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Neuroscience

Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes In Situ la technologie de détection

Published: March 27, 2018 doi: 10.3791/57444
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Program in Behavioral Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

Summary

Identification du récepteur D1-alpha de dopamine dans le noyau accumbens est critique pour clarifier le dysfonctionnement du récepteur D1 au cours d’une maladie du système nerveux central. Nous avons effectué un roman RNA essai in situ hybridation avec pour visualiser des molécules d’ARN unique dans une zone spécifiques du cerveau.

Abstract

Dans le système nerveux central, les récepteurs de sous-type D1-alpha (Drd1α) sont le plus abondant récepteur de dopamine (DA), qui joue un rôle essentiel dans la régulation du développement et croissance neuronale. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent les anomalies du récepteur Drd1α interceptent les réponses comportementales et moduler la fonction de mémoire de travail sont encore peu claires. Grâce à un roman RNA essai in situ hybridation avec, la présente étude a identifié dopamine Drd1α du récepteur et la tyrosine hydroxylase (TH) RNA expression de circuits axés sur la DA dans le noyau accumbens (NAc) et région de substantia nigra (SNR), respectivement. Drd1α expression dans le CNA présente « point discret » modèle de marquage. Différences de sexe clair dans l’expression de Drd1α ont été observés. En revanche, TH montre un patron de coloration « groupée ». Au sujet de l’ÉNIÈME expression, rates affichent une expression plus élevée de signal par cellule par rapport à des animaux mâles. Les méthodes présentées ici fournissent une technique d’hybridation roman sur place pour enquêter sur les changements dans le dysfonctionnement du système dopamine au cours de la progression de la maladie du système nerveux central.

Introduction

Dysfonctionnement du système de dopamine striatale est impliqué dans la progression des symptômes cliniques observés dans plusieurs maladies neurocognitives. Les récepteurs dopaminergiques D1 sont présents dans le cortex préfrontal (PFC) et les régions striatum du cerveau et influencent fortement les processus cognitifs1, y compris le travail de mémoire, traitement temporel et comportement locomotive2,3 , 4 , 5 , 6 , 7. études antérieures élucidé que changements de récepteurs de la dopamine D1 étaient associés à la progression de l’attention-hyperactivité trouble de (l’attention THADA)8, les symptômes neurocognitifs dans la schizophrénie9, stress et 10 susceptibilité11. Plus précisément, dans la schizophrénie, par émission de positrons (TEP) études ont indiqué que la capacité de liaison des récepteurs de la dopamine D1 dans le cortex préfrontal était fortement liée à des déficits cognitifs et la présence de symptômes négatifs11. La croissance dendritique des neurones excitateurs dans le cortex préfrontal, réglementés par les récepteurs de la dopamine D1 atténue la sensibilité aux stress. En outre, la précipitation du récepteur D1 dans les neurones du cortex préfrontal médial (MFPC) pourrait améliorer la défaite sociale induite par le stress social évitement12.

Ici, nous présentons une nouvelle technique d’hybridation in situ RNA de visualiser des molécules d’ARN seul dans une cellule avec des échantillons de tissus frais congelés. La technique actuelle possède plusieurs avantages par rapport aux méthodes qui existent au sein de la littérature actuelle. Tout d’abord, la procédure actuelle conserve le contexte spatial et morphologique du tissu et a été réalisée sur des échantillons de tissus frais congelés afin que les autres procédures nécessitant fraîches, tissus non incorporé peuvent être combinés avec les méthodes actuelles. Des procédures similaires dans les tissus fixés au formol et inclus en paraffine ont illustré que résolution unique de transcription peut être réalisée en utilisant un RNA in situ hybridation technique13. Détection de l’ARN au niveau de la transcription unique offre une sensibilité supérieure à l’expression de numéro de faibles copies ainsi que la possibilité de comparer l’expression des gènes au niveau des cellules individuelles ne peuvent être réalisées par d’autres méthodes de détection des acides nucléiques, comme les techniques de polymérase de réaction en chaîne (PCR). En outre, la méthode actuelle tient à jour des images avec un rapport signal sur bruit élevé grâce à des sondes d’ARN très spécifiques qui sont hybridées aux transcriptions d’ARN cible unique et séquentiellement liés avec une cascade de molécules d’amplification de signal dans la détection système. Enfin, la technologie actuelle offre la possibilité d’évaluer les systèmes biologiques multiples avec ses sondes propriétaires spécifique à la cible, plutôt que de limiter notre enquête à la seule catégorie des marqueurs liés au système telles que la détection de la protéine par Méthodes d’immunohistochimie.

Dans notre étude, nous avons utilisé ce roman RNA in situ hybridation afin d’évaluer l’expression des récepteurs Drd1α dans le noyau accumbens (NAc) et l’expression de la tyrosine hydroxylase (TH) dans la substantia nigra (SNR) de rats F344/N mâles et femelles. L’innovants RNA in situ hybridation nous a permis d’étudier les mécanismes influencer l’absorption DA et DA communiqué simultanément, en améliorant notre compréhension des complexités du système striatal DA. Nous décrivons ici la procédure pour les tranches de cerveau frais-congelé et proposent des méthodes d’analyse de données pour différentes colorations : « point discret » ou « clusters ».

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Protocol

Le protocole expérimental a été approuvé par l’utilisation Comité (IACUC) à la University of South Carolina et animalier (numéro d’assurance fédérale : A3049-01).

1. préparation des Sections de cerveau congelé frais

  1. Utiliser la souche de rat F344/N : trois rats de chaque sexe, 13 mois, poids environ 320 g.
  2. Ajuster la concentration de sévoflurane à 5 % (surdose de sévoflurane). Continuer l’exposition sévoflurane après la respiration s’arrête pendant une minute supplémentaire.
  3. Décapiter le rat et enlever le cerveau.
  4. Submerger le cerveau de rat dans l’azote liquide pendant 15 s à 5 min de la récolte de tissus.
  5. Equilibrer le cerveau à-20 ° C dans un cryostat pendant 1 h.
  6. Coupes de 30 µm et transfert sur glissières (voir Table des matières).
  7. Sélectionner les sections de la région du noyau accumbens, environ 2,76 mm à 2,28 mm antérieur Bregma14.
  8. Trancher en permanence le cerveau de rat de bulbe olfactif à travers la région du noyau accumbens selon la structure du cerveau stéréotaxiques du rat.
  9. Monter des échantillons sur les diapositives. Conserver les sections à-20 ° C pendant 10 minutes sécher.
  10. Immerger immédiatement les lames dans le paraformaldéhyde préalablement réfrigérées de 4 % pendant 1 h à 4 ° C.
  11. Déposer les lames dans un gradient croissant d’éthanol à température ambiante (RT) : 50 % EtOH pendant 5 min ; 70 % EtOH pendant 5 min ; et 100 % EtOH pendant 5 min.
  12. Répéter avec frais 100 % EtOH.
  13. Placer les lames sur du papier absorbant et sécher à l’air.
  14. Dessiner une barrière autour de chaque section avec un stylo de la barrière (voir Table des matières). Laissez la barrière sécher complètement pendant 1 min.

2. un pré-traitement des Sections du cerveau

  1. Allumez le four et réglez la température à 40 ° C.
  2. Ajouter 3 gouttes (90 µL) de réactif de prétraitement 4 (voir la Table des matières) sur chaque section du cerveau (une section par lame).
  3. Incuber les sections pendant 30 min à température ambiante.
  4. Submerger les diapositives en 1 x PBS PDT 1 min à RT. Repeat avec frais 1 x PBS.
    Remarque : Les diapositives ne devraient pas rester dans du PBS 1 x pendant plus de 15 min.

3. ARN In Situ hybridation fluorescente essai Multiplex

  1. Réchauffer la sonde de la cible pendant 10 min à 40 ° C dans un bain-marie et laisser refroidir puis RT.
  2. Placez le réactif RNA (p. ex., Amp FL 1-4) à température ambiante.
  3. Retirer le liquide en excès de diapositives avec du papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
  4. Ajouter 3 gouttes (90 µL) de la sonde Drd1α (C1) sur la tranche de l’échantillon. Incuber pendant 2 h à 40 ° C.
  5. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 minutes à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
  6. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
  7. Ajouter 3 gouttes (90 µL) d’Amp 1-FL sur la tranche de l’échantillon. Incuber 30 min à 40 ° C.
  8. Submerger les diapositives dans le tampon de 1 lavage pendant 2 min à RT. Repeat avec tampon de 1wash frais.
  9. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
  10. Ajouter 3 gouttes (90 µL) d’Amp 2-FL sur la tranche de l’échantillon. Incuber pendant 15 min à 40 ° C.
  11. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 minutes à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
  12. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
  13. Ajouter 3 gouttes (90 µL) d’Amp 3-FL sur la tranche de l’échantillon. Incuber 30 min à 40 ° C.
  14. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 min à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
  15. Retirer le liquide en excès les diapositives avec un papier absorbant et place sur la grille coulissante (voir Table des matières).
  16. Ajouter 3 gouttes (90 µL) de l’Amp 4-FL-Alt A sur la tranche de l’échantillon. Incuber pendant 15 min à 40 ° C.
  17. Plonger les lames dans 1 x tampon de lavage pendant 2 minutes à RT. Repeat avec frais 1 x tampon de lavage.
  18. Retirer le liquide en excès de diapositives et de placer immédiatement 2 gouttes de réactif de montage (voir Table des matières) sur chaque section.
  19. Placez une lamelle de 22 mm 22 mm (voir Table des matières) sur chaque section du cerveau.
  20. Conserver les diapositives dans l’obscurité entre 2 et 8 ° C jusqu'à sec.
  21. Allumez le microscope confocal et passer à un objectif de X 60.
  22. Obtenir des images de Z-pile avec un microscope confocal. Voir la vidéo supplémentaire pour une procédure détaillée d’imagerie confocale.
  23. Acquisition d’images de Drd1α marqué des cellules dans la région du noyau accumbens (Excitation : 488 nm ; Emission : 515/30 nm).
    Remarque : Ne pas laisser le cerveau sections sécher entre les étapes d’incubation.

4. analyse des données

  1. Semi-quantitativement analyser le modèle de coloration : « points discrets ».
    1. Pour identifier la cellule individuelle de l’image, effectuer la coloration DAPI comme marqueur nucléaire. Toutefois, il est toujours difficile d’analyser certaines parties du tissu cérébral, car il a plusieurs types de cellules avec une forme irrégulière de noyaux ou de cellules. Ici, deux chercheurs expérimentés assigner séparément chaque cellule d’images pour définir la zone de cellules.
    2. Le score visuellement chaque cellule dans les images confocales représentatifs basé sur le nombre de points par la cellule à l’aide de critères précis (Figure 1 b).
    3. Déterminer le nombre total de cellules dans chaque catégorie et diviser par le nombre total de cellules x100 pour créer des graphiques de fréquence relative qui affichent la fréquence pourcentage des cellules au sein de chaque catégorie pour toutes les coupes de tissus (Figure 2 a) et pour les hommes et les femmes séparément (Figure 2E).
    4. Diviser la somme des cellules dans toutes les catégories précédentes par le nombre total de cellules x100 pour déterminer la fréquence cumulée des cellules pour toutes les coupes de tissus (Figure 2 b) et pour les hommes et les femmes séparément (Figure 2F).
  2. D’analyser statistiquement les « points discrets » coloration motif (facultatif).
    1. Examiner le nombre de points par la cellule pour fournir une variable catégorique qui est ordinale en nature (c'est-à-dire, le nombre de cellules qui entrent dans chaque grade de plus faible expression de cellule (1) à la plus haute expression de la cellule (9)) pour approfondir les analyses statistiques.
    2. Après examen des statistiques descriptives, utilisez trois approches principales : une statistique de Mantel-Haenszel, un test U de Mann-Whitney et un test de Kruskal-Wallis. Bien que l’approche statistique précis sera dépendant de la question de conception et de la recherche expérimentale d’intérêt, un arbre de décision statistique (Figure 4) peut aider à prendre des décisions au sujet de son approche analytique.
  3. Quantifier l’intensité du signal dans la région d’intérêt (ROI) pour le modèle de marquage : « clusters ».
    1. Calculer l’intensité du signal de chaque image à l’aide de l’équation suivante :
      Intensité du signal = intensité totale de l’image ROI - (fond moyenne intensité × Total image zone)
    2. Compter le nombre total de cellules au sein de l’image ROI pour calculer l’expression signal approximative par cellule. Les différences de groupe dans l’intensité du signal/image ainsi que le nombre de cellules/image peuvent être intéressant d’examiner les mécanismes qui peuvent contribuer à des différences de groupe chez signal expression/cellule (Figure 3 b-3D).
  4. D’analyser statistiquement les « clusters » coloration motif (facultatif).
    1. Examinons l’expression signal/cellule afin de fournir une variable continue pour une analyse statistique plus poussée. Utiliser deux approches, y compris un échantillon indépendant t-test et analyse de variance (ANOVA), basé sur le nombre de facteurs inter-sujets incluses dans la conception. Un arbre de décision statistique (Figure 4) peut aider à prendre des décisions concernant l’approche statistique la plus appropriée.

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Representative Results

La présente étude a observé une « points discrets » modèle pour l’expression de RNA dans les récepteurs de la dopamine D1-alpha (Drd1α) de marquage du CNA rats F344/N (Figure 1 a). Signaux de fluorescence individuels ont été facilement identifiés et peuvent être considérées comme simples « points », qui représentent chacune un seul transcrit dans la cellule. Pour les images du CNA qui affichent les « points discrets » modèle de marquage, nous avons évalué la plage dynamique d’expression à l’aide d’une analyse semi-quantitative (Figure 1 a, Fig. 2 aet 2 b). Chaque cellule a été inscrit « 0-9 » basée sur le nombre de points par cellule. Ce « signal hybridée »-partition (H-score) méthode peut donc d’évaluer l’ampleur et la variabilité d’expression de Drd1α dans des cellules individuelles.

L’approche semi quantitative pour le « point discret » modèle de marquage fournit une variable catégorique qui est ordinale en nature (c'est-à-dire, le nombre de points par cellule classées de la plus basse (1) au plus élevé (9)) pour une analyse statistique plus poussée. Dans la présente étude, nous nous sommes intéressés en examinant l’effet d’un facteur inter-sujets (c.-à-d., sexe) sur l’expression de Drd1α dans le CNA. Pour tenir compte de la structure de données imbriqués (c.-à-d., deux images de Z-pile de Drd1α marqué des cellules dans le NAc ont été obtenues pour chaque animal), nombre moyen de valeurs ont été calculées pour chaque catégorie et utilisés pour l’analyse statistique (mâle : n= 3, femelle : n = 3). Compte tenu de nos intérêts lors de l’examen des différences dans l’un des facteurs inter-sujets (c.-à-d., sexe) avec deux groupes (c.-à-d., mâle, femelle) un U de Mann-Whitney a été testé pour évaluer les différences de numération médiane (Figure 2D). Un test U de Mann-Whitney a révélé un effet principal significatif du sexe [z=-5.8, p0,001], avec des animaux femelles, affichant un score de cellule médiane une diminution par rapport à des animaux mâles. Figure 2E et 2F illustrent la fréquence des cellules dans chaque catégorie à l’aide de deux méthodes : fréquence relative et la fréquence cumulée. Les femelles affichent une évolution significative dans la distribution, avec une fréquence plus grande des cellules dans des catégories inférieures ordonnées par rapport aux animaux mâles. Un test de Mantel-Haenszel syndicale a été mené pour examiner statistiquement la distribution, révélant un effet significatif du sexe [χ2MH(1) = 67.3, p0,001]. Ainsi, dans l’ensemble, les résultats suggèrent différences liées au sexe clair dans l’expression de Drd1α dans le CNA.

Dans les cas où le nombre de copies de la transcription est très élevé, les signaux peuvent apparaître comme des grappes. Ici, expression de tyrosine hydroxylase (TH) dans la région de la SNR a montré les « clusters » modèle (Figure 3 a) de marquage. Afin de quantifier ce marqueur exprimant le haut, nous tout d’abord en moyenne, l’intensité de l’arrière-plan de huit domaines de fond différent. Après avoir défini le seuil d’intensité minimale au-dessus de l’intensité moyenne, l’intensité de l’image ajustée a été analysée comme signal par cellule de Th

Compte tenu de nos intérêts en examinant un facteur inter-sujets (c.-à-d., sexe), un t-test d’échantillons indépendants est une méthode statistique appropriée. Pour l’analyse, les données étaient log-transformées. Pour tenir compte de la structure de données imbriqués (c.-à-d., deux images de Z-pile de TH étiquetés cellules SNR ont été obtenues pour chaque animal), les valeurs moyennes ont été calculées et utilisés pour l’analyse statistique (mâle : n= 2, femelle : n= 3). Animaux femelles affichent une augmentation significative dans l’intensité du signal moyen (Figure 3 b), évocateur d’un niveau plus élevé d’expression de TH total, par rapport aux animaux mâles (t(3) = 3,3, p≤ 0,05). Cependant, aucune différence significative de sexe ont été observés dans les deux le nombre de cellules par image (t(3) = 2.0, p> 0,05 ; La figure 3) ou la moyenne du signal expression par cellule (t(3) = 2.0, p> 0,05 ; Figure 3D). Une ANOVA mélangé-conception, considérant les trois mesures comme un facteur intra-sujet, a également révélé un effet principal significatif du sexe [F (1,3) = 10,6, p≤ 0,05].

Figure 1
Figure 1 : critères d’analyse semi-quantitative sur le nombre moyen de points par cellule pour modèle de marquage : « points discrets ». A. images confocales représentatifs (60 X) de l’expression de Drd1α à des scores différents (amplifié échelle de 250 % par rapport à la taille de l’image originale) B. La catégorie de « marquer » spécifique pour chaque critère. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : niveau de Dopamine D1-alpha récepteur (Drd1α) RNA dans la région de noyau Accumbens de rats F344/N. A. % la fréquence relative de chaque catégorie de « score ». B. une courbe dose-réponse sigmoïde ont donné un ajustement bien décrit (r2= 0,99) avec des intervalles de confiance 95 % (CI ; indiqué par les lignes pointillées) était apte au % de la fréquence cumulative de chaque catégorie de « score ». C. représentant images confocales (60 X) d’expression de la Drd1α chez les rats mâles et femelles, qui ont les « points discrets » modèle de marquage. D. Représentation graphique de la partition du cellulaire moyen chez les rats mâles et femelles. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM). E. % la fréquence relative de chaque catégorie de « score », comparant l’expression dans les tissus des rats mâles et femelles. F. les courbes dose-réponse sigmoïde ont donné un ajustement bien décrit (r2s = 0,99) avec des intervalles de confiance de 95 % pour le % de la fréquence cumulative de chaque catégorie de « score » entre les rats mâles et femelles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : niveau de Tyrosine hydroxylase RNA (TH) dans la région de la Substantia Nigra (SNR) chez les rats F344/N. A. les images confocales représentatifs (60 X ; Excitation : 543 nm ; Emission : 590/50 nm) de l’ÉNIÈME expression chez les rats mâles et femelles, qui ont les « clusters » modèle de marquage. B.-d. Analyse représentative de l’intensité du signal par cellule. Expression du signal / cellule peut être dérivé de quantifier l’intensité du signal de l’image (avec intensité seuil définie au-dessus de fond) et en divisant par le nombre de cellules dans le contrôle image. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : arbre de décision pour analyse statistique recommandée. L’arbre de décision fournit des lignes directrices pour la détermination dont l’analyse statistique est plus approprié pour la question de recherche d’intérêt. L’arbre de décision n’est pas exhaustive, et dans certains cas, d’autres analyses peuvent être appropriées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Dans le présent protocole, les auteurs décrivent une nouvelle technique d’hybridation in situ pour des tranches de cerveau frais congelé afin d’évaluer l’expression des récepteurs Drd1α dans le noyau accumbens (NAc) et expression de tyrosine hydroxylase (TH) dans la région de la substantia nigra (SNR). Nous fournissons également des méthodes d’analyse de données pour différentes colorations : « point discret » ou « clusters ».

Les étapes essentielles pour un succès fluorescence multiplex RNA essai in situ hybridation avec sont inclus. Une fois décapitant le rat et la suppression du cerveau, geler le cerveau dans l’azote liquide au sein de 5 min. Gardez les sections du cerveau à-20 ° C jusqu'à la fixation de paraformaldéhyde à 4 %. Après les 30 min d’incubation d’un prétraitement 4, les diapositives ne devraient pas rester dans du PBS 1 x pendant plus de 15 min. Ne pas laisser le cerveau sections sécher entre les étapes de l’amplification. Imagerie confocale est très utile pour fournir des images de haute qualité montrant des signaux clairs de coloration dans l’échantillon de tissu. Utilisation du four à hybridation rapidement et efficacement apportera les échantillons à 40 ° C.

Les signaux de fluorescence individuels de l’expression des récepteurs Drd1α dans le CNA ont été identifiés comme des « points » unique, chacun d’eux représentant un seul transcrit dans la cellule. Ce qui est important, « dot » taille reflète des différences dans les conditions expérimentales, préparation de l’échantillon et autres facteurs plutôt que les niveaux d’expression de l’ARN Drd1α. De même, l’intensité du signal de « points » n’est pas pertinente pour les niveaux d’expression de l’ARN Drd1α. Nous avons évalué la plage dynamique de cette expression comme une analyse semi-quantitative a marqué avec « 0-9 » basée sur le nombre de points par cellule, qui peut évaluer l’ampleur et la variabilité d’expression Drd1α. En outre, l’examen du nombre de points par cellule fournit une variable catégorielle pour approfondir les analyses statistiques.

Suite à l’examen des statistiques descriptives, notre protocole recommande trois approches principales pour analyser statistiquement les signaux qui présentent le « point discret » modèle, qui fournit une variable ordinale pour une analyse ultérieure de marquage. Plus précisément, un test non paramétrique de Mann-Whitney U, un test non paramétrique de Kruskal-Wallis et un test de Mantel-Haenszel syndicale sont recommandés. Un test U de Mann-Whitney et un test de Kruskal-Wallis sont plus appropriées lorsqu’un seul examen inter-sujets facteur (par exemple, sexe). En outre, un test de Mantel-Haenszel syndicale peut être approprié pour l’examen des changements dans la distribution. Des analyses statistiques plus complexes, y compris une équation d’estimation généralisée ou un modèle mixte linéaire général peuvent convenir lorsque des facteurs supplémentaires sont inclus. Les recommandations ne sont pas exhaustifs, et l’approche statistique précise sera dépendant de la conception expérimentale et la question de recherche d’intérêt.

Toutefois, dans les cas où le nombre de copies de la transcription est très élevé, les signaux peuvent apparaître comme des grappes. Ici, l’expression TH dans la région de la SNR a montré les « clusters » modèle de marquage. Afin de quantifier le marqueur de TH exprimant le haut, nous avons ajusté intensité de l’image en définissant le seuil d’intensité minimale au-dessus de l’intensité moyenne et analysés comme signal par cellule de Th Les signaux qui présentent le « cluster » modèle, de marquage tels que TH dans le SNR, peuvent être analysées statistiquement à l’aide d’un organisme indépendant d’échantillons tests t ou ANOVA pour comparer les groupes.

Il y a des limitations de ce roman RNA essai in situ hybridation avec. Pour le point « discret » modèle de marquage, il s’agit de la définition d’une cellule individuelle avec plus de précision. Dans notre étude, afin d’identifier la cellule individuelle de l’image, nous avons effectué la coloration DAPI comme marqueur nucléaire. Toutefois, il est toujours difficile d’analyser certaines parties du tissu cérébral, car il a plusieurs types de cellules avec des formes irrégulières des noyaux ou de cellules. Ici, deux chercheurs expérimentés assigner séparément chaque cellule d’images pour définir la région de la cellule. Pour les « clusters » modèle de marquage, logiciels spécifiques devraient être choisis pour configurer le seuil ou recognization cellule automatique.

Ainsi, l’innovants RNA essai in situ hybridation avec nous a permis d’étudier les mécanismes influencer l’absorption DA et DA communiqué simultanément, en améliorant la compréhension de la complexité du système striatal DA. Dans l’ensemble, les chercheurs auraient intérêt à cette nouvelle RNA in situ hybridation technique lors d’enquêtes sur des changements dysfonctionnels aux marqueurs dopaminergiques lors de l’apparition et la progression des troubles cérébraux.

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Disclosures

Il n’y a aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgments

Les présents travaux appuyés par les instituts nationaux de santé (NIH) subventions HD043680, MH106392, DA013137 et NS100624. Financement partiel est fourni par une bourse de formation de NIH T32 en science biomédicale-comportementale.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HybEZ Oven system Advanced Cell Diagnostics  310010
RNAscope Probe - Rn-Drd1a Advanced Cell Diagnostics  317031 Color channel 1, Green
RNAscope Probe - Rn-Th-C2 Advanced Cell Diagnostics  314651-C2 Color channel 2, Orange
RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit Advanced Cell Diagnostics  320850
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen Vector Laboratory H-4000
SuperFrost Plus Slides Fisher Scientific 12-550-154% 
4% paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127-500G
Sevoflurane Merritt Veterinary Supply 347075
Tissue-Tek vertical 24 slide rack Fisher Scientific NC9837976
Tissue-Tek staining dish Fisher Scientific NC0731403
Precision General Purpose Baths ThermoFisher Scientific TSGP28
Pretreatment 4 Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
ProLong Gold anti-fade reagent Life Technologies P36930
Amp 1-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 2-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 3-FL Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
Amp 4-FL-Alt A Advanced Cell Diagnostics  320850 parts of kits
EZ-C1 software package Nikon Instruments version 3.81b
SAS/STAT Software SAS Institute, Inc., version 9.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Neurosciences numéro 133 hybridation RNA récepteur de la Dopamine D1-alpha (Drd1α) in situ Neuroscience sexe biologique Rat
Identification de la Dopamine D1-Alpha du récepteur au sein de rongeurs noyau Accumbens par une ARN innovantes <em>In Situ</em> la technologie de détection
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Li, H., Illenberger, J. M.,… More

Li, H., Illenberger, J. M., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology. J. Vis. Exp. (133), e57444, doi:10.3791/57444 (2018).

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