التغيرات الهيكلية التي تحدث في الضغط الحمض النووي سيانوباكتيريال لم تكن معروفة بالتفصيل. من أجل التحقيق في هذه الهياكل بالمجهر الإلكتروني، من الضروري للتغلب على المشاكل التقنية الرئيسية اثنين. واحد هو مراقبة مثل هذه العينة سميكة من بكتيريا كله في القرب من الشروط الأصلية، والآخر هو التثبيت السريع من بنية ديناميكية. أما بالنسبة للمشكلة الأولى، المسار الحر يعني غير مرن (إيمفب) للإلكترونات يعتمد على الجهد المتسارع ل المجهر الإلكتروني5. في مجهر إلكتروني انتقال (TEM) من 300 كيلو فولت، هو أقل من 350 نانومتر. على سبيل المثال، عند سيانوباكتيريوم جزءا لا يتجزأ من الجليد (≈ سمك العينة 600 nm) يلاحظ في تيم 200kV (إيمفب ≈ 250 نانومتر)، الهياكل داخل الخلية ويصعب مراقبة. على النقيض من ذلك، 1 أم تيم (إيمفب ≈ 500 نانومتر) يمكن إعطاء وصورة لهيكل هيولى في جميع أنحاء الخلية (الشكل 1). في هذا البروتوكول، كجزء من الحل، مجهر إلكتروني جهد العالي (هفيم) في جهد متسارع من 1 أم كان يعمل. غير أن المرافق التي تقوم بتنفيذ هفيم محدودة في جميع أنحاء العالم. وتناقش أيضا في قسم مناقشة الحلول البديلة الممكنة. تم حل المشكلة الثانية بالميكروسكوب الإلكتروني cryo (cryo-م). هذا أداة قوية لتصور الهياكل الحيوية في القرب من الشروط الأصلية، يتم تجميد العينة سريعاً في الإيثان السائل باستخدام جهاز تجميد سريع، حيث لوحظ لحظة المجمدة مباشرة مع الحد أدنى من التعديلات6. الجمع بين التصوير المقطعي، يمكن بناؤها لقطة ثلاثية الأبعاد (3D) هياكل من سلسلة إمالة7. في هذه التجربة، واستنسخ انضغاط الحمض النووي في س. الونجاتوس استخدام الثقافة متزامن مع دورة كل الضوء/الظلام تحت 12 ح، ويتحدد توقيت تجميد العينة الرصد تحت مجهر الأسفار.

النهج الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على نطاق واسع لدراسة الهياكل الحيوية في الخلايا البكتيرية والعزل الصبغي وانقسام الخلية مثل العدوى بالعاثية، وتنطوي على إمكانيات لفتح آفاقاً جديدة في مجال البحوث الميكروبيولوجية.

Protocol

1-متزامن الثقافة من البكتيريا الزرقاء

  1. الثقافة الونجاتوس س. 7942 من المجلس المركزي الفلسطيني في تعقيم لوحة 11 حرس الحدود (في 9 سم معقمة بلاستيك بيتري طبق) تحتوي على 1.5% (w/v) أجار و 0.3% (w/v) ثيوكبريتات الصوديوم8.
  2. وضع اللوحات في دائرة نمو في 23 درجة مئوية مع شدة ضوء 50/ق2µE/m وتخضع ح 12 الضوء/12 ح دورات الظلام.
  3. نقل الخلايا على لوحات أجار BG11 الطازج مرة واحدة في أسبوع.
    ملاحظة: سوف تظهر الثقافات على أجار كعصابات خضراء من الخلايا المتكاثرة بنشاط بعد أسبوع واحد تحت هذا الشرط الثقافة.
  4. تأخذ الخضراء من كتل الخلايا مع حلقة سلكية معقمة اللهب والانتصارات الخلايا على طبق أجار BG11 طازجة. القيام بذلك على مقاعد البدلاء نظيفة.

2-رصد الأسفار الفحص المجهري

  1. تستخدم الخلايا المزروعة على لوحة أجار لمدة 6 أيام لمراقبة الضغط الحمض النووي. جمع الخلايا من اللوحة في نهاية فترة الخفيفة بصب 1 مل من محلول السكروز 0.2 متر فوق الخلايا. كرر صب الحل على الخلايا حيث أن معظم الخلايا يتم جمعها. نقل الحل تعليق خلية في أنبوب الجزئي لتلطيخ الحمض النووي.
  2. إضافة الحمض النووي تلطيخ الحل صبغ (مثل هويشت 33342) إلى 500 ميليلتر لحل تعليق خلية في أنبوب الصغرى إلى تركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل. بعد ذلك، إبقاء الأنبوب في الظلام لمدة 10 دقائق.
  3. الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 2,000 س ز للرواسب في الخلايا. تجاهل المادة طافية وإضافة 10 ميليلتر من محلول السكروز 0.2 M للحصول على تعليق خلية كثيفة.
  4. نقل 1 ميليلتر من الحل الذي يحتوي على خلايا الملون على زجاج شريحة، وطرح كشف الغطاء والتقيد مجهر الأسفار مزودة بفلتر الأشعة فوق البنفسجية باستخدام عدسة الهدف مع تكبير من 100 س وزيت الغمر.
  5. تأكيد أن يلاحظ الضغط الحمض النووي عند هذه النقطة في معظم الخلايا، ثم إعداد العينة لتجميد الخطوة التالية.

3-نموذج تجميد للبرد-هفت

  1. إعداد جهاز تجميد يغرق. ملء الخزان بالنيتروجين السائل والبدء في تبريد قاعة البرد بعد ربط الخزان والغرفة مع أنبوب تفلون.
  2. ملء الإيثان السائل في وعاء صغير من النحاس داخل الدائرة بعد تهدئة الدائرة إلى درجة حرارة النتروجين السائل. ارتداء النظارات أثناء العملية، لأن الإيثان السائل المتفجرة.
  3. توهج تصريف الكربون-جانب م المخرمة المغلفة بالكربون الشبكة (الشبكة المخرمة) لمدة 30 ثانية في 50 mA بومباردير أيون بلازما استخدام.
  4. تطبيق 1 ميليلتر من جيش صرب البوسنة الذهب الراسم (15 نانومتر) إلى الشبكة المخرمة كعلامة الاعتماد.
  5. تطبيق قاسمة 2.5 ميليلتر من الخلايا في مرحلة ضغط الحمض النووي على شبكة المخرمة. لطخة قبالة الحل الزائدة مع ورقة عامل التصفية. إغراق الشبكة في الإيثان السائل استخدام المكبس في جهاز التجميد يغرق فورا.
  6. تخزين الشبكات المجمدة في تخزين النيتروجين السائل حتى أنها تبحث.

4-البرد-هفت

  1. إعداد هفيم في جهد العالي 1 أم.
  2. تحميل الشبكة المجمدة في حامل cryo-عينة هفيم بريكوليد إلى-150 درجة مئوية مع النيتروجين السائل داخل cryo-محطة العمل، وتحميله في هفيم. كن حذراً لتجنب التلوث بالجليد.
  3. حدد منطقة تصوير في تكبير أقل من 1، 000 X. ضبط ارتفاع محور ع يوسينتريك.
  4. إمالة، مرحلة العينة إلى-60 ° وإزالة رد فعل عنيف تناوب إمالة.
  5. ضبط التركيز القرب من الموقع المستهدف في بير 10، 000 X. تعيين تحت التركيز من 6 إلى 10 ميكرون من انحراف صورة مركزة. للتصوير، وتعيين الجرعة/Å ه2-2 أو أقل في العينة مسبقاً.
  6. قياس الجرعة الإلكترون بالكثافة الحالية على الشاشة صورة في هفيم. التقاط صورة في هذا فيلم إلكترون أو بواسطة كاميرا رقمية في التكبير نفسه كما هو الحال في عملية التركيز.
  7. جمع إمالة الصور يدوياً بنفس الإجراء كما هو الحال في (4.5) من-60 ° إلى + 60 درجة في زيادة زاوية ميل ° 2 إلى 4 درجات.
    ملاحظة: في العديد من المجاهر الإلكترون الحديثة، هو الآلي الحصول على سلسلة إمالة بالمزيج من كاميرا رقمية. وفي هذه الحالة، اتبع دليل التعليمات. الأفلام السلبية، تطوير الأفلام لمدة 12 دقيقة عند 20 درجة مئوية في خزان مطور استخدام مطور كامل قوامها وإصلاحها في المثبت لرقمنة دقيقة 10 أفلام بدقة من 4,000 نقطة في البوصة (0.635 نيوتن متر/بكسل على الصورة) باستخدام ماسح ضوئي مسطح. في حالة كاميرا رقمية، موضوع الصور التي يتم جمعها مباشرة إلى الخطوة التالية في معالجة الصورة. إذا لزم الأمر، تقليل حجم الصورة بفلتر متوسط استخدام اثنين إلى أربعة binning (حجم خفض عامل) والبرمجيات الملائمة (مثل إيماجيج).

5-تمجربهك التعمير

  1. جعل ملف صورة كومة من الفرد إمالة الصور باستخدام الأمر "tif2mrc" أو "نيوستاك" في إيمود البرنامج9.
  2. بدء تشغيل البرنامج أتومو واجهة المستخدم الرسومية في إيمود، وتعيين معلمات الصورة: حجم بكسل، قطر الاعتماد، تدوير الصورة، إلخ. ثم قم بإنشاء البرامج النصية.
  3. تنفيذ البرامج الفردية وفقا للبرامج المذكورة في جداول المواد، حيث تتم محاذاة سلسلة الميل باستخدام علامات الاعتماد (بمتوسط متبقية خطأ أقل من 0.5). وأخيراً، إعادة بناء توموجرام ثلاثي الأبعاد استخدام خوارزمية سرت في إيمود.
  4. استخراج منطقة الفائدة (العائد على الاستثمار) من توموجرام ودينويسي باستخدام عامل تصفية دينويسي: تصفية عامل تصفية نشر متباين في إيمود أو عامل تصفية ثنائية في إيمان10مورفولوجيا رياضي11، إلخ، مع المعلمات المناسبة لزيادة التباين.

6-تجزئة ميزة الفائدة

ملاحظة: الإجراء الموضح أدناه محددة للبرمجيات المستخدمة (انظر الجدول المواد) لكن يمكن استخدام حزم البرامج الأخرى بدلاً من ذلك. أرجع إلى دليل المستخدم بها.

  1. في إطار عارض ثلاثي الأبعاد، افتح الملف توموجرام على البرمجيات أميرة وتولد أورثوسليسي.
  2. في إطار محرر تجزئة، إنشاء ملف تجزئة بتحديد جديد "تسمية حقل".
  3. تتبع حدود ميزة الفائدة (الفلبين) يدوياً. اتبع FOI عبر جميع شرائح توموجرام. ل FOI الثانية، إنشاء جديد "مواد" وكرر نفس العملية.
  4. تولد تقديم سطحية عن طريق تحديد من القائمة "سورفاسيجين". تصور حجم مجزأة، حدد من القائمة "سورفاسيفيو". لنقل، تدوير، وتكبير الحجم الثلاثي الأبعاد، استخدم الأدوات في إطار عارض ثلاثي الأبعاد.
  5. لتجزئة التلقائي، استخدم "أداة العصا السحرية". انقر فوق كائن ما، وضبط مربعات التمرير في عرض وإخفاء لتغطية نطاق القيم حتى يتم تحديد الكائن كاملا بمعالمه.

Representative Results

في ثقافة متزامن دقيقة تحت 12 ح دورة كل الضوء/الظلام، يظهر الحمض النووي المسمى مع هويشت توزيع موحد عادي في حالة الظلام (الشكل 2a). بيد أنه تدريجيا التعاقدات داخل الخلية أثناء فترة الخفيفة، ويظهر كهيكل قضيب مثل المجعد (الشكل 2) في نهاية فترة الخفيفة. وأخيراً، القضيب يقسم في المركز (الأسهم في الشكل 2 (ج)) وتوزع على جزأين في خلايا ابنه (الشكل 2d). بعد انقسام الخلية، يختفي ضغط الحمض النووي فورا، والحمض النووي يعود إلى توزيع موحد عادي.

عندما قاسمة الخلايا التي تحتوي على الخلايا في المرحلة النهائية من الضغط الحمض النووي فورا نقلوا على شبكة المخرمة والسريعة المجمدة في الإيثان السائل، ولوحظ الشبكة المجمدة بالبرد أم 1-هفيم، الهياكل الداخلية للبكتيريا بما في ذلك الحمض النووي وطبقات غشاء ثايلاكويد وجدران الخلية والمدنيتين، يبدو كما هو الحال في لقطة في لحظة تجميد (الشكل 3a). العديد من الخلايا وأظهرت متميزة انضغاط الحمض النووي في الخلايا (الأسهم البيضاء في الشكل 3 ألف)، ويمكن تمييزها بسهولة من الخلايا الطبيعية (رؤوس بيضاء في الشكل 3). بعض معارضها انقباض في مركز للخلايا كما هو متوقع قبل انقسام الخلية (السهم الأصفر في الشكل 3 ألف).

في توموجرامس ثلاثي الأبعاد، يمكن أن تكون مجزأة العضيات الرئيسية الخلية؛ يمكن أن يكون جدار الخلية وطبقات غشاء ثايلاكويد والحمض النووي والمدنيتين ميز (الشكل 4). على وجه الخصوص، كان فصل الحمض النووي المضغوطة بفجوة متميزة في السيتوبلازم حيث الحمض النووي كان محاطاً بالمواد ذات الكثافة السكانية المنخفضة وطبقات غشاء ثايلاكويد مشوهة على طول القضيب متموجة من الحمض النووي المضغوطة. السلوك الديناميكي المدنيتين لوحظ حديثا: في الحمض النووي ضغط الخلايا، وشوهدت المدنيتين صغيرة كثيرة على التمسك بالحمض النووي، بينما هم كبير وأقل في الخلايا الطبيعية. وبالإضافة إلى ذلك، معظم المدنيتين ظهرت كأزواج، وبعض الحمض النووي على ما يبدو في عملية الانفصال عن المدنيتين. واقترح هذا أن المدنيتين نفسها تنقسم إلى قسمين بتكرار الحمض النووي والدالة كموردين للفوسفات لتركيب الدنا.

Figure 1
الشكل 1. Cryo-م الصور من البكتيريا الزرقاء العادية جزءا لا يتجزأ من الجليد، الونجاتوس س. 7942 من المجلس المركزي الفلسطيني في الفولتية تسارع مختلفة. أ) 200kV و ب) 1000kV. شريط المقياس = 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: Fluorescence مجهرية من خلايا الونجاتوس س. سيانوباكتيريوم. بعد الثقافة متزامن تحت 12 ساعة دورات كل الضوء/الظلام، كانت ملطخة الخلايا هويشت 33342. إظهار الخلايا بعد 2 ساعة بداية الدولة الظلام (أ) وسم الحمض النووي موحدة. الحمض النووي في خلايا عديدة مكثف تدريجيا خلال فترة الخفيفة. في نهاية المطاف شكل قضيب متموجة سميكة (ب) نموذجي للضغط الحمض النووي. بعد هذه المرحلة، فصل هياكل الحمض النووي المضغوطة مقسمة بسرعة في هذه المراكز (رؤوس) أثناء انقسام الخلية (ج)، والشظايا اثنين إلى الخلايا ابنه (د)- الخلايا ابنه عاد إلى وسم الحمض النووي الموحد مرة أخرى في فترة مظلمة. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: صورة Cryo-هفيم من البكتيريا الزرقاء جزءا لا يتجزأ من غير متبلور مدت (أ) يوضح صورة raw في إمالة 0 °. الصور أخذت في نهاية فترة الخفيفة. بعض الخلايا إظهار متموج على شكل قضيب الحمض النووي هيئات مماثلة للكروموزومات مكثف حقيقية النواة (الأسهم البيضاء). في الخلايا الطبيعية، يحمل البكتيريا الزرقاء بنية الحمض النووي ملحوظة داخل السيتوبلازم (رؤوس بيضاء). بعض يحمل انقباض في مركز للخلايا كما هو متوقع قبل انقسام الخلية (السهم الأصفر). (ب) س وص، xz، yz-شرائح من توموجرام 3D. إظهار خطوط منقطة أصفر تقاطعات شرائح. شريط المقياس = 2 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: ضغط أولتراستروكتوري خلايا التي تحتوي على الحمض النووي- يتم تجزئة المكونات الرئيسية: جدار الخلية (أصفر لامع) وأغشية ثايلاكويد (أحمر)، والحمض النووي (أزرق). (أ) يبين z شريحة من توموجرام 3D. (ب) جميع الأجزاء. يظهر انقباض تشير إلى فصل الخلية في وسط الخلية (السهم). وعلى غرار المدنيتين كمجالات الأصفر أو البرتقالي؛ يمثل كل مجال البرتقال المناظر لمجال الأصفر الأقرب. شريط المقياس = 500 نانومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

وقد قدمنا سلسلة بروتوكولات لتصور عابر انضغاط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء. المفهوم الأساسي مماثلة لتلك التي ستتحقق من الضوء والمجهر الإلكتروني (كليم)12. وبالإضافة إلى ذلك، في هذا الأسلوب، البكتيريا الحية كانت تخضع للفحص المجهري الأسفار والمجمدة سريعاً على شبكات م وتصور مباشرة مع التصوير المقطعي الإلكترون cryo عالية الجهد. تم بنجاح تصور كتطبيق أول، بنية الحمض النووي تفصيلاً ضغط الخلايا البكتيرية في 3D. حاليا، يتم هذا الإجراء الخاصة بهذا الموضوع، ولكن سيتم تطبيقه على نطاق أوسع، مع منهجية معدلة في بعض الحالات. وتناقش هنا، المزايا والحدود، والاحتمالات المستقبلية لهذا الأسلوب.

ومن مزايا هذا الأسلوب هو التصور 3D من الخلية كلها. 1 MV هفيم بنجاح تصور الدينامية ضغط بنية العضيات سوبسيلولار في الحمض النووي الخلايا. ومع ذلك، يمكن تمييزها هيكل غرامة داخل الخلايا الطبيعية لا بسبب تباين الصورة منخفضة. زيادة مرونة ونثر متعددة في العينات سميكة يطمس الصورة13. صورة صفر-الخسارة ومعظم-المحتمل-خسارة تصفية بواسطة عامل تصفية الطاقة يمكن تحسين تباين الصورة بالحد من تشتت مرن14،15، ولكن فإنه لن يعمل لعينات أكثر سمكا من إيمفب. قمم الخسارة صفر ومعظم-المحتمل-خسارة الانخفاض جذريا مع سمك العينة. أنها صعبة للغاية للحصول على نسبة الإشارة إلى الضوضاء كافية للعينات جزءا لا يتجزأ من الجليد الحساسة إلكترون. موراتا et al. وقد أظهرت أن انتقال المسح 1MV مجهرية (الجذعية) يعطي أعلى تباين الصورة من صورة مشرقة ميدانية في البلاستيك جزءا لا يتجزأ من خلايا الخميرة مع 5 ميكرون سمك، حيث يتم إعطاء الصورة تباين أساسا على النقيض من السعة13 . ومع ذلك، فمن المتوقع أن يخلق تأثير الأضرار كنوكون على الإلكترونات المعجلة أعلى قيد آخر على جرعة الإشعاع لحساسة لأضرار البرد-عينات16. قد يكون تطبيق فولتا وزيرنيكه المرحلة لوحات17،18 بالنسبة هفيم قادرة على الحد من الأضرار كنوكون بتخفيض الجرعة الكلية في المستقبل. قيد آخر على استخدام هفيم للعينات سميكة يأتي من حقيقة أن التسهيلات المستخدم التي توفر هفيم شحيحة في جميع أنحاء العالم.

استخدام منهجية بديلة لمراقبة سميكة العينات، التصوير المقطعي الجذعية البرد في 300 كيلوفولت أثبتت الصور عالية التباين على العينات المجمدة-رطب مع سماكة تزيد عن عدة مئات نانومتر19. لاسترداد مرحلة التباين في البرد-الجذعية، الميكروسكوب الإلكتروني بثيتشوجرافيك كما أدخلت، الذي ينقل لوحة المرحلة في عدسة المكثف حيود التضمين المرحلة إلى كاشف 2D منقطة20. يتم استرداد الصور بواسطة حساب من إنكسار متعددة. يتم تطبيق مباشر وسريع 3D cryo-التصوير من الأم كبيرة تجميد عينات، cryo-التعزيز-وزارة شؤون المرأة يمكن أيضا أن تستخدم21، حيث المسلسل تمزيقها مع شعاع أيون مركزة ومنع تصوير الوجه لتصوير كامل رطب العينات المجمدة. على الرغم من أن هذه التكنولوجيات توسيع نطاق عرض العينات البيولوجية، من الصعب العثور على الموقع المستهدف من البكتيريا، مثل المسمى البكتيريا، لأن الهدف هو تماما تحت الجليد ولا يمكن تحديده قبل اقتطاع.

انضغاط الحمض النووي تنتج بنية متميزة في البكتيريا الزرقاء. الحمض النووي ضغط الخلايا بسهولة الموقر حتى بدون يجري الملون بسبب تحيز كثافة كبيرة داخل الخلايا غير موجودة في الخلايا الطبيعية. ومع ذلك، من أجل تصور المزيد من الأحداث المحلية داخل الخلية، من الضروري نقل المسمى فلوريسسينتلي دوروا في المجهر الإلكتروني. ستتحقق من الضوء والمجهر الإلكتروني (كليم)، صور المجهر الخفيفة وصور المجهر الإلكتروني عموما ترتبط باستخدام الخرز مطاط الفلورسنت أو نقاط الكم على م الباحث عن شبكات12. يجب أن تكون الجسيمات التوسيم للإلكترون عالية الكثافة بالإضافة إلى الأسفار. أنها دقة وموثوقية ربط المواقف بين اثنين من الصور. وعلاوة على ذلك، بالتأكيد على المنطقة المسماة بالبرد الخفيفة الميكروسكوب، يمكن أن يتحقق التداخل الكامل من العائد على الاستثمار بين المجاهر اثنين. عند وصف أحداث هيكلية أكثر تفصيلاً في الضغط الحمض النووي، ستكون هذه الجسيمات ومجهر الضوء cryo أداة لا غنى عنها لعلاقة أكثر قوة وأكثر دقة في المستقبل.

يوضح هذا المقال كيفية تحديد هيكل عابر للضغط الحمض النووي في البكتيريا الزرقاء بالجمع بين الثقافة متزامن والفحص المجهري الأسفار والتصوير المقطعي الإلكترون البرد الجهد العالي. ويركز هذا البروتوكول على مراقبة الحمض النووي المضغوطة. عن طريق الجمع بين هذا الأسلوب مع غيرها من التكنولوجيات الجديدة المشار إليها أعلاه، فإنه سيكون من الممكن للتحقيق في عملية الضغط الحمض النووي بمزيد من التفصيل، وأساليب تعديلها قابلة للتطبيق على نطاق واسع للأحداث الهيكلية الأخرى الحيوية في البكتيريا.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgements

يشكر المؤلفون التمو ريسيويتز لقراءة نقدية مخطوطة، وسواء "هاياشي ماكو" وهاجيوارا سايوري لزراعة حذراً والمراقبة للبكتيريا الزرقاء ويوشيتاكا كيموري لمعالجة الصور والأغنية كونج، ناويوكي ميازاكي وميوكو ناغايوشي لمساعدة مع تجزئة الهياكل. هذا العمل كان يدعمها "برنامج دراسة تعاونية" للمعهد الوطني فسيولوجية العلوم (خطط التنفيذ الوطنية) إلى مجموعة

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hoechst 33342 solution Dojindo 346-07951 1mg/mL in H2O
Agar Powder (for plant culture) Wako 016-11875
Boric acid Wako 027-02192 99.5%
Manganese chloride tetrahydrate Wako 139-00722 99%
Zinc sulfate heptahydrate Wako 264-00405 99.5%
Sodium molybdate Wako 196-02472 99%
Copper sulfate pentahydrate Wako 039-04412 99.5%
Cobalt nitrate hexahydrate Wako 031-03752 99.5%
Sodium nitrate Wako 191-02542 99%
Magnesium sulfate heptahydrate Wako 131-00405 99.5%
Calcium chloride dehydrate Wako 031-00435 99.5%
Citric acid Wako 036-05522 98%
EDTA-2Na Dojindo 343-01861 99.5%
Sodium carbonate Wako 197-01581 99.8%
Potassium phosphate dibasic Wako 164-04295 99%
TES (Good’s buffer) Dojindo 344-02653 99%
Ferric ammonium citrate Wako 092-00802 1st Grade
Sodium thiosulfate pentahydrate Wako 197-03585 99%
BSA gold tracer 15nm Aurion 215.133
Quantifoil EM grid Quantifoil MicroTools R3.5/1 Copper grid
Electron films Kodak SO-163
Developer Kodak D19
Fixer Kodak Rapid fixer Solution
Filter paper Whatman Grade 1
Growth chamber NKsystem LH-100SP
Fluorescent microscope Nikon ECLIPSE 50i
High voltage TEM HItachi H1250M
Cryo-specimen holder for HVEM Gatan
plunge-freezing device Leica EM CPC
Plasma Ion bombarder Vacuum device PIB-10
Liquid nitrogen storage Taylor-Wharton 25LDB
Developing tank Dosaka EM TB-3-75
flatbed scanner Nikon Coolscan 9000ED
Segmentation software FEI Amira https://www.fei.com/software/amira
Tomographic Reconstruction software eTOMO http://bio3d.colorado.edu/imod

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Smith, R. M., Williams, S. B. Circadian rhythms in gene transcription imparted by chromosome compaction in the cyanobacterium Synechococcus elongatus. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 103, (22), 8564-8569 (2006).
  2. Kondo, T. A cyanobacterial circadian clock based on the kai oscillator. CSHS Quant. Biol. 72, 47-55 (2007).
  3. Seki, Y., Nitta, K., Kaneko, Y. Observation of polyphosphate bodies and DNA during the cell division cycle of Synechococcus elongatus PCC 7942. Plant biol. 16, (1), Stuttgart, Germany. 258-263 (2014).
  4. Murata, K., Hagiwara, S., Kimori, Y., Kaneko, Y. Ultrastructure of compacted DNA in cyanobacteria by high-voltage cryo-electron tomography. Sci. Rep. 6, 34934 (2016).
  5. Koster, A. J., et al. Perspectives of molecular and cellular electron tomography. J. struct. boil. 120, (3), 276-308 (1997).
  6. Lučić, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: The challenge of doing structural biology in situ. J. Cell Biol. 202, (3), 407-419 (2013).
  7. Murata, K., et al. Visualizing Adsorption of Cyanophage P-SSP7 onto Marine Prochlorococcus. Sci. Rep. 7, 44176 (2017).
  8. Rippka, R., Deruelles, J., Waterbury, J. B., Herdman, M., Stanier, R. Y. Generic assignments, strain histories and properties of pure cultures of Cyanobacteria. J. Gen. Microbiol. 111, 1-61 (1979).
  9. Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD. J. struct. boil. 116, 71-76 (1996).
  10. Jiang, W., Baker, M. L., Wu, Q., Bajaj, C., Chiu, W. Applications of a bilateral denoising filter in biological electron microscopy. J. Struct. Biol. 144, 114-122 (2003).
  11. Kimori, Y. Morphological image processing for quantitative shape analysis of biomedical structures: effective contrast enhancement. J. Sync. Rad. 20, 848-853 (2013).
  12. Jun, S., Zhao, G., Ning, J., Ga Gibson,, Watkins, S. C., Zhang, P. Correlative microscopy for 3D structural analysis of dynamic interactions. J. Visual. Exper. 76, e50386 (2013).
  13. Murata, K., Esaki, M., Ogura, T., Arai, S., Yamamoto, Y., Tanaka, N. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicros. 146, 39-45 (2014).
  14. Kortje, K. H., Paulus, U., Ibsch, M., Rahmann, H. Imaging of thick sections of nervous tissue with energy-filtering transmission electron microscopy. J. Microsc. 183, 89-101 (1996).
  15. Bouwer, J. C., et al. Automated most-probable loss tomography of thick selectively stained biological specimens with quantitative measurement of resolution improvement. J. Struct. Biol. 148, (3), 297-306 (2004).
  16. Egerton, R. F., Li, P., Malac, M. Radiation damage in the TEM and SEM. Micron. 35, (6), 399-409 (2004).
  17. Danev, R., Buijsse, B., Khoshouei, M., Plitzko, J. M., Baumeister, W. Volta potential phase plate for in-focus phase contrast transmission electron microscopy. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 111, (44), 15635-15640 (2014).
  18. Murata, K., et al. Zernike phase contrast cryo-electron microscopy and tomography for structure determination at nanometer and subnanometer resolutions. Structure. 18, (8), 903-912 (2010).
  19. Wolf, S. G., Houben, L., Elbaum, M. Cryo-scanning transmission electron tomography of biological cells. Nat. Methods. 11, (4), 423-428 (2014).
  20. Ophus, C., et al. Efficient linear phase contrast in scanning transmission electron microscopy with matched illumination and detector interferometry. Nat. Comm. 7, 1-7 (2016).
  21. Schertel, A., et al. Cryo FIB-SEM: Volume imaging of cellular ultrastructure in native frozen specimens. J. Struct. Biol. 184, (2), 355-360 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics