Kvantifiering av Lipid överflöd och utvärdering av Lipid Distribution i Caenorhabditis elegans av Nile rött och olja röd O färgning

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nile röda färgning av fasta Caenorhabditis elegans är en metod för kvantitativ mätning av neutrala lipid insättningar, medan olja röd O färgning underlättar kvalitativ bedömning av lipid fördelning mellan vävnader.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (133), e57352, doi:10.3791/57352 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Caenorhabditis elegans är en enastående modellorganism där studera lipidmetabolismen och energi homeostas. Många av dess lipid gener bevaras hos människor och är associerade med metabolt syndrom eller andra sjukdomar. Undersökning av lipid ackumulering i denna organism kan utföras av fixativ färgämnen eller etikett-fria metoder. Fixativ fläckar som Nilen röd och olja röd O billig, pålitlig sätt att kvantitativt mäta lipidnivåer och kvalitativt iaktta lipid distribution i vävnader, respektive. Dessutom tillåta dessa fläckar för high-throughput screening av olika lipid metabolism gener och vägar. Dessutom sin hydrofoba natur underlättar lipidlöslighet, minskar samspel med omgivande vävnader och förhindrar dissociation i lösningsmedlet. Även om dessa metoder är effektiva på att undersöka allmänna fettinnehållet, ger de inte detaljerad information om den kemiska sammansättningen och mångfalden av lipid insättningar. För dessa ändamål, etikett-fria metoder såsom GC-MS och bilar mikroskopi är bättre lämpade, sina kostnader utan hinder.

Introduction

Lipider är väsentliga för livet. De är integrerade delar av membran, fungera som sekundära budbärare och signalera givare har avgörande funktioner i energilagring. När lipidmetabolismen dysreglerad, leder det till sjukdomar som fetma och diabetes typ II, som trycka på folkhälsan oro9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) är en utmärkt modellorganism som att studera lipidmetabolismen eftersom den har relativt kort livslängd, en transparent kropp, en känd cell härstamning och ett fullt sekvenserat genomet. Primärt en hermafrodit, C. elegans tillåter forskare att höja stort antal syngena djur kort tid för att utföra hög genomströmning framåt genetiska skärmar för att studera en rad olika metaboliska gener och vägar4. Denna strategi har visat en hög grad av bevarande i 273 C. elegans lipid metabolism gener bland människor, möss, råttor och drosophila. Över 300 lipid gener i C. elegans har dessutom mänskliga orthologues som är associerade med sjukdomar orelaterade till metabola syndromet11. Granskning av lipid lagring i C. elegans har traditionellt, främst förlitat sig på dye-märkt analyser, som ger robust information om lipid ackumulering. Mindre vanliga är en beskrivning av där lipider lokalisera och uppmätta skillnader i lipid överflöd över vävnader. Senaste arbete har dock visat att lipid fördelning kan vara lika viktigt som lipid ackumulering6.

Nyligen, studier har börjat integrera metoder såsom högpresterande liquid chromatography-masspektrometri (HPLC-MS), gaskromatografi-masspektrometri (GC-MS), och sammanhängande anti-stokes Raman spridning (bilar) mikroskopi till adress den bristerna i fläcken tillvägagångssätt genom att direkt analysera innehållet i lipid extrakt, särskilda lipid bråk och lipid insättningar, respektive10,11. BILAR mikroskopi har dessutom avslöjat att Nilen red endast kan fungera som en proxy för ansamling av fett när den används som ett fixativ färgämne, för dess användning som en vital fläcken leder till off-target färgning av auto-fluorescerande organeller10. Men det krävs teknisk expertis och kostnader i samband med dessa kromatografi och mikroskopi metoder gör deras användning ohållbar för många forskningsfrågor. I den här artikeln diskuterar vi en bekväm och pålitlig metod för att fixera och fläcken neutrala lipid insättningar i C. elegans med Nile röd och olja röd O för att skilja lipid överflöd i hela djur och i specifika vävnader.

Nile röd, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, är en benzophenoxazone färgämne som lätt löser sig i olika organiska lösningsmedel, men mestadels är olöslig i vatten. Det är en utmärkt lysochrome färgämne brukade färga neutrala lipider som triglycerider eller kolesterol estrar eftersom det finns en stark färg, solubilizes väl i lipider, har försumbar interaktion med omgivande vävnader och är mindre lösligt i lösningsmedlet än i lipider. Den har en excitation och utsläpp maxima 450-500 och 520 nm, respektive1. När Nilen röd-färgade C. elegans är ses för grön fluorescens, kan diskreta lipid organ observeras i hela tarmen och andra vävnader antingen i kluster eller jämnt spridda, beroende på djurets genotyp eller experimentell behandling 7.

Olja röd O är en lysochrome, fettlösligt färgämne som används för att färga triglycerider och lipoproteiner. Det kallas en azofärg eftersom dess kemiska struktur innehåller två azogrupper bifogas tre aromatiska ringar. Det är svårt att jonisera, som återger det lättlösligt i lipider. Dess fläck färg är röd och dess ljus absorptionsmaximum är 518 nm 3. C. elegans målat med olja röd O Visa röda lipid droppar som sticker ut mot djurets transparent kropp, vilket underlättar kvalitativ bedömning av lipid fördelning mellan olika vävnader6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nilen röd (NR) färgning av lipider

  1. Beredning av 5 mg/mL NR stamlösning
    1. I en 500 mL flaska, lägga till 100 mg NR pulver 200 mL 100% aceton.
    2. Täcka flaskan med aluminiumfolie att undvika eventuella exponering för ljus.
    3. Rör om lösningen för 2 h i mörkret före användning.
    4. För långtidsbehandling, förvara NR stamlösning i en tätslutande flaska utan någon ljusexponering. Skala NR stamlösning enligt forskningsbehov. Se till att samma stamlösningen används över NR-färgning experiment för att få konsekvent färgning och imaging resultat.
  2. Beredning av NR fungerande lösning
    1. För varje 1 mL 40% isopropanol (v/v), tillsätt 6 µL NR stamlösning.
    2. Förbereda 600 µL NR fungerande lösning för varje prov.
      Notera: Se färska NR arbeta lösning rätt innan färgning. Beroende på NR stamlösning behov, Använd antingen en 15 mL eller 50 mL graderad koniska rör.
  3. Preparering av maskar för NR lipid färgning
    1. Växa maskar till L4 tidigt vid 20 ° C på nematoder odlingsmedium (NGM) ympats med sena-log OP50 E. coli.
    2. Tvätta maskar av plattan med 1 mL 1 x fosfatbuffrad koksaltlösning + 0,01% Triton x-100 (PBST) lösning och sätta mask suspensionen i en 1,5 mL mikrofugrör.
    3. Centrifugera maskar vid 560 x g i 1 min. ta bort supernatanten och upprepa detta steg tills E. coli rensas från suspension.
    4. Tillsätt 100 µL av 40% isopropanol till mask pelleten och inkubera det i rumstemperatur i 3 min.
    5. Centrifugera maskar på 560 x g för 1 min och avlägsna supernatanten utan att störa pelleten mask.
      Obs: Använd högre volymer av PBST att tvätta maskar av plattorna om använder större tallrikar eller färgning fler maskar per platta. Tvätta inte maskar i PBST mer än 15 min innan provet fixering. Utföra ytterligare tvättar om supernatanten inte rensas av bakterier. Genomföra inkubering i 40% isopropanol med en nutator eller rocker. Alltid övervaka rören för att kontrollera hela provet upprördhet inträffar.
  4. Lipid färgning med NR
    1. I mörkret, tillsätt 600 µL NR fungerande lösning i varje prov. Invertera rören tre gånger och fullt blanda maskar i NR lösning.
    2. Rotera provet mörkt vid rumstemperatur för 2 h.
    3. Efter inkubering, Centrifugera maskar på 560 x g för 1 min och avlägsna supernatanten.
    4. Tillsätt 600 µL PBST och inkubera proverna i mörkret för 30 min att ta bort överflödig NR fläcken.
    5. Centrifugera proverna på 560 x g för 1 min och ta bort alla utom cirka 50 μl av supernatanten.
      Obs: NR inkubation inte kräver agitation. Reglerandet av maskar är vanligt under detta steg.
  5. Beredning av diabilder för Mikroskop imaging
    1. Återsuspendera pelleten mask i återstående supernatanten.
    2. Placera 5 µL mask suspension på ett objektglas och sätta ett täckglas på noggrant undvika svällning eventuella luftbubblor.
    3. Sigill på täckglaset med nagellack innan imaging maskar.
    4. Förbereda endast ett par bilder på en gång. Detta kommer att säkerställa NR imaging förblir konstant över prover. Kvaliteten på NR-färgade bilder minskar efter 6 h. diskret lipid droppar är svåra att observera och bakgrunden fluorescens ökar, vilket stör NR signaldetektion.
  6. Avbildning av NR-färgade maskar
    1. Bild maskar på 5 X förstoring att fånga flera djur per synfält.
    2. Växla till 10 X förstoring för bättre kvantifiering av enskilda maskar.
    3. Använd FITC/GFP kanal till bild NR-färgade maskar och prova olika exponeringstider att fastställa optimala förutsättningar för kvantifiering.
    4. Spara filer i TIF-format för att undvika att förlora data på grund av komprimering.
      Obs: Typisk exponering gånger alltifrån 100-1000 ms. har en optimal exponeringstid, använda den för alla prover för att upprätthålla en tänkbar konsekvens.
  7. NR färgning bild kvantifiering
    1. Ladda upp micrographs till ImageJ. I menyn Plugins pull-down funktionen Bio-format om bildfilen inte kan identifieras.
    2. I bilden använda nedrullningsbara menyn under funktionen stackar, bilder-till-Stack för att skapa en bildstapel när flera micrographs jämförs.
    3. I samma nedrullningsbara menyn Justera ljusstyrka/kontrast i bilden stack och sprid ändringar till alla bilder genom att klicka på Verkställ.
    4. Anställa Polygon markeringsverktyget att avgränsa varje avbildad mask och använda funktionen åtgärd under menyn analys nedrullningsbara för att kvantifiera fluorescensintensiteten som avges av NR.
    5. För varje bild, mäta fem bakgrund platser och beräkna genomsnittliga bakgrund fluorescensintensiteten.
    6. Subtrahera bakgrunden fluorescensintensiteten från varje avbildad mask med hjälp av formeln N = G - (A x B), där N står för net fluorescens, G för brutto fluorescens, A för totala mask område och B för genomsnittliga bakgrund fluorescens.
    7. För att normalisera fluorescensintensiteten av mask storlek, dela varje maskens netto fluorescens av dess totala areal. Resultaten redovisas som fluorescensintensiteten, i godtyckliga enheter (a.u.), per pixel.
      Obs: Undvik att exportera bilder i JPEG-format. Medan komprimering gör filerna mer lätthanterligt att lagra, äventyras dataintegriteten av detta format. Kontrollera att alla bilder är modifierad och analyseras identiskt. Kom ihåg att inkludera en skala bar för att rätt värdera storlek vid olika förstoringar. För att bättre visualisera skillnader i fluorescensintensiteten använder ImageJ, växeltyp bild från RGB till 8-bitars och välj eld från menyn bild lookup tabeller (LUT). Detta skapar en intensitetskarta bild i vilken ökad färg ljusstyrka korrelerar med ökad fluorescensintensiteten.

2. olja röd O färgning (ORO) av lipider

  1. Beredning av ORO stamlösning
    1. I en 250 mL flaska, tillsätt 500 mg ORO pulver till 100 mL 100% isopropanol och blanda väl.
    2. När förberett, förvaras i tättslutande utan ljus exponering.
  2. Beredning av ORO fungerande lösning
    1. Späd ORO stamlösning i vatten (3:2) till 60% isopropanol.
    2. Före användning, filtrera ORO arbetslösning genom ett 0,2 µm cellulosaacetat steril spruta filter.
      Obs: För bästa lösning kvalitet, förbereda arbetslösning ORO dagen innan och låta den blanda över natten. Dock om lösning behövs samma dag, späd och blanda ORO lösning på en rocker för minst 2 h före användning. Innan gungande, Linda koniska rör i paraffin tejp för att undvika läckage av ORO lösning.
  3. Preparering av maskar för ORO lipid färgning
    1. Växa maskar vid 20 ° C på nematoder odlingsmedium (NGM) ympats med sena-log OP50 E. coli till önskad levnadsstadier.
    2. Tillsätt 1 mL PBST lösning till plattan och snurra tills alla maskar är avstängda plattan. Luta plattan och tvätta det med 1 mL PBST. Överför masken till ett 1,5 mL mikrofugrör.
    3. Centrifugera maskar vid 560 x g i 1 min. avlägsna supernatanten utan att störa den pellet och upprepa tvättningen steg med 1 mL PBST tre gånger. Ta bort alla supernatant men 100 µL.
    4. Lägga till 600 µL av 40% isopropanol i masken pelleten och rock det i rumstemperatur i 3 min.
    5. Centrifugera maskar på 560 x g för 30 s och ta bort alla supernatant men 100 µL utan att störa pelleten mask.
      Obs: Använd högre volymer av PBST för att tvätta maskar av plattor om gör hög genomströmning färgning. Tvätta inte maskar i PBST mer än 15 min före provet fixering. Göra ytterligare tvättar om supernatanten inte rensas av bakterier. Genomföra inkubation i 40% isopropanol med en nutator eller rocker. Alltid övervaka rören så att hela provet upprördhet inträffar.
  4. Lipid färgning med ORO
    1. Lägga till 600 µL ORO fungerande lösning till varje prov. Vänd röret tre gånger och blanda maskar väl i ORO.
    2. Rotera proverna vid 30 rpm för 2 h i rumstemperatur.
    3. Centrifugera proverna på 560 x g för 1 min och eliminera alla supernatant men 100 µL.
    4. Återsuspendera proverna i 600 µL av PBST och rotera rören vid 30 rpm för 30 min att ta bort överflödig ORO fläcken.
    5. Centrifugera proverna på 560 x g för 1 min och eliminera alla utom 50 μl av supernatanten.
    6. För att bättre skilja platsen för djurets könsceller och intestinala celler, fläcken atomkärnor genom att lägga till 1 µL (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) för varje 1 mL arbetslösning ORO. Genomföra ORO färgning för 2 h med att lägga DAPI före montering diabilder för avbildning. Intestinal kärnorna är större i storlek och gonad kännetecknas av de utveckla könscellerna.
      Obs: Efter ORO färgning, maskar kan följa sidor som mikrofugrör och misslyckas att bilda en märkbar pellet. Om detta händer, centrifugeras maskar igen eller tillåta maskar sedimentera självtryck i minst 10 min.
  5. Förberedelse av bilderna för mask imaging
    1. Återsuspendera maskar i återstående supernatanten och blanda lösningen väl.
    2. Sätt 5 µL mask suspension på ett objektglas och placera ett täckglas noga, se till att inga luftbubblor form.
    3. Sigill på täckglaset med nagellack och bild maskar.
      Obs: Efter fastställande och färgning, maskar kan vara mycket stela och svåra att Pipettera. För att kringgå detta, göra wide-bore pipetter genom att skära av deras tips.
    4. Lagra bilder i en mikro-centrifug rack vid 4 ° C i upp till 24 h om inte imaging omedelbart efter färgning.
  6. Avbildning av ORO-färgade maskar
    1. Använda en färg-kapabel kamera bild ORO-färgade avmaskar.
    2. Använd 5 X förstoring till bild flera maskar i ett synfält.
    3. Växla till 10 X förstoring för bättre granskning av enskilda maskar.
    4. Exportera bilder i TIF-format för att undvika dataförlust på grund av komprimering.
      Obs: Om färgning med ORO + DAPI, växla färg-kompatibla kameran så att den kan fånga fluorescens.
  7. Bildanalys av ORO-färgade maskar
    1. Ladda upp micrograph(s) till ImageJ. I menyn Plugins pull-down funktionen Bio-format om bildfilen inte kan identifieras.
    2. I bilden använda nedrullningsbara menyn under funktionen stackar, bilder-till-Stack för att skapa en bildstapel när flera micrographs jämförs.
    3. Justera intensitet/kontrast under samma nedrullningsbara menyn att förbättra synligheten för lipid droppar.
    4. Kategorisera bilderna enligt lipid ackumulering i hela djurets kropp eller i specifika vävnader.
    5. För bättre utvärdering av lipid lokalisering och för identifiering av icke-specifika bildartefakter använder ImageJ, Välj funktionen färg enligt bild pull-down-menyn och klicka på Stack till RGB Visa signaler från varje RGB-komponent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SKN-1 är en bZip, cytoprotektiva transkriptionsfaktor som delar homologi med däggdjur NRF2 och har visat att medla fettsyra oxidation. Beroende på glukos koncentration i kosten Visa worms med ett konstitutivt aktiverade skn-1 -allelen olika lipidnivåer när färgas med Nile röd7. Figur 1A -C visar aktiverat skn-1 djur utsätts för förhållanden som leder till ökande lipidnivåer. NR fluorescens fångas med en FITC/GFP-kanal är framträdande längs tarmen, men är dimmer i huvud, svans och intestinala lumen. När lipidnivåer ökar, är diskreta NR-färgade partiklar svårare att urskilja, som kan kräva lägre exponering gånger. Även om denna metod använder fluorescensintensiteten som kvantitativa proxy för lipid ackumulering, det är otillräcklig på skilja ospecifik färgning av cellulära strukturer som inte är fettdepåer och är benägna att signalera störningar från intestinal auto fluorescens. Därför måste alternativa etikett och icke-etikett metoder användas parallellt att otvetydigt kvantifiera neutrala lipider i djurens10.

Åldersberoende somatiska utarmning av fett (Asdf), är en fenotyp som uppstår i år maskar whereby djur Visa minskade somatisk lipider, medan bakteriecellen lipider förbli oförändrad6. Olja röd O färgning är inte en metod som tillförlitligt kvantifierar lipidnivåer, men är utmärkt för att visualisera lipid lokalisering och är användbart för att bestämma fett utarmning fenotyper som Asdf i masken. Det är lätt att kategorisera maskar enligt närvaron eller frånvaron av Asdf, kan det vara svårt att identifiera djur med mellanliggande fettförbränning (figur 2A). Asdf maskar jämfört med icke-Asdf djur, som visar ljusa röda fläckar över hela kroppen med några genomskinliga områden (figur 2B), och uppvisar märkbar fett utarmning i intestinala celler (figur 2 c). Djur håller på att utveckla Asdf (figur 2D) ofta visar genomskinliga ställen där de flesta fettförbränning så småningom uppstår. Asdf maskar kan dessutom fortfarande har ljusa röda färgning i regionerna huvud och svans eftersom fenotypen inte definieras genom komplett somatisk fettförbränning, men genom omfattande fett utarmning i förhållande till icke-åldern (icke-Asdf) djur. Användningen av olja röd O färgning, möjliggör således, kvalitativ bestämning av lipid lokalisering och identifiering av fenotyper som väsentligen ändrar fettdepåer i masken.

Figure 1
Figur 1: färgning av lipider av Nile red. Nile röda färgning av aktiverad skn-1 mutanter under förhållanden som framkallar ökad lipid ackumulering (A-C). Förstärkningen av funktionen skn-1 stam (lax188) hamnar en E237K aminosyra ersättning som återger SKN-1 konstitutivt aktiv. L4-scenen maskar exponerades för 0, 15 och 30 J/m2 UV-ljus följt av en 12-h återhämtningsperiod på unseeded NGM tallrikar innan NR-färgning och imaging. Bilderna som visas är representativa för fenotypen. Lipid kvantifiering utfördes som nämns i avsnitt 1.7. Fire är en ImageJ look up table (LUT) används för att skapa en värmebild som visar fluorescens intensitet skillnaderna mellan bilderna. Sammanfoga visar FITC/GFP och DIC bilder kombineras. Kvantifiering av fluorescensintensiteten för varje bild visas längst ned i bild montage. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: färgning av lipider av olja röd O. Olja röd O färgning av aktiverad skn-1 mutanter (lax188) visar närvaron eller frånvaron av Asdf fenotypen (A-D). A & D Visa djur med mellanliggande Asdf fenotyper. B & C visar motsatt ORO-färgning. Medan B är icke-Asdf, visar C betydande somatisk fett utarmning med samtidig ökning i könsceller ansamling av fett, som definierar den Asdf fenotypen. Maskarna var målat med ORO följt av imaging 144 hafter L1-synkroniserad djur placerades på NGM media seedade med OP50 bakterier. Bilderna som visas är representativa för djur med eller utan Asdf fenotypen. Infälld karikatyrerna ändras från Lynn, o.a. 6 och representerar avsaknaden (B) eller (C) förekomsten av somatiska fett utarmning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ökningen av fetma och metabola sjukdomar priser gör C. elegans en lämplig modell för att studera de mekanismer som reglerar fettansamling i celler och vävnader. Nyligen tyder på att förändringar i lipidnivåer är korrelerade med cellulära processer alltifrån insulin signalering8, aktivering av hormon receptorer2, att reproduktionskapaciteten5. Röd O jämfört med etikett-fri mikroskopi och kromatografiska metoder, Nile röd och olja och är relativt billig färgämnen används för att färga neutrala lipider i masken konsekvent och reproducibly10,12,13. Först möjliggör kvantifiering av totala lipidnivåer, medan andra underlättar utvärderingen av lipid fördelning mellan vävnader såsom hypodermisna, tarmen och könscellernas utvecklingskedja. När används tillsammans, kan NR och ORO forskarna avgöra hur genotyp och miljöförändringar påverkar lipid ackumulering och där dessa förändringar sker i masken.

Dessa färgämnen, dock bedömer direkt inte lipid ackumulering på samma icke-invasivt sätt som gör bilar mikroskopi12. Därför, de är benägna att fel under fixering och färgning, vilket kan äventyra mätning noggrannhet13. Dessutom, dessa färgämnen oavsiktligt kan interagera med lipofuscin och intestinal granulat, vilket resulterar i fluorescens obesläktad till intracellulära neutral fett lagrar10,14. Dessutom i fall där lipidnivåer visas låg, NR och ORO färgning kan inte skilja på om resultatet resultat från permeabilitet problem eller minskad fettansamling. Dessutom kräver dessa fläckar till ljus känslighet särskilda åtgärder under lagring och aktiv hantering som begränsar den nedbrytning och foto blekning. Dock om försiktighet utövas när utför och dra slutsatser från etikettbaserade analyser, NR och ORO färgning är utmärkta medel för framåt genetiska skärmar att studera lipid metabolism vägar och undersöka deras interaktioner med andra fysiologiska funktioner. Användning av daf-2 och fett-6 maskar rekommenderas att göra relativa jämförelser av ökad och minskad lipid ackumulering, respektive. Tvätt och fixerande steg för NR och ORO färgning är likartade. Båda kan därför utföras samma dag. Dock kan bara bilder med ORO-färgade maskar lagras för imaging senare eftersom NR färgning är inkonsekvent efter 6 h. Under tvätten är det viktigt att inkludera Triton 100-X inte bara att öka permeabiliteten NR och ORO, men också att undvika mask på grund av överdriven adherencen till plasticware. Dessutom tvättas maskar mindre än 30 min före färgning för att säkerställa högsta permeabilitet för varje fläck. Medan NR och ORO inkubationstider får minskas till 1 h och 30 min, respektive, uppmuntras det att följa den tid som föreslås i denna artikel för mer konsekvent färgning och imaging resultat. Långvarig exponering av NR lösning för ljus och underlåtenhet att filtrera ORO lösning innan användningen kommer att öka bakgrunden fluorescens under imaging. Utför dessa färgprotokollen kräver 3-4 h utöver imaging tid. Även om fläcken inkubering erbjuder högst 2 h med paus mellan stegen, det rekommenderas starkt att protokollen utförs med så få avbrott som möjligt för att minska de många felkällor som inneboende alla färgämnet-baserade metoder av lipid kvantifiering och undersökning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete har gjorts möjlig genom NIH bidraget: R01GM109028 (S.P.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Oil red O Alfa Aesar A12989 Lipid Stain
DAPI Thermo Fisher D1306 DNA stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
0.2 µm seterile syringe filter VWR 28145-477 Cellulose acetate filter
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Shaker Rotisserie Lab Quake 400110Q Shaker
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator
K2HPO4 Sigma-Aldrich 7758-11-4 NGM
KH2PO4 Sigma-Aldrich 7778-77-0 NGM
MgSO4 Alfa Aesar 7786-30-3 NGM
CaCl2 Sigma-Aldrich 10035-04-8 NGM
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 NGM
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 NGM
Peptone BD Biosciences 211677 NGM
Agar Teknova L9110 NGM
LB media Sigma-Aldrich L3147 Bacterial growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, (3), 965-973 (1985).
  2. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122, (6), 749-752 (2009).
  3. Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. BIOS Scientific Publishers. (2002).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50, (21), 4774-4807 (2011).
  5. Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9, (6), 2180-2191 (2014).
  6. Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112, (50), 15378-15383 (2015).
  7. Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
  8. Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414, (6865), 799-806 (2001).
  9. Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
  10. Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5, (9), e12810 (2010).
  11. Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14, (1), 164 (2013).
  12. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21, (5), 585-590 (2011).
  13. Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
  14. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, (5), 430-435 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics