Ex Utero Elektroporation und organotypischen Slice Kulturen der embryonalen Mäusegehirnen für Live-Aufnahmen von Migration Gabaergen Interneuronen

Neuroscience

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Summary

Hier bieten wir eine kostengünstige und zuverlässige Methode um elektroporiert Gehirn organotypischen Slice Kulturen von mäuseembryonen geeignet für konfokale Mikroskopie und Leben-bildgebende Verfahren zu generieren.

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Eid, L., Lachance, M., Hickson, G., Rossignol, E. Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons. J. Vis. Exp. (134), e57526, doi:10.3791/57526 (2018).

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Abstract

Gabaergen Interneuronen (INs) sind wichtige Komponenten der neuronalen Netzwerke, die Kognition und Verhalten zu steuern. Dazu bestimmt, den Kortex bevölkern INs migrieren tangential aus ihren Herkunftsort in der ventralen Telencephalon (u. a. aus der medialen und kaudalen ganglionic Eminenzen (MGE, CGE)), um die dorsale kortikale Platte in Reaktion auf eine Vielzahl von inneren und äußeren Hinweise. Verschiedene Methoden wurden im Laufe der Jahre zu genetisch bestimmte Wege zu manipulieren und zu untersuchen, wie sie die dynamische Zellskelett Änderungen erforderlich, für eine ordnungsgemäße regulieren IN der Migration. In Utero Elektroporation wurde ausgiebig genutzt, um die Wirkung des Gens Repression zu untersuchen oder Überexpression in spezifischen IN Subtypen bei der Bewertung der Auswirkungen auf Morphologie und Endposition. Jedoch während dieser Ansatz leicht Radial wandernde Pyramidenzellen ändern verwendet wird, ist es technisch schwierig wenn targeting VG In Utero Elektroporation eine geringe Ausbeute angesichts der verringerten Überlebensraten von Welpen erzeugt bei Elektroporation ist vor e14.5, wie üblich bei MGE-abgeleitete INs Studium durchgeführt. In einem alternativen Ansatz MGE Explantaten bieten einen einfachen Zugang zu den MGE und erleichtern die Darstellung der gentechnisch veränderten INs. Jedoch in diesen Explantaten INs Wandern in eine künstliche Matrix, frei von endogenen Anleitung Cues und thalamische Eingänge. Dies veranlasste uns, eine Methode zu optimieren, wo INs in einer Umgebung mit naturalistischer migrieren können, unter Umgehung der technischen Herausforderungen in Utero Ansätze. In diesem Artikel beschreiben wir die Kombination von Ex Utero Elektroporation von embryonalen mäusegehirnen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen leicht nachverfolgen, Bild und gentechnisch veränderten INs entlang ihrer natürlichen Wege als Reaktion auf die Migration zu rekonstruieren körpereigene Signale. Dieser Ansatz ermöglicht die Quantifizierung die dynamischen Aspekte der Migration mit Time-Lapse confocal Imaging sowie die detaillierte Analyse der verschiedenen morphologischen Parameter mithilfe neuronale Rekonstruktionen auf festen Immunolabeled Gewebe.

Introduction

Kortikale Gabaergen Interneuronen (INs) sind vielfältig in Bezug auf ihre biochemische Eigenschaften, physiologische Eigenschaften und Konnektivität, und sie vermitteln verschiedene Funktionen im Reifen Netzwerke1,2,3 ,4,5. Die Spezifikation der verschiedenen Subtypen der kortikalen INs ist streng reguliert durch genetische Kaskaden, die ausgiebig studiert1,2. Die Mehrheit (70 %) der kortikalen GABAergic INs stammen von Vorfahren in der medialen ganglionic Eminenz (MGE), eine ventral befindet sich embryonale Struktur und muss migrieren über relativ große Entfernungen auf die kortikale Platte1, zu erreichen 2 , 6. während kortikale Pyramidenzellen Radial auf die kortikale Platte entlang der radialen Glia-Gerüst aus der ventrikulären Zone (VZ) migrieren, die tangentiale Migration ins, die nicht zu solch einem Gerüst befestigt sind, erfordert eine Vielzahl von inneren und extrinsische Signale zu Migration von Neuronen in Richtung der kortikalen Platte zu gewinnen, und führen sie weg von nicht-kortikale Strukturen2,7,8. Nach Verlassen des Zellzyklus, INs sind abgestoßen von der MGE von Chemo-abstoßende Signale innerhalb der VZ MGE, tangentialer Übergang zu den kortikalen Platte9,10auslöst. Migration INs vermeiden das Striatum mit Hilfe von verschiedenen abstoßende Signale11 und, nach Erreichen der kortikalen Platte, sie wechseln Sie von einen tangential zu radial Migrationsmodus und erreichen ihre laminar Endlage, teils in Erwiderung auf Signale von Pyramiden Zellen12 und anderen zellularen Bevölkerungen13. Die Migration von INs, wie bei anderen neuronalen Populationen beinhaltet verschiedene dynamische morphologische Veränderungen um die tatsächliche Bewegung des Neurons zu ermöglichen. Diese so genannte neuronale Fortbewegung zeichnet sich durch sich wiederholende Zyklen von drei aufeinander folgenden Schritten: die Dehnung von einem führenden Prozess, eine aktive Anterograde Bewegung des Kerns (Nucleokinesis) und das Einfahren der nachfolgende Prozess14. BEI der Migration wird durch zahlreiche intrinsische und extrinsische Signale reguliert, die Verzweigungen und aktive Umgestaltung des führenden Prozesses INs führen in die richtige Richtung, Bestimmung, Ausrichtung und Geschwindigkeit der Migration14,15 fahren ,16.

Die Determinanten, die Regulierung der kortikalen Migration haben in den letzten Jahren1,2,7,17,18,19,20ausführlich untersucht, und Störungen in einigen dieser molekularen Akteure hat postuliert, führen zu Entwicklungsstörungen des, wie pädiatrische refraktäre Epilepsie oder Autismus Spektrum Störungen1,2,21, 22 , 23 , 24. daher die Entwicklung von in Vitro und in Vivo Ansätzen verfolgt wurden, um unsere Fähigkeit, dieser dynamischen Prozess, wie zuvor bewertete25erheblich voranbringen. In-vitro- Methoden, einschließlich der Boyden Kammer Assay und der Streifen-Wahl-Test bieten die schnellste und die meisten reproduzierbare Mittel zur Bewertung der Anforderung und Zelle-autonome Auswirkungen von bestimmten Genen oder Proteinen während der neuronalen Migration, ohne der Einfluss anderer Faktoren25. Diese Tests sind besonders nützlich in Kombination mit live-Imaging8,26,27. Mit diesen Techniken INs leicht aus e13.5 MGE abgerufen und durch enzymatische und mechanische Dissoziation, wonach verschiedene Signalwege und Anleitung Hinweise untersucht werden können, isoliert, wie zuvor dargestellt,8,28 . Doch statt diese Assays in eine künstliche extrazelluläre Matrix in Ermangelung von dreidimensionalen Gewebearchitektur, die neuronale Verhalten und Zelle Eigenschaften potenziell beeinflussen Zelle Migration und/oder überleben25verändern kann. Um diese Einschränkungen zu umgehen, wurden als alternative Instrument zur Quantifizierung der dynamischen morphologische Veränderungen während der Migration zusammen mit Parametern wie Geschwindigkeit und Orientierung14 Ex Vivo MGE Explantaten entwickelt, 29. Generierung von MGE Explantaten ist relativ einfach und wurde ausgiebig30an anderer Stelle beschrieben. Es umfasst die Beschichtung ein kleiner Auszug der MGE auf einem monomolekularen Film gemischte kortikale Zellen oder in einem Gemisch von Matrigel und Kollagen in Anwesenheit von anziehend oder abstoßend Cues25, obwohl letztere optional31 sind. MGE Explantaten ermöglichen hochauflösende Bildgebung des spärlich markierten Zellen, Vereinfachung der Studie von intrazellulären Prozessen, wie Zellskelett Umbau bei führenden Verzweigungen, wie zuvor gezeigt,32,33 ,34 und in der vorliegenden Studie. MGE Explantate sind erfolgreich benutzt worden, um dynamische Zellskelett Veränderungen während der Migration in einer 2D Umgebung, zum Beispiel nach bestimmten pharmakologischen oder chemotaktische Manipulationen zu beurteilen (siehe z. B. Tielens Et Al. 201633) . Aber mit diesem Ansatz INs Wandern innerhalb einer künstlichen Matrix, und dies könnte IN Verhalten und die Reproduzierbarkeit und die Bedeutung der experimentellen Ergebnisse verändern.

Im Gegensatz dazu in Utero Elektroporation ermöglicht die genetische Manipulation von INs in ihrer natürlichen Umgebung und ist eine weit verbreitete Methode, um schnell und effizient die Auswirkungen von Gewinn und Verlust der Genfunktion beurteilen unter Umgehung der Beschränkungen des Kosten- und zeitintensive Knockout und Knock-in Strategien25,35. In Utero Elektroporation kann auf IN Stammväter indem Zelle Art spezifische Promotoren und Positionierung der Elektroden in Richtung ventromedialen Strukturen, einschließlich die MGE36voreingenommen sein. Darüber hinaus Elektroporation ermöglicht die rechtzeitige Ausdruck der experimentellen Konstrukte innerhalb von 1-2 Tagen, Vektoren in der Gebärmutter im Vergleich zu den 7-10 Tage benötigt, Konstrukt Ausdruck virale25. Jedoch tendenziell in Utero Elektroporation von IN Stammväter geringer Sprengkraft. In der Tat, obwohl pyramidale Zelle Vorfahren liegt in der dorsalen ventrikuläre Zone effizient transfiziert werden können ist in der Gebärmutter mit Elektroporation, targeting mehr ventral befindet sich Strukturen, z. B. die MGE mehr technisch anspruchsvoll, vor allem in kleinen e13.5 reduziert Embryonen und die hohe Rate der embryonalen Tödlichkeit weiter die experimentelle Ertrag25.

Zur Umgehung der technischen Einschränkungen verbunden mit in-vitro- MGE explant Experimente und in Vivo im Mutterleib Elektroporation, ex Vivo organotypischen Slice Kulturen wurden entwickelten8,37, 38,39. Gehirn organotypischen Slice Kulturen bieten der Vorteil der Nachahmung in Vivo Bedingungen während weniger teuer und zeitaufwendig als Erzeugung von25 Tiermodelle. In der Tat, diese Präparate ermöglichen einen einfachen Zugang zu den MGE, zusammen mit der spezifischen Visualisierung von INs, und ist kombinierbar mit fokalen Elektroporation, spezifische Molekulare Signalwege im INs Migration in einem mehr physiologische Umgebung8 zu untersuchen , 39 , 40 , 41. Wir haben deshalb einen Ansatz für organotypischen Kulturen38, die wir mit Ex Utero Electroporation und Time-Lapse confocal Imaging kombiniert optimiert, zur weiteren Beurteilung die morphologischen und dynamischer Prozess auftretenden bei der tangentialen Migration von MGE-INs. Dieses Protokoll wurde angepasst und optimiert von anderen, die Ex Utero oder in Utero Gehirn Electroporation und organotypischen Slice Kulturen verwendet, um die Migration von Pyramidenzellen42,43 zu studieren und kortikale INs36,39,44. Insbesondere mausembryonen enthauptet und die MGE ist elektroporiert Ex Vivo nach der intraventrikulären Injektion von den experimentellen Plasmiden ermöglicht effizientes und präzises targeting von MGE Stammväter als erreichten mit in Utero Elektroporation. Die Köpfe werden dann extrahiert und geschnitten in Gesamt-Hirn koronalen Scheiben, die für ein paar Tage kultiviert werden können, wodurch die kontinuierliche tracking und imaging-transfizierten ins. Dieser Ansatz kennzeichnet in der Regel 5-20 tangential Migration INs pro Gehirn-Scheibe, die Minimierung von experimentellen Iterationen erforderlich, um die statistischen Signifikanz zu erreichen, während die Kennzeichnung einer ausreichend spärlichen neuronalen Bevölkerung dafür einfache Trennung von einzelner Neuronen für Wiederaufbau und feine morphologische Beurteilung. Darüber hinaus im Vergleich zu MGE Explantaten organotypischen Kulturen zu gewährleisten, dass Migration INs ausgesetzt sind ein natürlicher Umgebung, einschließlich lokal sezernierten Chemokine und Inputs thalamische afferenzen. Dieser Ansatz eignet sich daher gut zur Direktionalität und wandernden Weg angenommenen transfizierten INs, bietet ausreichend anatomische Details ermöglicht die Charakterisierung der feineren dynamische Prozesse wie führende Prozess Verzweigung zu quantifizieren, Nucleokinesis und nachgestellten Prozess zurückziehen.

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Protocol

Alle Experimente mit Tieren vom Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques Avec Les Animaux de Recherche (CIBPAR) am Forschungszentrum CHU Sainte-Justine genehmigt und wurden im Einklang mit dem Canadian Council über Animal Care Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren (Ed. 2).

Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert für Elektroporation von Embryonen im embryonalen Tag (e) 13,5, zu einem Zeitpunkt wann MGE abgeleitet INs aktiv erzeugt werden, bevor die Spitze der CGE abgeleitet INs Produktion45,46. Darüber hinaus nutzen wir um die Elektroporation in Richtung GABAergic INs-bias, Förderer selektiv in INs (zum Beispiel der Dlx5/6 -Veranstalter mit seiner minimalen Enhancer)47ausgedrückt.

1. Vorbereitung der Lösungen für Electroporation und organotypischen Slice Kulturen

  1. 125 mL sterilen Nährmedium vorzubereiten.
    1. 125 mL regelmäßige Neuron-spezifische Kulturmedium zu messen (siehe Tabelle der Materialien für die Formulierung) in eine sterilisierte Flasche in einen zuvor UV-sterilisiert Biosafety Schrank mit 70 % Ethanol besprüht. Fügen Sie 2,25 mL 50 x serumfreien Neuron-spezifische Ergänzung, 1,75 mL 200mM Glutamin (Endkonzentration von 0,5 mM) und 6,25 mL Hitze-inaktivierten Pferd Serum zuvor regelmäñig unter sterilen Bedingungen. Gut durchmischen, Aliquote in 15 mL sterile konische Rohre und Lagerung bei 4 ° C.
      Hinweis: Präparierten Nährmedium kann bis zu 3 Wochen bei 4 ° c aufbewahrt werden
    2. Teilen Sie eine 100 X Botteinstein n-2 Formulierung48 -Stammlösung in 150 µL-Aliquots unter sterilen Bedingungen und bei-20 ° C bis zum Gebrauch einfrieren.
  2. Bereiten Sie 1 L des sterilen künstlichen Liquor cerebrospinalis (ACFS).
    1. 800 mL destilliertem Wasser in einer 1 L Becher zu messen. Fügen Sie 25,67 g Saccharose, 5,08 g Natriumchlorid (NaCl) 2,18 g Natriumbicarbonat (Nahco33) 1,80 g Glukose, 0,19 g Kaliumchlorid (KCl), 0,15 g monobasic wasserfreies Natriumphosphat (NaH2PO4), 1 mL 1 M Lager CaCl2 .2H2O und 2 mL 1 M MgSO4.7H2O. unter Rühren auflösen bei Raumtemperatur lagern. Fügen Sie destilliertes Wasser zu einem Gesamtvolumen von 1 L.
    2. Mit einem 0,22 µm-Filter, Filtern Sie die Lösung in eine sterile Flasche in eine sterilisierte Biosafety Kabinett und bei 4 ° C für bis zu 1 Monat aufbewahren.
  3. Bereiten Sie eine frische Lösung von 4 % Agarose in ACFS vor jedem Experiment.
    1. Messen Sie 25 mL der vorbereiteten ACFS in einem 50 mL sterile konische Rohr zu und fügen Sie 1 g Niedrigschmelzende Punkt Agarose.
    2. Wärme für 45 s in der Mikrowelle. Um zu vermeiden, Verschütten, unterbrechen Sie Heizung Alle 3-4 s, beim Kochen beginnt, öffnen Sie das Rohr um den Druck aus, schließen Sie ihn wieder und agitieren manuell die Agarose mischen zu lassen. Wiederholen Sie, bis die Agarose-Lösung homogen ist. Halten Sie die Agarose-Lösung bei 42 ° C, während der Rest des Experiments, Erstarrung zu vermeiden.
      Hinweis: Höhere Temperaturen beschädigen Hirngewebe.

2. Vorbereitung der Plasmide Injektionslösung

  1. Ziehen Sie eine Glaspipette Mikroinjektion
    1. Mikropipette Abzieher mit den richtigen Parametern eingestellt, die Glas-Kapillare in den zur Verfügung gestellten Raum zu sichern und stellen Sie sicher, dass es mit dem Filament zentriert ist.
    2. Drücken Sie die Schaltfläche "ziehen".
    3. Entfernen Sie vorsichtig die neugebildeten Mikroinjektion Pipetten aus der Hitze Puller und in einer Box oder einem sauberen Petrischale bis zur weiteren Verwendung zur Vermeidung von Schäden die Spitze.
  2. Aufbau der Biosicherheit Schrank mit allen Instrumenten benötigt dafür experimentieren (siehe Abbildung 1A), Sprühen Sie großzügig alle Instrumente in der Biosicherheit Schrank mit 70 % Ethanol und Sterilisieren die Instrumente und die Umwelt mit UV-Licht für 15-20 min.
  3. Während der Sterilisation Schritt tauen Sie Plasmide auf Eis (4 ° C auf).
  4. Messen Sie 10 µL des Plasmids aus einer Stammlösung (4 µg/µL) in eine saubere 1,5 mL Zentrifugenröhrchen. 0,01 % der schnell grün FCF hinzufügen. Vorsichtig mischen, kurz drehen und halten Sie auf dem Eis bis zur Verwendung.
    Hinweis: Maxi-Prep DNA sollte nach der Hersteller-Protokoll mit einem Endotoxin-freie Maxi-Prep Kit vorbereitet werden. DNA kann in TE-Puffer oder Nuklease-freie solubilisiert werden H2O und die Vorbereitung des Plasmids mit Farbstoff Lösung kann jedoch nicht unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden müssen. Plasmide von Maxi-Prep sollte regelmäñig, mehrere Gefrier-tau-Zyklen zu vermeiden. Regelmäñig Plasmide sollte mit der Farbstoff nicht mehr, dass 2 h vor Gebrauch gemischt werden und sollten nicht für die weitere Verwendung eingefroren werden.
  5. Bereiten Sie nach der Sterilisation die Nano-Injektor wie folgt vor.
    1. Wählen Sie eines der zuvor vorbereiteten Mikroinjektion Glaspipette gespeichert in einem sauberen Box oder Petrischale und kleine Pinzette verwenden, schneiden Sie die PIPETTENSPITZE abgeschrägte gewissermaßen einen Außendurchmesser von ca. 15 µm zu erreichen.
      Hinweis: Der hier gegebenen Außendurchmesser ist eine ungefähre Maßnahme, um dem Benutzer eine Vorstellung davon, was wir in unseren Experimenten nutzen und wurde optimiert, um das piercing des Schädels Injektionslösung Plasmid ohne Beschädigung des Gehirns, wobei für das Fluid zu erleichtern Laden und Freigabe der DNA. Der äußere Durchmesser kann gemessen werden, durch die geschnittene Spitze der Mikroinjektion Glaspipette apposed um eine mikrometrische Maßstabsleiste unter dem Hellfeld-Mikroskop betrachten.
    2. Verwenden Sie eine Spritze, um die Mikropipette mit Mineralöl aus seinem unpulled Ende (um die Luft zu vertreiben) zu füllen.
    3. Legen Sie die gefüllten Glas Mikropipette im Nano-Injektor durch Anweisungen des Herstellers.
    4. Leere 2/3rds der das Glas Mikropipette (wobei genug Öl, um Lufteintritt zu verhindern).
  6. Sorgfältig einfügen Sie vorbereitete Mikropipette in das Röhrchen mit dem Plasmid/Farbstofflösung und füllen Sie das Glas Mikropipette mit Plasmid/Farbstofflösung.

3. Sammlung von Mäuseembryonen von trächtigen Weibchen

  1. Zuchthündinnen täglich um zu beurteilen für vaginale einstecken, vorzugsweise zur gleichen Zeit täglich (am frühen Nachmittag) zu überwachen. Tag e0.5 entspricht dem ersten Tag als ein vaginaler Stecker beobachtet wird.
    Hinweis: Die hier beschriebenen Experimente können in Wildtyp Mäusen durchgeführt werden. Jedoch, um die Identifizierung der MGE zu erleichtern und alle GABAergic INs (oder bestimmte Teilmengen wie MGE abgeleitet INs) zu kennzeichnen, Transgene Tiere können verwendet werden (z.B.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre mit einem Cre-Reporter-Allel, etc.47,49). In diesem Fall sollte das experimentelle Plasmid injiziert zum Ausdruck bringen eine andere Fluorophore (zum Beispiel mCherry oder TdTomato) ermöglichen die Visualisierung der transfizierten INs (gelb), die mit nicht-transfizierten INs (grün) verglichen werden kann.
  2. Das Weibchen an embryonalen Tag e13.5 durch Hals Luxation zu opfern.
    Hinweis: Zum Zeitpunkt des Opfers Anästhetika können Auswirkungen auf Migration und Überleben50,51 und sollte vermieden werden.
  3. Embryonen wie folgt per Kaiserschnitt zu sammeln.
    1. Sprühen Sie den weiblichen Bauch großzügig mit 70 % Ethanol. Hochziehen Sie die Bauchhaut mit einer sterilen Pinzette und mit der anderen Hand verwenden Sie sterilisierte chirurgische Scheren, schneiden Sie die Haut aus dem Bauch.
    2. Hochziehen Sie mit einem zweiten paar sterilisierte Pinzette und Schere die Bauch-Faszie und schneiden Sie es vorsichtig die Gebärmutter zu vermeiden.
    3. Mit einer dritten sterilisierte Pinzette und Schere, ziehen Sie die uterine Hörner und schneiden Sie sie aus der Beckenhöhle. Legen Sie die seziert uterine Hörner in einer sterilen 60 mm Petrischale gefüllt mit neuronalen basierende Kulturmedium mit Aminosäuren, Vitaminen und anorganische Salze (siehe Tabelle der Materialien für handelsübliches Produkt) ergänzt.
  4. Verwenden Sie in einem sterilen Biosafety Kabinett zwei Paare von feinen Pinzette (eins in jeder Hand) zu sezieren die Embryonen aus der Plazenta und isolieren die Köpfe durch Enthauptung.
  5. Schrägschnitt eine sterile 3 mL Kunststoff Transfer PIPETTENSPITZE Aspirieren Sie die Köpfe und Transfer in eine neue sterile Petrischale 60 mm mit erstarrten schwarzen Wachs geschichtet und gefüllt mit der gleichen neuronalen Basis ergänzt Kulturmedium wie oben beschrieben.
    Hinweis: Dieser Schritt minimiert die Übertragung von Kontaminanten (Maus Haare, Blut). Die schwarzen Wachs wird verwendet, um den Kopf während der Präparation zu stabilisieren. Nährmedien müssen nicht während dieser Verfahren Sauerstoff.

4. intraventrikuläre Plasmid-Injektionen und Ex Vivo Elektroporation von der MGE

Hinweis: Die folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen in die vorher vorbereiteten Biosicherheit Schrank durchgeführt werden.

  1. Ort der 60-mm-Petrischale mit schwarzen Wachs geschichtet und enthält die abgeschlagenen Köpfe in neuronale Grundlage Kulturmedium unter das Fernglas in die Biosicherheit Kabinett ergänzt.
  2. Stabilisieren Sie den Kopf, die rostral Teil nach rechts, mit einer feinen Pinzette mit der linken Hand und mit der Nano-Injektor in der rechten Hand um 1-2 µL Plasmid/Farbstofflösung in den rechten seitlichen Ventrikel zu injizieren.
    Bemerkung: Co Experimente kann von co-Electroporating ein Rettungs-Plasmid und eine ShRNA exprimierenden Plasmid durch die Vermischung beider Plasmide bei äquimolaren Konzentrationen durchgeführt.
  3. Electroporate das Gehirn injiziert.
    1. Legen Sie den Kopf zwischen den Elektroden mit der negativen Elektrode positioniert dorsal und parallel zum Kopf und die positive Elektrode in Richtung der ventralen Seite des Kopfes, um gezielt die MGE.
    2. Sobald die Elektroden gut positioniert sind, liefern Sie 4 quadratische Impulse von 40 V für 50 ms bei 500 ms Inter Puls Intervalle.
    3. Entfernen Sie jede verbleibende Gewebe von den Elektroden mit einer Pinzette, die bereits in der Biosicherheit Schrank platziert.
      Hinweis: Diese Parameter wurden speziell für die Electroporator in unseren Experimenten verwendet optimiert. Es wird empfohlen, dass die Nutzer vorher Optimierung Tests durchführen, wenn eine andere Art von Electroporator zu verwenden.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 4.1 bis 4.3 für alle übrigen Gehirne.
      Hinweis: Obwohl dieses Protokoll die Manipulationen für ein Gehirn benötigt beschreibt, ist es möglich, bis zu 4 Köpfe nacheinander vor Electroporating jedes Gehirn, wodurch sich des Ertrags injizieren. Diese Strategie ist besonders vorteilhaft, wenn 2 oder mehr verschiedene Plasmide sequenziell (z. B. Kontrolle oder experimentelle Plasmid) während das gleiche Experiment (so dass für den Vergleich zwischen wurfgeschwistern) injiziert werden. Darüber hinaus ist es möglich, Spritzen und Electroporate gleichzeitig beide Seiten des Gehirns, um den Ertrag zu steigern, durch die Positionierung der Elektroden vollständig parallel zu der Oberfläche des Gehirns.

5. Gehirn Sie sezieren und organotypischen Slice Kulturen

  1. Während noch in der sterilen Umgebung der Biosicherheit Kabinett zu manipulieren, sezieren Sie das Gehirn aus dem Schädel.
    1. Stabilisieren Sie den Kopf auf die Schicht des schwarzen Wachs durch eine Nadel in jedes Auge während des Gehirns sorgfältig zu vermeiden.
    2. Verwenden Sie ein paar feine Pinzette auf um der linken Seite des Halses und ein zweites Paar feine Pinzette, um die Haut vor den Schädel, von hinten nach vorne reißen zu halten.
    3. Halten Sie den Kopf seitlich mit einer Pinzette in der Hand, verwenden Sie ein weiteres Paar Pinzette in der anderen Hand, schneiden Sie vorsichtig den Schädel auf der Ebene der Hirnstamm und ziehen vorsichtig den Schädel auf. Mit jeder Pinzette Schneiden des Schädels in der Sagittalebene (Mittellinie) nach vorne, und dann seitlich Einschneiden, um die Schädel-Fragmente zu befreien.
    4. Heben Sie den Hirnstamm und schneiden Sie vorsichtig die Hirnhäute und Hirnnerven, bis das Gehirn aus dem Schädel komplett ist.
      Hinweis: Alle in 5.1 beschriebenen Schritte sollte unter streng sterilen Bedingungen in ein Kabinett Biosafety durchgeführt werden.
  2. Betten Sie das Gehirn in 4 % niedrig schmelzende Punkt Agarose für schneiden.
    1. Füllen Sie eine 35-mm-Petrischale mit über vorbereitete Agarose-Lösung (bei 42 ° C flüssig gehalten).
    2. Schnelle Übertragung eine elektroporiert Gehirn in die Agarose-gefüllte Schale mit der zuvor ausgeschnittene transferpipette. Die Schüssel bei Zimmertemperatur aufbewahren.
    3. Rühren Sie die Agarose mit einem Metallstab, das Gehirn in der Mitte der Brunnen (zum Untergang zu verhindern) zu halten und das Gehirn in einer Rostro-kaudalen Ebene parallel auf den Teller zu positionieren. Nicht mehr rühren, wenn die Agarose beginnt zu festigen, um eine Schädigung des Gehirns zu vermeiden.
    4. Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Agarose umgibt das Gehirn um einen rechteckigen Block, eine Marge von 1 bis 2 Millimeter zu verlassen, um das Gehirn herum bilden geschnitten. Sicherstellen Sie, dass die rostral Teil des Gehirns senkrecht zu der vorderen Begrenzung des Blocks zur Erleichterung der Orientierung für die nachfolgenden speziellen Schritte ist.
    5. Wiederholen Sie für jedes Gehirn.
      Hinweis: Es ist möglich, mehr als ein Gehirn zu einem Zeitpunkt (maximal 3) zu schneiden, durch Gestaltung von separaten Agarose Blöcke während der Einstellung jedes Gehirn in unterschiedlichen Höhen.
  3. Vibratome koronalen Abschnitte und Slice-Kultur.
    1. Tauwetter ein Aliquot von 100 X n-2 (150 µL) auf Eis zu ergänzen und 15 mL regelmäñig Kulturmedium unter sterilen Bedingungen hinzufügen.
    2. 750 µL Kulturmedium (mit 1 X N2 Zuschlag) in jede Vertiefung einer Kultur 6-Well-Platte zu übertragen.
    3. Legen Sie mit gebogenen Pinzette eine Zelle Kultur Einsatz (Durchmesser 30 mm, 0,4 µm Porengröße, PTFE) in jedem Medium-gut gefüllt.
    4. Füllen Sie das Vibratome Bad mit ständig sauerstoffreiches ACFS. Mit Eis rund um das Bad auf 4 ° C kühlen Sie ab, oder verwenden Sie einen gekühlten Vibratome.
    5. Vibratome Geschwindigkeit 0,150 mm/s und Frequenz bis zu 80 Hertz einstellen.
    6. Kleben Sie die Agarose-Block auf der Vibratome Plattform, rostral Kante nach unten und ventralen Rand mit Blick auf den Benutzer.
    7. Schneiden Sie das Gehirn im koronalen Abschnitte 250 µm Dicke Abschnitte (bei 4 ° C) zu erhalten.
    8. Mit sterilisierten Spachteln sammeln Sie 2-3 Abschnitte mit MGE und Stelle alle Gehirn-Abschnitte von einem Tier auf einer einzelnen 30-mm-Membran einfügen sorgfältig vermeiden Überschneidungen zwischen Abschnitten. Legen Sie den Einsatz in einem gut einer Kultur 6-Well-Platte (mit 750 µL ergänzt Kulturmedium, wie oben beschrieben). Alternativ kann jeder Abschnitt auf einer separaten 13-mm-Durchmesser-Membran in einem 12-Well Kultur Teller gefüllt mit 500 µl ergänzt Kulturmedium platziert werden. Die Höhe der Nährmedium empfohlen für jedes gut ermöglicht die Gehirn-Abschnitte von den Medien genährt werden, ohne als untergetaucht.
      Hinweis: In 5.3.6 und 5.3.7 beschriebenen Schritte sind nicht unter komplette sterilen Bedingungen durchgeführt, es sei denn der Vibratome sterilisiert und in einen Schrank Biosafety verwendet werden kann. Daher ist es wichtig, diese Schritte sorgfältig, um eine Kontamination zu vermeiden führen. Geeigneter Schutzausrüstung (saubere Maske, OP-Handschuhe und Kittel) sollte zu allen Zeiten und Körperteile, getragen werden sogar bedeckt, wie Haare, Gesicht und Hände, sollten nie über Kultur-Platten (mit oder ohne Kulturmedium) übergeben. Es wird auch empfohlen, Sprühen Sie 70 % Ethanol häufig auf die Handschuhe und Spachtel verwendet, um das Gehirn Abschnitte zu sammeln.
    9. Platzieren Sie die Kultur-Platte in einem belüfteten sterile Inkubator bei 37 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 48 oder 72 h.
      Hinweis: Diese Inkubationszeiten waren für Zeitraffer-Bildgebung von MGE abgeleitet INs und konfokale Abbildung von festen Scheiben bzw. optimiert. Optimale Inkubationszeiten sollte im Voraus für jede Versuchsanordnung getestet werden. Darüber hinaus, wenn die gewählte Inkubation 72 h und unter, gibt es keine Notwendigkeit, das Kulturmedium ändern. Für längere Inkubationszeiten sollte das Kulturmedium alle 2-3 Tage geändert werden.
    10. Übertragen Sie nach der gewünschten Inkubationszeit die Abschnitte von Interesse, eine 8-gekammert deckgläschen geben Sie und 3-5 µL Kulturmedium. Ort das Deckglas in einer Klimakammer (37 ° C, Luftfeuchtigkeit von 60 %, 5 % CO2) mit einer invertierten verbunden spinning Disk konfokale ausgestattet mit eine EDV-gestützte Datenerfassungs-Software zum Aufbau der Zeitraffer bildgebenden Sitzung.
      Hinweis: Alternativ können Abschnitte mit 4 % Paraformaldehyd (über Nacht bei 4 ° C oder 2 h bei Raumtemperatur) und anschließend Immunostained mit verschiedenen Antikörpern zur Visualisierung der morphologischen Merkmale der elektroporiert INs unter einem konfokalen fixiert werden Mikroskop. Obwohl eGFP und mCherry durch konfokale Mikroskopie ohne Counter befleckenden Verfahren sichtbar gemacht werden können, empfehlen wir Immunohistochemistry gegen GFP und mCherry, um das Signal zu verbessern, da die Fixierung Prozess Fluoreszenz, reduzieren kann reduzieren die Erkennung der feineren Bestandteile des embryonalen Nervenzellen, wie kleinere Äste in die führende oder nachfolgende Prozesse.

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Representative Results

In diesem Abschnitt bieten wir repräsentative Ergebnisse nach der Ex Utero Elektroporation ein Steuerelement Plasmid oder eine experimentelle Plasmid Ausrichtung auf ein Gen des Interesses an der MGE e13.5 mausembryonen gefolgt von organotypischen Slice Kulturen bei 37 ° C für 48 h (für Zeitraffer-Tomographie) oder 72 h (für Fixierung und immunhistochemische Kennzeichnung) inkubiert (siehe Abbildung 1 b schematische Protokoll). Repräsentative Beispiele der Migration von einer MGE Explant INs sind auch illustrierte (siehe Abbildung 1 schematische Protokoll) im Vergleich zu der hier beschriebenen Methode. Die Elektroporation ein Plasmid in MGE Stammväter scheint die Ausfahrt ins von der MGE verzögern und Kulturzeit muss entsprechend angepasst werden.

Ein gelungenes Experiment organotypischen Scheiben unter dem konfokalen Mikroskop gesund erscheinen, d.h. kortikale Schichten unterscheiden sich leicht mit dem Hellfeld-Modus und gibt es keine sichtbaren Verunreinigungen auf der Oberfläche der Scheibe (erkennbar durch intensive Autofluoreszenz und das Vorhandensein von fluoreszierenden Fasern unter Epifluoreszenz sichtbar). Etwa 20 % der Zellen Apoptose in gesunden chronische organotypischen Scheiben nach 72 h in der Kultur (Abbildung 2), wie zuvor beschrieben in chronischen organotypischen (z. B. postnatale Kulturen)52. Brutto Cytoarchitectural Gehirnstruktur bleibt jedoch gut definiert, wie hier mit DAPI-Färbung (Abbildung 2A). Unser Protokoll für ex-Vivo Elektroporation von der MGE ergibt einen Durchschnitt von 50-100 transfizierten Zellen pro Stück (Abb. 3AB), welche 5-20 Zellen migrieren dorsal nach 72 h im Kultur gesehen werden werden. Nach Fixierung und immunhistochemische Färbung kann INs Migration tangential auf die kortikale Platte leicht mit konfokalen Mikroskopie identifiziert werden wie sie eine länglich/Oval Zellkörper, die gelegentliche nachgestellten Prozess und eine führende Prozess-präsentieren tangential orientiert. Die führenden Prozess in der Regel ergibt sich ein oder zwei Zweige und ist erkennbar durch die Anwesenheit von eine gelegentliche Schwellung vor dem Kern (Gehäuse der Centrosome vor Nucleokinesis) und Wachstum Zapfen am Ende jeder Verzweigung. (Abbildung 3-G).

Dieses Protokoll wurde für die Beobachtung der Migration von MGE abgeleitet INs Ebene der Einzeller mit Zeitraffer Bildgebung entwickelt. Für dieses besondere Experiment (Abbildung 4) wurden von Dlx5/6Crekoronalen organotypischen Gehirnscheiben erzielt; RCEEGFP Embryonen elektroporiert am e13.5 mit einem Plasmid mit dem Ausdruck einer experimentellen ShRNA (targeting eines Gens von Interesse) und die TdTomato -Kassette. Die Scheiben wurden für 48 h inkubiert, übertragen auf eine 8-Brunnen gekammerten Deckglas Teller (1 Scheibe pro Kammer auf eine dünne Schicht ergänzt Kulturmedium Schwimmen) und alle 3 Minuten für 6-8 h mit einem Objektiv 20 X Luft (0,70 NA) auf einem inversen Mikroskop ausgestattet abgebildet mit einem drehenden Scheibe konfokale Kopf, eine EDV-gestützte Datenerfassungs-Software und eine Bühne-Top Klimakammer. Während der Bildgebung, die Scheiben wurden bei 37 ° C gehalten und wurden kontinuierlich mit Sauerstoff und befeuchtet in die Klimakammer (5 % CO2 und 60 % H2O). INs Elektroporiert MGE abgeleitet wurden als solche gekennzeichnet durch ihren Ausdruck von eGFP, bestätigte ihre Gabaergen IN Identität und ihren Ausdruck des TdTomato, bestätigt, dass sie das experimentelle Plasmid (Abbildung 4AB) zum Ausdruck bringen. Electroporated INs sind leicht erkennbar und gut isoliert, wie in Abbildung 4, so dass für die feinere Analyse der Migration dynamische Parameter wie Geschwindigkeit und Abstand reiste. Darüber hinaus beschrifteten INs gelten Migration tangential auf die kortikale Platte, während in ihrer natürlichen Umgebung ermöglicht uns, dynamische morphologische Veränderungen wie z. B. die Verzweigung der führende Prozess- und Nucleokinesis (Abbildung 4 zu erkennen -F).

Der ex-Vivo Elektroporation von MGE abgeleitet INs kombinierbar mit MGE Explantaten ermöglicht hochauflösende Bildgebung dynamische Zellskelett Prozesse, die während der Migration als Ergänzung zum Studium der Richtwirkung und wandernden Dynamik in organotypischen Kulturen. Als Beispiel, verschiedene Phasen der neuronalen Fortbewegung erinnert an die auftretenden tangential Migration ins organotypischen Slice Kulturen beobachtet werden in elektroporiert INs Migration von einem MGE explant 48 h nach Elektroporation, wie führende Neurit Erweiterung und Nucleokinesis (Abb. 5 b-E). Verschiedenen Zellskelett Prozesse können dann untersucht werden, mit hoher Auflösung in isolierten Zellen, die Migration von einer modellabhängigen MGE, zum Beispiel durch Färbung F-Aktin-Strukturen mit Phalloidin (Abb. 6A), die optimal in organotypischen Scheiben erreicht werden kann Angesichts der hohen zelluläre Dichte (und damit des Zytoskeletts Elemente) in einer natürlichen Umgebung. Diese Zellskelett Prozesse und vor allem F-Aktin umgestaltet, kann weiter untersucht werden dynamisch durch die Kombination von Lifeact Ausdruck mit Zeitraffer-Bildgebung. Zum Beispiel zeigen wir ein Beispiel für hochauflösende Zeitraffer Bildgebung der eine IN abgeleitet eine MGE Explant gewonnenen ein Nkx2.1Cre; RCEEGFP tragen eine gezielte Löschung eines Gens von Interesse in INs Gehirn der Maus. Diesen wurde mit dem mCherry-Lifeact-7-Plasmid unter der Kontrolle des Veranstalters CMV (Geschenk von Michael Davidson), transfiziert mit der Methode, die in Abbildung 1, ermöglicht die Verfolgung von F-Aktin Umbau Auftritt in Echtzeit (Abbildung schematisiert 6 b). damit, während organotypischen Kulturen Direktionalität oder Migration Weg von gentechnisch veränderten INs richtig einschätzen müssen, MGE Explantaten ergänzen können solche Studien durch einen besseren Zugang zu isolierten Zellen für die hochauflösende Darstellung von dynamische Zellskelett Prozesse.

Technische Fallstricke können Ausfall der oben beschriebenen Experimente führen. Zum Beispiel kann Einbettung der Gehirne in eine Agarose-Lösung über 42 ° C wärmer führen Gewebezerstörung und neuronalen Tod, offenbart durch einen Verlust der Lichtdurchlässigkeit des Gehirns oder Scheiben, die undurchsichtig geworden. Allerdings sollte die Temperatur werden nicht zu niedrig gehalten wie eine erstarrenden Agarose-Lösung bei der Einbettung der empfindliche embryonale Gehirn zerstören kann. Zweitens, Kontamination deutlich reduzieren kann die Ausbeute an die experimentelle Ansätze, die hier beschrieben. Daher sollten alle Schritte mit Sorgfalt unter streng sterilen Bedingungen so weit wie möglich durchgeführt werden. Alle Lösungen und Geräte sollten vor Gebrauch sterilisiert werden und Ausrüstung sollten häufig mit 70 % Ethanol zur Vermeidung von Kontaminationen von Bakterien oder Schimmel gespritzt werden. Verunreinigungen kann direkt in die Kultur Brunnen, sichtbar, wie das Kulturmedium gelb oder undurchsichtig wird. Verschmutzung kann unbemerkt, wenn das Kulturmedium klar und flüssig bleibt. Jedoch in der Regel eine Schicht von Schimmel auf der Oberfläche der Scheibe beobachtet werden oder die Scheiben werden während der Fixierung und Färbung Schritte übermäßig zerbrechlich. Wenn solche Scheiben unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden, Kontamination kann als eine Schicht von Autofluoreszenz über beschriftete Neuronen manifestieren oder durch die Anwesenheit von lange fluoreszierende Fäden aufgedeckt werden. Organotypischen Scheiben in kontaminierten Brunnen gehalten heraus geworfen werden sollte, aber die Scheiben in die weiteren Bohrungen der gleichen Platte kultiviert für weitere Schritte gehalten werden können. Bakterielle Kontamination ist sehr selten aber sollte ernst genommen werden, was bedeutet, dass alle Geräte, einschließlich der gemeinsamen Inkubatoren und Kultur Raum manuell gereinigt und sterilisiert werden sollte.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellungen der Protokolle für ex Utero Elektroporation gefolgt von organotypischen Stück Kultur oder MGE explants. A. Beispiel eines Biosafety Kabinett Setup mit allen sterilisierte Instrumente für das hier beschriebene Protokoll benötigt. B. Schematische Darstellung des Protokolls für die Ex Utero Electroporation und organotypischen Slice Kulturen verwendet. Kurz, die Embryonen enthauptet, die experimentelle Plasmid wird in der seitlichen Ventrikel (1) und elektroporiert in der MGE (2) injiziert. Das Gehirn ist Microdissected aus dem Schädel (3) und eingebettet in Agarose (4). Organotypischen Abschnitte sind auf eine Vibratome (5) generiert und in Kultur bei 37 °C(6) für 48 h für Zeitraffer-Mikroskopie (7.1) oder 72 h für Zelle Rekonstruktionen (7.2). C. schematische Darstellung des Protokolls von Myers Et Al. 201353 angepasst und verwendet für die Erzeugung von MGE explants. Kurz, dorsolateralen Cortex sind zunächst seziert von e12.5 bis e14.5-Wildtyp Maus-Embryonen (1) und in ergänzt Kulturmedium (2) mechanisch getrennt. Kortikale Zellen sind bei einer Dichte von 5,25 x 105 kortikalen Zellen/cm2 vernickelt und für 2 h bei 37 ° C in einem Kollagen/Poly-L-Lysin-beschichtete 8 Kammern deckgläschen (3) kultiviert. Dann, e13.5 Dlx5/6Cre; RCEEGFP Embryonen werden verarbeitet, ex Utero Elektroporation von MGE (4, 5), und die MGE ist manuell aus dem Gehirn isoliert und schneiden Sie in 100 µm2 Fragmente (6). Diese Explantaten sind dann auf vorbereitete kortikalen Feeder Layer platziert, bedeckt mit Nährmedium, Co für 48 h vor dem Time-Lapse Bildgebung (7) kultiviert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Cytoarchitecture in gesunden organotypischen Scheiben erhalten. Schneiden Sie die Generation der organotypischen Kulturen nach ex-Vivo Elektroporation von Nkx2.1Cre; RCEEGFP mausembryonen (A) führt nicht zu erheblichen Gewebeschäden durch erhaltene Cytoarchitecture (DAPI (blau) und Cre-Reporter (GFP)), im Vergleich zu einer 18 µm dicken Cryosection aus einem Nkx2.1Cre; RCEEGFP Embryo Transcardially durchströmt mit 4 % PFA bei e15.5. D und M anzugeben dorsal-Ventral und Latero-medialen Achsen bzw.. (B). hohe Vergrößerung mit einem inversen confocal Mikroskop aufgenommene Bilder mit 63 X / 1,4 Öl Ziel nach der Färbung mit einem Anti-gespalten-Caspase 3 Antikörper (Cl-cas3) zeigen, dass etwa 20 % der Zellen in der kortikalen Platte zu unterziehen Apoptose (weiße Pfeilspitzen) nach 72 h in der Kultur während der GFP-positiven INs gesund zu bleiben (weißer Pfeil), wie die Vergößerung in C-C'' '. Zum Vergleich: zellulären Apoptose ist fast vollständig abwesend von der dünnen Cryosection aus einem PERFUNDIERTEN Tier (D-D'' '). Skalieren Sie Bars: 250 µm (A-B) und 15 µm (C-D'' '). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: organotypischen Scheiben von Mäusen Gehirn-Embryonen und hoher Vergrößerung Mikrofotos von elektroporiert Interneuronen (INs). A. eine organotypischen Stück Kultur von einer Dlx5/6Cre; RCEEGFP Gehirn der Maus (in dem sind alle INs grün) elektroporiert mit einem Dlx5/6::shRNARührei-IRES-TdTomato Plasmid. Die Scheibe wurde behoben mit 4 % PFA nach 72 h im Kultur- und Immunostained für GLP und mCherry. Electroporated INs wurden in 3D (50-60 µm dicken Z-Stapel mit optischen Abschnitten genommen jede 0,5 µm) abgebildet mit einem konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 63 X / 1,3 NA Öl Ziel. INs Migration tangential in der Sub-ventrikuläre Zone des dorsalen Pallium sind leicht zu identifizieren (rote, offene Pfeil). D und M anzugeben dorsal-Ventral und Latero-medialen Achsen bzw.. B. eine repräsentative organotypischen Stück Kultur aus einem Wildtyp (WT) Embryo Electoporated mit einer Steuerung Dlx5/6::shRNARührei-IRES-TdTomato Plasmid, 72 h und Immunostained für mCherry nur festgesetzt. Elektroporiert INs (rot) werden gesehen, dorsal in Richtung der kortikalen Platte migrieren. Electroporated INs sind gekennzeichnet durch ihre Co Expression von TdTomato und EGFP in Dlx5/6Cre; RCEEGFP Mäuse (C-D), oder durch ihren Ausdruck der TdTomato nur bei WT-Mäusen (E-H), und durch ihre typische Morphologie, d.h. ein Oval Zelle Körper, einem verzweigten führenden Prozess (weiße Pfeilspitzen, D-H), eine gelegentliche nachgestellten Prozess (weißer Pfeil, C-D) und eine gelegentliche Schwellung des führenden Prozesses Gehäuse Centrosome vor Nucleokinesis (weißer Stern in C-C' und G). Skalieren Sie Bars: 250 µm (A-B) und 25 µm (C-H). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Zeitraffer live-Darstellung der elektroporiert INs in organotypischen Scheiben kultivierten für 48 h INs elektroporiert am e13.5 mit einem experimentellen Plasmid mit dem Ausdruck der TdTomato Kassette und eine Ausrichtung auf ein Gen des Interesses ShRNA gelten in tangentialer Migration in eine organotypischen Gehirn-Scheibe aus einem Dlx5/6Cregewonnen; RCEEGFP Mausembryos nach 48 h Kultur (A, weißes Quadrat). In B, die gleichen elektroporiert IN (weißes Quadrat) gilt in den Prozess der Nucleokinesis, während der Migration tangential im Kortex, d.h. parallel zur der pial Oberfläche und folgt im Zeitraffer imaging alle 3 Minuten für 8 h mit einem 20 x / 0,85 NA Luft Ziel (erweiterten Boxen, C-F). Das Neuron zeigt zunächst eine längliche Zellkörper (offene Pfeil) in den Prozess der Nucleokinesis (C), sowie eine nachgestellte (weißer Pfeil) und eine verzweigte führenden Prozess (weiße Pfeilspitzen). Nach 3 h live-Imaging die Nucleokinesis ist abgeschlossen, der nachfolgende Prozess hat zurückgezogen und der führenden Prozess baut zwei lange Zweigen (D, weiße Pfeilspitzen). Nach 5 h 30 min eines der führenden Prozess Niederlassung hat (weiße Pfeilspitzen) zurückgezogen und Neurons Zellkörper (offene Pfeil) ist umgezogen nach vorne ca. 10 µm (E). Schließlich nach 8 h der Bildgebung, Migration wurde angehalten, das Neuron hat seinen führenden Prozess erneut erweitert und ein nachgestellter Prozess ist erschienen (weißer Pfeil), aber der Kern (offene Pfeil) ist noch nicht bewegt (F) zu übermitteln. Skalieren Sie Bars: 250 µm (A), 70 µm (B) und 30 µm (C-F). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Zeitraffer Bildgebung ins abgeleitet eine MGE Explant kultivierten für 48 h INs werden gesehen, dass aus einem MGE Explant ein Nkx2.1Creentnommen; RCEEGFP Maus (in welche alle MGE abgeleitet INs ausdrückliche eGFP) elektroporiert mit der CMV::mCherry-LifeAct-7 -Plasmid an e13.5, mit der Methode von Myers Et Al. 201353 angepasst und in Abbildung 1schematisiert und für 48 h (A) kultiviert. INs wurden mit Zeitraffer-live-Imaging für 5 h (B-E) visualisiert. In diesem Beispiel eine Zusammenarbeit zum Ausdruck zu bringen eGFP und LifeAct sieht man zunächst in den Prozess der Nucleokinesis (offene Pfeil) und erstreckt sich zwei führende Prozess Zweige (weiße Pfeilspitzen; B). dieser IN rundet Nucleokinesis nach 1 h (siehe offene Pfeil), da die Zellkörper vorangekommen ist und einen nachgestellter Prozess erschienen im hinteren Teil der Zellkörper (weißer Pfeil) und zeigt immer noch einen führenden Prozess mit zwei Filialen (weiße Pfeilspitzen; ( C). eine zweite Nucleokinesis ist im Gange, nach 2 h 30 min (offene Pfeile) und die IN ist jetzt ausgestattet mit zwei führenden Prozesse aus dem Zellkörper und einen mehr nachgestellten Prozess (weißer Pfeil; ( D). schließlich, nach 5 h, die IN fährt ein Neurit während translocating Centrosome im übrigen führenden Prozess Zweig (weiße Pfeilspitze) in Vorbereitung auf einen dritten Nucleokinesis, mit einem nachgestellten Prozess (weißer Pfeil) noch vorhanden an der Rückseite des die Zellkörper (E). Skalieren Sie Bars: 70 µm (A) und 20 µm (B-E). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: hochauflösender Zeitraffer imaging von Aktin Umbau in INs aus einem MGE Explant kultiviert für 48 h A. Ein organotypischen Slice aus einer Nkx2.1Cre; RCEEGFP Gehirn der Maus ist bei e15.5, gefärbt mit Alexa-594 Phalloidin, ermöglicht die Visualisierung von filamentösen Aktin fixiert. INs werden abgebildet mit 63 X / 1,3 NA Öl Ziel auf einem confocal Mikroskop. In gesunden INs filamentösen Aktin gilt Schröpfen der Rückseite der Zelle Körper nach der Retraktion des nachfolgenden Prozesses nach Abschluss des Nucleokinesis (weißer Pfeil, A'-A'' '). B. An MGE Explant ergibt sich wie oben von einem Nkx2.1Cre; RCEEGFP Gehirn der Maus eine gezielte Löschung eines Gens von Interesse und elektroporiert mit ein Plasmid mit dem Ausdruck mCherry-Lifeact-7 unter der Kontrolle der CMV -Promotors tragen. Time-Lapse live Bildgebung erfolgt nach 48 h Kultur und elektroporiert INs folgen alle 3 Minuten für 3 h mit einem 40 x / 0,85 Luft Ziel. Aktive Umgestaltung des Aktin-Zytoskeletts tritt in den transfizierten mit LifeAct, beispielhaft durch die Bewegung der rot (weiß in schwarz / weiß Bilder) fluoreszierende Punkte innerhalb der führenden Prozess- und Wachstum Kegel (weiße Pfeilspitzen) und an der Rückseite des IN der Zellkörper während Nucleokinesis (B-B'' ', weiße Pfeile). Skalieren Sie Bars: 7 µm (A-A'' ') und 10 µm (B-B'' '). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

In diesem Artikel bieten wir eine zuverlässige Methode für die Durchführung von ex Utero Elektroporation der Maus MGE in e13.5 und zur Erzeugung von organotypischen Kulturen der embryonalen Gehirnscheiben. Obwohl in-vitro- Methoden, z. B. Boyden Kammer Assay, relativ einfach sind durchzuführen und verwendet werden, können um die spezifischen Rollen von verschiedenen Genen und Proteinen ohne die Einmischung von anderen Faktoren zu beurteilen, schließen sie die Untersuchung IN Migration-Dynamik im Hinblick auf die Ausrichtung und Migration Weg25. MGE Explantaten bieten ein nützliches Mittel zu studieren die dynamische Zellskelett Veränderungen während Migration, da wir hier zeigen, aber sie frei von den endogenen Signale sind und häufig erfordern den Zusatz Anleitung Cues, neuronale Migration zu fördern, (obwohl dies bei MGE Explantaten auf kortikale Feeder Schichten kultiviert werden deutlich verbessert)25,54. Dennoch können Tests basierend auf MGE Explantaten die Implikation der molekularen Signale beteiligt subtiler Mechanismen wie die Führung den spezifischen Direktionalität oder Migration Weg INs29erkennt nicht. Dieses Problem wurde schließlich durch in Utero Elektroporation25, wodurch für die spezifische Kennzeichnung von MGE abgeleitet INs Migration in ihrer natürlichen Umgebung13,29,41umgangen. Jedoch, die Technik ist Geschick-anspruchsvoll, durch die chirurgische Verfahren beteiligt und seine Ausbeute ist begrenzt durch die geringe Überlebensrate von Embryonen und die Tatsache, dass die MGE schwerlich in Utero, Ziel ist häufig erfordert die Verwendung von mehreren Würfen zu Bedeutung55zu erreichen. Daher bietet ex Utero Elektroporation von der MGE gefolgt von organotypischen Kultur von Mäusen Gehirn Embryonen eine kostengünstige, zeitsparende und zuverlässige Methode zur Untersuchung der Migration Dynamik und die Morphologie von MGE abgeleitet INs in ihrer natürlichen Umwelt, Queues unter Umgehung der chirurgische Eingriffe in der Gebärmutter Electroporation und die Notwendigkeit der Führung in MGE Explantaten. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik einen leichteren Zugang zu den MGE, die durch apposing direkt die positive Elektrode unter den Hals und die negative oben auf dem Kopf, eine Konfiguration schwieriger anzunehmen in Uteroausgerichtet werden kann. Alternativ kann die MGE fokal injiziert und elektroporiert direkt nach dem generieren organotypischen Scheiben13,25,29, aber diese Technik erwies sich als schwieriger und weniger effektiv in unseren Händen als das Protokoll hier beschrieben. Die in diesem Artikel beschriebenen Schritte befolgen, erhalten eine 50-100 elektroporiert MGE abgeleitet INs pro organotypischen Scheibe, 5-20 von denen gesehen werden tangential die Migration aus der MGE nach 72 h. Transfected INs Leben mit Zeitraffer Bildgebung visualisiert werden können oder abgebildeten und rekonstruierte nach Fixierung und immunhistochemische beschriften.

Das hier beschriebene Protokoll wurde optimiert, um IN Migration ex Vivo zu studieren und wurde inspiriert durch verschiedene veröffentlichten Protokolle beschreiben in Utero Elektroporation von MGE abgeleitet INs, ex Vivo MGE Injektion und Elektroporation, oder die Generation von chronischen organotypischen Gehirn Slice Kulturen36,38,39,42,43,56,57,58. Unser Ansatz begrenzt mögliche Schäden an den MGE Stammväter mit geringer Impulsintensität (40 V) und intraventrikuläre Plasmid-Injektionen als Intra-MGE-Injektionen Hochspannungsimpulse (100 V), wie an anderer Stelle beschrieben39,56 ,57,58. Darüber hinaus, während andere eine Kombination von Penicillin, Streptomycin und Gentamycin zur Verkeimung39,56,57,58zu verhindern, haben wir uns entschieden um Antibiotika zu vermeiden in unserem Kulturmedium, da sie theoretisch IN Migration beeinflussen können. Insbesondere Penicillin ist ein Antagonist von GABA-A Rezeptor59,60, und GABA-A -Rezeptor-Aktivierung aktiviert und später bei der Migration abhängig von intrazellulären Chlorid Steigungen und KCC2 stoppt Ausdruck in verschiedenen Phasen der Migration61. Jedoch kann mit Hilfe der verschiedenen Vorsichtsmaßnahmen in das aktuelle Protokoll angegeben, Kontamination wirksam auch in Abwesenheit von Antibiotika vermieden werden.

Trotz der Effizienz dieses Ansatzes in unseren Händen hat ex Utero Elektroporation auch seine Nachteile. Während eine natürliche dreidimensionale Umgebung für Zellen migrieren, kann es schwierig pharmakologischen Tests in organotypischen Scheiben im Zusammenhang mit Migration durchzuführen sein. In der Tat, die Migration von MGE abgeleitet INs hängt meistens von extrazellulären Signale2,13,19 und die Anwendung von pharmakologischen Inhibitoren oder Aktivatoren auf organotypischen Scheiben erlaubt nicht die genaue Dissoziation der Zelle autonome Effekte von globalen Auswirkungen auf den Gesamtzustand Slice oder Aktivität. Für solche Experimente könnten MGE Explantaten in gemischten dissoziierten kortikalen Zellen gewachsen organotypischen Slice Kulturen vorzuziehen da INs Migration aus dem modellabhängigen leichter isoliert und selektiv auf bestimmte Verbindungen62ausgesetzt werden. Außerdem, obwohl ex Utero Elektroporation einfacher durchzuführen als in Utero Elektroporation, kann es noch technisch anspruchsvolle im embryonalen illustriert hier angesichts der geringen Größe und fragile Zustand des embryonalen Gehirn im Alter sein E13.5. Ermittler benötigen ein paar Versuche, die elektroporiert Köpfe bei e13.5 effizient zu extrahieren, ohne Beschädigung der Oberfläche des Gehirns. Darüber hinaus können im Gegensatz zu postnatalen Scheiben embryonalen organotypischen Scheiben in Kultur über lange Zeiträume hinweg gehalten werden. Obwohl embryonalen organotypischen Slice Kulturen für mindestens 7 Tage in Vitro63gehalten werden können, dies nicht mit Elektroporation kombiniert war und die hier beschriebenen Experimente haben für bis zu 3 Tage in Vitro mit zuverlässigen Ergebnissen getestet in unseren Händen. Daher sollten Ermittler Optimierung Tests im Voraus durchführen, ggf. längere Inkubationszeiten. Weiter, die Untersuchung der IN der Entwicklung bei spätstadien embryonalen oder frühen postnatalen empfiehlt sich nicht mit dieser Technik bei Verwendung e13.5 Embryonen25, jedoch lässt mit in Utero Elektroporation, wo erfolgreich elektroporiert Embryonen in die Gebärmutterhöhle zurück genommen werden und können geboren werden und in späteren Stadien21,64analysiert überlassen werden. Zu guter Letzt ermöglicht ex Utero Elektroporation gefolgt von organotypischen Slice Kulturen für die Analyse von der Morphologie und der Migration Dynamik entwickeln INs. Jedoch wie es zuvor für die in Utero Elektroporation Technik36hingewiesen hat, ex Utero Electroporations Ausbeute 50-100 Electoporated Zellen pro Gehirn Slice und eignen sich daher nicht für die Bevölkerung Analyse. Solche Untersuchungen sind besser in Tiermodellen tragen entweder eine vollständige oder bedingte Löschung (oder Knock-in) des Gens von Interesse. Wenn verfügbar, solche Modelle können dann effizient verwendet werden, um organotypischen Slice Kulturen zu generieren oder MGE explants um die tatsächliche Dynamik der Migration, zu visualisieren, wie hier gezeigt (siehe Abbildung 5 und Abbildung 6).

Viele Schritte in diesem Protokoll sollte sorgfältig durchgeführt werden, um optimale Ergebnisse zu erzielen. Zum Beispiel ist es ur, dass alle Schritte unter streng sterilen Bedingungen durchgeführt werden, wie Verunreinigungen ganz leicht entstehen kann. Handschuhe und Instrumente außerhalb der Biosicherheit Schrank sollte mit 70 % Ethanol häufig während des gesamten Verfahrens gesprüht werden. Darüber hinaus Lösungen wie Kultur, Medien und künstliche Liquor cerebrospinalis aufbewahrt werden steril und kalt (4 ° C) und aus frischen alle 2-3 Wochen. MGE-abgeleitete INs genauer beschriften, Plasmide, die in solchen Experimenten verwendet werden sollte unter der Kontrolle einer IN-spezifischen Promotors geklont werden (z. B.: Dlx5/649, Lhx6-65), anstatt einfach auf die anatomischen Angriffe auf die MGE. Die Generation der organotypischen Scheiben benötigt das Gehirn am Leben zu bleiben. So sollten zur Erhaltung von Gesundheit und Überleben dieses Experiment in weniger als 3 Stunden ab dem Zeitpunkt durchgeführt werden, dass die Embryonen abgerufen werden, bis die organotypischen Scheiben in Kultur gebracht werden. Für Zeiteffizienz können Kultur-Platten vorausgefüllt mit hausgemachten Kulturmedium kurz vor Beginn des Experiments und im Inkubator 37 ° C Zelle Kultur bis zur Verwendung. Darüber hinaus sollte die Gehirne sorgfältig aus dem Schädel ohne Schäden an der kortikalen Oberfläche seziert werden, um korrekte Einbettung in die Agarose-Lösung und anschließende Vibratome-Schnitt zu erreichen. Beispielsweise kann Beschädigung der kortikalen Oberfläche, sogar minimal, die Ablösung der 250 µm Dicke Abschnitte aus dem umliegenden Agarosegel oder Abbau der in den Abschnitten während Vibratome schneiden führen. Für neuronale überleben, ist es auch wichtig, dass die Temperatur der Agarose-Lösung in der Nähe von 42 ° C bleibt, da höhere Temperaturen zu Schaden und Zelle Absterben von Gewebe, führen während niedrigere Temperaturen auszuschließen werden die richtige Einbettung des Gehirns (oder Schäden während der Einbettung des Prozesses). Einmal sollte in der Kultur zu anderen Kontaminationsquellen vermeiden die Scheiben nicht manipuliert werden bis sie auf die Lupe für die Bildgebung übertragen werden. Diese Schritte sollten in einer sterilen Umgebung durchgeführt werden und muss Aufmerksamkeit nicht verunreinigen die Platten nach diesen Manipulationen, vor allem, wenn sie in der Kultur für die spätere Re-imaging zurückgestellt werden müssen. Zu guter Letzt empfehlen wir nicht, dass ein DNA-aliquoten erholt gemischt mit Farbstoff aus früheren Experimenten für die zukünftige Verwendung zu laden, wie wir einen erheblichen Rückgang der Ertrag der elektroporiert Neuronen mit solchem Material beobachtet.

Abschließend das ex Utero Electroporation und organotypischen Stück Kultur Protokoll beschriebenen ermöglicht die spezielle Kennzeichnung von MGE abgeleitet INs Ebene der einzelligen und kann verwendet werden, um spezifische Molekulare Signalwege zu genetisch verändern studieren Sie ihre Rolle bei der Regulierung der morphologischen Veränderungen und Migration Dynamik der tangential Migration INs. Diese Methode ermöglicht die schnelle und kostengünstige frühe funktionelle Untersuchung neue Kandidatengene identifiziert durch einzelne Zelle RNA Sequenzierung von wandernden INs66,67 oder durch Next Generation Sequencing von Patienten mit Neurodevelopmental Störungen68,69,70. Diese Technik ist beträchtlich benutzt worden, um Migration in andere Zell-Populationen, einschließlich Pyramidenzellen in der Kortex und Hippocampus70,71,72,73zu studieren. Einmal gemeistert, könnte es für das recycling und Handel von Membranproteinen, wie Rezeptoren und Kanäle mit GFP-markierten Proteinen image verwendet werden; die Aktivierung der spezifischen zellulären Signalisierung Kaskaden mit Biosensoren74; oder auch die Überwachung und Manipulation der Zellaktivität mit Kalzium Imaging, optogenetik in kortikalen INs, sondern auch in anderen Bereichen des Gehirns, wie Hippocampus, Amygdala oder sogar das Striatum gekoppelt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben. Die hierin geäußerten Ansichten repräsentieren nicht unbedingt die Meinung der Gesundheitsminister oder der Regierung von Kanada.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von Betriebskostenzuschüssen von Savoy-Stiftung und der Heilung-Epilepsie-Stiftung unterstützt und durch Ausrüstung gewährt der kanadischen Stiftung für Innovation E.R (confocal Mikroskop) und G.H (Spinning Disk confocal Mikroskop). E.r. erhält einen Karriere-Award von der Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Clinician-Scientist Award) sowie von der Canadian Institute for Health Research (CIHR; Young Investigator Award). G.h. ist ein senior Scholar des FRQ-S. L.E ist der Empfänger des Steriade-Savoy Postdoc Training Award der Savoy-Stiftung, Postdoc Training CHU Sainte-Justine Stiftungspreis und FRQ-S Postdoc Bildungspreis, in Partnerschaft mit der Stiftung der Sterne. Dieses Projekt wurde vom Gehirn Kanada durch Kanada Brain Research Fund, mit finanzieller Unterstützung von Health Canada, verliehen an l.e. ermöglicht

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neurobasal Medium ThermoFisher Scientific 21103049 Commercially available neuron-specific culture medium. Complete formulation available on this website: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html
B-27 serum-free supplement ThermoFisher Scientific 17504044 50X Serum-free neuron specific supplement
15 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.554.002
Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-Glutamine) ThermoFisher Scientific 11415064 Commercially available neural-based culture medium supplemented with amino acids, vitamins and inorganic salts. Complete formulation available on the distributor's website 
L-Glutamine Invitrogen 25030-081
Horse serum, heat inactivated Millipore-Sigma H1138-500ML
Neurocell supplement N-2 100X Wisent 305-016 Botteinstein's N-2 Formulation
VWR Square PETG Media Bottles 125 mL VWR 89132-062
Class II Type A Biosafety Cabinet Nuaire NU-540
Sucrose BioShop SUC700.1
Sodium Chloride BioShop SOD001.1
Sodium bicarbonate ThermoFisher Scientific S233-500
D+ glucose Millipore-Sigma G7528-250G
Potassium Chloride ThermoFisher Scientific P217-500
Sodium phosphate monobasic anhydrous BioShop SPM400.500
Calcium chloride dihydrate  ThermoFisher Scientific C79-500
Magnesium sulfate heptahydrate BiosShop MAG522
Agarose BioShop AGA002.500
50 mL sterile centrifuge tubes Sarstedt 62.547.004
1.5 mL centrifuge tubes Sarstedt 72.690.001
P-97 Flaming/Brown Micropipette puller Sutter Instruments Co. Model P-97
0.4 mm I.D. x 75 mm Capillary Tube Drummond scientific 1-000-800/12
Ethanol VWR E193
5 mL syringe Becton Dickinson & Co 309646
Mineral Oil (heavy) Rougier Pharma
WPI Swiss Tweezers #5 World Precision Instruments 504511 11 cm, straight, 0.06x0.07mm tips, antimagnetic. You will need 2 of these.
WPI Swiss Tweezers #7 World Precision Instruments 504504 11.5 cm, 0.18x0.2mm, curved tips
HTC Tweezers World Precision Instruments 504617 11 cm, Straight, flat
Operating scissors World Precision Instruments 501225 16 cm, Sharp/sharp, straight. You will need 3 of these.
Dressing Forceps World Precision Instruments 501217 12.5 cm, straight, serrated
Iris Forceps World Precision Instruments 504478 10.2 cm, full curve, serrated
DeBakey Tissue Forceps World Precision Instruments 501996 15 cm, 45° angle, Delicate Jaw, 1.5mm wide
Fisherbran Microspatula with rounded ends FisherScientific 21-401-5 You will need 2 of these.
Nanoject II Auto-Nanoliter Injector Drummond scientific 3-000-204
TC Dish 60, Standard Sarstedt 83.3901 60-mm dish
Tissue culture dish Sarstedt 83.1800 35-mm dish
Black Wax FisherScientific S17432
Transfer pipettes  Ultident 170-CTB700-212 3 mL, small bulb
Stereo Microscope Leica Biosystems Leica M80 In replacement to our stereomicroscope which has been discontinued by the manufacturer (StereoMaster from FisherScientific)
Electro Square Porator BTX Harvard Apparatus ECM 830
Tweezertrodes, Plattinum Plated, 3mm BTX Harvard Apparatus 45-0487
25G 1 1/2 Becton Dickinson & Co 305127
Leica VT1000S Vibrating blade microtome Leica Biosystems VT1000S
GEM, Single edge razor blade Electron Microscopy Sciences 71952-10 Remove the blunt end before inserting in the blade designated space of the vibratome
µ-Slide 8 well Ibidi 80827 Pack of 15
Millicell cell culture insert Millipore-Sigma PICM0RG50 30 mm, hydrophilic PTFE, 0.4 µm pore, pack of 50. 
Leica DMi6000 microscope Leica Microsystems N/A
Spinning disk confocal head Ultraview Vox Perkin Elmer N/A
Volocity 6.0 acquisition software Improvision/Perkin Elmer N/A
LiveCell Stage top incubation system Pathology devices LC30030 Provides Temperature, CO2 and humidity control. 
SP8 confocal microscope Leica
mCherry-Lifeact-7 Addgene 54491 Gift from Michael Davidson
Fast Green FCF Millipore-Sigma F7258-25G 25G bottle, certified by the Biological Stain Commission

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