前子宫内胚胎小鼠脑电穿孔和脊髓切片培养迁移 GABAergic 中间神经元的活体成像

Neuroscience

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Summary

在这里, 我们提供了一个低成本和可靠的方法来产生转脑脊髓切片培养的小鼠胚胎适合共焦显微镜和实时成像技术。

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Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

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Abstract

GABAergic 中间神经元 (INs) 是神经网络的重要组成部分, 它驱动着认知和行为。用于填充皮层的 INs 在腹侧前脑 (包括从内侧和尾部节显赫人士 (梅兰日兰、CGE)) 向背皮质板块迁移, 以响应各种内在和外在线索。多年来, 已经制定了不同的方法来基因操作特定的途径, 并调查它们如何调节在迁移过程中适当的动态骨架变化。在子宫内电穿孔广泛用于研究基因抑制或过度表达在亚型中的作用, 同时评估对形态学和最终位置的影响。然而, 虽然这种方法很容易用于修改径向迁移的锥体细胞, 但它在技术上更具挑战性, 当靶向 INs.在子宫内电穿孔产生低产量, 因为幼崽的存活率降低时电穿孔是在 e14.5 之前进行的, 就像研究梅兰日兰的习惯一样。在另一种方法中, 梅兰日兰外植体为梅兰日兰提供了方便的途径, 并促进了基因修饰的 INs 的成像。然而, 在这些外植体中, INs 迁移成一个人工基质, 缺乏内源性指导线索和丘脑输入。这促使我们优化一种方法, 使 INs 可以在更自然的环境中迁移, 同时规避在子宫内方法中的技术挑战。本文描述了胚胎小鼠脑中的前宫内电穿孔与脊髓切片培养的结合, 以方便地跟踪、图像和重建基因改造的 INs 沿着自然路径迁徙, 以应对内源性线索。这种方法既可以量化的动态方面的迁移与时间推移共焦成像, 以及详细分析各种形态学参数使用神经元重建的固定 immunolabeled 组织。

Introduction

皮质 GABAergic 中间神经元 (INs) 不同于它们的生化特性、生理特性和连通性, 它们在成熟网络中调解不同的功能 1, 2, 3 ,4,5。通过对12进行了广泛研究的遗传级联, 对皮质 INs 的不同亚型进行了严格的规范。大多数 (70%) 皮质 GABAergic 的起源于祖细胞的内侧节隆起 (梅兰日兰), 腹部定位胚胎结构, 并必须跨越较长的距离迁移到皮质板1,2,6. 当皮质锥体细胞从心室区 (VZ) 向皮质板块沿径向胶质组织支架进行径向迁移时, 不依附于这种支架的 INs 的切向迁移需要多种内在和外部提示, 吸引迁移神经元朝向皮质板块, 同时引导他们远离非皮层结构2,7,8。在退出细胞周期后, 在梅兰日兰的 VZ 中表达的化疗排斥信号会使 INs 被排斥在梅兰日兰中, 这会触发向皮质板块9,10的切向迁移。迁移 INs 避免纹状体与不同的排斥线索11 , 并在到达皮质板块后, 他们从一个切线切换到径向迁移模式, 并达到他们的最终层流位置, 部分是响应从金字塔的线索单元格12和其他蜂窝群13。对于其他神经元种群, INs 的迁移涉及各种动态形态学变化, 以允许神经元的实际运动。这种所谓的神经元运动的特点是重复循环三个连续步骤: 一个领先的进程的伸长, 核的主动顺运动 (nucleokinesis), 并撤回的尾随进程14。在迁移过程中, 通过许多内在和外在的线索来调节引导进程的分支和主动重塑, 以正确的方向指导 INs, 同时确定迁移的方向和速度14,15 ,16

在迁移中调节皮质的决定因素近年来得到了广泛的研究1,2,7,17,18,19,20,一些分子行为者的中断被假定导致神经发育紊乱, 如小儿难治性癫痫或自闭症频谱紊乱1,2,21,22,23,24. 因此, 开发了各种体外体内方法, 以极大地提高我们研究这个动态过程的能力, 如前所述25体外方法, 包括博伊登室法和条纹选择法, 提供了评估神经元迁移过程中特定基因或蛋白质的需求和细胞自主影响的最快和最可重现的手段,没有其他因素的影响25。当与实时成像82627结合使用时, 这些检测尤其有用。通过这些技术, INs 可以很容易地从 e13.5 梅兰日兰中提取出来, 并通过酶和机械分离被分离, 然后通过不同的信号通路和指导线索进行研究, 如前所示8,28.然而, 这些化验发生在一个人工细胞外基质中缺乏三维组织结构, 这可能会改变神经细胞的行为和细胞的性质, 可能影响细胞迁移和/或生存25。为了规避这些限制,体梅兰日兰外植体已被开发为一种替代工具, 用于量化迁移过程中发生的动态形态学变化以及诸如速度和方向14等参数, 29。生成梅兰日兰外植体相对简单, 在其他地方也被广泛描述为30。它需要在有吸引力或令人反感的提示25的情况下, 将梅兰日兰的小提取物涂在混合皮质细胞的单层上, 或者在胶和胶原蛋白的混合物中, 尽管后者是可选的31。梅兰日兰外植体允许高分辨率成像的疏生标记细胞, 简化了细胞内过程的研究, 如骨架重塑在领先的过程分支, 如前所示32,33 34和本研究中。梅兰日兰外植体已成功地用于评估在2D 环境中迁移过程中的动态骨架变化, 例如在特定的药理或趋化操作之后 (参见, 例如, Tielens et 201633).然而, 通过这种方法, INs 在一个人工矩阵中迁移, 这可能改变行为和实验结果的再现性和意义。

相比之下,在子宫内电穿孔能够在其本土环境中对 INs 进行遗传操作, 是一种广泛使用的方法, 可以快速有效地评估基因功能的增益和丢失的影响, 同时规避成本高昂且耗时的挖空和敲入策略25,35在子宫内电穿孔可能会偏向于祖细胞, 通过使用单元类型特定的促进器, 并将电极定位到丘脑结构, 包括梅兰日兰36。此外,在子宫内电穿孔允许在 1-2 天内及时表达实验性构造, 与使用病毒载体25构建表达式所需的 7-10 天相比。然而, 在祖细胞中的在子宫内电穿孔往往是低产量。的确, 虽然位于背心室区的锥体细胞祖体可以用在子宫内电穿孔中有效地转染, 但针对更多的腹部定位结构, 如梅兰日兰, 在技术上更具挑战性,特别是在小 e13.5 胚胎中, 胚胎致死率的高速度进一步降低了实验产量25

为了规避与体外梅兰日兰植块实验和体内在子宫内的的一些技术局限性电穿孔,体脊髓切片培养已经开发8,37, 38,39。大脑脊髓切片区域性提供了模拟体内条件的优势, 同时它比生成动物模型25更便宜, 而且耗时。事实上, 这些准备工作可以方便地访问梅兰日兰, 同时还可以通过特定的 INs 可视化, 并可与焦电穿孔结合, 调查在更具生理环境中迁移的 ins 中的特定分子通路8,39,40,41. 因此, 我们优化了脊髓文化的方法38, 我们结合前子宫电穿孔和时间推移共焦成像, 进一步评估的形态学和动态过程中发生在梅兰日兰的切向迁移过程中。本议定书是根据使用了前子宫子宫内脑电穿孔和脊髓切片培养的其他人进行调整和优化的, 以研究锥体细胞的迁移42,43和皮质 INs36,39,44。具体来说, 小鼠胚胎被斩首, 梅兰日兰是转的体在脑室注射实验质粒后, 允许更有效和精确的靶向梅兰日兰祖细胞比什么可以达到在子宫内电穿孔。然后将大脑提取并切片成全脑冠状切片, 可以培养几天, 从而允许连续跟踪和成像转染的 INs。这种方法通常标签为每脑切片 5-20 个切向迁移的 INs, 尽量减少达到统计学意义所需的实验迭代次数, 同时标记足够稀疏的神经元种群, 以确保容易分离单个神经元进行重建和精细形态学评估。此外, 与梅兰日兰外植体相比, 脊髓文化确保迁徙的 INs 接触到更自然的环境, 包括局部分泌的趋化因子和丘脑传入的投入。因此, 这种方法非常适合于量化转染的 INs 所采用的方向性和迁徙路径, 同时提供足够的解剖细节, 以便能够刻画出更精细的动态过程, 如领先的过程分支,nucleokinesis 和尾随过程撤回。

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Protocol

所有涉及动物的实验均由 Institutionnel 女佣 Pratiques avec Animaux de 研究所 (CIBPAR) 在楚圣贾斯汀研究中心批准, 并按照加拿大动物保育委员会指南进行实验动物的护理和使用 (Ed 2)。

此处描述的协议是在胚胎日 (e) 13.5 中对胚胎的电穿孔进行优化的, 此时在梅兰日兰派生的 ins 被主动生成之前, 在 CGE 派生的 ins 生产45,46的峰值之前。此外, 为了将电穿孔偏向 GABAergic, 我们使用在 ins 中有选择地表达的启动器 (例如, Dlx5/6启动器及其最小增强程序)47

1. 电穿孔和脊髓切片培养液的制备

  1. 准备125毫升无菌培养基。
    1. 测量125毫升的常规神经元特定培养基 (参见材料表, 用于配方) 在先前 UV 灭菌的生物安全柜中喷洒70% 乙醇的消毒瓶。添加2.25 毫升50x 无血清神经元特异补充剂, 1.75 毫升200mM 谷氨酰胺 (最终浓度0.5 毫米) 和6.25 毫升的热灭活马血清以前 aliquoted 在无菌条件下。彻底混合, 整除15毫升无菌锥形管, 并贮存在4摄氏度。
      注: 制备培养基可贮存3周至4摄氏度。
    2. 将 Botteinstein 的 N-2 配方48的100X 库存解决方案划分为150µL 整除数在无菌条件下, 并在20°c 处冻结直至使用。
  2. 制备 1 L 无菌人工脑脊液 (ACSF)。
    1. 在1升烧杯中测量800毫升蒸馏水。加入25.67 克蔗糖, 5.08 克氯化钠 (NaCl), 2.18 克碳酸氢钠 (NaHCO3), 1.80 克葡萄糖, 0.19 克氯化钾 (氯化钾), 0.15 克磷酸钙无水磷酸磷酸钠 (NaH2PO4), 1 毫升1M 库存 CaCl2. 2H2O 和2毫升1M 库存 MgSO47H2o 搅拌在室温下溶解。加蒸馏水达到总容积1升。
    2. 使用0.22 µm 过滤器, 将溶液过滤成消毒后的生物安全柜中的无菌瓶, 贮存在4摄氏度至1月。
  3. 在每次试验前, 在 ACSF 中准备4% 琼脂糖的新鲜溶液。
    1. 测量25毫升以前制备的 ACSF 在50毫升无菌圆锥管和添加1克的低熔点琼脂糖。
    2. 四十五年代在微波炉加热。为避免溢出, 每 3-4 秒加热时, 每次沸腾启动时, 打开管子让压力流出, 再关闭它, 并手动搅拌以混合琼脂糖。重复, 直到琼脂糖溶液是均匀的。保持琼脂糖溶液在42°c 在其余的实验, 以避免凝固。
      注意: 温度升高会损伤脑组织。

2. 注射用质粒的制备

  1. 拉玻璃微注射吸管
    1. 用适当的参数设置微拉拔器, 在所提供的空间中确保玻璃毛细管的安全, 并确保其以灯丝为中心。
    2. 按下拉按钮。
    3. 小心地去除新做的微注射吸管从热拉器和地方在盒或清洁培养皿, 直到进一步使用, 以避免损坏的小费。
  2. 建立生物安全柜与本实验所需的所有仪器 (见图 1A), 用70% 乙醇将生物安全柜中的所有仪器进行慷慨喷洒, 用 UV 光为 15-20 分钟消毒仪器和环境。
  3. 在灭菌步骤中, 在冰上解冻质粒 (4 °c)。
  4. 从库存溶液 (4 µg/µL) 到清洁1.5 毫升离心管中测量质粒的10µL。添加0.01% 的快速绿色 FCF。轻轻地混合, 旋转, 并保持在冰上, 直到使用。
    注: 最大准备 DNA 应根据制造商的协议, 使用无内毒素的最重要的试剂盒准备。DNA 可以可溶性在 TE 缓冲器或无核酸酶 H 2 O 和用染料溶液制备质粒, 但不需要在无菌条件下进行.应 aliquoted 质粒从最大的准备, 以避免多个冻融循环。在使用前, Aliquoted 质粒应与染料混合, 2 小时以上, 不应解冻进一步使用。
  5. 灭菌后, 准备纳米注射器如下。
    1. 选择一个以前准备好的玻璃微注射吸管储存在一个干净的盒子或培养皿, 并使用小镊子削减的尖端的吸管在斜面的方式, 以达到约15µm 外径。
      注: 这里给出的外径是一个近似的措施, 给用户一个想法, 我们在我们的实验中使用, 并已优化, 以方便穿刺的头骨的质粒注射, 而不损害大脑, 同时允许液体DNA 的加载和释放。外径可以通过观察玻璃微注射吸管并列在明亮的场显微镜下的测微刻度条上的切割尖端来测量。
    2. 用注射器填充微的 unpulled 端的矿物油 (排出所有的空气)。
    3. 按照制造商的说明, 在纳米喷油器中插入填充玻璃微。
    4. 空 2/第三的玻璃微 (保持足够的油, 以防止空气进入)。
  6. 在含有质粒/染料溶液的管中小心插入所制备的微, 并用质粒/染料溶液填充玻璃微。

3. 从孕妇中收集小鼠胚胎

  1. 每日监测雌性繁殖, 以评估阴道堵塞情况, 最好是每天同一时间 (下午)。日 e0.5 对应于第一天, 当阴道插头被观察。
    注意: 这里所描述的实验可以在野生型小鼠中进行。但是, 为了便于识别梅兰日兰并对所有 GABAergic (或特定的子集 (如梅兰日兰派生的 ins) 进行标记, 可以使用转基因动物 (例如: GAD67EGFP;Dlx5/6 的., 其中有一个有创报告的等位基因, 等等47,49)。在这种情况下, 注射的实验质粒应表达另一种荧光 (例如mCherryTdTomato), 以允许可与未转染的 ins (绿色) 进行比较的转染 ins (黄色) 的可视化。
  2. 在胚胎日 e13.5, 由颈部脱位牺牲雌性。
    注: 在牺牲时给出的麻醉药可能影响迁移和生存50,51 , 应避免。
  3. 按 C 节采集胚胎, 如下所示。
    1. 用70% 乙醇慷慨喷洒女性腹部。用一双消毒钳拉腹部皮肤, 另一方面, 用消毒的手术剪刀从腹部切开皮肤。
    2. 用第二对消毒钳和剪刀, 拉腹部筋膜, 并削减它, 而小心避免子宫。
    3. 使用第三对消毒钳和剪刀, 拉子宫角, 并把他们从骨盆腔。将解剖后的子宫角放置在一个无菌的60毫米培养皿中, 用神经基培养基补充氨基酸、维他命和无机盐 (参见材料表以供商业使用的产品)。
  4. 在无菌生物安全柜中, 使用两对细镊子 (每只手一只) 从胎盘中解剖胚胎, 用斩首将头颅分离。
  5. 锥切的一个无菌3毫升塑料转移吸管的尖端, 吸头和转移他们在一个新的无菌60毫米培养皿分层的固化黑蜡和填充相同的神经基补充培养基, 如上所述。
    注意: 这一步最小化污染物的转移 (老鼠头发, 血液)。黑色蜡用于在解剖过程中稳定头部。在这些过程中, 文化媒体不需要有氧。

4. 梅兰日兰脑室内质粒注射液和体外电穿孔

注: 在以前准备的生物安全柜中, 必须在无菌条件下执行以下步骤。

  1. 将60毫米的培养皿分层为黑色蜡, 并在生物安全柜内的双筒望远镜下, 将被斩首的头颅置于神经基补充培养基中。
  2. 稳定头部, 延髓部分面对右, 用细镊子与左手, 并使用纳米注射器在右手注入 1-2 µL 的质粒/染料溶液进入右侧脑室。
    注: 通过将两种质粒混合在摩尔浓度上, 通过共 electroporating 一 shRNA 表达质粒, 进行共表达实验。
  3. Electroporate 注射的大脑。
    1. 将磁头置于电极之间, 将负极定位背, 并平行于头部和正电极朝向头部的腹侧, 以梅兰日兰为目标。
    2. 一旦电极定位良好, 在500毫秒间脉冲间隔内, 为50毫秒提供4平方脉冲 40 V。
    3. 使用已置于生物安全柜中的镊子从电极上取出任何残余组织。
      注意: 这些参数已针对我们实验中使用的 electroporator 进行了优化。建议用户在使用不同类型的 electroporator 时预先进行优化测试。
    4. 对所有剩余的大脑重复步骤4.1 到4.3。
      注意: 尽管本协议描述了一个大脑所需的操作, 但在 electroporating 每个大脑之前, 可以依次注入多达4个大脑, 从而提高了产量。当2种或更多不同的质粒在同一实验中 (例如控制或实验粒) 被注射 (允许窝比较) 时, 这种策略特别有利。此外, 通过将电极完全平行于脑表面, 可以同时注入和 electroporate 大脑两侧以增加产量。

5. 脑解剖和脊髓切片培养

  1. 虽然仍然在生物安全柜的无菌环境中操作, 解剖大脑出头骨。
    1. 将针头插入每只眼睛, 同时小心地避免大脑, 使头部在黑色蜡层上稳定下来。
    2. 使用一对细镊子, 以保持颈部左侧和第二对细镊子撕裂皮肤从头骨, 从背部到前面。
    3. 一方面用镊子将头部侧向, 另一方面, 用另一双镊子仔细地将头骨在脑干的水平上切开, 然后轻轻地将头骨向上拉。每镊子, 在矢状平面 (中线) 上切开头骨朝向前面, 然后侧向切开以解放头骨碎片。
    4. 抬起脑干, 仔细切开脑膜和脑神经, 直到大脑完全脱离头骨。
      注: 5.1 中描述的所有步骤都应在安全柜的严格无菌条件下进行。
  2. 将大脑嵌入4% 低熔点琼脂糖切片。
    1. 用上面准备的琼脂糖溶液填充35毫米培养皿 (保持液体在42摄氏度)。
    2. 使用先前的割转吸管快速将转的大脑转移到琼脂糖填充皿中。把盘子放在室温下。
    3. 用金属棍搅动琼脂糖, 使大脑保持在井中间 (防止下沉), 并将大脑定位在与盘子平行的 rostro 尾平面上。当琼脂糖开始凝固时, 不要搅拌, 以免脑损伤。
    4. 用剃刀刀片切开围绕大脑的琼脂糖, 以形成一个长方形块, 在大脑周围留下 1-2 毫米的边缘。确保大脑的延髓部分垂直于块的前极限, 以利于后续切片步骤的方向。
    5. 为每个大脑重复。
      注意: 通过在不同高度设置每个大脑的同时, 通过形成单独的琼脂糖块, 可以一次切割超过一个大脑 (最大 3)。
  3. Vibratome 冠状部分和切片培养。
    1. 解冻一整除 100X N-2 补充 (150 µL) 在冰上, 并添加到15毫升 aliquoted 培养基在无菌条件下。
    2. 将750µL 培养基 (用 1X N2 补充) 输送到6井培养板的每一个井中。
    3. 用弯曲的镊子, 安置一个细胞培养插入物 (30 毫米直径, 0.4 µm 孔大小, PTFE) 在每个中等填装的井。
    4. 用连续含氧 ACSF 填充 vibratome 浴。冷却到4°c 与周围的冰浴, 或使用冷藏 vibratome。
    5. 将 vibratome 速度设置为0.150 毫米/秒, 频率为80赫兹。
    6. 将琼脂糖块粘附在 vibratome 平台上, 延髓边缘朝下, 面对用户的腹边边缘。
    7. 切割冠状部分的大脑, 以获得250µm 厚的部分 (在4摄氏度)。
    8. 与灭菌铲子, 收集 2-3 个部分包含梅兰日兰, 并把所有的大脑部分从一个动物在一个单一的30毫米膜插入, 而小心避免节之间的重叠。将插入物放置在6井培养板的一个井中 (如上所述), 其中包含750µL 的补充培养基。另外, 每节可以放置在一个单独的13毫米直径膜在一个12井培养板填充500µl 补充培养基。为每个井推荐的培养基数量允许大脑部分在不被淹没的情况下由培养基滋养。
      注: 5.3.6 和5.3.7 中描述的步骤在完全不育条件下不进行, 除非 vibratome 可以在生物安全柜中进行灭菌和使用。因此, 必须小心地采取这些步骤, 以避免任何污染。适当的防护设备 (清洁口罩、手术手套和实验室大衣) 应佩戴在任何时候和身体部位, 甚至覆盖, 如头发, 脸部和手, 不应该通过文化板块 (有或没有培养基)。它还建议经常喷洒70% 乙醇的手套和铲子用于收集大脑部分。
    9. 将文化板块放在通风不育的孵化器中, 温度为37摄氏度, 湿度为 60%, 5% CO2为48或 72 h。
      注意: 这些潜伏期被优化为梅兰日兰的时间推移成像和固定切片共焦成像。每个实验设计都应预先测试最佳潜伏期。此外, 如果选择的孵化是72小时和下, 没有必要改变培养基。对于较长的潜伏期, 培养基应每 2-3 天改变一次。
    10. 在理想的孵化时间后, 将感兴趣的部分转移到一个8腔的盖玻片中, 并添加 3-5 µL 培养基。将盖玻片放在环境室 (37 °c, 60% 湿度, 5%CO2) 上, 连接到一个倒置的旋转圆盘共焦, 配备了计算机辅助的采集软件来设置时间推移成像会话。
      注: 或者, 节可以固定与4% 多聚甲醛 (隔夜在4摄氏度或2小时室温), 随后 immunostained 与不同的抗体, 以可视化的形态学特征的转在共焦显微镜。虽然 eGFP 和 mCherry 可以通过共聚焦显微镜可视化, 没有任何反染色程序, 我们建议对 GFP 和 mCherry 进行免疫组化, 以增强信号, 因为固定过程可以减少荧光, 减少检测胚胎神经元的较细成分, 如前导或尾随过程中较小的分支。

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Representative Results

在这一节中, 我们提供了具有代表性的结果后, 在前子宫内电穿孔的控制质粒, 或一个实验质粒靶向感兴趣的基因, 在 e13.5 小鼠胚胎梅兰日兰后脊髓切片培养孵化37°c 为48小时 (用于时间推移成像) 或 72 h (用于固定和免疫组化标记) (请参见图 1B用于示意图协议)。还说明了从梅兰日兰外植体迁移的 INs 的代表性示例 (参见图 1C的示意图协议), 作为与此处描述的方法的比较。梅兰日兰祖细胞中质粒的电穿孔似乎延缓了梅兰日兰的退出, 培养时间必须相应调整。

在一个成功的实验中, 在共焦显微镜下, 脊髓切片看起来是健康的, 即皮质层很容易区分使用明亮的场模式, 并没有明显的污染在切片表面 (可识别的强烈自体荧光和荧光丝在荧光下可见的存在。在健康的慢性脊髓切片中, 大约20% 的细胞在 72 h 的培养后发生凋亡 (图 2), 如先前在慢性脊髓培养 (如产后培养)52中所述。尽管如此, cytoarchitectural 的大脑结构仍有很好的定义, 如使用 DAPI 染色 (图 2A) 所示。我们的梅兰日兰体外电穿孔协议平均每片 50-100 转染细胞 ( 图 3A, B), 其中 5-20 细胞将被看见迁移背在 72 h 以后在文化中。在固定和免疫组化染色后, 向皮质板迁移的 INs 可以很容易地用共焦显微镜识别, 因为它们呈现一个拉长/椭圆形的细胞体, 偶尔的尾随过程, 和一个领先的过程定向切向。主导的过程通常导致一个或两个分支并且是可认识的在核前面的偶尔的肿胀 (住房中心体在 nucleokinesis 之前) 和生长锥体在每个分支的末端。(图 3C-G)。

本协议的设计目的是观察在单细胞水平上迁移梅兰日兰的方法, 利用时间推移成像。对于此特定的实验 (图 4), 从 Dlx5/6 脊髓中生成了日冕的脑切片;RCEEGFP 胚胎转在 e13.5 上, 用质粒表示实验性 shRNA (针对感兴趣的基因) 和TdTomato卡带。切片被孵化48小时, 转移到一个8井腔盖玻片盘 (每室1片漂浮在一薄层补充培养基) 和成像每3分钟 6-8 h 使用20x 空气 (0.70 NA) 目标在倒置显微镜装备具有旋转圆盘共焦头、计算机辅助采集软件和舞台顶部环境室。在成像过程中, 切片保持在37摄氏度, 并在环境室 (5% CO2和 60% H2O) 中持续加氧和湿润。转梅兰日兰派生的 INs 由它们的 eGFP 表达式、确认其在标识中的 GABAergic 以及TdTomato的表达式确定, 确认它们表示实验质粒 (图 4A, B)。转 INs 很容易识别和隔离, 如图 4所示, 允许对迁移动态参数 (如速度和距离) 进行更细致的分析。此外, 被标记的 INs 被看到向皮质板块迁移, 而在它们的自然环境中, 使我们能够识别动态形态学变化, 如主导过程和 nucleokinesis 的分支 (图 4C-f)。

梅兰日兰衍生 INs 的体外电穿孔也可以与梅兰日兰外植体结合使用, 以使迁移过程中发生动态骨架过程的高分辨率成像成为对方向性和迁移动力学研究的补充. 在脊髓文化中。作为一个例子, 神经元运动的不同阶段, 让人联想到在脊髓切片培养中, 在转移出的梅兰日兰外植体48小时后, 可以观察到在移植过程中发生的变化, 如引导突起扩展名和 nucleokinesis (图 5B-E)。然后, 可以在从梅兰日兰外植体迁移的分离细胞中高分辨率地研究各种骨架过程, 例如用罗丹明 (图 6A) 染色 F 肌动蛋白结构, 这在脊髓切片中无法最佳实现。在本机环境中考虑到高细胞密度 (以及骨架元素)。这些骨架过程, 特别是 F 肌动蛋白重塑, 可以进一步研究的动态结合 Lifeact 表达与时间推移成像。例如, 我们展示了一个从 Nkx2.1 的梅兰日兰外植体中获得的高分辨率时移成像的例子;RCEEGFP 鼠标大脑携带有目标的删除对 INs 感兴趣的基因。这在 mCherry-Lifeact-7 质粒被转染了在巨细胞病毒促进者的控制下 (礼物从迈克尔戴维森), 使用方法图解在图 1C, 允许跟踪 F 肌动蛋白重塑实时发生 (图6B). 因此, 尽管脊髓文化需要适当地评估基因修饰的 INs 的方向性或迁移路径, 梅兰日兰外植体还可以通过提供更好的途径对分离细胞进行高分辨率成像, 来补充这种研究。动态骨架过程。

技术缺陷可能导致上述实验失败。例如, 将大脑嵌入到42摄氏度以上的琼脂糖溶液中, 会导致组织破坏和神经元死亡, 这是由于大脑或切片的半透明性丧失所揭示的。然而, 温度不应保持过低, 因为凝固琼脂糖溶液可以破坏脆弱的胚胎大脑在嵌入过程中。其次, 污染可以显著降低这里描述的实验方法的产量。因此, 所有的步骤都应该小心地进行, 在严格的无菌条件下尽可能多的可行。所有的解决方案和设备应在使用前消毒, 设备应经常喷洒70% 乙醇, 以避免细菌或霉菌的污染。污染可以直接在养殖井中看到, 因为培养基变得黄色或不透明。当培养基保持清澈和流动时, 污染可能会被忽视。然而, 切片表面上的一层霉菌通常可以观察到, 或者切片在固定和染色步骤中变得过于脆弱。当这种切片在显微镜下可视化时, 污染可能会被标记为神经元的一层自体荧光, 或者被长荧光丝的存在所揭示。在被污染的井中保存的脊髓切片应该被扔掉, 但是在同一板块的其他井中培养的切片可以保留以作进一步的步骤。细菌污染是相当罕见的, 但应认真对待, 这意味着所有设备, 包括共享孵化器, 和文化室, 应手动清洁和消毒。

Figure 1
图 1:前子宫内电穿孔协议的示意图表示法, 后跟脊髓切片培养或梅兰日兰外植体。a.安全柜安装的示例, 其中介绍了该议定书所需的所有灭菌仪器。B. 用于前宫内电穿孔和脊髓切片培养的协议的示意图表示。简单地, 胚胎被斩首, 实验质粒注射在侧脑室 (1) 和转在梅兰日兰 (2)。大脑被 microdissected 出头骨 (3) 并嵌入琼脂糖 (4)。脊髓节是在 vibratome (5) 上生成的, 并置于37°c (6) 的区域性, 用于时间推移显微镜 (7.1) 或 72 h 用于细胞重建 (7.2)。C.由迈尔斯et . 201353改编的协议的示意图表示形式, 用于生成梅兰日兰外植体。简要地, 侧皮层首先从 e12.5 到 e14.5 野生型小鼠胚胎 (1), 并机械分离在补充培养基 (2)。皮质细胞在密度为 5.25 x 105皮质细胞/cm2和培养 2 h 在37摄氏度在胶原/聚 l-赖氨酸涂层8腔盖玻片 (3)。然后, e13.5 Dlx5/6.;RCEEGFP 对梅兰日兰 (4、5) 的子宫内电穿孔进行处理, 梅兰日兰被手动从大脑中分离, 并在100µm2片段 (6) 中进行切割。然后将这些外植体放在先前准备好的皮质饲养层上, 用培养基覆盖, 在时间推移成像 (7) 前共培养48小时。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 保存在健康脊髓切片中的细胞构筑。Nkx2.1 脊髓的体外电穿孔后生成的切片培养 ;RCEEGFP 小鼠胚胎 (A) 不会造成明显的组织损伤, 如保存的细胞构筑 (DAPI (蓝色) 和创能报告 (GFP)) 所揭示的, 当与µm 的 18 cryosection 厚的 Nkx2.1 进行比较;RCEEGFP 胚胎 transcardially 在 e15.5 中灌注4% 粉煤灰。D 和 M 分别表示 dorso 腹和 latero 内侧轴。(B). 用反裂-Caspase 3 抗体 (Cl-cas3) 染色的倒置共焦显微镜拍摄的高放大图像显示, 在皮质板块中约20% 的细胞经过细胞凋亡 (白色箭头) 在文化中72小时之后, 而 GFP 阳性的 INs 保持健康 (白色箭头), 如c-c "'中的显微照片中所示。相比之下, 细胞凋亡几乎完全没有从瘦 cryosection 从灌注动物 (d-d) ")。缩放条: 250 µm (a B) 和15µm (C D "')。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 脊髓切片的小鼠脑胚和高放大率显微照片转中间神经元 (INs)。a.Dlx5/6脊髓的切片区域性。RCEEGFP 鼠标大脑 (所有 INs 都是绿色的) 转与Dlx5/6::shRNA-IRES TdTomato质粒。切片是固定的4% 粉煤灰后, 72 小时的文化, 和 immunostained 的 GFP 和 mCherry。转 INs 是在 3D (50-60 µm 厚 z 栈与光学部分采取每0.5 µm) 使用共焦显微镜配备了 63 x/1.3 NA 油目标。在背大脑皮层的亚心室区内移切的 INs 容易辨认 (红色, 打开箭头)。D 和 M 分别表示 dorso 腹和 latero 内侧轴。B.一个代表性的脊髓切片区域性, 从 wildtype (小波) 胚胎 electoporated 与控制Dlx5/6::shRNA-IRES-TdTomato质粒, 固定在 72 h 和 immunostained 仅为 mCherry。转 (红色) 被看见向皮质板块迁移背。转 INs 由它们在 Dlx5/6中 TdTomato 和 EGFP 的共同表达式标识;RCEEGFP 鼠标 (C D), 或者, 它们只在小波 (E H) 中表达TdTomato , 以及它们的典型形态学, 即椭圆形细胞体、分支前导过程 (白色箭头、 d-H),偶尔的尾随过程 (白色箭头、 C D) 和在 nucleokinesis 之前 (在c-c 'G中的中心体) 之前的前导进程的偶尔肿胀。缩放条: 250 µm (A B) 和25µm (c/c++)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4: 为48小时培养的脊髓切片中转的时间推移实时成像.INs 转在 e13.5 与一个实验质粒表达的TdTomato盒和 shRNA 靶向基因感兴趣的是从一个脊髓的大脑切片获得从一个 Dlx5/6 的研究;RCEEGFP 48 h 后的鼠标胚胎 (A,白色正方形)。在B中, 在 nucleokinesis 过程中会看到相同的转 (白色正方形), 同时在皮层中偏移切向, 即平行于脑膜表面, 并在每次3分钟后以8小时的时间推移成像, 使用 20 x/0.85 NA 空气目标 (放大框, -f)。神经元最初在 nucleokinesis (C) 的过程中显示细长的单元体 (打开箭头), 以及尾随进程 (白色箭头) 和分支前导进程 (白色箭头)。在3小时的实时成像后, nucleokinesis 完成, 尾随进程已收回, 前导进程扩展两个长分支 (D, 白色箭头)。在5小时30分钟后, 其中一个前导进程分支已缩回 (白色箭头), 神经元单元体 (打开箭头) 向前移动了约10µm (E)。最后, 在8小时的成像后, 迁移停顿了, 神经元再次扩展了其前导过程, 并出现了一个尾随进程 (白色箭头), 但原子核 (打开箭头) 尚未向前移动 (F)。刻度条: 250 µm (A), 70 µm (B) 和30µm (C F)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 5
图 5: 从培养为 48 h 的梅兰日兰外植体派生的 INs 的时间推移成像.在从 Nkx2.1 梅兰日兰的外植体中获取的外接程序被视为从;RCEEGFP 鼠标 (在其中所有梅兰日兰派生的 INs 表示 EGFP) 转与CMV::mCherry-LifeAct-7质粒在 e13.5, 使用适应的方法从迈尔斯et , 201353和图解在图 1C,并培养为 48 h (A)。INs 是使用 5 h (B E) 的延时实时成像进行可视化的。在这个例子中, 一个在共同表达 eGFP 和 LifeAct 的过程中最初看到的 nucleokinesis (打开箭头) 和扩展两个领先的进程分支 (白色箭头;B). 这在完成 nucleokinesis 在 1 h 以后 (参见打开箭头), 当细胞身体向前移动了, 并且一个尾随的过程出现了在细胞身体的后方 (白色箭头), 并且仍然显示一个带领的过程与二个分支 (白色箭头;C). 在2小时30分钟 (打开的箭头) 之后, 第二个 nucleokinesis 正在进行中, 现在赋予了两个由细胞体产生的主要过程和一个较长的尾随过程 (白色箭头;D). 最后, 在 5 h 以后, 在缩回一突起, 而转运中心体在剩余的主导的过程分支 (白色箭头) 为第三个 nucleokinesis 的准备, 与尾随过程 (白色箭头) 仍然存在在后方单元格体 (E)。缩放条:70 µm (A) 和20µm (B E)。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 6
图 6: 用于 48 h.a. 的梅兰日兰外植体中的肌动蛋白重塑的高分辨率时移成像方法Nkx2.1 的脊髓切片;RCEEGFP 鼠标大脑是固定在 e15.5, 染色 Alexa-594 罗丹明, 允许可视化丝状肌动蛋白。INs 在共聚焦显微镜上使用 63 x/1.3 NA 油目标成像。在健康的人, 丝状肌动蛋白被视为拔罐后方的细胞体后撤回后的后续进程后, 完成 nucleokinesis (白色箭头, a '')。B.从 Nkx2.1 梅兰日兰中获得上述外植体;RCEEGFP 鼠标大脑携带有目标的删除感兴趣的基因和转的质粒表达 mCherry-Lifeact-7 控制下的巨细胞病毒启动子。在48小时的培养后进行时间推移实时成像, 转 INs 每3分钟跟踪3小时, 使用 40 x/0.85 空气目标。肌动蛋白细胞骨架的主动重塑发生在转染与 LifeAct, 如由红色 (黑白图像中的白色) 在主导的过程和生长锥 (白色箭头) 中的荧光点, 并在后方nucleokinesis 期间的单元格体 (b-b ' ', 白色箭头)。缩放条: 7 µm (a a ") 和10µm (b b")。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

在本文中, 我们提供了一个可靠的方法来执行前子宫内电穿孔的小鼠梅兰日兰在 e13.5 和脊髓培养胚胎脑切片。虽然体外方法 (如博伊登室化验) 相对容易执行, 可用于评估不同基因和蛋白质在不受其他因素干扰的情况下的具体作用, 但它们排除了在关于方向性和迁移路径的迁移动态25。梅兰日兰外植体提供了一种有用的方法来研究在迁移过程中发生的动态骨架变化, 正如我们在这里所展示的, 但它们缺乏大多数内源性的线索, 而且常常需要添加指导线索来促进神经元迁移 (尽管这是在皮质送纸层上培养梅兰日兰外植体时显著改善)25,54。然而, 基于梅兰日兰外植体的化验方法可能无法检测到更微妙的机制 (如引导 INs29的特定方向性或迁移路径) 所涉及的分子线索的含义。此问题最终由在子宫内电穿孔25中规避, 它允许在其本机环境中迁移的梅兰日兰派生的 INs 的特定标签,13,29,41。然而, 这项技术是技术上的挑战, 由于所涉及的手术程序, 其产量受到限制的低存活率的胚胎和事实, 梅兰日兰是很难靶向在子宫内, 往往需要使用多个凋落物来达到意义55。因此, 梅兰日兰的前子宫内电穿孔, 其次是小鼠脑胚脊髓培养, 提供了一种低成本、高效、可靠的方法来调查梅兰日兰的迁移动力学和形态学, 其自然环境, 同时绕过在子宫内电穿孔的手术程序和需要在梅兰日兰外植体中的指导线索。此外, 这种技术允许更容易地进入梅兰日兰, 这可以被直接 apposing 在颈部下的阳性电极和头部顶部的阴性, 这一配置更难以采用在子宫内。或者, 在生成脊髓切片132529之后, 梅兰日兰可以直接局部注入和转, 但这一技术在我们手中已证明更加困难和不那么有效。比这里描述的协议。按照本文中描述的步骤, 您将获得每脊髓切片的 50-100 转梅兰日兰派生的 INs, 5-20 将被视为在 72 h 之后从梅兰日兰中移出. 转染的 ins 可以可视化实时成像或成像和重建后的固定和免疫组化标记。

此处描述的协议被优化为在迁移 "体" 中进行研究, 并受到各种已发布的协议的启发, 其中描述了 在子宫内电穿孔中的梅兰日兰派生的 INs、体梅兰日兰注射液和电穿孔, 或世代慢性脊髓脑切片培养36,38,39,42,43,56,57,58。我们的方法限制了梅兰日兰祖细胞的潜在损害, 使用较低的脉冲强度 (40 v) 和脑室质粒注射, 而不是梅兰日兰内注射高压脉冲 (100 V), 如其他地方所述39,56 ,57,58。此外, 虽然其他人使用青霉素, 链霉素和庆大霉素的结合, 以防止细菌污染39,56,57,58, 我们选择了避免抗生素在我们的文化媒介中, 因为它们在迁移过程中具有理论上的影响。特别是青霉素是 GABA 的拮抗剂A受体59,60和 gabaA受体活化激活和以后停止迁移取决于细胞内氯化物梯度和 KCC2在迁移61的各个阶段中的表达式。然而, 使用现行议定书中规定的各种预防措施, 即使在没有抗生素的情况下, 也可以有效地避免污染。

尽管这种方法在我们手中的效率,前子宫内电穿孔也有它的缺点。虽然为细胞迁移提供了一个自然的三维环境, 但在迁移过程中, 在脊髓切片中很难进行药理学化验。实际上, 梅兰日兰派生的 INs 的迁移主要取决于胞外提示21319以及药理抑制剂或激活剂在脊髓切片上的应用不允许精确细胞自主效应从全球影响到整体切片健康或活动的离解。对于这样的实验, 梅兰日兰外植体生长在混合分离的皮质细胞可能是最好的脊髓切片培养, 因为移出的移植物可以更容易地隔离和暴露于特定化合物62。此外, 虽然前子宫内电穿孔比在子宫内电穿孔更容易执行, 但在技术上, 它仍然可以在技术性的挑战, 在这里说明的胚胎时代, 鉴于小规模和脆弱的胚胎大脑的状态e13.5. 调查人员将需要一些试验, 以有效地提取转的大脑在 e13.5 而不损害大脑表面。此外, 与产后切片相比, 胚胎脊髓切片不能长时间保存在培养中。虽然胚胎脊髓切片培养可以保持至少7天的体外63, 这是没有结合电穿孔和这里所描述的实验已被测试3天体外与可靠的结果在我们手中。因此, 如果需要更长的潜伏期, 研究者应事先进行优化测试。此外, 在使用 e13.5 胚胎25时, 不建议在胚胎晚期或产后早期阶段对发育进行调查, 但在子宫内的内电穿孔中可以实现这种方法, 成功地转胚胎被放回子宫腔内, 并且可以在以后的阶段21,64中被留下来进行分析。最后,前子宫内电穿孔后的脊髓切片培养, 可以分析的形态和迁移动态的发展 INs。然而, 正如先前指出的, 对于在子宫内电穿孔技术36,前子宫electroporations 产量 50-100 electoporated 细胞每脑切片, 因此不适合人口分析。这种调查最好是在动物模型中进行的, 这种模式可以对感兴趣的基因进行完全或有条件的删除 (或撞击)。如果可用, 这样的模型可以有效地用于生成脊髓切片区域性或梅兰日兰外植体, 以可视化迁移的实际动态, 如下所示 (请参见图 5 图 6)。

为了获得最佳结果, 本议定书中的许多步骤应仔细进行。例如, 在严格的无菌条件下, 所有步骤都是原始的, 因为污染很容易发生。在安全柜外使用的手套和器械应在整个过程中经常喷洒70% 乙醇。此外, 培养基和人工脑脊液等解决方案应保持无菌和冷 (4 摄氏度), 并使新鲜每 2-3 周。为了更具体地标注梅兰日兰派生的 INs, 将用于此类实验的质粒应在特定的启动子 (前: Dlx5/649Lhx665) 的控制下克隆, 而不是仅仅依靠解剖梅兰日兰的目标。脊髓切片的产生需要大脑保持活力。因此, 为了保持细胞的健康和生存, 这个实验应该在不到3小时的时间内进行, 从胚胎被提取到脊髓切片的培养。为了提高时间效率, 在开始实验之前, 培养皿可以预先填充自制培养基, 并放入37°c 细胞培养孵化器中, 直到使用。此外, 大脑应该仔细解剖从头骨没有任何损害的皮质表面, 以实现适当嵌入琼脂糖溶液和随后的 vibratome 切片。例如, 对皮质表面的损伤, 甚至是最小的, 可能导致250µm 厚的部分从周围的琼脂糖凝胶或在 vibratome 切片期间退化的部分。对于神经元的生存, 也至关重要的是, 琼脂糖溶液温度保持接近42摄氏度, 因为较高的温度导致组织损伤和细胞死亡, 而较低的温度将排除正确嵌入大脑 (或损害它在嵌入过程)。一旦在文化 , 为了避免其他污染来源 , 切片不应该纵 , 直到他们转移到显微镜为成像。这些步骤应在灭菌的环境中进行, 必须注意不要在这些操作后污染板块, 特别是如果需要将它们放回文化中以供后续重新成像。最后, 我们不建议从以前的实验中恢复与负载染料混合的 DNA 整除, 以供将来使用, 因为我们观察到转神经元的产量有相当大的降低。

总之, 上面所述的前子宫内电穿孔和脊髓切片培养协议允许在单细胞水平上对梅兰日兰衍生的 INs 进行特定标记, 并可用于基因操作特定分子通路, 以研究它们在调节切向迁徙的形态学变化和迁移动力学中的作用。这种方法允许快速和低成本的早期功能调查新的候选基因, 通过单细胞 RNA 测序的迁移 INs66,67或通过下一代测序的患者神经发育紊乱68,69,70。该技术已广泛用于研究其他细胞种群的迁移, 包括皮层和海马区的锥体细胞70,71,72,73。一旦掌握, 它可能被用来图像的循环和贩运膜蛋白, 如受体和渠道使用 GFP 标签的蛋白质;使用生物传感器74激活特定的细胞信号的层叠;甚至是对细胞活性的监测和操纵, 使用钙成像结合光遗传学在皮层, 但也在其他脑区, 如海马, 杏仁核, 甚至纹状体。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。此处所表达的意见不一定代表卫生部长或加拿大政府的意见。

Acknowledgments

这项工作得到了萨伏地基金会和治疗癫痫基金会的业务赠款和加拿大创新基金会 (共聚焦显微镜) 和 G H (旋转圆盘共焦显微镜) 的设备赠款的支持。急诊室从全宗 de 研究所Santé (FRQ S) 获得职业奖;临床医生-科学家奖) 并且从加拿大学院为健康研究 (卫生研究院;年轻研究员奖)。伦理是 FRQ 的资深学者。L. E 是 Steriade-萨伏基博士后培训奖的接受者, 从萨伏依基金会, 楚圣-贾斯汀基金会博士后培训奖和 FRQ 博士后培训奖, 与明星基金会合作。加拿大脑研究基金在加拿大卫生部的财政支持下, 通过加拿大大脑研究所, 使这个项目成为可能, 授予 L.E。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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