Quantificazione dell'abbondanza del lipido e valutazione della distribuzione del lipido in Caenorhabditis elegans Nilo rosso e macchie di olio rosso O

Biology

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Summary

Nilo rosso macchiatura di fisso Caenorhabditis elegans è un metodo per la misurazione quantitativa dei depositi di lipidi neutri, mentre olio rosso O colorazione facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi fra i tessuti.

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Escorcia, W., Ruter, D. L., Nhan, J., Curran, S. P. Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (133), e57352, doi:10.3791/57352 (2018).

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Abstract

Caenorhabditis elegans è un organismo modello eccezionale in cui studiare il metabolismo dei lipidi e dell'omeostasi energetica. Molti dei suoi geni del lipido sono conservati negli esseri umani e sono associati con la sindrome metabolica o altre malattie. Esame di accumulazione del lipido in questo organismo può essere effettuato da coloranti fissativi o metodi privo di etichetta. Macchie di fissativo come Nilo rosso e olio rosso O sono modi poco costosi, affidabili per misurare quantitativamente i livelli di lipidi e di osservare qualitativamente distribuzione dei lipidi attraverso tessuti, rispettivamente. Inoltre, queste macchie consentono per high throughput screening di vari geni del metabolismo di lipidi e percorsi. Inoltre, loro natura idrofobica facilita la solubilità dei lipidi, riduce l'interazione con i tessuti circostanti e previene la dissociazione in solvente. Anche se questi metodi sono efficaci ad esaminare il contenuto di lipidi in generale, non forniscono informazioni dettagliate circa la composizione chimica e la diversità dei giacimenti del lipido. Per questi scopi, metodi privo di etichetta come microscopia di GC-MS e automobili sono meglio adatto, le spese in deroga.

Introduction

I lipidi sono essenziali per la vita. Essi sono parti integranti delle membrane, fungono da messaggeri secondari e trasduttori del segnale e hanno funzioni cruciali in stoccaggio di energia. Quando il metabolismo dei lipidi è dysregulated, si porta a malattie come obesità e diabete di tipo II, che sono premendo di preoccupazioni di sanità pubblica9. Caenorhabditis elegans (C. elegans) è un organismo modello eccellente per studiare il metabolismo dei lipidi perché ha un ciclo di vita relativamente breve, un corpo trasparente, un lignaggio di conosciuti delle cellule e un genoma sequenziato completamente. Principalmente un ermafrodito, c. elegans permette ai ricercatori di raccogliere grandi quantità di animali isogeni in breve periodi di tempo a carryout high throughput avanti schermi genetici per studiare una vasta gamma di geni e vie metaboliche4. Questo approccio ha rivelato un alto grado di conservazione in 273 c. elegans geni di metabolismo lipidico tra gli esseri umani, topi, ratti e della drosofila. Inoltre, oltre 300 geni del lipido in c. elegans hanno orthologues umana che sono associati con le malattie non correlate alla sindrome metabolica11. Esame di immagazzinaggio del lipido in c. elegans ha per lo più tradizionalmente, tingere-contrassegnati saggi, che forniscono informazioni affidabili sull'accumulo di lipidi. Meno comune è una descrizione di dove localizzare i lipidi e le differenze misurate in abbondanza di lipidi attraverso tessuti. Tuttavia, recenti studi hanno rilevato che la distribuzione dei lipidi può essere importante come accumulo di lipidi6.

Ultimamente, gli studi hanno cominciato a integrare metodi come spettrometria liquida di cromatografia-Massachussets ad alte prestazioni (HPLC-MS), spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS), e anti-stokes coerente della microscopia Raman scattering (automobili) all'indirizzo del carenze di approcci basati su macchia analizzando direttamente il contenuto di estratti del lipido, frazioni specifiche del lipido e giacimenti del lipido, rispettivamente10,11. Inoltre, microscopia di automobili ha rivelato che red Nilo può servire solo come un proxy per accumulo di grasso quando viene utilizzato come una fissativo della tintura, per il suo uso come una macchia vitale conduce alla macchiatura fuori bersaglio di auto-fluorescente organelli10. Tuttavia, le competenze tecniche necessarie e i costi associati con questi cromatografia e microscopia Metodi rendono loro uso insostenibile per molte domande di ricerca. In questo articolo, discutiamo un metodo conveniente e affidabile per fissarsi e macchia i depositi di lipidi neutri in c. elegans utilizzando Nilo rosso e olio rosso O per distinguere l'abbondanza del lipido in animali interi e in tessuti specifici.

Rosso del Nilo, 9-diethylamino-5H-benzo[α]phenoxazine-5-one, è un colorante benzophenoxazone che prontamente si dissolve in vari solventi organici, ma è praticamente insolubile in acqua. Si tratta di un eccellente lysochrome colorante utilizzato per macchiare lipidi neutri come trigliceridi o esteri del colesterolo perché è dotato di un colore forte, solubilizza bene in lipidi, ha trascurabile interazione con i tessuti circostanti ed è meno solubili in solvente rispetto a lipidi. Ha un'eccitazione e emissione massimi di 450-500 e 520 nm, rispettivamente1. Quando il Nilo rosso-macchiato di c. elegans è visto per fluorescenza verde, corpi discreti del lipido possono essere osservati in tutto l'intestino e altri tessuti o in cluster o uniformemente dispersi, a seconda del genotipo dell'animale o il trattamento sperimentale 7.

Olio rosso O è un lysochrome, liposolubili colorante usato per macchiare i trigliceridi e lipoproteine. Si chiama un colorante azoico perché la sua struttura chimica contiene due gruppi azoici, collegati a tre anelli aromatici. È difficile ionizzare, che lo rende altamente solubili nei lipidi. La macchia di colore è rosso e il massimo di assorbimento della luce è 518 nm 3. C. elegans macchiato con olio rosso O Visualizza le goccioline del lipido rosso che si stagliano contro il corpo trasparente dell'animale, che facilita la valutazione qualitativa della distribuzione dei lipidi tra diversi tessuti6.

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Protocol

1. Nilo rosso (NR) colorazione dei lipidi

  1. Preparazione della soluzione di riserva di 5 mg/mL NR
    1. In una bottiglia da 500 mL, aggiungere 200 mL di acetone 100% 100 mg di polvere di NR.
    2. Coprire la bottiglia con foglio di alluminio per evitare l'esposizione alla luce.
    3. Prima dell'uso, agitare la soluzione per 2 h al buio.
    4. Per uso a lungo termine, conservare la soluzione di riserva di NR in bottiglia ermeticamente senza qualsiasi esposizione alla luce. Soluzione di riserva di scala NR secondo esigenze di ricerca. Assicurarsi che la stessa soluzione di riserva è utilizzata attraverso esperimenti NR-macchiatura per ottenere la colorazione coerente e risultati di formazione immagine.
  2. Preparazione della soluzione di lavoro di NR
    1. Per ogni 1 mL di isopropanolo 40% (v/v), aggiungere 6 µ l di soluzione madre NR.
    2. Preparare 600 µ l di soluzione di lavoro di NR per ciascun campione.
      Nota: Assicurarsi di fresco NR lavorando soluzione proprio prima della colorazione. A seconda delle esigenze di soluzione stock di NR, utilizzare un tubo conico graduata da 50 mL o 15 mL.
  3. Preparazione di vermi per colorazione di NR del lipido
    1. Crescere vermi alla fase iniziale di L4 a 20 ° C il mezzo di sviluppo del nematode (NGM) seminato con tardo-registro OP50 Escherichia coli.
    2. Lavare i vermi fuori la piastra con 1 mL di soluzione tampone fosfato + 0,01% Triton X-100 (PBST) soluzione: 1x e mettere la sospensione di vite senza fine in una provetta da 1,5 mL microfuge.
    3. Centrifugare che i vermi a 560 x g per 1 min. rimuovere il surnatante e ripetere questo passaggio fino a e. coli è deselezionato dalla sospensione.
    4. Aggiungere 100 µ l di 40% isopropanolo al pellet di verme e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
    5. Centrifugare i vermi a 560 x g per 1 min e rimuovere il supernatante senza interrompere il pellet di verme.
      Nota: Maggiori volumi di uso di PBST per lavare i vermi fuori le piastre se utilizzando piastre più grandi o più vermi per piastra di colorazione. Non lavare i vermi in PBST più di 15 min prima della fissazione del campione. Eseguire ulteriori lavaggi se il surnatante non viene cancellato dei batteri. Svolgere l'incubazione in 40% isopropanolo utilizzando un nutator o un rocker. Monitorare sempre i tubi per assicurarsi di agitazione di esempio completo è in corso.
  4. Lipidica macchiatura con NR
    1. Nel buio, aggiungere 600 µ l di soluzione di lavoro di NR per ogni campione. Invertire i tubi tre volte e mescolare completamente i vermi in soluzione NR.
    2. Ruotare il campione al buio a temperatura ambiente per 2 h.
    3. Dopo l'incubazione, centrifugare i vermi a 560 x g per 1 min e rimuovere il surnatante.
    4. Aggiungere 600 µ l di PBST e incubare i campioni al buio per 30 minuti rimuovere macchie di NR in eccesso.
    5. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min e rimuovete tutti ma circa 50 µ l del surnatante.
      Nota: Incubazione NR non richiede agitazione. Sedimentazione di worms è comune durante questo passaggio.
  5. Preparazione dei vetrini per formazione immagine del microscopio
    1. Risospendere il pellet di verme nel surnatante rimanenti.
    2. Posto 5 µ l di sospensione di vite senza fine su un vetrino da microscopio e messo un vetrino coprioggetto con attenzione per evitare di intrappolare bolle d'aria.
    3. Sigillare il coprioggetto con lo smalto prima dell'imaging di vermi.
    4. Preparare solo un paio di diapositive alla volta. In tal modo la formazione immagine NR rimane costante attraverso campioni. La qualità delle immagini NR-macchiato diminuisce dopo 6 h. discreti del lipido goccioline sono difficili da osservare e fluorescenza di fondo aumenta, che interferisce con il rilevamento del segnale NR.
  6. Imaging di vermi NR-macchiato
    1. I vermi a ingrandimento 5x per catturare animali diversi per campo di vista dell'immagine.
    2. Passare a 10 ingrandimenti per migliore quantificazione delle singole viti senza fine.
    3. Utilizzare FITC/GFP canale immagine vermi NR-macchiato e provare tempi di esposizione differenti per determinare le condizioni ottimali per la quantificazione.
    4. Salvare i file in formato TIF per evitare di perdere dati a causa di compressione.
      Nota: Tempi di esposizione tipico variano da MS. 100-1000 avendo un tempo di esposizione ottimale, utilizzare per tutti i campioni per mantenere la coerenza di imaging.
  7. Quantificazione di immagine colorazione NR
    1. Caricare micrografie ImageJ. Nel menu pull-down di plugin, è necessario utilizzare la funzione Bio-Formats se il file di immagine non viene riconosciuto.
    2. Nell'immagine dal menu a discesa, sotto la funzione di stack, utilizzare immagini-Stack per creare una serie di immagini quando micrografie diversi vengono confrontati.
    3. Nello stesso menu pull-down, regolare la luminosità/contrasto dello stack immagine e propagare le modifiche a tutte le immagini facendo clic su Applica.
    4. Utilizzare lo strumento di selezione poligono per delineare ogni verme imaged e utilizzare la funzione di misura sotto menu pull-down di analisi per quantificare l'intensità di fluorescenza emessa dal NR.
    5. Per ogni immagine, cinque siti di fondo di misurare e calcolare l'intensità di fluorescenza di fondo media.
    6. Sottrarre l'intensità di fluorescenza di fondo da ogni verme imaged utilizzando la formula N = G - (A x B), dove N sta per fluorescenza netto, G per fluorescenza lordo, A per area totale verme e B per fluorescenza di fondo medio.
    7. Per normalizzare l'intensità della fluorescenza di dimensione del verme, dividere il fluorescenza netto di ogni verme dalla sua superficie totale. I risultati sono riportati come intensità di fluorescenza, in unità arbitrarie (UA), al pixel.
      Nota: Evitare di esportare le immagini in formato JPEG. Mentre la compressione rende più gestibile per archiviare i file, l'integrità dei dati è compromessa da questo formato. Assicurarsi che tutte le immagini sono per volta e analizzate in modo identico. Ricordati di includere una barra di scala per valutare adeguatamente formato a diversi ingrandimenti. Per visualizzare meglio le differenze nell'intensità di fluorescenza usando ImageJ, cambiare il tipo di immagine da RGB a 8 bit e selezionare fuoco dal menu immagine ricerca tabelle (LUT). Questo crea un'immagine di mappa di calore nel quale colore aumentata luminosità correla con l'intensità di fluorescenza maggiore.

2. olio rosso O macchiatura (ORO) dei lipidi

  1. Preparazione della soluzione di riserva ORO
    1. In una bottiglia da 250 mL, aggiungere 500 mg di polvere di ORO a 100 mL di isopropanolo 100% e mescolare bene.
    2. Una volta preparato, conservare la soluzione ermeticamente chiuso con nessuna esposizione alla luce.
  2. Preparazione della soluzione di lavoro di ORO
    1. Diluire la soluzione di riserva di ORO in acqua (3:2) al 60% di isopropanolo.
    2. Prima dell'uso, è possibile filtrare la soluzione di ORO di lavoro attraverso un filtro da 0,2 µm in acetato di cellulosa siringa sterile.
      Nota: Per una migliore qualità di soluzione, preparare la soluzione di lavoro ORO il giorno prima e lasciarlo mescolare durante la notte. Tuttavia, se la soluzione è necessario lo stesso giorno, diluire e mescolare la soluzione ORO su un rocker per almeno 2 h prima dell'uso. Prima a dondolo, avvolgere tubo conico in nastro di paraffina per evitare la fuoriuscita della soluzione ORO.
  3. Preparazione di vermi per colorazione di ORO del lipido
    1. Crescere i vermi a 20 ° C il mezzo di sviluppo del nematode (NGM) seminato con tardo-registro OP50 Escherichia coli alla fase di vita desiderato.
    2. Aggiungere 1 mL di soluzione PBST alla piastra e agitare fino a quando tutti i vermi sono fuori la piastra. Inclinare la piastra e lavare con 1 mL di PBST. Trasferire la sospensione di vite senza fine in una provetta di microfuge 1,5 mL.
    3. Centrifugare che i vermi a 560 x g per 1 min. eliminare il surnatante senza disturbare il pellet e ripetere il lavaggio passo con 1 mL di PBST tre volte. Rimuovere tutti i supernatanti ma 100 µ l.
    4. Aggiungere 600 µ l di 40% isopropanolo al pellet di verme e rock a temperatura ambiente per 3 min.
    5. Centrifugare i vermi a 560 x g per 30 s e Rimuovi tutto surnatante ma 100 µ l senza interrompere il pellet di verme.
      Nota: Utilizzare volumi più elevati di PBST per lavare i vermi fuori piastre se facendo macchiatura di alto-rendimento. Non lavare vermi in PBST più di 15 min prima della fissazione del campione. Fare ulteriori lavaggi se surnatante non viene cancellato dei batteri. Svolgere con incubazione in 40% isopropanolo utilizzando un nutator o un rocker. Monitorare sempre i tubi per assicurarsi di agitazione di esempio completo è in corso.
  4. Lipidica macchiatura con ORO
    1. Aggiungere 600 µ l ORO lavoro soluzione a ciascun campione. Capovolgere la provetta tre volte e mescolare i vermi bene in ORO.
    2. Ruotare i campioni a 30 rpm per 2 ore a temperatura ambiente.
    3. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min ed eliminare tutti i supernatanti ma 100 µ l.
    4. Risospendere i campioni in 600 µ l di PBST e ruotare i tubi a 30 rpm per 30 min rimuovere macchie di ORO in eccesso.
    5. Centrifugare i campioni a 560 x g per 1 min ed eliminare tutti, ma 50 µ l del surnatante.
    6. Per distinguere meglio la posizione di germline cellule intestinali e dell'animale, macchia i nuclei aggiungendo 1 µ l di (2-(4-amidinophenyl) - 1H-indole-6-detto) (DAPI) per ogni 1 mL di soluzione di lavoro di ORO. Eseguire colorazione ORO per 2 h con l'aggiunta di DAPI prima del montaggio diapositive per imaging. I nuclei intestinali sono di dimensioni maggiori e la gonade si distingue per le cellule germinali in via di sviluppo.
      Nota: Dopo ORO macchiatura, vermi possono aderire ai lati del tubo microfuge e non riescono a formare una pallina evidente. Se questo accade, centrifugare nuovamente i vermi o consentire vermi depositarsi per gravità per almeno 10 min.
  5. Preparazione delle diapositive per worm imaging
    1. Risospendere i vermi nel surnatante rimanente e mescolare bene la soluzione.
    2. Mettere 5 µ l di sospensione di vite senza fine su un vetrino da microscopio e porre un coprivetrino attentamente, assicurando che nessun aria formano delle bolle.
    3. Sigillare il coprioggetto con smalto e vermi di immagine.
      Nota: Dopo la fissazione e colorazione, vermi possono essere molto rigidi e difficili da dispensare. Per aggirare questo problema, rendere wide-bore pipette, tagliando loro suggerimenti.
    4. Conservare i vetrini in un rack di micro-centrifuga a 4 ° C fino a 24 ore se non imaging immediatamente dopo la colorazione.
  6. Imaging di vermi ORO-macchiato
    1. Utilizzare una fotocamera in grado colore alle viti senza fine ORO tinto di immagine.
    2. Utilizzare ingrandimento 5x per diversi worm in un campo di vista di immagine.
    3. Passare a ingrandimento 10x per una migliore analisi delle singole viti senza fine.
    4. Esportare le immagini in formato TIF per evitare perdita di dati dovuta alla compressione.
      Nota: Se la macchiatura con ORO + DAPI, accendere la fotocamera in grado colore a uno che può catturare la fluorescenza.
  7. Analisi di immagini di worms ORO-macchiato
    1. Caricare micrograph(s) ImageJ. Nel menu pull-down di plugin, è necessario utilizzare la funzione Bio-Formats se il file di immagine non viene riconosciuto.
    2. Nell'immagine dal menu a discesa, sotto la funzione di stack, utilizzare immagini-Stack per creare una serie di immagini quando micrografie diversi vengono confrontati.
    3. Regolare la luminosità/contrasto sotto menu pull-down stesso per migliorare la visibilità di goccioline lipidiche.
    4. Classificare le immagini secondo l'accumulazione del lipido in tutto il corpo dell'animale o in tessuti specifici.
    5. Migliore valutazione della localizzazione del lipido e per l'identificazione di artefatti dell'immagine non specifici usando ImageJ, selezionare la funzione di colore sotto menu pull-down di immagine e fare clic su Stack in RGB per mostrare i segnali di ogni componente RGB.

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Representative Results

SKN-1 è un bZip, fattore di trascrizione di cytoprotective che condivide omologia con mammiferi NRF2 ed è stato indicato per mediare l'ossidazione degli acidi grassi. A seconda della concentrazione di glucosio nella loro dieta, worm con un allele costitutivamente attivato skn-1 mostrano livelli di lipidi differenti quando macchiato con Nilo rosso7. Figura 1A -C Mostra attivato skn-1 gli animali esposti a condizioni che portano ad aumentare i livelli di lipidi. Fluorescenza NR acquisito utilizzando un canale FITC/GFP è prominente lungo l'intestino, ma è dimmer nella testa, coda e nel lume intestinale. Come aumentare i livelli di lipidi, particelle discrete NR-macchiato sono più difficili da discernere, che può richiedere tempi di esposizione più bassi. Anche se questo metodo utilizza l'intensità di fluorescenza come proxy quantitativo per accumulo di lipidi, è inadeguata a distinguere colorazione aspecifica delle strutture cellulari che non sono depositi di grasso ed è soggetto a interferenze da auto intestinale di segnale fluorescenza. Pertanto, etichetta alternativa e senza etichetta metodi devono essere utilizzati in parallelo per quantificare in modo inequivocabile lipidi neutri nell' animale10.

Età-dipendente somatici deplezione di grasso (Asdf), è un fenotipo che si verifica a worms invecchiato per cui animali display in diminuzione dei lipidi delle cellule somatiche, mentre i lipidi delle cellule di germe rimangano invariato6. Olio rosso O colorazione non è un metodo che quantifica i livelli di lipidi, in modo affidabile, ma è eccellente per la visualizzazione di localizzazione del lipido ed è utile per determinare fenotipi di svuotamento grasso come Asdf nel verme. Mentre è facile categorizzare i vermi secondo la presenza o l'assenza di Asdf, può essere difficile identificare gli animali con perdita di grasso intermedia (Figura 2A). Rispetto agli animali non-Asdf, che mostrano il rosso brillante colorazione in tutto il corpo con poche aree traslucide (Figura 2B), Asdf worm presentano evidente deplezione di grasso nelle cellule intestinali (Figura 2). Animali nel processo di sviluppo Asdf (Figura 2D) spesso mostrano macchie traslucide dove maggior parte perdita di grasso si verifica alla fine. Inoltre, Asdf vermi possono ancora caratteristica brillante colorazione rossa nelle regioni di testa e coda perché il fenotipo non è definito da completa perdita di grasso somatica, ma da svuotamento vasto grasso rispetto al non-invecchiato (non-Asdf) animali. L'uso di olio rosso O colorazione, quindi, permette per la determinazione qualitativa della localizzazione del lipido e l'identificazione dei fenotipi che cambiano sostanzialmente i depositi di grasso nel verme.

Figure 1
Figura 1: colorazione dei lipidi da Nilo rosso Nilo rosso macchiatura di attivato skn-1 mutanti in condizioni tali da suscitano l'accumulazione aumentata del lipido (A-C). Il guadagno del ceppo skn-1 funzione (lax188) porti una sostituzione dell'amminoacido di E237K che esegue il rendering di SKN-1 costitutivamente attiva. Vermi L4-fase sono stati esposti a 0, 15 e 30 J/m2 UV-luce seguita da un periodo di recupero di 12 h su piastre di NGM non teste di serie prima di NR-macchiatura e imaging. Le immagini sono rappresentante del fenotipo. Quantificazione del lipido è stato effettuato come indicato nella sezione 1.7. Il fuoco è un ImageJ look up table (LUT) utilizzato per creare un'immagine termica che mostra fluorescenza differenze di intensità tra le immagini. Unione Mostra immagini FITC/GFP e DIC combinate. Quantificazione dell'intensità di fluorescenza per ogni immagine viene visualizzata nella parte inferiore del montaggio immagine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: colorazione dei lipidi di olio rosso O. Olio rosso O macchiatura di attivato skn-1 mutanti (lax188) che mostra la presenza o l'assenza del fenotipo Asdf (A-D). A & D Visualizza animali con fenotipi intermedi Asdf. B & C visualizzare ORO-colorazione opposta. Mentre B è non-Asdf, C Mostra sostanziale deplezione di grasso somatiche con aumento concomitante in accumulo di grasso germinale, che definisce il fenotipo di Asdf. I vermi sono stati macchiati con ORO seguita da imaging 144 hafter L1-sincronizzato animali sono stati disposti su supporti NGM seminati con OP50 batteri. Le immagini sono rappresentante degli animali con o senza il fenotipo di Asdf. Cartoni animati inserto vengono modificati da Lynn, et al. 6 e rappresentano l'assenza (B) o presenza (C) di svuotamento grasso somatico. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

L'aumento dell'obesità e tassi di malattia metabolica rende c. elegans un modello adatto per studiare i meccanismi che regolano l'accumulo di grasso nelle cellule e tessuti. La prova recente suggerisce che i cambiamenti nei livelli di lipidi sono correlati con i processi cellulari che vanno da8, l'attivazione di recettori dell'ormone2, a capacità riproduttiva5di segnalazione dell'insulina. Rispetto ai metodi di cromatografia, Nilo rosso e olio e microscopia privo di etichetta O rosso sono relativamente poco costosi coloranti utilizzati a macchiare lipidi neutri nel verme costantemente e riproducibile10,12,13. Il primo consente la quantificazione dei livelli di lipidi totali, mentre il secondo facilita la valutazione della distribuzione dei lipidi tra tessuti quali l'ipoderma, intestino e la linea germinale. Quando usato in congiunzione, NR e ORO permettono ai ricercatori di determinare come genotipo e cambiamenti ambientali influenzano l'accumulazione del lipido e dove nel verme questi cambiamenti si verificano.

Questi coloranti, tuttavia, non valutare direttamente l'accumulazione del lipido in maniera non invasiva come fa automobili microscopia12. Pertanto, essi sono soggetti ad errori durante la fissazione e colorazione, che possono compromettere la precisione di misura13. Inoltre, questi coloranti inavvertitamente possono interagire con il lipofuscin e granuli intestinale, con conseguente fluorescenza estraneo a grasso neutro intracellulare memorizza10,14. Inoltre, in casi dove i livelli di lipidi presentano bassi, NR e ORO colorazione non può distinguere se il risultato deriva da problemi di permeabilità o ridotto accumulo di grasso. Inoltre, la sensibilità di queste macchie di luce richiede misure speciali durante lo stoccaggio e la manipolazione attiva tale limite il degrado e la foto lo sbiancamento. Tuttavia, se è usata cautela quando esecuzione e trarre conclusioni da saggi basati su etichette, NR e colorazione ORO sono mezzi eccellenti di schermi avanti genetici per studiare vie di metabolismo dei lipidi ed esaminare le loro interazioni con altri fisiologici funzioni. L'uso di vermi daf-2 e grasso-6 è raccomandato per effettuare confronti relativi di accumulazione del lipido di aumento e in diminuzione, rispettivamente. Il lavaggio e fissazione passaggi per NR e ORO colorazione sono simili. Di conseguenza, entrambi può essere eseguite lo stesso giorno. Tuttavia, solo le diapositive con i vermi tinto ORO sono memorizzabili per l'imaging più tardi perché NR macchiatura è incoerente dopo 6 h. Durante il lavaggio, è fondamentale includere Triton X-100 non solo per migliorare la permeabilità al NR e ORO, ma anche per evitare la perdita di vite senza fine a causa di eccessiva aderenza al plasticware. Inoltre, i vermi devono essere lavati meno di 30 min prima della colorazione per garantire la massima permeabilità al vapore ogni macchia. Mentre i tempi di incubazione NR e ORO possono essere ridotto a 1 h e 30 min, rispettivamente, è incoraggiato a seguire il tempo suggerito in questo articolo per la colorazione più coerente e risultati di formazione immagine. Esposizione prolungata della soluzione NR alla luce e fallimento per filtrare la soluzione ORO prima uso aumenterà la fluorescenza di fondo durante la formazione immagine. Questi protocolli di colorazione richiede 3-4 h oltre tempo di imaging. Se macchia incubazione offre al massimo 2 ore di pausa tra i passaggi, si raccomanda vivamente che i protocolli siano effettuati con minor numero di interruzioni possibile per ridurre le molte fonti di errore inerente a tutti i metodi di base di tintura di quantificazione del lipido e esame.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato reso possibile dalla concessione NIH: R01GM109028 (S.P.C)

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Imager.M2m Microscope Zeiss n/a Fluorescence microscope
ERC5s camera Axiocam n/a Color-capable
MRm camera Axiocam n/a Fluorescence-capable
Nile red Thermo Fisher N1142 Lipid Stain
Oil red O Alfa Aesar A12989 Lipid Stain
DAPI Thermo Fisher D1306 DNA stain
Isopropyl Alcohol BDH BDH1133-1LP Fixative solution
0.2 µm seterile syringe filter VWR 28145-477 Cellulose acetate filter
Centrifuge 5430 Eppendorf 5428000015 Centrifuge
Shaker Rotisserie Lab Quake 400110Q Shaker
Tube Rotator VWR 10136-084 Rotator
K2HPO4 Sigma-Aldrich 7758-11-4 NGM
KH2PO4 Sigma-Aldrich 7778-77-0 NGM
MgSO4 Alfa Aesar 7786-30-3 NGM
CaCl2 Sigma-Aldrich 10035-04-8 NGM
NaCl Sigma-Aldrich 7647-14-5 NGM
Cholesterol Sigma-Aldrich 57-88-5 NGM
Peptone BD Biosciences 211677 NGM
Agar Teknova L9110 NGM
LB media Sigma-Aldrich L3147 Bacterial growth

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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