Kvantifisering av Lipid overflod og evaluering av Lipid distribusjon i Caenorhabditis elegans av Nilen rød og olje Red O flekker

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Nilen røde flekker av fast Caenorhabditis elegans er en metode for kvantitativ måling av nøytrale lipid innskudd, mens olje røde O flekker forenkler kvalitativ vurdering av lipid fordeling mellom vev.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (133), e57352, doi:10.3791/57352 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Caenorhabditis elegans er en utmerket modell organisme i å studere lipid metabolisme og energi homeostase. Mange av sine lipid gener er bevart i mennesker og er tilknyttet Metabolsk syndrom eller andre sykdommer. Undersøkelse av lipid akkumulering i denne organismen kan utføres av etappe, den stabiliserende fargestoffer eller etikett-fri metoder. Etappe, den stabiliserende flekker som Nile rød og olje røde O er rimelige, pålitelige måter å måle kvantitativt lipid nivåer og kvalitativt observere lipid distribusjon over vev, henholdsvis. Videre gir disse flekker høy gjennomstrømming screening av ulike lipid metabolisme gener og veier. I tillegg sine hydrofobe natur forenkler lipid løselighet, reduserer interaksjon med omkringliggende vev, og hindrer dissosiasjon i løsemiddelet. Disse metodene er effektiv på å undersøke de generelle lipid innhold, gir de ikke detaljert informasjon om kjemisk sammensetning og mangfoldet av lipid innskudd. For disse formål, etikett-fri metoder som GC-MS og biler mikroskopi er bedre egnet, kostnadene til tross.

Introduction

Lipider er avgjørende for liv. De er integrert komponenter i membraner, fungere som sekundær budbringere og signalisere transduktorer, og har viktige funksjoner i energilagring. Når lipid metabolisme er dysregulated, fører det til sykdommer som fedme og type II diabetes, som trykker offentlig helse bekymringer9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) er en utmerket modell organisme i å studere lipid metabolisme fordi den har en relativt kort livssyklus, en transparent kropp, en kjent celle avstamning og et fullt sekvensert genom. Først og fremst en Hermafroditt, C. elegans tillater forskere å heve store mengder isogenic dyr i korte perioder carryout høy gjennomstrømming frem genetisk skjermene å studere en rekke metabolske gener og veier4. Denne tilnærmingen har avsløre en høy grad av bevaring i 273 C. elegans lipid metabolisme gener blant mennesker, mus, rotter og drosophila. Videre har over 300 lipid gener i C. elegans menneskelige orthologues som er knyttet til sykdommer relatert til Metabolsk syndrom11. Tradisjonelt er undersøkelse av lipid lagring i C. elegans hovedsakelig basert på fargestoff-merket analyser, som gir robust opplysninger lipid akkumulering. En beskrivelse av hvor lipider lokalisere og målt forskjeller i lipid overflod er over vev. Men har nyere arbeid avdekket at lipid distribusjon kan være like viktig som lipid akkumulering6.

I det siste, studier har begynt å integrere metoder som høy ytelse flytende kromatografi-massespektrometri (såkalt HPLC-MS), gass kromatografi-massespektrometri (GC-MS), og sammenhengende anti-stokes Raman spredning (biler) mikroskopi adresse i mangler av flekken tilnærminger av direkte analysere innholdet av lipid ekstrakter, bestemte lipid fraksjoner og lipid innskudd, henholdsvis10,11. Videre har biler mikroskopi avdekket at Nilen røde kan bare tjene som en proxy for fett ansamling når den brukes som en etappe, den stabiliserende fargestoff, for sin bruk som en viktig flekken fører til off-målet farging av auto-fluorescerende organeller10. Men de nødvendige tekniske kompetanse og kostnadene forbundet med disse kromatografi og mikroskopi metoder gjør bruken uholdbar for mange forskning spørsmål. I denne artikkelen diskutere vi en praktisk og pålitelig metode for å fixate og flekken nøytral lipid innskudd i C. elegans bruker Nilen rød og olje røde O for å skille lipid overflod i hele dyr og bestemt vev.

Nilen rød, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, er en benzophenoxazone farge som lett oppløses i ulike organiske løsemidler, men er mest uløselig i vann. Det er en utmerket lysochrome fargestoff brukt stain nøytral lipider som triglyserider eller kolesterol estere fordi den har en sterk farge, solubilizes i lipider, har ubetydelig samhandling med omkringliggende vev, og mindre løselig i løsemiddelet enn i lipider. Den har en eksitasjon og utslipp maxima 450-500 og 520 nm, henholdsvis1. Nilen rød-farget C. elegans er sett til grønne fluorescens, kan diskret lipid organer observeres under tarmen og andre vev enten i grupper eller jevnt spredt, avhengig av dyrets genotype eller eksperimentell behandling 7.

Olje røde O er en lysochrome, fettløselige fargestoff brukes stain triglyserider og lipoproteiner. Det kalles en azo fargestoff fordi den kjemiske strukturen inneholder to azo grupper knyttet til tre aromatiske ringer. Det er vanskelig å ionisere, noe som gjør det svært løselig i lipider. Dens lys absorpsjon maksimal er 518 nm 3flekken fargen er rød. C. elegans farget med olje røde O Vis røde lipid dråper som skiller seg ut mot dyr transparent kropp, som muliggjør kvalitativ vurdering av lipid fordeling mellom forskjellige vev6.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Nilen rød (NR) flekker av lipider

  1. Utarbeidelse av 5 mg/mL NR lagerløsning
    1. I en 500 mL flaske, legge 100 mg av NR pulver til 200 mL 100% aceton.
    2. Dekk flasken med aluminiumsfolie for å unngå noen eksponering for lys.
    3. Før bruk, rør løsningen for 2t i mørket.
    4. For langsiktig bruk, kan du lagre NR lager løsningen i en tett forseglet flaske uten noen lyseksponering. Skalere NR lagerløsning etter behov. Sikre at den samme lager løsningen brukes over NR flekker eksperimenter konsekvent flekker og imaging resultater.
  2. Utarbeidelse av NR fungerende løsning
    1. For hver 1 mL av 40% isopropanol (v/v), legge 6 µL av NR lagerløsning.
    2. Klargjør 600 µL av NR fungerende løsning for hvert utvalg.
      Merk: Kontroller frisk NR arbeider løsning rett før farging. Avhengig av NR lagerløsning behov, kan du bruke en 15 mL eller 50 mL uteksaminert konisk rør.
  3. Utarbeidelse av ormer for NR lipid flekker
    1. Vokse ormer tidlig L4 scenen på 20 ° C på Rundormer vekst medium (NGM) plantet med sen-log OP50 E. coli.
    2. Vask ormer av platen med 1 mL 1 x fosfat-bufret saline + 0,01% Triton X-100 (PBST) løsning og ormen suspensjon innlegge en 1,5 mL microfuge tube.
    3. Sentrifuger ormer 560 x g i 1 Fjern nedbryting og gjenta dette trinnet til E. coli fjernes fra suspensjon.
    4. Legge til 100 µL av 40% isopropanol ormen pellets og ruge det ved romtemperatur for 3 min.
    5. Sentrifuge ormer 560 x g for 1 min og fjerne nedbryting uten å forstyrre ormen pellets.
      Merk: Bruk større mengder PBST å vaske ormer av platene hvis bruker større plater eller flekker mer ormer per plate. Ikke vask ormer i PBST mer enn 15 min før eksempel fiksering. Utføre flere vasker hvis nedbryting ikke fjernes av bakterier. Utføre inkubasjon i 40% isopropanol bruker en nutator eller rocker. Alltid overvåke rør for å sikre full prøve agitasjon skjer.
  4. Lipid farging med NR
    1. I mørket, legge 600 µL av NR fungerende løsning til hvert utvalg. Invertere rør tre ganger og fullt ut blande ormer i NR løsning.
    2. Rotere prøven i mørket ved romtemperatur for 2T.
    3. Etter inkubasjon, sentrifuge ormer 560 x g for 1 min og fjerne nedbryting.
    4. Legg til 600 µL av PBST og ruge prøvene i mørket 30 min fjerner overflødig NR stain.
    5. Sentrifuge prøvene 560 x g for 1 min, og fjerne alle bortsett fra ca 50 µL av nedbryting.
      Merk: NR inkubasjon krever ikke agitasjon. Bosetting av ormer er vanlig i dette trinnet.
  5. Utarbeidelse av lysbilder for mikroskop bildebehandling
    1. Resuspend orm pellet i gjenværende nedbryting.
    2. Plasser 5 µL av ormen suspensjon på et mikroskop lysbilde og sette en dekkglassvæske på nøye unngå overlapping eventuelle luftbobler.
    3. Forsegle dekkglassvæske med neglelakk før imaging ormer.
    4. Forberede bare et par lysbilder samtidig. Dette vil sikre NR imaging forblir konstant over prøver. Kvaliteten på NR-farget bilder avtar etter 6 h. diskret lipid dråper er vanskelig å observere og bakgrunn fluorescens øker, som forstyrrer NR signalgjenkjenning.
  6. Imaging NR-farget ormer
    1. Bilde av ormer på 5 X forstørrelse å fange flere dyr per synsfelt.
    2. Bytt til 10 X forstørrelse for bedre kvantifisering av personlige ormer.
    3. Bruk FITC/GFP kanal bilde NR-farget ormer og prøve ulike eksponeringstider å bestemme optimale forhold for kvantifisering.
    4. Lagre filer i TIF-format for å unngå å miste data på grunn av komprimering.
      Merk: Typisk eksponering tiden varierer fra 100-1000 ms. har en optimal eksponeringstid, bruk den for alle prøver for å opprettholde tenkelig konsistens.
  7. NR flekker bilde kvantifisering
    1. Laste opp micrographs til ImageJ. I rullegardinmenyen Plugins Bruk funksjonen Bio-formater Hvis bildefilen ikke gjenkjennes.
    2. I bildet Bruk rullegardinmenyen, under funksjonen stabler, bilder stabelen for å opprette en bildestakk når flere micrographs sammenlignes.
    3. I den samme rullegardinmenyen, justere lysstyrke/kontrast av bildestakk og Overfør endringer til alle bildene ved å klikke Bruk.
    4. Ansette utvalg polygonverktøyet å avgrense hvert fotografert orm og bruke funksjonen mål under rullegardinmenyen analyse for å kvantifisere fluorescens intensitet fra NR.
    5. For hvert bilde, måler fem bakgrunn steder og beregne gjennomsnittlig bakgrunn fluorescens intensiteten.
    6. Trekke fra bakgrunnen fluorescens intensiteten av hver fotografert ormen bruker formelen N = G - (A x B), der N står for netto fluorescens, G til brutto fluorescens, A totale ormen området og B til gjennomsnittlig bakgrunn fluorescens.
    7. For å normalisere fluorescens intensiteten av ormen størrelse, kan du dele hver ormen netto fluorescens av det totale området. Resultatene rapporteres som fluorescens intensitet, i vilkårlig enheter (a.u.), per piksel.
      Merk: Unngå eksportere bilder i JPEG-format. Mens komprimering gjør det mer overkommelig å lagre filer, er dataintegritet kompromittert av dette formatet. Kontroller at alle bildene er endret og analysert identisk. Husk å inkludere en skala stang å kunne vurdere størrelsen ved ulike forstørrelser. For bedre å visualisere forskjeller i fluorescens intensitet bruker ImageJ, bytte bildetype fra RGB til 8-biters og velg brann bilde oppslag tabeller (LUT)-menyen. Dette skaper et varmekartet bilde økt fargen lysstyrke korrelerer med økt fluorescens intensitet.

2. olje røde O flekker (ORO) av lipider

  1. Utarbeidelse av ORO lagerløsning
    1. I en 250 mL flaske, legge 500 mg ORO pulver til 100 mL 100% isopropanol og bland det godt.
    2. Når forberedt, lagre løsningen tett forseglet med ingen lyseksponering.
  2. Utarbeidelse av ORO fungerende løsning
    1. Fortynne ORO lagerløsning i vann (3:2) til 60% isopropanol.
    2. Før bruk, filtrere fungerende ORO løsning gjennom en 0,2 µm celluloseacetat sterile sprøyter filter.
      Merk: For best løsning kvalitet, forberede fungerende ORO løsning dagen før, og la det blande over natten. Men hvis løsning for samme dag, fortynne og bland ORO løsningen på en rocker i minst 2 timer før bruk. Før rock, vikle konisk rør i parafin tape for å unngå ORO løsning.
  3. Utarbeidelse av ormer for ORO lipid flekker
    1. Vokse ormer ved 20 ° C på Rundormer vekst medium (NGM) plantet med sen-log OP50 E. coli til ønsket liv stadium.
    2. Legge 1 mL av PBST løsning til plate og virvel til alle ormer er av platen. Tilt platen og vask det med 1 mL av PBST. Overføre ormen suspensjon slik 1,5 mL microfuge.
    3. Sentrifuger ormer 560 x g i 1 Fjern nedbryting uten å forstyrre den pellets og gjenta vask gå med 1 mL av PBST tre ganger. Fjern alle supernatant men 100 µL.
    4. Legge til 600 µL av 40% isopropanol ormen pellets og rist den ved romtemperatur for 3 min.
    5. Sentrifuge ormer på 560 x g for 30 s og fjerne alle supernatant men 100 µL uten å forstyrre ormen pellets.
      Merk: Bruk større mengder PBST vask ormer av plater hvis gjør høy gjennomstrømming flekker. Ikke vask ormer i PBST mer enn 15 min før eksempel fiksering. Gjøre flere vasker hvis nedbryting ikke fjernes av bakterier. Utføre inkubasjon i 40% isopropanol bruker en nutator eller rocker. Alltid overvåke rør å sikre full prøve agitasjon skjer.
  4. Lipid farging med ORO
    1. Legge til 600 µL ORO fungerende løsning i hver prøve. Invertere røret tre ganger og bland ormer i ORO.
    2. Rotere prøvene på 30 rpm for 2 timer ved romtemperatur.
    3. Sentrifuge prøvene 560 x g for 1 min og eliminere alle supernatant men 100 µL.
    4. Resuspend prøvene i 600 µL av PBST og rotere rørene på 30 rpm i 30 min fjerner overflødig ORO stain.
    5. Sentrifuge eksempler på 560 x g for 1 min og fjerne nesten 50 µL av nedbryting.
    6. For skille bedre plasseringen av dyr germline og intestinal celler, beis kjerner ved å legge til 1 µL av (2-(4-amidinophenyl) - 1 H-indol-6-carboxamidine) (DAPI) for hver 1 mL av ORO fungerende løsning. Utføre ORO flekker for 2t med å legge DAPI før montering lysbilder for bildebehandling. Intestinal kjerner er større, og gonad snart utvikle bakterie celler.
      Merk: Etter ORO flekker, kan ormer overholder sidene av microfuge røret og unnlater å danne merkbar pellets. Hvis dette skjer, sentrifuge ormer igjen eller tillate ormer å slå av tyngdekraften på minst 10 min.
  5. Utarbeidelse av lysbildene for ormen imaging
    1. Resuspend ormer i gjenværende nedbryting og bland løsningen godt.
    2. Sett 5 µL av ormen suspensjon på et mikroskop lysbilde og plassere en dekkglassvæske nøye, slik at ingen luft bobler skjemaet.
    3. Forsegle dekkglassvæske med neglelakk og bilde ormer.
      Merk: Etter festing og flekker, ormer kan være veldig stiv og vanskelig å pipetter. For å omgå dette, gjør wide-fødte Pipetter ved å kutte av deres tips.
    4. Lagre lysbilder i en mikro-sentrifuge rack ved 4 ° C i opptil 24 timer hvis ikke tenkelig umiddelbart etter farging.
  6. Imaging ORO-farget ormer
    1. Bruk en farge-dugelig kameraet til bildet ORO-farget ormer.
    2. Bruk 5 X forstørrelse for å image flere ormer inne en synsfelt.
    3. Bytt til 10 X forstørrelse for bedre undersøkelse av personlige ormer.
    4. Eksportere bilder i TIF-format for å unngå tap av data på grunn av komprimering.
      Merk: Hvis flekker med ORO + DAPI, bytte farge-dugelig kameraet til en som kan fange fluorescens.
  7. Bildeanalyse ORO-farget ormer
    1. Laste opp micrograph(s) til ImageJ. I rullegardinmenyen Plugins Bruk funksjonen Bio-formater Hvis bildefilen ikke gjenkjennes.
    2. I bildet Bruk rullegardinmenyen, under funksjonen stabler, bilder stabelen for å opprette en bildestakk når flere micrographs sammenlignes.
    3. Justere lysstyrke/kontrast under den samme rullegardinmenyen å forbedre synligheten av lipid dråper.
    4. Kategorisere bildene etter lipid akkumulering hele dyrets kroppen eller i bestemte vev.
    5. Bedre evaluering av lipid lokalisering og identifikasjon av ikke-spesifikk bilderester bruker ImageJ, Velg funksjonen farge under rullegardinmenyen bildet og klikk på stakken til RGB vise signaler på hver RGB-komponent.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SKN-1 er en bZip, cytoprotective transkripsjon faktor som aksjer homologi med pattedyr NRF2 og har vist seg å megle fettsyrer oksidering. Avhengig av glukose konsentrasjonen i kostholdet viser ormer med en constitutively aktivert skn-1 allelet forskjellige lipid nivåer når beiset med Nile røde7. Figur 1A C viser aktivert skn-1 dyr utsatt for forhold som fører til økende lipid nivåer. NR fluorescens tatt ved hjelp av en FITC/GFP kanal er fremtredende langs tarmen, men svakere i hodet, hale og intestinal lumen. Lipid nivåer øker, er diskrete NR-farget partikler vanskeligere å se, som kan nødvendiggjøre lavere eksponeringstider. Selv om denne metoden bruker fluorescens intensitet kvantitative proxy for lipid akkumulering, det er utilstrekkelig mellom uspesifikke farging av cellulære strukturer som ikke er fett butikker og er utsatt for signal forstyrrelser fra intestinal auto fluorescens. Derfor må alternativ etikett og ikke-etikett metoder brukes parallelt utvetydig kvantifisere nøytral lipider i dyr10.

Avhengig av alder somatiske nedbryting av fett (Asdf), er en fenotypen som oppstår i alderen ormer der dyr viser redusert somatisk cell lipider, mens bakterie celle lipider forblir uendret6. Olje røde O flekker er ikke en metode som pålitelig kvantifiserer lipid nivåer, men er utmerket for å visualisere lipid lokalisering og administratorer fett uttømming fenotyper som Asdf i ormen. Mens det er lett å kategorisere ormer i henhold til tilstedeværelse eller fravær av Asdf, kan det være vanskelig å identifisere dyr med middels fett tap (figur 2A). Sammenlignet med ikke-Asdf dyr som viser lyse røde flekker over hele kroppen med gjennomsiktige områdene (figur 2B), utstilling Asdf ormer merkbar fett uttømming i intestinal celler (figur 2C). Dyr holder på å utvikle Asdf (figur 2D) ofte vise gjennomskinnelig stedene hvor de fleste fett tap til slutt oppstår. Videre kan Asdf ormer fortsatt har lyse røde flekker i hodet og baklykter områder fordi fenotypen ikke er definert av fullstendig somatiske fett tap, men omfattende fett uttømming i forhold til ikke-alderen (ikke-Asdf) dyr. Bruk av olje røde O flekker, dermed gir kvalitativ fastsettelse av lipid lokalisering og identifikasjon av fenotyper vesentlig endre fett innskudd i ormen.

Figure 1
Figur 1: flekker av lipider av Nilen red. Nilen røde flekker av aktivert skn-1 mutanter under forhold som framprovosere økt lipid opphopning (-vekselstrøm). Gevinsten av funksjonen skn-1 belastning (lax188) havner en E237K aminosyren erstatning som gjengir SKN-1 constitutively aktive. L4-trinns ormer ble utsatt for 0, 15 og 30 J/m2 UV-lys etterfulgt av en 12-h restitusjonsperiode på unseeded NGM plater før NR flekker og bildebehandling. Bilder vist er representant for fenotypen. Lipid kvantifisering ble utført som nevnes i delen 1.7. Fire er en ImageJ se tabellen (LUT) brukes til å opprette en termisk bilde som viser fluorescens intensitet forskjeller mellom bilder. Flett viser FITC/GFP og DIC bilder kombinert. Kvantifisering av fluorescens for hvert bilde vises nederst på bilde montasjen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: flekker av lipider av olje røde O. Olje røde O farging av aktivert skn-1 mutanter (lax188) viser tilstedeværelse eller fravær av Asdf fenotypen (A-D). A & D vise dyr med middels Asdf fenotyper. B & C Vis motsatt ORO flekker. Mens B er ikke-Asdf, viser betydelig somatiske fett uttømming samtidig økning i germline fett ansamling, som definerer Asdf fenotypen. Ormer var farget med ORO etterfulgt av imaging 144 hafter L1-synkroniserte dyr ble plassert på NGM media seeded med OP50 bakterier. Bilder vist er representant for dyr med eller uten Asdf fenotypen. Innfelt tegneserier er endret fra Lynn, et al. 6 og representerer fravær (B) eller tilstedeværelse (C) av somatiske fett uttømming. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Økningen i overvekt og metabolsk sykdom priser gjør C. elegans en passende modell å studere mekanismer som regulerer fett ansamling i celler og vev. Nyere bevis antyder at endringene i lipid nivåer er korrelert med cellulære prosesser fra insulin signalering8, aktivering av hormon reseptorer2, reproduktive utgang5. Rød O sammenlignet etikett-fri mikroskopi og kromatografi metoder, Nilen rød og olje og er relativt billig fargestoffer brukes stain nøytral lipider i ormen konsekvent og reproduserbar10,12,13. Først gir kvantifiseringen totale lipid nivåer, mens andre forenkler evalueringen av lipid fordeling mellom vev som i epidermis, tarmen og bakterie linjen. Når brukes sammen, aktivere NR og ORO forskerne å avgjøre hvordan genotype og miljøendringer påvirker lipid akkumulering og hvor i ormen endringene er forekommende.

Disse fargestoffer, likevel gjør ikke direkte vurdere lipid akkumulering i samme ikke-invasiv måte som biler mikroskopi12. Derfor de er utsatt for feil under fiksering og flekker, som kan kompromittere måling nøyaktighet13. I tillegg disse fargestoffer utilsiktet kan samhandle med lipofuscin og intestinal granulater, resulterer i fluorescens relatert til intracellulær nøytral fett butikker10,14. I tillegg i tilfeller hvor lipid nivåer vises lav, NR og ORO kan ikke flekker skille hvis resultatet skyldes permeabilitet problemer eller redusert fett ansamling. Videre krever følsomheten til disse flekker lys spesielle tiltak under lagring og aktive håndtering som begrenser fornedrelse og foto bleking. Men hvis forsiktig utøves når utføre og trekke konklusjoner fra etikett-baserte analyser, NR og ORO flekker er utmerket frem genetisk skjermer å studere lipid metabolisme veier og undersøke deres samhandling med andre fysiologiske funksjoner. Bruk av daf-2 og fett-6 anbefales å gjøre relative sammenligninger av økte og reduserte lipid opphopning, henholdsvis. Vask og fixating trinnene for NR og ORO flekker er like. Derfor kan både utføres samme dag. Imidlertid kan bare lysbildene med ORO-farget ormer lagres i imaging senere fordi NR flekker er i strid etter 6 h. Under vasken er det avgjørende med Triton 100-X ikke bare å forbedre permeabilitet NR og ORO, men også å unngå ormen tap på grunn av overdreven tilslutning til plasticware. I tillegg bør ormer vaskes mindre enn 30 min før farging for å sikre maksimal permeabilitet til hver flekk. Mens NR og ORO inkubasjon ganger kan reduseres til 1 h og 30 min, henholdsvis, er det oppfordret til å følge tiden foreslått i denne artikkelen for mer konsekvent flekk og imaging resultater. Langvarig eksponering NR løsning for lys og manglende evne til å filtrere ORO løsning før bruk vil øke bakgrunnen fluorescens under bildebehandling. Utføre disse fargeprotokollene krever 3-4 h i tillegg til tenkelig tid. Selv om flekken inkubasjon gir maksimalt 2 timer med pause mellom trinn, er det sterkt anbefalt at protokollene utføres med så lite avbrudd som mulig å redusere mange kilder feilkilder til alle fargebasert metoder av lipid kvantifisering og undersøkelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble gjort mulig ved NIH stipendet: R01GM109028 (S.P.C.)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Oil red O Alfa Aesar A12989 Lipid Stain
DAPI Thermo Fisher D1306 DNA stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
0.2 µm seterile syringe filter VWR 28145-477 Cellulose acetate filter
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Shaker Rotisserie Lab Quake 400110Q Shaker
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator
K2HPO4 Sigma-Aldrich 7758-11-4 NGM
KH2PO4 Sigma-Aldrich 7778-77-0 NGM
MgSO4 Alfa Aesar 7786-30-3 NGM
CaCl2 Sigma-Aldrich 10035-04-8 NGM
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 NGM
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 NGM
Peptone BD Biosciences 211677 NGM
Agar Teknova L9110 NGM
LB media Sigma-Aldrich L3147 Bacterial growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greenspan, P., Mayer, E. P., Fowler, S. D. Nile red: a selective fluorescent stain for intracellular lipid droplets. J Cell Biol. 100, (3), 965-973 (1985).
  2. Guo, Y., Cordes, K. R., Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid droplets at a glance. J Cell Sci. 122, (6), 749-752 (2009).
  3. Horobin, R. W., Kiernan, J. A. Conn's biological stains: a handbook of dyes, stains and fluorochromes for use in biology and medicine. BIOS Scientific Publishers. (2002).
  4. Hulme, S. E., Whitesides, G. M. Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research. Angew Chem Int Edit. 50, (21), 4774-4807 (2011).
  5. Khanna, A., Johnson, D. L., Curran, S. P. Physiological roles for mafr-1 in reproduction and lipid homeostasis. Cell Rep. 9, (6), 2180-2191 (2014).
  6. Lynn, D. A., Dalton, H. M., Sowa, J. N., Wang, M. C., Soukas, A. A., Curran, S. P. Omega-3 and-6 fatty acids allocate somatic and germline lipids to ensure fitness during nutrient and oxidative stress in Caenorhabditis elegans. P Natl Acad Sci USA. 112, (50), 15378-15383 (2015).
  7. Pang, S., Lynn, D. A., Lo, J. Y., Paek, J., Curran, S. P. SKN-1 and Nrf2 couples proline catabolism with lipid metabolism during nutrient deprivation. Nat Commun. 5, (2014).
  8. Saltiel, A. R., Kahn, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nature. 414, (6865), 799-806 (2001).
  9. Witting, M., Schmitt-Kopplin, P. The Caenorhabditis elegans lipidome: A primer for lipid analysis in Caenorhabditis elegans. Arch Biochem Biophys. 589, 27-37 (2016).
  10. Yen, K., Le, T. T., Bansal, A., Narasimhan, S. D., Cheng, J. X., Tissenbaum, H. A. A comparative study of fat storage quantitation in nematode Caenorhabditis elegans using label and label-free methods. PloS One. 5, (9), e12810 (2010).
  11. Zhang, Y., Zou, X., Ding, Y., Wang, H., Wu, X., Liang, B. Comparative genomics and functional study of lipid metabolic genes in Caenorhabditis elegans. BMC Genomics. 14, (1), 164 (2013).
  12. Folick, A., Min, W., Wang, M. C. Label-free imaging of lipid dynamics using Coherent Anti-stokes Raman Scattering (CARS) and Stimulated Raman Scattering (SRS) microscopy. Curr Opin Genet Dev. 21, (5), 585-590 (2011).
  13. Pino, E. C., Webster, C. M., Carr, C. E., Soukas, A. A. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J Vis Exp. (73), (2013).
  14. O'Rourke, E. J., Soukas, A. A., Carr, C. E., Ruvkun, G. C. elegans major fats are stored in vesicles distinct from lysosome-related organelles. Cell Metab. 10, (5), 430-435 (2009).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics