ठहराव लिपिड बहुतायत और लिपिड वितरण के मूल्यांकन में Caenorhabditis एलिगेंस द्वारा नील लाल और तेल लाल ओ धुंधला

Biology

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Summary

नील लाल फिक्स्ड Caenorhabditis एलिगेंस के दाग तटस्थ लिपिड जमा की मात्रात्मक माप के लिए एक विधि है, जबकि तेल लाल हे दाग ऊतकों के बीच लिपिड वितरण के गुणात्मक आकलन की सुविधा ।

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Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (133), e57352, doi:10.3791/57352 (2018).

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Abstract

Caenorhabditis एलिगेंस एक असाधारण मॉडल जीव है जिसमें लिपिड चयापचय और ऊर्जा homeostasis का अध्ययन करने के लिए । इसके लिपिड जीन के कई मनुष्यों में संरक्षित कर रहे है और चयापचय सिंड्रोम या अंय रोगों के साथ जुड़े रहे हैं । इस जीव में लिपिड संचय की परीक्षा को निर्धारण रंजक या लेबल मुक्त तरीकों से किया जा सकता है । नील लाल और तेल लाल हे जैसे निर्धारण दाग सस्ती हैं, मात्रात्मक रूप से लिपिड स्तर को मापने के लिए विश्वसनीय तरीके और गुणात्मक ऊतकों में लिपिड वितरण का पालन करने के लिए, क्रमशः । इसके अलावा, इन दाग विभिंन लिपिड चयापचय जीन और रास्ते के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देते हैं । इसके अतिरिक्त, उनके hydrophobic प्रकृति लिपिड घुलनशीलता की सुविधा, आसपास के ऊतकों के साथ बातचीत कम कर देता है, और विलायक में पृथक्करण रोकता है । हालांकि इन तरीकों को सामान्य लिपिड सामग्री की जांच में प्रभावी रहे हैं, वे रासायनिक संरचना और लिपिड जमा की विविधता के बारे में विस्तृत जानकारी प्रदान नहीं करते । इन उद्देश्यों के लिए, जैसे GC-MS और कारों माइक्रोस्कोपी के रूप में लेबल मुक्त तरीकों बेहतर अनुकूल हैं, उनकी लागत के बावजूद ।

Introduction

लिपिड जीवन के लिए आवश्यक हैं । वे झिल्ली के अभिंन घटक हैं, माध्यमिक दूत और संकेत ट्रांसड्यूसर के रूप में कार्य करते हैं, और ऊर्जा भंडारण में महत्वपूर्ण कार्य किया है । जब लिपिड चयापचय dysregulated है, यह मोटापा और प्रकार द्वितीय मधुमेह, जो सार्वजनिक स्वास्थ्य चिंताओं को दबा रहे हैं जैसे रोगों की ओर जाता है9. Caenorhabditis एलिगेंस (सी. एलिगेंस) एक उत्कृष्ट मॉडल जीव है जिसमें लिपिड चयापचय का अध्ययन करने के लिए क्योंकि यह एक अपेक्षाकृत कम जीवन चक्र, एक पारदर्शी शरीर, एक ज्ञात कोशिका वंश है, और एक पूरी तरह से अनुक्रम जीनोम. मुख्य रूप से एक द्विलिंग, सी. एलिगेंस शोधकर्ताओं ने समय की छोटी अवधि में isogenic पशुओं की बड़ी संख्या बढ़ाने के लिए carryout उच्च प्रवाह आगे आनुवंशिक स्क्रीन चयापचय जीन और रास्ते4की एक विस्तृत सरणी का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण से मानव, चूहों, चूहों और drosophila के बीच 273 C. एलिगेंस लिपिड चयापचय जीन में संरक्षण के एक उच्च डिग्री का पता चला है । इसके अलावा, C. एलिगेंस में 300 से अधिक लिपिड जीन मानव orthologues कि चयापचय सिंड्रोम11से असंबंधित रोगों के साथ जुड़े रहे हैं । परंपरागत रूप से, सी. एलिगेंस में लिपिड भंडारण की परीक्षा ज्यादातर डाई पर भरोसा किया है-परख, जो लिपिड संचय के बारे में मजबूत जानकारी प्रदान लेबल । कम आम जहां लिपिड स्थानीयकरण और ऊतकों में लिपिड बहुतायत में अंतर मापा का वर्णन है । हालांकि, हाल ही में काम से पता चला है कि लिपिड वितरण के रूप में लिपिड संचय6के रूप में महत्वपूर्ण हो सकता है ।

हाल ही में, अध्ययनों से उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (HPLC-ms), गैस क्रोमैटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (जीसी-ms), और सुसंगत विरोधी स्टोक्स रमन कैटरिंग (कारें) माइक्रोस्कोपी को संबोधित करने के रूप में तरीकों का घालमेल शुरू कर दिया है सीधे लिपिड निष्कर्षों की सामग्री का विश्लेषण करके दाग आधारित दृष्टिकोण की कमियों, विशिष्ट लिपिड भिन्न, और लिपिड जमा, क्रमशः10,11. इसके अलावा, कार माइक्रोस्कोपी से पता चला है कि नील लाल केवल वसा संचय के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में सेवा कर सकते है जब एक निर्धारण डाई के रूप में प्रयोग किया जाता है, एक महत्वपूर्ण दाग के रूप में इसके उपयोग के लिए रवाना ऑटो-फ्लोरोसेंट organelles10के धुंधला लक्ष्य की ओर जाता है । तथापि, आवश्यक तकनीकी विशेषज्ञता और इन क्रोमैटोग्राफी और सूक्ष्म तरीकों के साथ जुड़े लागत कई अनुसंधान सवालों के लिए उनके उपयोग अस्थिर बनाते हैं । इस अनुच्छेद में, हम एक सुविधाजनक और विश्वसनीय विधि को निर्धारित करने और C. एलिगेंस में तटस्थ लिपिड जमा दाग नील लाल और तेल लाल हे का उपयोग करने के लिए पूरे पशुओं में और विशिष्ट ऊतकों में लिपिड बहुतायत भेद चर्चा ।

नील लाल, 9-diethylamino-5H-benzo [α] phenoxazine-5-एक, एक benzophenoxazone डाई है कि आसानी से विभिंन कार्बनिक सॉल्वैंट्स में घुल, लेकिन पानी में ज्यादातर अघुलनशील है । यह एक उत्कृष्ट lysochrome जैसे ट्राइग्लिसराइड्स या कोलेस्ट्रॉल एस्टर के रूप में तटस्थ लिपिड दाग इस्तेमाल किया डाई है, क्योंकि यह एक मजबूत रंग सुविधाओं, लिपिड में अच्छी तरह से solubilizes, आसपास के ऊतकों के साथ नगण्य बातचीत है, और में से विलायक में कम घुलनशील है रक्तदाब. यह एक उत्तेजना और 450-500 और 520 एनएम के उत्सर्जन maxima, क्रमशः1है । जब नील लाल दाग सी. एलिगेंस हरे प्रतिदीप्ति के लिए देखा जाता है, असतत लिपिड निकायों आंत और अन्य ऊतकों में या तो समूहों में मनाया जा सकता है या समान रूप से फैलाया, जानवर के जीनोटाइप या प्रयोगात्मक उपचार पर निर्भर करता है 7.

तेल लाल हे एक lysochrome, वसा में घुलनशील डाई ट्राइग्लिसराइड्स और लिपो दाग के लिए इस्तेमाल किया है । इसे एक डाइज डाई कहा जाता है क्योंकि इसकी रासायनिक संरचना में तीन खुशबूदार छल्ले से जुड़ी दो डाइज समूह होती हैं. यह मुश्किल है, जो renders यह अत्यधिक लिपिड में घुलनशील । इसका दाग रंग लाल है और इसका प्रकाश अवशोषण अधिकतम 518 एनएम 3है । C. एलिगेंस तेल लाल ओ शो लाल लिपिड बूंदों है कि पशु पारदर्शी शरीर है, जो विभिंन ऊतकों के बीच लिपिड वितरण के गुणात्मक मूल्यांकन की सुविधा के खिलाफ बाहर खड़े6के साथ दाग ।

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Protocol

1. नील लाल (NR) लिपिड के दाग

  1. तैयारी 5 मिलीग्राम/एमएल NR स्टॉक समाधान
    1. एक 500 मिलीलीटर की बोतल में 100 मिलीग्राम NR पाउडर 100% एसीटोन की 200 मिलीलीटर जोड़ें ।
    2. एल्यूमीनियम पंनी के साथ बोतल को कवर करने के लिए प्रकाश किसी भी जोखिम से बचें ।
    3. उपयोग करने से पहले, अंधेरे में 2 ज के लिए समाधान हलचल ।
    4. लंबी अवधि के उपयोग के लिए, किसी भी प्रकाश जोखिम के बिना एक कसकर सील बोतल में NR स्टॉक समाधान की दुकान. अनुसंधान की जरूरत के अनुसार स्केल NR स्टॉक समाधान । सुनिश्चित करें कि एक ही स्टॉक समाधान NR-धुंधला प्रयोग में लगातार धुंधला और इमेजिंग परिणाम प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
  2. NR कार्य समाधान की तैयारी
    1. हर 1 मिलीलीटर के लिए 40% isopropanol (v/v), जोड़ें 6 µ NR स्टॉक समाधान की l ।
    2. एक नमूना के लिए NR काम समाधान के 600 µ l तैयार करें.
      नोट: दाग से पहले ताजा NR काम समाधान सही बनाओ । NR स्टॉक समाधान की जरूरत के आधार पर, या तो एक 15 मिलीलीटर या 50 मिलीलीटर स्नातक की उपाधि प्राप्त शंकु ट्यूब का उपयोग करें ।
  3. NR लिपिड धुंधला के लिए कीड़े की तैयारी
    1. निमेटोड विकास मध्यम (NGM) पर 20 डिग्री सेल्सियस पर जल्दी L4 चरण के लिए कीड़े बढे देर-लॉग OP50 ई. कोलाईके साथ वरीयता प्राप्त ।
    2. 1x फॉस्फेट के 1 मिलीलीटर के साथ थाली बंद कीड़े धो-खारा + 0.01% ट्राइटन X-100 (PBST) समाधान और एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में कीड़ा निलंबन डाल दिया ।
    3. 1 मिनट के लिए 560 x g पर कीड़े केंद्रापसारक supernatant निकालें और ई. कोलाई निलंबन से मंजूरी दे दी है जब तक यह कदम दोहराएं ।
    4. कीड़ा गोली करने के लिए 40% isopropanol के 100 µ एल जोड़ें और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर यह मशीन ।
    5. 1 मिनट के लिए 560 x g पर कीड़े केंद्रापसारक और कीड़ा गोली को बाधित किए बिना supernatant निकालें ।
      नोट: बड़ी प्लेटों का उपयोग कर या थाली प्रति अधिक कीड़े दाग अगर प्लेटों से कीड़े धोने के लिए PBST की उच्च मात्रा का उपयोग करें । नमूना निर्धारण से पहले 15 मिनट से अधिक PBST में कीड़े न धोएं । supernatant बैक्टीरिया की साफ़ नहीं है, तो अतिरिक्त बहाकर निष्पादित करें । एक nutator या घुमाव का उपयोग कर isopropanol 40% में मशीन बाहर ले । हमेशा ट्यूबों की निगरानी करने के लिए सुनिश्चित करें कि पूर्ण नमूना आंदोलन उत्पन्न हो रही है.
  4. लिपिड धुंधला के साथ NR
    1. अंधेरे में, प्रत्येक नमूने के लिए NR काम समाधान के 600 µ एल जोड़ें. ट्यूबों तीन बार पलटना और पूरी तरह से NR समाधान में कीड़े मिश्रण.
    2. 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर अंधेरे में नमूना घुमाएँ ।
    3. मशीन के बाद, 1 मिनट के लिए 560 x g पर कीड़े के केंद्रापसारक और supernatant को हटा दें ।
    4. PBST के 600 µ एल जोड़ें और 30 मिनट अतिरिक्त NR दाग को दूर करने के लिए अंधेरे में नमूनों की मशीन ।
    5. 1 मिनट के लिए 560 x g पर नमूनों की जांच करें और सभी को हटा दें लेकिन लगभग 50 µ l को supernatant ।
      नोट: NR गर्मी आंदोलन की आवश्यकता नहीं है. इस कदम के दौरान कीड़े का निपटान आम है ।
  5. माइक्रोस्कोप इमेजिंग के लिए स्लाइड की तैयारी
    1. शेष supernatant में कीड़ा गोली reसस्पेंड ।
    2. एक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 5 µ एल वर्म सस्पेंशन के प्लेस और किसी भी हवा के बुलबुले को फँसाने से बचने के लिए ध्यान से पर एक coverslip डाल दिया ।
    3. इमेजिंग वर्म्स से पहले नेल पॉलिश के साथ coverslip को सील कर दीजिये ।
    4. एक समय में केवल एक जोड़ी स्लाइड तैयार करें । यह सुनिश्चित करेगा NR इमेजिंग नमूनों में निरंतर रहता है. nr-सना छवियों की गुणवत्ता के बाद कम हो जाती है 6 एच असतत लिपिड बूंदों का पालन करने के लिए मुश्किल और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति बढ़ जाती है, जो NR संकेत का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप.
  6. NR-दाग कीड़े की इमेजिंग
    1. 5x आवर्धन पर कीड़े छवि को देखने के क्षेत्र में प्रति कई जानवरों पर कब्जा ।
    2. व्यक्तिगत कीड़े के बेहतर ठहराव के लिए 10x इज़ाफ़ा करने के लिए स्विच ।
    3. FITC/GFP चैनल का उपयोग करने के लिए छवि NR-दाग कीड़े और ठहराव के लिए इष्टतम स्थितियों का निर्धारण करने के लिए अलग जोखिम समय की कोशिश.
    4. संपीड़न के कारण डेटा खोने से बचने के लिए फ़ाइलों को TIF स्वरूप में सहेजें ।
      नोट: ठेठ जोखिम टाइंस रेंज से 100-1000 ms. एक इष्टतम जोखिम समय होने, यह सभी नमूनों के लिए उपयोग करने के लिए इमेजिंग निरंतरता बनाए रखने के ।
  7. NR धुंधला छवि ठहराव
    1. अपलोड माइक्रोग्राफ ImageJ । प्लगइंस पुल-डाउन मेनू में, यदि छवि फ़ाइल को पहचाना नहीं गया है, तो बायो-फ़ॉर्मेट फंक्शन का उपयोग करें ।
    2. छवि पुल-डाउन मेनू में, स्टैक्स फ़ंक्शन के अंतर्गत, कई माइक्रोग्राफ की तुलना किए जाने पर चित्र स्टैक बनाने के लिए छवियाँ-से-स्टैक का उपयोग करें.
    3. एक ही पुल-डाउन मेनू में, छवि स्टैक की चमक/कंट्रास्ट समायोजित करें और लागू करेंक्लिक करके सभी छवियों में परिवर्तन प्रचारित करें ।
    4. बहुभुज चयन उपकरण प्रत्येक छवि वाले कीड़ा चित्रित करने के लिए रोजगार और विश्लेषण पुल-डाउन मेनू के तहत माप समारोह का उपयोग करने के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा उत्सर्जित की मात्रा NR.
    5. प्रत्येक छवि के लिए, पांच पृष्ठभूमि स्थानों को मापने और औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता की गणना ।
    6. प्रत्येक छवि वाले कीड़ा से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता घटाना सूत्र N = जी का उपयोग कर-(एक एक्स बी), जहां n नेट प्रतिदीप्ति के लिए खड़ा है, सकल प्रतिदीप्ति के लिए जी, कुल कृमि क्षेत्र के लिए एक और औसत पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए बी ।
    7. कृमि के आकार द्वारा प्रतिदीप्ति तीव्रता को सामान्य करने के लिए, प्रत्येक कृमि के शुद्ध प्रतिदीप्ति को उसके कुल क्षेत्र से विभाजित करें । परिणाम प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं, मनमाना इकाइयों में (a.u.), प्रति पिक्सेल ।
      नोट: JPEG स्वरूप में छवियों को निर्यात करने से बचें । जबकि संपीड़न फ़ाइलों को संग्रहीत करने के लिए अधिक प्रबंधनीय बनाता है, डेटा अक्षतता इस स्वरूप द्वारा compromised है । सुनिश्चित करें कि सभी छवियों को संशोधित और हूबहू विश्लेषण कर रहे हैं । विभिंन आवर्धन पर ठीक से आकार का मूल्यांकन करने के लिए एक स्केल बार शामिल करना याद रखें । बेहतर प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर कल्पना ImageJ का उपयोग कर, RGB से छवि प्रकार स्विच करने के लिए 8 बिट और चयन आग से छवि लुकअप टेबल (LUT) मेनू । यह एक गर्मी नक्शा छवि में वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति तीव्रता के साथ बढ़ रंग चमक को संबद्ध बनाता है.

२. तेल लाल हे दाग (ओरो) च्या रक्तदाब

  1. ओरो स्टॉक समाधान की तैयारी
    1. एक 250 मिलीलीटर की बोतल में, 100% isopropanol के 100 मिलीलीटर के लिए ओरो पाउडर के 500 मिलीग्राम जोड़ें और यह अच्छी तरह से मिश्रण ।
    2. एक बार तैयार है, कोई प्रकाश जोखिम के साथ कसकर बंद समाधान की दुकान ।
  2. ओरो काम समाधान की तैयारी
    1. पानी में ओरो स्टॉक समाधान (3:2) पतला करने के लिए 60% isopropanol ।
    2. उपयोग करने से पहले, एक 0.2 µm फाइबर एसीटेट बाँझ सिरिंज फिल्टर के माध्यम से काम कर ओरो समाधान फ़िल्टर.
      नोट: सबसे अच्छा समाधान की गुणवत्ता के लिए, काम ओरो समाधान पहले दिन तैयार है, और इसे रात भर मिश्रण करते हैं । हालांकि, अगर समाधान एक ही दिन की जरूरत है, पतला और मिश्रण एक झूली कुरसी पर उपयोग से पहले कम से 2 घंटे के लिए समाधान ओरो । कमाल करने से पहले, तेल टेप में शंकु ट्यूब लपेटें ओरो समाधान के रिसाव से बचने के लिए ।
  3. ओरो लिपिड धुंधला के लिए कीड़े की तैयारी
    1. निमेटोड विकास मध्यम पर 20 डिग्री सेल्सियस पर कीड़े बढ़ने (NGM) वांछित जीवन स्तर के लिए देर से लॉग OP50 ई. कोलाई के साथ वरीयता प्राप्त.
    2. थाली में PBST समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें और जब तक सभी कीड़े थाली बंद कर रहे है भंवर । प्लेट झुकाएं और PBST के 1 मिलीलीटर से धो लें । एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब करने के लिए कीड़ा निलंबन स्थानांतरण ।
    3. 1 मिनट के लिए 560 x g पर कीड़े केंद्रापसारक । गोली परेशान बिना supernatant निकालें और PBST की 1 मिलीलीटर के साथ धुलाई कदम दोहराने तीन बार । सभी supernatant को हटा दें लेकिन 100 µ एल.
    4. कीड़ा गोली करने के लिए 40% isopropanol के 600 µ एल जोड़ें और 3 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर यह रॉक ।
    5. 30 एस के लिए 560 x g पर कीड़े को दूर करें और वर्मी गोली को बाधित किए बिना सभी supernatant लेकिन 100 µ l को निकालें ।
      नोट: उच्च प्रवाह धुंधला कर रही है, तो प्लेटों से कीड़े धोने के लिए PBST की उच्च मात्रा का उपयोग करें । नमूना निर्धारण करने से पहले 15 मिनट से अधिक PBST में कीड़े धोने मत करो । यदि supernatant बैक्टीरिया की सफाई नहीं है अतिरिक्त बहाकर मत करो । एक nutator या झूली कुरसी का उपयोग कर 40% isopropanol में मशीन बाहर ले । हमेशा ट्यूबों की निगरानी के लिए सुनिश्चित करें कि पूर्ण नमूना आंदोलन हो रहा है ।
  4. लिपिड ओरो के साथ धुंधला
    1. जोड़ें 600 µ एल ओरो प्रत्येक नमूने के लिए काम कर समाधान । तीन बार ट्यूब पलटना और कीड़े अच्छी तरह से ओरो में मिश्रण ।
    2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए 30 rpm पर नमूने घुमाएँ ।
    3. 1 मिनट के लिए 560 x g पर नमूने की जांच करें और सभी supernatant को खत्म कर दें लेकिन 100 µ l
    4. PBST के 600 µ एल में नमूनों reसस्पेंड और 30 rpm पर ट्यूबों को ३० मिनट के लिए अतिरिक्त ओरो दाग को दूर घुमाएं ।
    5. 1 मिनट के लिए 560 x g पर नमूने केंद्रापसारक और सभी लेकिन supernatant के 50 µ एल खत्म ।
    6. बेहतर है जानवर germline और आंत्र कोशिकाओं के स्थान को भेद करने के लिए, दाग नाभिक के 1 µ एल जोड़कर (2-(4-amidinophenyl)-एक 1-इण्डोल-6-carboxamidine) (DAPI) ओरो काम कर रहे समाधान के हर १ मिलीलीटर के लिए । बाहर ले ओरो 2 के लिए धुंधला DAPI जोड़ने के साथ इमेजिंग के लिए स्लाइड बढ़ते से पहले । आंतों नाभिक आकार में बड़ा कर रहे हैं और gonad विकासशील रोगाणु कोशिकाओं द्वारा प्रतिष्ठित है ।
      नोट: ओरो धुंधला के बाद, कीड़े microfuge ट्यूब के पक्ष का पालन करने के लिए और एक नजर गोली फार्म के लिए असफल हो सकता है । यदि ऐसा होता है, तो कीड़े फिर से बनाना या कीड़े कम 10 मिनट के लिए गुरुत्वाकर्षण द्वारा व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं ।
  5. वर्मी इमेजिंग के लिए स्लाइड तैयार करना
    1. शेष supernatant में कीड़े reसस्पेंड और समाधान अच्छी तरह से मिश्रण ।
    2. एक खुर्दबीन स्लाइड पर कीड़ा निलंबन के 5 µ एल रखो और एक coverslip जगह ध्यान से, सुनिश्चित करना है कि कोई हवा बुलबुले के रूप में ।
    3. नेल पॉलिश और इमेज वॉर्म के साथ coverslip को सील करें ।
      नोट: फिक्सिंग और दाग के बाद, कीड़े बहुत कठोर और पिपेट करने के लिए मुश्किल हो सकता है । इस दरकिनार करने के लिए, अपने सुझावों को काटने से चौड़ा बोर पिपेट बनाते हैं ।
    4. 4 ° c पर एक माइक्रो-केंद्रापसारक रैक में स्लाइड की दुकान अप करने के लिए 24 ज अगर धुंधला के बाद तुरंत इमेजिंग नहीं ।
  6. ओरो-दाग कीड़े की इमेजिंग
    1. छवि ओरो-सना हुआ कीड़े के लिए एक रंग सक्षम कैमरा का प्रयोग करें ।
    2. देखने के एक क्षेत्र में कई कीड़ों छवि के लिए 5x आवर्धन का उपयोग करें ।
    3. व्यक्तिगत कीड़े की बेहतर परीक्षा के लिए 10x इज़ाफ़ा करने के लिए स्विच ।
    4. संपीड़न के कारण डेटा हानि से बचने के लिए TIF स्वरूप में छवियों को निर्यात करें ।
      नोट: अगर ओरो + DAPI के साथ धुंधला, रंग एक है कि प्रतिदीप्ति कब्जा कर सकते है करने के लिए सक्षम कैमरा स्विच ।
  7. ओरो-दाग कीड़े की छवि विश्लेषण
    1. अपलोड micrograph (ओं) को ImageJ । प्लगइंस पुल-डाउन मेनू में, यदि छवि फ़ाइल को पहचाना नहीं गया है, तो बायो-फ़ॉर्मेट फंक्शन का उपयोग करें ।
    2. छवि पुल-डाउन मेनू में, स्टैक्स फ़ंक्शन के अंतर्गत, कई माइक्रोग्राफ की तुलना किए जाने पर चित्र स्टैक बनाने के लिए छवियाँ-से-स्टैक का उपयोग करें.
    3. लिपिड बूंदों की दृश्यता में सुधार करने के लिए एक ही पुल-डाउन मेनू के तहत चमक/कंट्रास्ट समायोजित करें ।
    4. पशुओं के शरीर में या विशिष्ट ऊतकों में लिपिड संचय के अनुसार छवियों को वर्गीकृत ।
    5. लिपिड स्थानीयकरण के बेहतर मूल्यांकन के लिए और ImageJ का उपयोग कर गैर विशिष्ट छवि कलाकृतियों की पहचान के लिए, छवि पुल-डाउन मेनू के तहत रंग समारोह का चयन करें और प्रत्येक आरजीबी घटक के संकेतों को दिखाने के लिए आरजीबी के ढेर पर क्लिक करते हैं ।

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Representative Results

SKN-1 एक bZip, cytoprotective प्रतिलेखन कारक है कि शेयरों समरूपता स्तनधारी NRF2 के साथ और फैटी एसिड ऑक्सीकरण मध्यस्थता करने के लिए दिखाया गया है । उनके आहार में ग्लूकोज एकाग्रता पर निर्भर करता है, एक constitutively सक्रिय के साथ कीड़े skn-1 एलील जब नील लाल7के साथ दाग अलग लिपिड स्तर दिखा. चित्र 1a सी से पता चलता है सक्रिय skn-1 जानवरों की स्थिति है कि लिपिड स्तर में वृद्धि करने के लिए नेतृत्व के संपर्क में । NR प्रतिदीप्ति पर कब्जा कर लिया एक FITC/GFP चैनल आंत के साथ प्रमुख है, लेकिन सिर, पूंछ में dimmer है, और आंत्र लुमेन. के रूप में लिपिड स्तर में वृद्धि, असतत NR-सना हुआ कण और अधिक विचार करना मुश्किल है, जो कम जोखिम समय जरूरत कर सकते हैं । हालांकि इस विधि लिपिड संचय के लिए एक मात्रात्मक प्रॉक्सी के रूप में प्रतिदीप्ति तीव्रता का उपयोग करता है, यह सेलुलर संरचनाओं कि वसा भंडार नहीं कर रहे है और आंत्र ऑटो से संकेत हस्तक्षेप करने के लिए प्रवण है की विशिष्ट धुंधला में भेद पर अपर्याप्त है प्रतिदीप्ति. इसलिए, वैकल्पिक लेबल और गैर लेबल तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए समानांतर में स्पष्ट रूप से तटस्थ लिपिड में पशु10

वसा की आयु पर निर्भर दैहिक कमी (Asdf), एक phenotype है कि वृद्ध कीड़े में होता है जिससे जानवरों के प्रदर्शन दैहिक कोशिका लिपिड कम है, जबकि रोगाणु कोशिका लिपिड अपरिवर्तित बने रहते हैं6. तेल लाल हे धुंधलाना एक तरीका है कि मज़बूती से लिपिड स्तर quantifies नहीं है, लेकिन लिपिड स्थानीयकरण visualizing के लिए उत्कृष्ट है और कीड़ा में Asdf की तरह वसा कमी phenotypes का निर्धारण करने के लिए उपयोगी है । जबकि Asdf की उपस्थिति या अनुपस्थिति के अनुसार कीड़ों को वर्गीकृत करना आसान होता है, ऐसे में मध्यवर्ती वसा हानि (चित्र 2a) के साथ पशुओं की पहचान करना कठिन हो सकता है. गैर-Asdf जानवरों, जो कुछ पारदर्शी क्षेत्रों के साथ शरीर भर में चमकदार लाल दाग दिखाने के लिए की तुलना में (चित्रा 2 बी), Asdf कीड़े आंत्र कोशिकाओं में ध्यान देने योग्य वसा घट (चित्रा 2c) प्रदर्शन । Asdf विकसित करने की प्रक्रिया में पशु (चित्र 2d) अक्सर पारदर्शी धब्बे दिखाने के लिए जहां सबसे अधिक वसा हानि अंततः होता है । इसके अलावा, Asdf कीड़े अभी भी सिर और पूंछ क्षेत्रों में चमकदार लाल दाग की सुविधा हो सकती है क्योंकि phenotype पूरी दैहिक वसा हानि द्वारा परिभाषित नहीं है, लेकिन व्यापक वसा कम करने के सापेक्ष गैर आयु वर्ग के (गैर Asdf) पशुओं । तेल लाल हे धुंधला का उपयोग, इस प्रकार, लिपिड स्थानीयकरण के गुणात्मक दृढ़ संकल्प और phenotypes की पहचान है कि काफी कीड़ा में वसा जमा बदलने के लिए अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्रा 1: नील लाल द्वारा लिपिड के दाग । नील लाल सक्रिय skn-1 के दाग की स्थिति है कि वृद्धि हुई लिपिड संचय (एक-सी) के तहत म्यूटेंट । समारोह के लाभ skn-1 तनाव (lax188) एक E237K एमिनो एसिड प्रतिस्थापन कि renders skn-1 constitutively सक्रिय बंदरगाह । L4-स्टेज कीड़े 0, 15 और 30 J/m2 यूवी-प्रकाश NR-धुंधला और इमेजिंग से पहले एक 12-h वसूली अवधि के बाद unNGM प्लेट्स पर उजागर किया गया । दिखाए गए चित्र phenotype के प्रतिनिधि हैं । लिपिड ठहराव के रूप में धारा 1.7 में वर्णित किया गया था । आग एक ImageJ ऊपर देखो तालिका (LUT) एक थर्मल छवि है कि छवियों के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता मतभेदों से पता चलता है बनाने के लिए इस्तेमाल किया है । विलय FITC/GFP और संयुक्त डिक छवियां दिखाता है । प्रत्येक छवि के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता के ठहराव छवि असेंबल के तल पर दिखाया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: तेल लाल ओ द्वारा लिपिड के दाग । आपन skn-1 म्यूटेंट (lax188) की उपस्थिति या अनुपस्थिति Asdf phenotype (A-D) दिखा रहा है की तेल लाल हे दाग । मध्यवर्ती Asdf phenotypes के साथ एक & डी दिखाएं जानवरों । B & C विपरीत ओरो-धुंधला प्रदर्शन । जबकि बी गैर Asdf है, सी germline वसा संचय, जो Asdf phenotype को परिभाषित करता है में सहवर्ती वृद्धि के साथ पर्याप्त दैहिक वसा कमी से पता चलता है । कीड़े इमेजिंग द्वारा पीछा ओरो के साथ दाग थे 144 hafter L1-सिंक्रनाइज़ जानवरों NGM मीडिया पर रखा OP50 बैक्टीरिया के साथ वरीयता प्राप्त थे । दिखाए गए चित्र जानवरों के साथ या बिना Asdf phenotype के प्रतिनिधि हैं । इनसेट कार्टून लिन, एट अल से संशोधित कर रहे हैं । 6 और अनुपस्थिति का प्रतिनिधित्व करते है (B) या दैहिक वसा की कमी की उपस्थिति (सी) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

मोटापा और चयापचय रोग दर में वृद्धि सी. एलिगेंस एक उपयुक्त मॉडल है कि कोशिकाओं और ऊतकों में वसा संचय को विनियमित तंत्र का अध्ययन करने के लिए बनाता है । हाल के सबूत से पता चलता है कि लिपिड स्तर में परिवर्तन इंसुलिन संकेतन8, हार्मोन रिसेप्टर्स2के सक्रियण, प्रजनन उत्पादन5से लेकर सेलुलर प्रक्रियाओं के साथ संबंधित हैं. लेबल से मुक्त माइक्रोस्कोपी और क्रोमैटोग्राफी तरीकों की तुलना में, नील लाल और तेल लाल हे अपेक्षाकृत सस्ती रंजक लगातार कीड़ा में तटस्थ लिपिड दाग और reproducibly10,12,13के लिए प्रयोग किया जाता है । पहले कुल लिपिड स्तर के ठहराव के लिए अनुमति देता है, जबकि दूसरा hypodermis, आंत, और रोगाणु लाइन जैसे ऊतकों के बीच लिपिड वितरण के मूल्यांकन की सुविधा । जब संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया, NR और ओरो शोधकर्ताओं ने निर्धारित करने के लिए सक्षम कैसे जीनोटाइप और पर्यावरण परिवर्तन लिपिड संचय को प्रभावित और जहां कीड़ा में इन परिवर्तनों को उत्पन्न कर रहे हैं.

इन रंगों, फिर भी, सीधे ही गैर इनवेसिव तरीके में लिपिड संचय का आकलन नहीं है के रूप में कारों माइक्रोस्कोपी12करता है । इसलिए, वे निर्धारण और धुंधला है, जो माप सटीकता13समझौता हो सकता है के दौरान त्रुटियों के लिए प्रवण हैं । इसके अतिरिक्त, इन रंगों अनजाने lipofuscin और आंत्र granules के साथ बातचीत कर सकते हैं, intracellular तटस्थ वसा स्टोर करने के लिए असंबंधित प्रतिदीप्ति में जिसके परिणामस्वरूप10,14। इसके अतिरिक्त, मामलों में जहां लिपिड स्तर कम दिखाई देते हैं, NR और ओरो धुंधला अगर परिणाम पारगम्यता मुद्दों या कम वसा संचय से परिणाम नहीं कर सकते. इसके अलावा, प्रकाश के लिए इन दाग की संवेदनशीलता भंडारण और सक्रिय हैंडलिंग के दौरान विशेष उपायों की आवश्यकता है कि सीमा क्षरण और फोटो ब्लीचिंग । हालांकि, अगर सावधानी व्यायाम जब प्रदर्शन और लेबल से निष्कर्ष ड्राइंग आधारित परख, NR और ओरो धुंधला है आगे आनुवंशिक स्क्रीन के उत्कृष्ट साधन के लिए लिपिड चयापचय रास्ते का अध्ययन कर रहे है और अंय शारीरिक के साथ अपने संबंधों की जांच कार्यों. डीएएफ-2 और वसा-6 कीड़े के उपयोग की सिफारिश की है के सापेक्ष तुलना करने के लिए वृद्धि हुई है और कम लिपिड संचय, क्रमशः । धोने और NR और ओरो धुंधला के लिए चरणों का निर्धारण समान हैं । इसलिए दोनों एक ही दिन पर प्रदर्शन कर सकते हैं । हालांकि, केवल ओरो-दाग कीड़े के साथ स्लाइड बाद में इमेजिंग के लिए संग्रहीत किया जा सकता है क्योंकि NR धुंधला 6 घंटे के बाद असंगत है । धोने के दौरान, यह ट्राइटन 100 एक्स शामिल करने के लिए न केवल NR और ओरो को पारगम्यता बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है, लेकिन यह भी plasticware के लिए अत्यधिक पालन के कारण कीड़ा नुकसान से बचने के लिए. इसके अतिरिक्त, कीड़े के लिए प्रत्येक दाग को अधिकतम पारगम्यता सुनिश्चित करने के लिए दाग से कम 30 मिनट से धोया जाना चाहिए । जबकि NR और ओरो गर्मी बार 1 ज और 30 मिनट, क्रमशः के लिए कम हो सकता है, यह समय का पालन करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है और लगातार धुंधला और इमेजिंग परिणामों के लिए इस लेख में सुझाव दिया । उपयोग करने से पहले प्रकाश और फिल्टर ओरो समाधान करने के लिए विफलता के लिए NR समाधान के लंबे समय तक जोखिम इमेजिंग के दौरान पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति वृद्धि होगी. इन दाग प्रोटोकॉल बाहर ले जाने के लिए इमेजिंग समय के अलावा 3-4 एच की आवश्यकता है । हालांकि दाग गर्मी चरणों के बीच ठहराव के सबसे 2 ज पर प्रदान करता है, यह दृढ़ता से सिफारिश की है कि प्रोटोकॉल के रूप में कुछ रुकावट के साथ किया जाता है के रूप में संभव त्रुटि के कई स्रोतों को कम करने के लिए निहित सभी डाई आधारित लिपिड ठहराव के तरीकों और परीक्षा.

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम NIH ग्रांट द्वारा ही संभव किया गया था: R01GM109028 (S.P.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Oil red O Alfa Aesar A12989 Lipid Stain
DAPI Thermo Fisher D1306 DNA stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
0.2 µm seterile syringe filter VWR 28145-477 Cellulose acetate filter
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Shaker Rotisserie Lab Quake 400110Q Shaker
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator
K2HPO4 Sigma-Aldrich 7758-11-4 NGM
KH2PO4 Sigma-Aldrich 7778-77-0 NGM
MgSO4 Alfa Aesar 7786-30-3 NGM
CaCl2 Sigma-Aldrich 10035-04-8 NGM
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 NGM
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 NGM
Peptone BD Biosciences 211677 NGM
Agar Teknova L9110 NGM
LB media Sigma-Aldrich L3147 Bacterial growth

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References

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