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Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene

Biology

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Summary

Questo articolo illustra i principi di un'iniezione rapida, come minimo dilagante di microparticelle fluorescenti in circulatory system di piccoli pesci e la visualizzazione in vivo delle microparticelle in sangue di pesce.

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Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Karnaukhov, D., Sadovoy, A., Meglinski, I., Timofeyev, M. Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection. J. Vis. Exp. (136), e57491, doi:10.3791/57491 (2018).

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Abstract

La somministrazione sistemica di particelle micro-dimensione in un organismo vivente può essere applicata per la visualizzazione del sistema vascolare, droga e distribuzione del vaccino, l'impianto di cellule transgeniche e piccoli sensori ottici. Tuttavia, microiniezioni endovenosa in piccoli animali, che sono principalmente utilizzati nei laboratori biologici e veterinari, sono molto difficili e richiedono personale qualificato. Qui, dimostriamo un metodo robusto ed efficiente per l'introduzione di microparticelle nell'apparato circolatorio di adulto zebrafish (Danio rerio) tramite l'iniezione nel rene pesce. Per visualizzare le microparticelle introdotte nel sistema vascolare, vi proponiamo una semplice tecnica di imaging videomicroscopia nelle branchie di pesce. In vivo monitoraggio del pH del sangue di zebrafish è stato compiuto usando un fluorescente microincapsulati iniettato sonda, SNARF-1, per dimostrare una delle possibili applicazioni della tecnica descritta. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di incapsulamento di pH sensibili colorante e dimostra i principi dell'iniezione rapida e la visualizzazione di microcapsule ottenute per registrazione in vivo del segnale fluorescente. Il metodo proposto di iniezione è caratterizzato da un tasso di mortalità basso (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili. Tutte le procedure descritte possono essere eseguite su altre specie di piccoli pesci, come i guppies e medaka.

Introduction

La somministrazione di particelle micro-dimensione in un organismo animale è un compito importante in tali zone come droga e vaccino consegna1, sistema vascolare visualizzazione2, cellula transgenica impianto3e l'impianto piccolo sensore ottico 4 , 5. Tuttavia, la procedura di impianto per le particelle di Microscala nel sistema vascolare di piccoli animali da laboratorio è difficile, soprattutto per gli organismi acquatici delicati. Per campioni di ricerca popolari come zebrafish, è consigliabile che queste procedure essere chiarita mediante protocolli dei video.

Microiniezioni intracardiache e capillare richiedono personale qualificato e servizi di microchirurgia unico per la consegna dei microobjects nel sangue di zebrafish. In precedenza, un' iniezione manuale retro-orbitale3 è stato suggerito come un metodo facile ed efficace per la somministrazione di cellule intere. Tuttavia, nella nostra esperienza, a causa della piccola zona della rete capillare occhio, ci vuole molta pratica per ottenere il risultato desiderato da questa tecnica.

Qui, descriviamo un metodo per l'impianto di microparticelle solide ed efficienti nell'apparato circolatorio di iniezione manuale direttamente nel tessuto del rene di zebrafish adulto, che è ricca di vasi capillari e vasi renali. Questa tecnica si basa sul protocollo dei video per trapianto di cellule in zebrafish rene6, ma sono stati eliminati i passaggi di microsurgical traumatici e che richiede tempo. Il metodo proposto è caratterizzato da bassa mortalità (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili.

Una parte importante del protocollo proposto è la visualizzazione delle impiantato microparticelle (se sono fluorescenti o colorato) nei capillari gill, che permette di verificare la qualità di iniezione, una valutazione relativa approssimativa del numero di particelle iniettate e la rilevazione del segnale spettrale per misurazioni fisiologiche direttamente dal sangue circolante. Come esempio delle possibili applicazioni della tecnica descritta, dimostriamo il protocollo per in vivo misure di pH del sangue di zebrafish usando una sonda fluorescente microincapsulata, SNARF-1, originariamente suggerito nel Borvinskaya et al. 20175.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono stati condotti in conformità con la direttiva europea 2010/63/UE per gli esperimenti sugli animali e sono state approvate da animale soggetti ricerca comitato di Istituto di biologia all'Università statale di Irkutsk.

1. fabbricazione di microcapsule

Nota: Microcapsule che trasportano una tintura fluorescente sono preparati utilizzando un assembly di strato dopo strato di carica opposta polielettroliti7,8. Tutte le procedure sono state effettuate a temperatura ambiente.

  1. Per sintetizzare poroso CaCO3 microcarote che racchiude il colorante fluorescente, mescolare 2 mL della soluzione di SNARF-1-destrano (può essere usato più associato a polimero colorante fluorescente come FITC-BSA) ad una concentrazione di ~ 2 mg/mL con 0,6 mL ciascuna delle soluzioni di 1 mol/L di CaCl2 e Na2CO3 sotto veloce agitazione.
    Nota: Prestare attenzione alle diverse sensibilità di coloranti fluorescenti per photobleaching; Se viene utilizzata una sonda fluorescente sensibile alla luce (come SNARF-1), la manipolazione e lo stoccaggio delle microparticelle deve essere eseguite con come poca luce possibile.
  2. Dopo 5-10 s di agitazione, trasferire la sospensione alle provette microcentrifuga da 2 mL e centrifugare per 15 s a 10.000-12.000 g a pellet CaCO3 microcarote.
  3. Eliminare il supernatante, lavare i nuclei con ~ 2 mL di acqua deionizzata e risospendere il pellet agitando.
  4. Ripetere la procedura di centrifugazione-lavaggio tre volte in totale. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante.
  5. Incubare la microcarote per 1 min in un bagno ad ultrasuoni per ridurre la loro aggregazione.
    Attenzione: Non dimenticate di proteggere le orecchie con le cuffie.
  6. Per depositare il primo strato polimerico sui modelli, risospendere i nuclei in ~ 2 mL di una soluzione di 4 mg/mL di poly(allylamine hydrochloride) (PAH) in 1 mol/L NaCl.
    1. Tenere il microcarote soluzione per ~ 5 minuti con agitazione costante.
    2. Dopo 15 s di centrifugazione, scartare il surnatante con la PAH non associato. Lavare il microcarote coperto con acqua deionizzata, almeno 3 volte attraverso centrifugazione più e fasi di lavaggio. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante.
    3. Incubare la microcarote per 1 min in un bagno ad ultrasuoni per ridurre la loro aggregazione.
      Nota: Se il colorante fluorescente applicato è cationico, a partire da poli (4-Stirensolfonato di sodio) (PSS) in 1 mol/L NaCl (Vedi punto 1.7).
  7. Ripetere il passaggio 1.6 ~ 2 ml di una soluzione di 4 mg/mL di PSS (contenente anche 1 mol/L NaCl) per depositare il secondo strato polimerico sui modelli.
  8. Ripetere i passaggi da 1.6 e 1.7 sei volte a depositare 12 strati polimerici.
    Nota: Non è consigliabile prendere una lunga pausa (~ 12 h o più) nella procedura fino a ~ 3-5 strati sono stati depositati perché CaCO3 microcarote senza copertura tendono a cristallizzare. Si noti che copertura PSS provoca una maggiore aggregazione della microcarote, e la lunga pausa è consigliabile che solo quando PAH o poli-L-lisina innestato con polietilenglicole (PLL-g-PEG) è lo strato più esterno.
  9. Incubare il microcarote coperto a 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL ogni microprovetta) per almeno 2 h.
    1. Lavare il microcarote con acqua tramite centrifugazione sequenziale e passaggi di risospensione. Dopo l'ultima centrifugazione, scartare il surnatante.
  10. Per ottenere cavità microcapsule, sciogliere i CaCO3 modelli con l'aggiunta di 2 mL di 0,1 mol/L acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) soluzione acida (regolata a pH 7,1 con NaOH) per il microcarote coperto.
    1. Dopo ~ 5 min di incubazione, centrifugare le microcapsule per 45 s e scartare il surnatante con l'EDTA.
    2. Ripetere i passaggi da 1.10-1.10.1 due volte.
  11. Lavare le microcapsule con 0,9% NaCl tre volte attraverso centrifugazione più passi entro 45 s seguita da fasi di lavaggio. Dopo l'ultimo passo di centrifugazione, scartare il surnatante.
    Nota: La soluzione finale microcapsule iniettabile deve essere mantenuta sterile (ad esempio con l'aggiunta di ampicillina, 0,1 mg/mL), e i media dovrebbero essere biocompatibili con l'oggetto di indagine (isotonica media con pH neutro).
  12. Stimare la concentrazione di microcapsule preparate in un emocitometro sotto un microscopio a fluorescenza. Prendere una serie di immagini di microcapsule, misurare il diametro di circa un centinaio di microcapsule usando ImageJ9 o equivalente software e indagare la distribuzione di dimensione utilizzando un istogramma.
  13. Archivio ottenuto incapsulato sonda al buio.
    Nota: dopo diversi lavaggi in sterile 0,9% NaCl, le microcapsule possono essere conservate per mesi a 4 ° C. Si consiglia di non completa essiccazione delle microcapsule durante la conservazione.

2. preparazione del Setup ottico e calibrazione di microincapsulati SNARF-1

Nota: Misure di pH ruvido con microincapsulati SNARF-1 può essere fatta utilizzando immagini in due canali di un microscopio a fluorescenza7, ma in questo protocollo un microscopio a fluorescenza un canale collegato ad uno spettrometro di fibra è stato applicato.

  1. Inserire il corretto set di filtri di fluorescenza al microscopio fluorescente secondo le caratteristiche del colorante fluorescente applicata e accendere la lampada fluorescente.
    1. Estrarre la leva per gli oculari.
      Attenzione: Luce in eccesso può danneggiare la matrice di spettrometro. Così, assicurarsi che la leva sia in modalità "oculare", quando non viene utilizzato lo spettrometro.
    2. Collegare un'estremità della fibra ottica per lo spettrometro e l'altra estremità a un collimatore. Utilizzando adattatori, posizionare il collimatore nella messa a fuoco del tubo fotocamera o altra porta disponibile del microscopio fluorescente.
    3. Accendere lo spettrometro. Eseguire il programma di controllo di spettrometro e tarare lo spettrofotometro per misure.
  2. Per la calibrazione del batch microcapsule, mettere ~ 5 µ l della sospensione di microcapsule (microcapsule ~ 10 000 per µ l in acqua deionizzata) su un vetrino da microscopio e asciugare la goccia in un luogo buio (ad esempio, in un termostato a 35 ° C).
    1. Per calibrare le caratteristiche spettrali del microincapsulati SNARF-1, è possibile utilizzare una serie di buffer con diversi gradi di pH nell'intervallo ~ 6-9. Goccia ~ 10 µ l di un tampone sulle microcapsule secche con SNARF-1-destrano e coprire con un vetrino coprioggetti.
    2. Porre il vetrino di vetro sulla fase di microscopio. Individuare le microcapsule usando un obiettivo di 40 ×.
    3. Ruotare la leva di microscopio alla porta macchina fotografica. Registrare loro fluorescenza con lo spettrometro. Ruotare la leva indietro verso gli oculari.
      Nota: Assicurarsi che il segnale spettrale è ben oltre il livello di sfondo e garantire che le microcapsule nel campo di vista non sono in una bolla (passando ad un ingrandimento minore se necessario). Evitare illuminazione prolungata di microcapsule stesse. SNARF-1 è sensibile al photobleaching.
    4. Ripetere il passaggio 2.2.3 per diversi microcapsule 10 - 15 volte.
  3. Calcolare i rapporti di picchi di fluorescenza (ad esempio, utilizzando R o Scilab) per tutti gli spettri registrati e determinare la retta di regressione tra il rapporto mediano (per ogni buffer) e pH medio utilizzando la seguente formula:
    Equation 1
    Nota: SNARF-1 ha uno spettro con due picchi corrispondenti all'emissione della tintura protonata e deprotonato, e il rapporto tra le cime è sensibile al pH del mezzo. In questo studio, il rapporto tra l'intensità di fluorescenza per 605 e 660 nm viene utilizzato. Queste lunghezze d'onda vengono scelti a seconda del filtro utilizzato. a e b sono coefficienti da determinarsi di regressione non lineare (ad esempio, utilizzando R). Valori 0,15 e 1.1 sono, rispettivamente, i valori minimi e massimo di ho605/I660 osservati durante la calibrazione.
  4. Raccogliere circa 10 µ l di sangue di pesce da circa 5 animali adulti. Pesce posto in una capsula di Petri con 1 µ l/mL sospensione di olio di chiodi di garofano per anestesia di acqua e attendere che l'animale si trasforma sul suo lato e si blocca a pizzichi della pinna (solitamente ~ 2-3 min). Trasferire il pesce su un vetrino. Tagliare la coda di pesce con un bisturi e raccogliere circa 2 µ l di sangue di pesce da vena caudale.
    Nota: Per evitare la coagulazione del sangue, trattare l'incisione con l'eparina (5000 U/mL) e utilizzare tubi capillari in vetro eparinizzata e tubi per microcentrifuga per raccogliere il sangue.
    1. Circa 10 µ l di sangue con una pipetta sulla punta del microelettrodo a goccia e determinare il pH utilizzando un pH-metro.
    2. Goccia di sangue su un vetrino con microcapsule secchi e registrare il rapporto tra l'intensità della fluorescenza come descritto per i buffer di calibrazione (punti 2.2-2.3).
  5. Regolare il coefficiente lineare della curva di calibrazione per rendere la curva corrispondono le misurazioni nel sangue di pesce (per maggiori dettagli vedere Borvinskaya et al 20175).

3. preparazione iniettabile

  1. Rilasciare l'ago in acciaio dalla punta della penna dell'insulina (o siringa) rimuovendo la plastica con un bisturi affilato.
    Nota: Qualsiasi ago sottile (Ø0.33 mm o meno) o capillare di vetro (solitamente Ø1 mm) può essere preparato per microiniezione10,11.
  2. Inserire l'ago a metà del vetro microcapillary; rapidamente e delicatamente solder utilizzando un cannello a gas.
  3. Collegare il vetro microcapillary per la microinjector e sciacquarlo con acqua sterile tre volte. Assicurarsi che il liquido fluisce attraverso l'ago.
  4. Riempire l'impianto con acqua distillata.
    Nota: Assicurarsi che non ci siano bolle nel sistema.

4. iniezione

  1. Risospendere la soluzione ricostituita di microcapsule (in sterile 0,9% NaCl, o qualsiasi altro supporto utilizzato per le iniezioni, con una concentrazione di 0,5 a 6 milioni di microcapsule per microlitro) utilizzando il bagno a ultrasuoni per 1 min.
    Nota: Poiché le microcapsule tendono a precipitare, durante l'iniezione seguente, agitare il flaconcino con le microcapsule meccanicamente (tramite un rotore) o manualmente ogni pochi minuti per risospendere li e prevenire la loro aggregazione.
  2. Mettere il pesce in una capsula di Petri con anestetico (0,1 mL/L di olio di chiodi di garofano sospesa in acqua) per ~ 2-3 min. attendere che il pesce gira su un fianco e si blocca a un leggero pizzico della pinna.
  3. Usando un cucchiaio, trasferire il pesce fuori l'anestetico e inserirlo delicatamente su una spugna umida in posizione laterale con la testa verso sinistra (per destri) o verso destra (per persona di sinistra).
  4. Appena prima dell'iniezione, succhiare 1-2 mm di aria nel vetro capillare collegato con microinjector. Poi, caricarlo con circa 2 µ l di microcapsule dispersione.
    Nota: Prima dell'iniezione, la soluzione di microcapsule deve essere regolata alla temperatura a cui sono tenuti i pesci.
  5. Delicatamente e stabilizzare il corpo del pesce sulla spugna con mano non dominante.
    1. Trovare la linea laterale dei pesci. Selezionare mentalmente un segmento che si estende dall'opercolo fino alla fine della cavità addominale. Trovare la metà di questo segmento. Mettere l'ago 1 mm inferiore in direzione ventrale.
    2. Con un movimento di raschiatura, muovete delicatamente il pesce scale da parte e fare una puntura. Inserire l'ago nel corpo ad un angolo di 45° verso la superficie del tavolo.
    3. Spingere l'ago verso la spina dorsale fino a posizionarla con attenzione contro di esso.
    4. Circa 1 µ l di sospensione delle microcapsule di rilascio nel rene e ritirare lentamente l'ago.
      Nota: Per trovare il sito di puntura corretto più facilmente, è utile alla pratica trovando il rene di tronco di transilluminating i pesci usando una luce di fondo, come mostrato in Figura 2A e 2B.
  6. Sciacquare il pesce dalla testa alla coda con un flusso di acqua per rimuovere qualsiasi microcapsule versati al sito di iniezione.

5. visualizzazione in Vivo

  1. Utilizzare le forbici di dissezione per rimuovere il coperchio di gill dalla testa del pesce e denudare le branchie di pesce. Sciacquare le branchie con acqua.
  2. Usando un cucchiaio, trasferire il pesce a un vetrino da microscopio e posizionarlo sul palco del microscopio fluorescente.
    Nota: Assicurarsi che le branchie dei pesci non asciugarsi durante le procedure successive. Per evitare questo problema, periodicamente di bagnarli con acqua usando una pipetta di Pasteur (circa ogni 1-2 min).
  3. Oscurare la stanza e utilizzando basso ingrandimento (x 10 obiettivo) ispezionare le branchie per trovare le microcapsule fluorescente.
    Nota: Quando la procedura viene utilizzata per l'introduzione di alcune particelle fluorescenti nel sistema circolatorio di pesce, si consiglia di ispezionare le branchie di parecchi individui per particelle fluorescenti impreviste prima iniezioni. Branchie di selvaggio-tipo zebrafish non hanno autofluorescenza, ma in alcuni casi sporadiche particelle fluorescenti (come pezzi di cibo o simbionti unicellulari) possono essere presenti sulle branchie. Se necessario, tali particelle possono essere riconosciute sulla loro forma specifica base (ad esempio, pezzi di cibo hanno forma irregolare, a differenza di microcapsule sferiche) o dello spettro di fluorescenza (cioè, colori).
    1. Passare la lente di una magnitudo superiore (obiettivo × 40) e posizionare un microcapsule o un gruppo di microcapsule al centro del campo visivo.
    2. Ruotare la leva alla porta con uno spettrometro connesso. Registrare il segnale spettrale.
    3. Ruotare la leva indietro verso l'oculare.
    4. Ripetere le misurazioni per diversi microcapsule diverse volte.
  4. Trasferire i pesci nell'acquario con adeguata aerazione per il recupero.
    Nota: Con la minima pratica, è possibile effettuare l'iniezione e il segnale di registrazione a un ritmo approssimativo di 2-3 min per pesce. La misura può essere ripetuta per una individuale più volte con l'uso di dosi ripetute di basse, innocue di anestesia o un altro metodo di fissazione. Per l'osservazione a lungo termine, è necessario utilizzare un sistema con anestesia continua12.

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Representative Results

I risultati ottenuti provengono da una delle tre principali categorie del protocollo presentato: la formazione di microparticelle fluorescenti di incapsulamento di un colorante fluorescente (Figura 1), l'iniezione di rene di microcapsule con ulteriore visualizzazione in Gill capillari (Figura 2 e 3) e, infine, la in vivo spettrale registrazione della fluorescenza di SNARF-1 per il monitoraggio (Figura 4) i livelli di pH del sangue.

L'approccio a strati usando rivestimento dei core modello CaCO3 che racchiude la tintura da più strati di modo opposto addebitato polimeri (PAH e PSS) ed uno strato più esterno di un polimero biocompatibile (PLL-g-PEG) è un metodo semplice ed economico che consente di incapsulare diverse sonde fluorescenti come SNARF-1-destrano, FITC-BSA o altre (Figura 1A). Di conseguenza, Cave microcapsule di micrometrica dimensioni con conchiglie elastici semipermeabile stabile e caricati con il colorante fluorescente sono ottenuti (Figura 1B). Le microcapsule fabbricate da questa tecnica sono in genere non uniforme, con una distribuzione normale di dimensione delle particelle e caratteristico formato mediano in ogni batch (Figura 1С).

Figure 1
Figura 1 : A strati sintesi e caratterizzazione di microcapsule di polielettrolita cavo caricato con una tintura fluorescente. (A) schema di un'Assemblea di microcapsule (disegnata da uno schema simile pubblicato in Hurkou et al 20164). (B) foto di microcapsule cavi caricato con colorante fluorescente FITC-BSA. (C) dimensioni caratterizzazione del batch di microcapsule da Figura 1B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

L'impianto di microparticelle solide ed efficienti nel sistema circolatorio di piccoli pesci può essere eseguita tramite iniezione manuale direttamente nel rene pesce. La puntura nel sito corretto del corpo dei pesci (rene tronco) è cruciale per una consegna rapida di microparticelle di iniezione manuale. Il rene di pesce è un organo ematopoietico e contiene melanofori pigmentate, e così, è ben colorato. Perché è accoccolato tra camere trasparente della vescica natatoria, è facile individuare l'organo nell'animale intatto con pigmentazione debole o dal transillumination di piccoli pesci utilizzando una sorgente di luce di fondo, come mostrato nella Figura 2A e 2B.

Figure 2
Figura 2 : Localizzazione del sito corretto per l'iniezione del rene. (A) Trans-illuminazione di zebrafish dimostra la localizzazione del rene tronco (freccia). (B) schema illustra come identificare il sito di puntura corretto. La linea tratteggiata bianca indica la linea laterale del segmento addominale del pesce. La freccia indica il sito di puntura e la corretta direzione di iniezione verso la spina dorsale. La vescica natatoria è indicata dalla linea verde. (C) visualizzazione del rene di zebrafish dopo la rimozione di organi e la parete del corpo. Una freccia indica il rigonfiamento centrale del rene tronco. (D) una sezione sagittale istologica di d. rerio illustra l'anatomia generale degli organi interni del pesce adulto (macchia di H & E). (E) microfotografia di un rene di pesce (puntinato) scalato da (D) con una freccia rivolta verso il lume della vena cardinale posteriore. Gli asterischi indicano la vescica natatoria. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per verificare il successo della procedura di iniezione, è opportuno un rapido controllo visivo delle branchie a basso ingrandimento (obiettivo x10-20) dopo aver tagliato il pesce branchia copertura (Figura 3A). Nonostante la maggior parte delle microcapsule restanti al sito di iniezione o fuoriuscite nella cavità del corpo (Figura 3B), se l'iniezione viene eseguita correttamente, è possibile osservare le microcapsule fluorescente galleggiano liberamente nei capillari branchia della denudato pesci branchie immediatamente dopo l'iniezione (Figura 3). Se nessun particelle fluorescenti vengono rilevate nelle branchie, è possibile ripetere l'iniezione nella puntura stessa. Consegna di successo al flusso sanguigno dovrebbe essere ottenuta in circa il 70-90% del totale iniettato pesce.

Figure 3
Figura 3 : Iniezione di rene di microcapsule con ulteriore visualizzazione nei capillari branchia. (A) lo schema generale della consegna microcapsule nel flusso sanguigno zebrafish. (B) immagine fluorescente di un zebrafish dopo l'iniezione di microcapsule con colorante verde FITC-BSA (il sito di puntura è indicato da una freccia). (C) questa immagine delle branchie dei pesci, scalati da (B), dimostra il successo della fornitura di microcapsule di iniezione del rene (branchie di selvaggio-tipo zebrafish non hanno nessun autofluorescence). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Durante l'iniezione direttamente nel rene tronco pesce, vasta ecchimosi normalmente forma sotto il sito di puntura, indicanti il danno per i capillari del parenchima o i vasi renali. Non c'è nessuna perdita di sangue fuori dal corpo, perché la puntura sembra rapidamente contratto. Nonostante un'emorragia interna, gli individui possono ancora recuperare con circa 80-90% di sopravvivenza attraverso la procedura (tabella 1). È anche noto che specie di pesci possono rigenerare nefroni de novo dopo lesioni13,14. Se più del 20% di pesce stanno morendo, uno deve garantire che l'amputate viene eseguita correttamente.

Colorante fluorescente incapsulato n Concentrazione, microcapsule per µ l Volume di iniezione, µ l Diametro medio di microcapsule, µm Consegna di successo nella circolazione sanguigna pesce, % Mortalità dopo l'iniezione, %
1 h 1 giorno
Iniezione nel rene tronco
FITC-BSA 36 4 x 106 1.6 2.7 94 8 3
SNARF-1-destrano 29 3-6 x 105 1-2 5.1 72 7 12
RITC-destrano 20 6 x 106 2 2.0 70 0 0
0,9% NaCl 41 - 1-2 - - 5 0
Iniezione di retro-orbitale
FITC-BSA 9 1 x 105 2 4.2 11 22 0
RITC-destrano 11 6 x 106 1 2.0 9 18 0

Tabella 1. Sicurezza e l'efficienza della consegna di microcapsule nel flusso sanguigno zebrafish. Il successo della procedura è determinato dalla presenza di materiali fluorescenti nei capillari branchia pesce.

Se la concentrazione delle microparticelle iniettate è insufficiente, troppo poche particelle potrebbero essere disponibili per essere visualizzate rapidamente nelle branchie di pesce. Allo stesso tempo, una sospensione con una concentrazione troppo alta può intasare l'ago. In caso di strato dopo strato microcapsule assemblati con diametro mediano ~ 2-5 µm, una concentrazione di circa 4 * 105-6 * 106 microcapsule per µ l è ottima per il rilevamento senza sforzo nelle branchie di pesce dopo iniezione nel rene di pesce (tabella 2).

Concentrazione, microcapsule per µ l Numero di microcapsule in un microscopio campo visivo (obiettivo × 20) nelle branchie dei diversi individui (n = 7 a concentrazione)
4 x 106 > 100 > 100 0 > 100 ≈ 70 ≈ 50 > 100
4 x 105 ≈ 10 ≈ 20 0 0 ≈ 20 ≈ 40 ≈ 15
4 x 104 0 3 0 0 0 0 4
4 x 103 0 0 0 0 0 0 0

Tabella 2. Record del conteggio visivo di microcapsule contenenti FITC-BSA in d. rerio branchie dopo iniezione (1.6 µ l) nel rene tronco.

Il metodo proposto per l'impianto dei microparticelle nell'apparato circolatorio di pesce può applicarsi per in vivo monitoraggio del pH del sangue di zebrafish dalla sonda fluorescente microincapsulato, SNARF-1 (Figura 4). SNARF-1 ha uno spettro con due picchi corrispondenti all'emissione della tintura protonata e deprotonated (Figura 4A), così la calibrazione curve del rapporto tra i picchi a diversi pH dei media possono essere tracciati (Figura 4B). I componenti del sangue influenzano la lettura del incapsulato SNARF-1 (Figura 4B), che può essere valutato sperimentalmente tramite la misura simultanea di pH del sangue dal microcapsule e un pH-metro con un microelettrodo di vetro. Una curva di calibrazione putativo per microcapsule in zebrafish sangue dovrebbe essere tracciata spostando curva dei buffer per il coefficiente pari alla differenza di pH misurato sperimentalmente (Vedi Borvinskaya et al 20175 per dettagli).

PH del sangue nei capillari branchia zebrafish rimane stabile durante almeno alcune ore dopo l'iniezione di microcapsule (Figura 4). Allo stesso tempo, una breve esposizione hypercapnic conduce ad una diminuzione statisticamente significativa del pH del sangue, che dimostra l'applicabilità del metodo per la ricerca in vivo su piccoli pesci.

Figure 4
Figura 4 : Esempio rappresentativo di monitoraggio di zebrafish sangue РН di registrazione degli spettri di fluorescenza della tintura microincapsulato SNARF-1. (A) spettri di microcapsule preparate caricato con SNARF-1 nei buffer sodio fosfato a pH diversi. (B) le curve di calibrazione delle microcapsule di pH sensibili preparate nel buffer di fosfato di sodio e nel sangue di zebrafish estratti. Per tutte le misurazioni, è raffigurata la media ± deviazione standard. (C) un esempio rappresentativo in vivo monitoraggio di zebrafish sangue рН di tintura fluorescente incapsulata di SNARF-1 nei capillari branchia di zebrafish. In condizioni di controllo, pH del sangue rimane stabile durante 4 ore dopo l'iniezione di microcapsule, mentre 5 minuti l'esposizione sotto grave ipercapnia (900-1000 mg/L del disciolto CO2) provoca l'acidificazione del sangue di pesce. Asterisco indica una differenza statisticamente significativa dal gruppo di controllo parallelo con p < 0.01 (test U di Mann-Whitney). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Per dimostrare l'iniezione di microparticelle in zebrafish rene, abbiamo usato semipermeabile microcapsule caricati con un colorante indicatore. Così, il protocollo contiene le istruzioni per la fabbricazione di microcapsule usando l'Assemblea strato dopo strato di carica opposta polielettroliti7,8,15,16,17 ,18 (Figura 1A). Un vantaggio di questa tecnologia è che è facile da eseguire con attrezzature di laboratorio disponibili. A seconda delle condizioni e composti utilizzati, le microcapsule fabbricate possono variare da 0,5 a 100 µm con polielettrolita nanometri di spessore shell15. I parametri di sintesi descritti in questo risultato di manoscritto in microcapsule elastici composto da 12 strati (oltre lo strato finale biocompatibile) dei polimeri dimensioni (Figura 1B e 1C) di circa 2-6 µm. Il passo più importante per determinare le dimensioni di microcapsule è la formazione di microcarote il modello. Questo processo coinvolge la formazione spontanea di cristalli di carbonato di calcio, e di conseguenza, le particelle ottenute sono non uniformi. Quindi, una caratterizzazione della distribuzione di dimensione di microcapsule deve essere eseguita per ogni batch.

La tappa importante di questo protocollo è l'ottimizzazione della consegna delle microparticelle nell'apparato circolatorio di zebrafish senza l'uso di tecniche di micromanipolazione. La somministrazione di cellule intere di retro-orbitale iniezione precedentemente è stato descritto in dettaglio3. Nella nostra esperienza, tuttavia, non è facile per gli utenti meno esperti di ottenere l'efficienza di iniezione descritto dagli autori perché il seno di retro-orbitale è molto piccolo e si trova vicino alla faringe e archi branchiali, che sono facili da ferire accidentalmente con un ago. Da meno di un millimetro precisione è necessaria per le iniezioni, l'iniezione correttamente è un compito piuttosto difficile. Un'alternativa altrettanto veloce e più efficiente (tabella 1) è di iniettare direttamente nel parenchima del rene di pesce. Durante l'iniezione, l'ago meccanicamente danni renali capillari e vasi sanguigni (ad es., la più grande vena cardinale posteriore), che permette l'ingresso di microparticelle nell'apparato circolatorio (Figura 2E). Infine, il rigonfiamento centrale del rene tronco in zebrafish adulto è grande abbastanza (fino a 2 mm) per un'iniezione manuale senza attrezzature microsurgical.

Il corretto posizionamento dell'ago per iniezione è fondamentale per una corretta amministrazione manuale. Si può praticare trovando il rene di tronco in animali intatti da transilluminating pesci usando una luce di fondo, come mostrato nella Figura 2A e 2B. Lo schema in Figura 2B viene illustrato come eseguire correttamente l'iniezione. Se la procedura non riesce ad amministrare microparticelle nel flusso sanguigno, re-iniezione può essere fatto presso la puntura stessa entro un breve lasso di tempo con virtualmente nessun effetto sul tasso di sopravvivenza degli individui.

Iniezione nel rene tronco di zebrafish adulto (testato con successo anche su adulti guppy Poecilia reticulata) è un efficace metodo di consegna microparticella nel flusso sanguigno pesce con una mortalità animale ammissibile; Tuttavia, non è perfettamente adatto per l'amministrazione di droga a causa di variazioni del volume iniettato. Un punto debole di questa tecnica è una perdita significativa della soluzione fuori il rene nell'addome a causa della somministrazione rapida. Tuttavia, una quantità relativa di sostanza iniettata nel flusso sanguigno può essere approssimativamente stimata utilizzando la visualizzazione nei capillari gill (tabella 2). Non c'è nessuna limitazione rigorosa del volume iniezione, ma l'amministrazione di più di 1 µ l della sospensione sembra essere inefficace. I migliori capillari di vetro possono essere applicati per il microinjection; Tuttavia, perché un gran numero di microcapsule tende ad incitare l'aggregazione, si consiglia l'uso di 31-29G (Ø 0.33-0.25 mm) in acciaio aghi per evitare zoccoli nel lume dell'ago.

Il successo di consegna di microcapsule attraverso iniezione di rene nella circolazione sanguigna deve essere monitorato mediante l'ispezione rapida per la presenza delle particelle fluorescenti nelle branchie. Le branchie sono organi facilmente accessibili per le osservazioni in vivo . I filamenti di gill sono una rete di capillari sanguigni coperti da un sottile strato di epitelio respiratorio, che rende videomicroscopia imaging del sangue fluire nelle branchie particolarmente conveniente (una sorta di finestra ottica naturale). Per eseguire l'osservazione, la copertura di branchia della cartilagine può essere tagliata per esporre i filamenti. Questa procedura è sicura per i pesci, che possono vivere con le branchie denudate in acqua ben aerato senza una diminuzione della speranza di vita. Inoltre, le branchie dei pesci di grandi dimensioni possono essere esaminate al microscopio semplicemente spingendo l'opercolo fuori il modo di19. In caso di un'iniezione di successo, microparticelle fluorescenti appaiono immediatamente nelle branchie (Figura 3). Si noti che microparticelle impiantate sono dissolti considerevolmente il volume di sangue circolante e un ridotto numero di particelle raggiunga i capillari di gill, così sufficiente concentrazione di microparticelle dovrebbe essere selezionata per il rilevamento nelle branchie di pesce dopo iniezione nel rene di pesce (tabella 2).

La procedura proposta per l'impianto può essere applicata in una vasta gamma di studi condotti su diverse specie di piccoli pesci. Nonostante la tecnica essendo stato sviluppato e ottimizzato per iniezione di microparticelle fluorescenti nel sistema circolatorio, esso può essere applicato anche per l'impianto di micro non color/nanoparticelle o disciolti sostanze; Tuttavia, in questo caso l'efficacia dell'iniezione deve essere verificata in qualche altro modo. La procedura attualmente descritta è ottima per tali scopi come fisiologico monitoraggio utilizzando diverse ottiche micro - o nanosensori, visualizzazione del sistema vascolare, consegna dei vaccini o farmaci su alcuni vettori otticamente visibili e l'impianto di cellule geneticamente modificate.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Autori riconoscono notevolmente l'aiuto di Bogdan Osadchiy ed Evgenii Protasov (Università statale di Irkutsk, Russia) in preparazione del protocollo dei video. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione scienza russa (n. 15-14-10008) e dalla Fondazione russa per la ricerca di base (n. 15-29-01003).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SNARF-1-dextran, 70000 MW Thermo Fisher Scientific D3304 Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) SIGMA A9771 Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) SIGMA R9379 Fluorescent probe
Calcium chloride SIGMA C1016 CaCO3 templates formation
Sodium carbonate SIGMA S7795 CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) SIGMA 283215 Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) SIGMA 243051 Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) SuSoS PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride SIGMA S8776 To dissolve applied polymers
Water Purification System Millipore SIMSV0000 To prepare deionized water
Magnetic stirrer Stegler For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL Eppendorf Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL Eppendorf Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL F.L. Medical 28093 Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL Eppendorf Z640069 Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed BioSan For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL Eppendorf Z666513 Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L ELMY Ltd. To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner To reduce microcapsule aggregation
Head phones  To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid SIGMA EDS To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate SIGMA S9638 Preparation of pH buffers
Disodium phosphate SIGMA S9390 Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide SIGMA S8045 To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2 LOMO In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) Chroma 79010 Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro Ocean Optics Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m Ocean Optics To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A Thorlabs To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide Fisherbrand 12-550-A3 Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm Pearl MS-SLIDCV Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL Blaubrand BR708709 To collect fish blood
Clove oil SIGMA C8392 Fish anesthesia
Lancet No 11 Apexmed international B.V. P00588 To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL Calbiochem L6510-BC For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode Mettler Toledo To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm Becton, Dickinson and Company For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co 9201075 For injection procedure
Gas torch To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B NARISHIGE For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene SIGMA P5481 For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors Thermo Scientific 31212 To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL BRAND Z331767 To moisten fish gills

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References

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