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인간 T 세포 회수 응답에서 Vivo에서 공부 하는 흡입 물집 프로토콜

Immunology and Infection
 

Summary

여기, 우리는 흡입 물집 피부 리콜 모델의 데모를 제공합니다. 모델에는 인간의 vivo에서 적응 면역 반응, 예를 들어 백신 개발의 맥락에서에서 연구 간단한 액세스할 수 있습니다.

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Holm, L. L., Vukmanovic-Stejic, M., Blauenfeldt, T., Benfield, T., Andersen, P., Akbar, A. N., Ruhwald, M. A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo. J. Vis. Exp. (138), e57554, doi:10.3791/57554 (2018).

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Abstract

피부 항 원-리콜 모델 인간의 메모리 응답 비보의 연구에 대 한 수 있습니다. 피부 흡입 물집 (SB) 유도 결합 하 여,이 모델은 셀룰러 메모리 응답으로는 cytokine microenvironment에서 현장에서의 항 원 특정 T-세포 대표의 드문 인구를 내게 필요한 옵션을 제공 합니다.

이 보고서에서는 피부 리콜, SB 유도 및 항 원 특정 T-세포의 수확의 실질적인 절차를 설명합니다. 방법을 예증, 투베르쿨린 피부 검사 사용 개인,이 연구에 앞서 수술 감염 접종 균 메-게 랭에 항 원 리콜 결핵균. 마지막으로, 예제 SB 표본의 멀티 플렉스 및 흐름 cytometric 분석의 제공 됩니다, 세포는 혈액에서 분리에 비해이 샘플링 방법으로 항 원 특정 polyfunctional CD4 + T 세포 수의 높은 분수를 보여주는.

여기 설명 하는 방법을 안전 하 고 최소한 침략 적 공부를 모두 타고 난 및 적응형 면역 응답 vivo에서, 독특한 기회를 제공 합니다 이며, 셀 중재 면역과 인간의 협력 연구의 광범위 한 지역 사회에 도움이 될 수 있습니다. 메모리 응답, 백신 개발의 맥락에서.

Introduction

피부 SB는 인위적으로 유도 물집 세포와 피부에서 직접 액체의 수확에 대 한 허용 하는. 진공으로 SBs를 올리기의 기술이 이다 피부과 피부 면역학 건강과 질병1,2,3,,45, 의 연구에 대 한 사용의 분야에서 잘 알려진 도구 6 , 7 , 8.이 보고서 보여줍니다 어떻게 피부 항 원 리콜 (SB 피부 리콜 방법)와 결합 된 SB 기술을 적응 면역 반응 비보에 직접적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

SB 유도 뒤에 원리는 간단 하다: 가벼운 진공 피부의 작은 영역에 적용 됩니다. 부정적인 압력은 결국 표 피 및 셀1,,29가득 로컬 물집을 만드는 진 피에서 분리를 강제 합니다. 물집 액체 정밀한 바늘 포부에 의해 수확 수 있습니다 고 추가 연구에서 시험관에대 한 콘텐츠를 사용할 수 있습니다.

최근 몇 년 동안에 SB 방법 질병 피부10,11제한 이외의 면역 반응 생체 내에서 의 연구에 대 한 관심이 증가 되었습니다. 인간의 적응 면역의 연구는 세포 그리고 cytokines의 샘플링 말 초 혈액에서 림프 노드 또는 위장 점 막 조직에의 한 침략 샘플링 용납 하 고 비 윤리적인 수 있기 때문에 사실에 의해 제한 됩니다. 예를 들어는 예방 접종12후 긴 인간의 기억 T 세포 응답의 연구 이다. 이러한 시련에 관련 T-세포의 샘플링 관련 인구 면제를 중재 하는 셀의 림프 조직에 존재 하기 때문에 큰 도전 수 고만 매우 제한 된 수의 특정 T-세포는 말 초 혈액에서 순환.

SB 기술은 메모리 T-세포의 연구는 독특한 기회 및 다른 특정 세포 인구를 제공합니다. 항 원 피부 접종 다음 T-세포는 항 원에 대 한 특정 피부 림프 그들의 은신처에서 모집 하 고 SB에서 쉽게 샘플링할 수 있다. 이 피부 리콜 모델의 방법론 및 연구 응용 프로그램 아크 바르 외. 에 의해 설명 했다 20132에서. 피부 회수에 대 한 일반적으로 사용 되는 항 mycobacteria PPD 피부 피부 층에 주입은 투베르쿨린 피부 검사 (TST)13, 수행 하는 데 사용의 상용 순화 된 단백질 유도체 (PPD)입니다. PPD [예를 들어, 개인 결핵균 (Mtb) 감염 또는 이전 균 메 게 랭 (BCG) 접종]으로 기존 면역 메모리를 가진 개인, 항 원 증 착에서 결과 피부 하 비보에 클론 확장 PPD 특정 CD4 + T 세포2,11,,1415의 마이그레이션 응답을 기억 합니다. 그 결과, PPD 특정 polyfunctional의 높은 분수 CD4 + T 세포는 SB 샘플링에 대 한 준비 피부에 누적 됩니다. 이 방법에 의해 수집 된 T-세포는 강력한 것을 입증 되며 immunoassays의 범위 및 장기 생체 외에서 문화15특징을 충분히 풍부. 따라서, 피부 리콜 모델과 SB 유도 비보 전 분석에 의해 vivo에서 T 세포 응답을 공부 하는 귀중 한 방법을 증명할 수 있습니다. 그리고이 방법의 증가 지식 세포 면역학에 관심을 가진 연구자 혜택을 수 있습니다. 그리고 백신입니다.

이 보고서는 PPD 주사 피부에 인간 피부 흡입 물집을 유도 하는 방법에 첫 번째 단계적 가이드를 제공 합니다. 피부 항 원 리콜 모델은 BCG 예방 접종 자원 봉사자에서는 TST를 사용 하 여 보여 줍니다. 마지막으로, 세포의 cytokines SB에 의해 분리 관련 비보 전 분석은 exemplified. SB 메서드에서 얻은 PPD 전용 T-세포의 phenotypical 및 기능적 특성은 철저 하 게 설명 되어2,,1011,,1617, 18 , 19.이 보고서 다른 연구 그룹에 의해이 기술의 응용 프로그램 완화 방법의 실용적이 고 면역 측면을 논의 하는 것을 목표로.

Protocol

인간의 자의 사용을 포함 하 여 아래 설명 된 모든 방법은 건강 연구 윤리 (H-15002988) 및 덴마크어 데이터 보호 기관 (jr.nr. 2015-57-0102) 덴마크 위원회에 의해 승인 되었습니다가지고. PPD는 인간 사용을 위해 승인 하 고 제조업체에서 제공 하는 정확한 복용량에서 관리 인증된 제품 이어야 합니다. 복용량 또는 관리 모든 편차가 추가 윤리적인 승인 해야 하 고 자원 봉사자 동의 부여 해야 합니다.

1. 투베르쿨린 피부 검사

  1. 자원 봉사에서 구두 및 서 면 동의 얻을. 주입, 이전 지원자를 이해 하 고 수락 가능한 불리 한 효과 포함 하는 절차를 확인 합니다.
    참고:이 프로토콜 특정 포함 기준 > 18 세 및 문서화 BCG 예방 접종은. 포함 기준 연구 질문에 따라 다를 수 있습니다 (, 추가 포함 기준 긍정적인 TST의 증거 일 수 있었다).
  2. PPD의 기성 솔루션을 사용 하 여 인간의 사용 [20 투베르쿨린 단위 (TU) /mL]에 대 한. 소독 알콜 면봉을 사용 하 여 유리병의 고무 캡.
  3. 사출 사이트 준비
    1. 자원 봉사자의 팔 뚝의 복 부 측에 사출 사이트를 찾습니다.
    2. 일반 표면에 팜 업 팔을 놓고 팔 뚝, 팔꿈치 관절에서 약 5-10 cm의 위 세 번째 영역을 선택 합니다. 숙박은 상처, 정 맥, 또는 손상 된 피부의 선택을 취소 합니다.
    3. 알코올 면봉을 사용 하 여 영역을 소독.
  4. PPD 솔루션 준비
    1. 1 mL 균 주사기 27-30 G/짧은 (예를들면, 12 m m) 바늘을 고정을 사용 합니다.
    2. 부드럽게 혼합 하 고 PPD 솔루션의 0.1 mL를 갈망. 거품 없는 볼 수 있는지 확인 합니다.
  5. 피부 PPD 주사
    참고:이 단계 단일 PPD 증 착을 수행 하는 방법을 설명 하지만 동일한 팔에서 PPD의 여러 증언 가능 합니다. 그러나,이 특정 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다.
    1. 피부를 스트레칭 하 고 위쪽으로 향하게 하는 경사와 함께 피부에 5-15 ° 각도로 바늘을 가리킵니다.
    2. 피부 피부 층에 바늘의 팁을 삽입 하 고 팁은 표 피를 통해 거의 볼 수 있는지 확인 하십시오.
    3. 천천히 PPD 솔루션의 0.1 mL를 주사.
      참고: 올바르게 관리 하는 경우 6 ~ 10 mm의 창백한 구 진 즉시 나타납니다. 구 진 약 10 분 후 사라진다.
    4. 두 개 이상의 증언 때, 팔꿈치 및 손목 영역에서 좋은 거리에서를 유지 하면서 사출 사이트의 최대 별거 (5-10 cm)에 대 한 목표.
      참고:이 피부 테스트 응답의 잠재적인 합류를 방지 하 고 있습니다 두 개의 흡입 챔버의 중단 위치.

2. 피부 반응-3 일의 평가

  1. 48-72 시간 후 note 피부 반응의 크기. 단단하게 됨 (붓기)를 측정 하지 반응의 홍 반 (적색).
  2. 하드를 만져 손가락을 사용 하 여 붓기와 볼펜을 사용 하 여 단단하게 됨의 가장자리를 표시 하는 다음. 눈금자를 사용 하 여 단단하게 됨 직경을 측정 하 고 결과 m m.
    참고: 단단하게 됨 크기의 흡입 챔버에 대 한 오리 피스 직경의 선택을 가이드 수 있습니다.

3. 흡입 물집 유도-7 일

  1. 흡입 장치 단위 조립.
    참고: 흡입 장치 단위는 흡입 물집 유도 대 한 연결 된 챔버와 진공 펌프. 이 데모에서 사용 되는 장치는 사용자 정의 하지만 흡입 장치 단위는 또한 상업적으로 사용할 수 있습니다. 펌프-20 ~-40 kPa의 범위 내에서 조정 가능 하 고 안정 하 고 신뢰할 수 있는 부정적인 압력을 제공 해야 합니다. 이 메서드를 사용 하 여 실험을 실시 이전 지역 윤리적인 승인을 얻은 합니다.
    1. 첫째, 하단 오리 피스 플레이트와 챔버와 연결 호스 창 접시를 조립 하 여 흡입 챔버를 준비 합니다. 진공 펌프를 단단히 챔버에 연결 호스를 연결 합니다.
      참고: 챔버는 인간의 피부와 접촉에 적합 해야 합니다, 물집 유도 구멍 바닥판 및 물집의 비주얼 모니터링에 대 한 허용 창 상단 플레이트 포함 되어야 합니다.
  2. 피부 반응;의 크기를 기준으로 오리 피스 플레이트의 최적의 오리 피스 직경을 결정 오리 피스, 크기가 큰 물집.
  3. 오리 피스 플레이트와는 자원 봉사자의 피부 소독 알코올 면봉을 사용 하 여.
  4. 피부에 흡입 챔버를 연결 합니다.
    1. 자원 봉사자의 팔 편안 하 게 휴식 하 고는 다는 것을 확인 하십시오.
    2. 피부 반응의 센터 표시 되도록 PPD 반응을 통해 흡입 챔버의 하단 플레이트에 구멍 위치 다는 것을 확인 하십시오.
    3. 안전 띠를 사용 하 여 느슨하게 챔버: 챔버 피부에 준수 되며 그 위치를 유지 때 부정적인 압력이 적용 됩니다.
  5. 흡입 장치를 설정 하 고-20 kPa에 압력을 조정 합니다.
  6. 30 분 후-25 kPa에 부정적인 압력을 증가.
  7. 60 분 후-30 kPa에 부정적인 압력을 더욱 높일.
  8. 물집은 완전히 형성 될 때까지-30 kPa에서 압력을 유지. 이 프로토콜에서 제공 하는 부정적인 압력 특정 사용자 지정 된 악기 인지 확인 합니다. 그것은 약간 다른 설정에서 프로토콜을 적용할 때 압력을 조정 해야 합니다.
    참고: 물집 유도 단계 Blistering는 종종 가려움 센 세이 션과 관련 된 마지막 30 분 이내에 발생 하는 실제 물집 형성-180 분 (1-3 h) 60에서 배열 한다. 물집은 하나 또는 여러 개의 병합 물집으로 발생할 수 있습니다. 만약 물집이 파열 또는 출혈 발생, 천천히 압력을 방출 하 여 물집 유도 종료 하는 것이 좋습니다.
  9. 물집은 완전히 형성 후 압력을 놓고 피부에서 물집 파열 없이 흡입 챔버를 조심 스럽게 제거.
  10. 주변 피부에 부드러운 드레싱을 적용 하 고 물집 하드 캡 (예를 들어, 50 mL 플라스틱 튜브에서) 장소.
  11. 부드러운 신축성 붕대 뒤 비 알레르기 수술 테이프로 모자를 보안 합니다.
  12. 다음 12-24 h에 대 한 물집 지역에 과도 한 신체 부담을 피하기 위해 자원 봉사를 하도록 지시 합니다.

4. 수확 물집 유체의-주 8

  1. 8번째 날, 부드럽게 보호 드레싱을 제거 하 고 피부 소독 스프레이와 물집을 치료.
  2. 23 G 바늘으로 2 mL의 멸 균 주사기를 사용 하 여 물집 콘텐츠를 수확. 물집의 상단/측면 쪽에 바늘을 삽입 하 고 액체를 천천히 발음. 구멍의 바닥을 만지지 마십시오 하지만 모든 액체를 수확.
  3. 축소 된 물집에 드레싱을 적용 합니다.
  4. 무 균 튜브에 물집 유체를 전송. 볼륨 note
  5. 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 4 분 600 x g에 아래로 물집 액체를 회전 합니다.
  6. 다른 튜브에는 상쾌한 전송 및 셀 매체의 500 µ L에서 셀 펠 릿 resuspend.
    참고: 셀은 계산 및 추가 분석에 대 한 준비. Supernatants 사용까지-20-80 ° C에 저장할 수 있습니다.

5. 흡입의 분석 물집 세포 및 체액

참고:이 프로토콜의 범위 내에서 않습니다 세포와 피부 흡입 물집에서 얻은 액체의 분석에 대 한 지침을 제공. 그러나,이 보고서에 대 한 대표적인 결과 제공, 세포내 얼룩 흐름 cytometry 및 멀티플렉스 분석 수행 했다. 방법론은 아래에 간단히 설명 되어 있습니다.

  1. Cytometry
    1. 1 x 105 신선한 셀 1 BCG 예방 접종 자원 봉사자와 PPD의 10 µ g/mL에서에서 흡입 물집에서 절연의 현 탁 액을 자극 하 고 37 ° C, 5%에서 세포를 품 어 공동2. 병렬 부 화에 대 한 unstimulated 셀을 포함 합니다.
    2. 1 x 106 PBMCs PPD의 10 µ g/mL와 함께 1 BCG 예방 접종 자원에서 얻은 정지를 자극 하 고 37 ° C에서 5% 혼합물을 품 어 공동2. 병렬 부 화에 대 한 unstimulated 셀을 포함 합니다.
    3. 2 시간 후 Brefaldin A와 monensin 모든 세포를 치료 하 고 37 ° c.에 6 h에 대 한 그들을 품 어
    4. 라이브/죽은-얼룩-BV510, 안티-CD4-AF780, 안티-CD3-BV421, 안티-CD8-PerCP-Cy5.5, 안티-CCR7-PE, 안티-CD45RA-BV786, 안티-IFN-γ-AF700, 안티-TNF-α-PE-Cy7, 및 안티-일리노이-2-FITC 패널 셀 얼룩.
    5. PBMC 패널에 FMO 컨트롤을 포함 합니다.
    6. 교류 cytometer와 흐름 cytometric 분석을 수행 하 고 관련 소프트웨어를 사용 하 여 결과 분석.
    7. Cytokine 생산 CD3 + CD4 + CD8-하위 다음과 같은 제어 전략을 사용 하 여에 게이트: singlets-> 가능한 CD3 +-> CD4 + CD8--> IFN-γ +, TNF-α + 또는 일리노이-2 +.
    8. 이펙터 메모리 셀 인구는 다음과 같은 제어 전략을 사용 하 여에 게이트: singlets-> 가능한 CD3 +-> CD4 + CD8--> CCR7-CD45RA-.
    9. 부울 게이팅을 사용 하 여 개별 cytokine 프로필을 계산 합니다.
  2. Cytokine 릴리스 데모
    1. Vivo에서릴리스에 cytokine의 데모에 대 한, 다중 분석을 사용 하 여 계량 일리노이-2, IFN-γ, TNF-α, 일리노이의 레벨-10, 및 IL-13 4 자원에서 얻은 해 동된 흡입 물집 액체에서.
    2. 세포 cytokine 방출의 데모에서 얻은 흡입 물집 전 비보, 사용 신선한 흡입 물집 세포와 PBMCs 1 BCG 예방 접종 자원에서 얻은.
    3. 감염에서 PBMC 100 콜로 니 형성 단위 (CFU) Mtb H37Rv 물집 세포를 흡입 하 고 4 일 동안 그들을 품 어.
    4. 다중 분석을 사용 하 여 계량 일리노이-2, IFN-γ, TNF-α, 일리노이의 레벨-10과 IL-13 모든 문화 supernatants에.
    5. 위 계산도 분석 결과 계산 범위 위의 측정을 조정 합니다.

Representative Results

8 건강 한 성인 자원 봉사자 (평균 나이: 30 년 범위: 26-43 년) 문서화 이전 BCG 예방 접종으로 (BCG 예방 접종에서 중간 시간: 5.5 년, 범위: 1-30 년) 포함 했다. 참가자는 2 TU PPD TST 평가 3 일에 의해 다음의 intradermally 도전 되었다. SBs는 7 일에 유도 되었고 8, 당일 수확 그리고 모든 물집 물집 흡입 챔버를 사용 하 여 10mm 구멍 직경을 제기 했다. 7 개인 2 병렬 SB inductions 뒤 같은 팔에서 동시에 분리 되 2 PPD 예방 접종을 부여 했다 (단계 1.4 프로토콜아래 여러 PPD 증언에 관한 참고를 참조 하십시오). 주변 혈액 플라스마 및 PBMCs 절연 제 7 일에 조밀도 기온 변화도 원심 분리에 의해 그려진 했다. SBs에서 플라즈마와 액체 supernatants-20 ° c.에 저장 된 신선한 SB 셀 (SBCs) nigrosine 얼룩 현미경 검사 법을 사용 하 여 계산 했다.

임상 TST 반응과 SBC 수익률 그림 1에 표시 됩니다. TST indurations의 평균 크기는 10.25 m m (범위: 0-20 m m) 그리고 물집 당 평균 휴대폰 번호 50000 (범위: 15000-210000 셀, 물집의 수: 15). 2 자원 봉사자 2 TSTs 중 고 15000 셀/물집의 해당 낮은 총 셀 수익률에 임상 응답을 했다. 셀 항복 TST의 평균 임상 응답와 관련 되었다 (Spearman의 r = 0.643, p = 0.094).

Figure 1
그림 1 : 흡입 물집 세포 수확량. ()이이 패널이 보여줍니다 대표 SBs에서 격리 nigrosine-얼룩진 세포의 현미경 7 일 게시물 TST 제기. (b)이이 패널에서는 평균 TST 단단하게 됨 (mm)와 평균 셀 생산량 (n/blister) 사이의 관계 8 BCG 예방 접종 자원 봉사자 (물집의 수 = 15). 점 들 개별 비 열 측정을 나타냅니다. 2 자원 봉사자 모두 0 m m의 TST 단단하게 됨 및 15, 000의 셀 항복 했다 2 점 겹치며 note 하시기 바랍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

흐름 cytometric SB 특성을 보여 SBCs BCG 예방 접종 30 년 전에 었 었던 43-올해-옛 자원 봉사에서 가져온 고 Mtb. 는 SBCs를 알려진된 노출 없이 단일 물집 (의 유도 따라 격리 했다 단단하게 됨: 1.4 m m/100000 SBCs). 그림 2 는 SBCs PBMCs의 얼룩이 지는 세포내 cytokine의 대표 작을 보여준다.

이 자원 봉사자 CD3 + CD4 + CD8-Sbc의 분수에서에서 증가 unstimulated 세포에서 67%는 PPD 생체 외에서 restimulation 시 > 90% 반면 CD3 + CD4 + CD8-PBMCs의 일부분 남아 일정 (~ 51%, 그림 2). 이펙터 메모리 종류의 92%는 체 외에서 PPD-뿐 아니라 unstimulated CD3 + CD4 + CD8-SBCs 했다 하는 이상 (CCR7-CD45RA-, 데이터 표시 되지 않음). PPD 자극에 의해 유도 된 특정 CD3 + CD4 + CD8 세포의 전반적인 분수는 PBMCs에 비해 SBCs에서 높았다 (33.1 vs. 0.2%, unstimulated 샘플 빼고). PBMCs에서 polyfunctional PPD 특정 CD3 + CD4 + CD8 세포의 분수 모든 < 0.05%는 이었다.

Figure 2
그림 2 : Sbc의 대표적인 흐름 cytometry 플롯 PBMCs. 패널은 ab 표시 대표 밀도 플롯 CD8 +와 CD4 + 인구 (a)의 unstimulated vs. PPD 자극 PBMCs 및 (c) SBCs. 패널 b d 느린 PPD 자극 CD3 + CD4 + CD8-셀 (b) PBMCs에에서 얼룩이 지는 세포내 cytokine의 플롯 및 (d) SBCs. 제발 큰 보려면 여기 클릭 이 그림의 버전.

예상 했던 대로, CD3 + CD4 + CD8-SBCs 주된 cytokines TNF-α와 IFN-γ와 활성화 된 vivo에서, 얼룩 upregulated cytokines (12%), 대 한 세포의 높은 비율에 의해 그림 했다. 그러나, PPD 자극에 따라 세포를 은닉 하는 cytokine 이동 쪽으로 트리플 또는 더블-양성 IFN-γ, TNF-α + IL-2 + (17%)와 IFN-γ + TNF-α + (15%) 프로필 (그림 3b, 같은 기증자에서 PBMC 프로필 포함 된다 에에서 비교에 대 한 그림 3a). PPD 자극 이펙터 메모리 CD4 + T 세포 부분 집합에 대 한 cytokine 식 프로필 (CD3 + CD4 + CD8-CCR7-CD45RA-) CD3 + CD4 + CD8-인구 그림 2와 3 (데이터 표시 되지 않음)에 비교 했다.

Figure 3
그림 3: PBMCs 대 자극 하는 CD4 + PPD와 unstimulated SBCs Cytokine 프로필.  이 패널 표시 cytokine 생산에 대 한 개별 프로필 () CD3 + CD4 + CD8-PBMCs 세포와 (b) CD3 + CD4 + CD8-Sbc. 막대 항 원 특정 cytokine 프로필 unstimulated 셀 (흰색 막대)와 PPD (컬러 바)와 생체 외에서 자극 시의 분수를 나타냅니다.

피부 테스트 사이트에서 cytokine microenvironment에 정보의 소스로 SB 액체를 탐험, cytokine 수준 SBs 유도 7 일 게시물-TST (그림 4a)에서 수확 하는 유체에서 측정 되었다. IFN-γ, TNF-α와 일리노이-2의 중간 레벨 339 pg/mL, 되었고 19 pg/mL, 1 pg/mL, 각각 (n = 6). 플라스마 수준은 일반적으로 매우 낮은 했다. SBs에서 고립 된 셀 프로 염증 성 cytokines 비보 전 (그림 4b)의 높은 수준의 생산. 1 자원 봉사에서 Sbc의 titrations 4 일 악성 M. 결핵 의 존재에 대 한 교양 했다 ± 헌 PBMCs. IFN-γ 수준 > 30-fold SBCs, PBMCs의 존재에 관계 없이 포함 된 문화에서 더 높은.

Figure 4
그림 4 : SB 유체, 플라즈마, Cytokine 수준 및 Mtb -문화 supernatants 감염. ()이이 패널 cytokine 수준을 보여줍니다 SB 유체 supernatants 및 플라즈마 6 BCG 예방 접종 자원 봉사자에서. 바 대표 중간 cytokine 수준; 오차 막대 범위를 나타냅니다. (b)이이 패널에서는 cytokine 레벨 4 병렬 600 µ l 비보 전 4 일간의 문화 1 x 106 PBMCs (검은 막대), 1.75 x 10에서에서 supernatants5 SBCs (흰색 막대), 및 1 x 106 PBMCs 아군 0.5 또는 1.75 x 10 5 SBCs (회색 막대) Mtb에 감염. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

이 원고는 인간의 면역 메모리 응답에서 vivo에서, 흡입 물집 유도 함으로써 피부 항 원 회수 및 셀 수확을 사용 하 여 연구에 대 한 실질적인 절차를 설명 합니다. TST 피부 항 원 증 착 및 BCG 백신 회수의 한 예로 사용 되었다. 마지막으로, SB 표본 특성 흐름 cytometric 및 멀티플렉스 cytokine 분석의 예를 제공, 이펙터 메모리 형의 항 원 특정 polyfunctional T-세포를 했다 SB 셀의 세 번째는 대략 시연 했다.

이 프로토콜의 중요 한 단계는 피부 주입, 흡입 물집 유도 기술과 물집 펑크 포함 됩니다. 첫째, 올바른 피부 증 착 훈련된 인원을 필요합니다. 잘못 된 증 착 차선의 결과 발생할 수 있습니다. PPD는 일반적으로 잘 알려진 하 고 안전한 피부 항, 하지만 그 구성 comparability13,20제한 제조 업체 간의 다를 수 있습니다. 이 보고서는 2 TU의 단일 피부 증 착 및 필요에 따라 두 개의 병렬 증언 (2 x 2 TU), 추가 윤리적인 승인을 요구할 수 있습니다에 대 한 지침을 제공 합니다. 그러나, 다른 연구 사용 10 부 엉, 강한 피부 반응10,21의 가능성을 증가 하는. SB 유도 단계에서 부정적인 압력에서 작은 stepwise 증가 출혈 및 물집 파열의 위험을 줄일 것입니다. 적혈구와 백혈구 혈 류에서 오염의 기회는 일반적으로 낮은2. 무 균 바늘 기술 미생물 오염을 방지 하 고 파편 또는 거주 피부 세포의 불순물을 감소 펑크 바늘 및 피부 물집 바닥 사이의 접촉을 피하고. 그러나, 일부 연구 자들은 SB 액체 구멍이 물집10회전 압력을 적용 하 여 수확을 선호 합니다. 그것은 물집 내의 septa 펑크 필요할 수 있습니다. SB 기법 자체는 최소 침 습; 축소 된 SBs 흉터 없이 치료 하 고 감염 매우 드물다. 그러나 2 , 어느 정도의 hypo-착 색 발생할 수 있습니다 및 SB 유도 아마 콜 로이드 흉터의 역사를 가진 사람들에 피해 야 한다.

기술 한계는 낮은 총 셀 수율 및 장기 저장을 위한 따라서 제한 된 옵션을 포함합니다. 백혈구 수율, 임상 TST 응답, 물집 크기, 및 적혈구 오염 간의 관계 되었습니다 철저 하 게2,10설명 되어. BCG 회수 실험에서 여기에 제시 된 (그림 1), 각 물집에서 평균 총 수익률 50000, Sbc는15공부 혼자 하는 경우에 특히 이러한 세포를 사용 하 여 소규모 실험 설정을 암시 했다. 그러나, SB 샘플에서 특정 T 세포 인구 대부분 초과 두 상대 및 절대 셀 카운트에서 PBMC 샘플에서 무엇을 발견 합니다. 그림 2에 표시 하는 예제에서 트리플-긍정적인 PPD 전용 T-셀 100000 SB 세포의 샘플 수는 숫자에서 1 x 106 PBMCs 같은 기증자 (데이터 표시 되지 않음)에서 보다 큰 x 2 이상 했다. TST 반응은 시각적으로 채 점 하는 것은 M. 결핵 메모리 평가 대 한 가장 일반적인 임상 방법입니다. 메모의 기본 적응 면역 반응 임상 피부 반응2,21로 동시에 피크 하지 않습니다. 모든 BCG-예방 접종을 하지 또는 Mtb-노출된 개인 강한 TST 반응 및 분류, 그리고 응답자, TST 비-연구 인구에 기존 mycobacterial sensitization에서 샘플의 처리에 대 한 전략을 개발할 것입니다 이 메서드를 사용 하 여 리콜 재판을 시작 하기 전에 고려 될 필요가 있다. 또한, SB 샘플링 및 시각적 득점, 이론적인 편견 감소 피부 반응 때문에 글로벌 개인에 대 한 가능성 또는 본, 예를 들어, 특정 연령 그룹2, HIV 감염에 면역 장애 피부 관련 13,,1820. 또한, 반복 테스트와 TST 반응의 면역 증폭 잘 알려진20,22입니다. 그러나, TSTs는 반복된10SB 셀 고기 오히려 지속적인 유지 됩니다. 이 관찰 세포 면역 반응의 경도 연구에서 SB 회수의 역할을 지원합니다.

T-셀 immunologists, SB 회 항 원 특정 셀의 높은 분수의 수확 할 수 있습니다. 그러나, PPD 증 착에서 샘플링 SB의 타이밍은 세포 구성과 cytokine microenvironment 시간이 지남에 변경 중요 합니다. 이 프로토콜에서 물집 있었다 유도 7 일 후 도전과 고립 된 세포 주로 CD4 + 이펙터 메모리 T-세포 IFN-γ, TNF-α와 일리노이-2의 공동 식 셀의 높은 분수를 포함 하 여. 이 관측은 T-세포 활성화, 확산, 그리고 차별화 준비 하는 PPD 피부2,,1521에서 발생 하는 방법을 설명 하는 이전 연구에 맞춰. PPD 응 개인 운동 SB 연구 제안 초기 피부 반응입니다. 그러나, 이미 일 내에 첫 번째 PPD 도전 다음, 응답 CD4 + T 세포 (둘 다 중앙 메모리와 이펙터 메모리 고기 설명 되었습니다)에 의해 지배 되 고, 3 일 후, 응답의 높은 분수에 의해 지배 된다 PPD 관련 cytokine 생산 하는 CD4 + T 세포2,,810,,1521. 이 적응형 cytokine 응답 2 주2,,810,23이상 감지 남아 있습니다. 7 일 게시물 TST 메모리 CD4 + T 세포2를 생산 하는 사이토카인의 컬렉션에 대 한 가장 최적의 시간 지점에 것 처럼 보인다. 그러나, 다른 시간 점 물론, 항 원 및 관심의 응답에 따라 관련성이 있을 수 있습니다. 노트, 한 연구에 적합 한 PPD 반응 5 일 포스트 TST10에 이미 프로-염증 성 cytokine 분 비 감소와 조금 일찍 절정에 보고 되었습니다.

SB 액체 프로 염증 성 cytokines과 피부 microenvironment15,24의 대표자를 표시 하는 다른 단백질의 높은 수준을 포함 합니다. 활동 연구는 TNF-α와 IFN-γ 레벨 SB 유체 피크에 일리노이-2 레벨 피크 동안 3 일 후 7 일2,10, 후 아마 반영 하는 적응형 응답의 지배력이 나중 단계에서 나타났습니다. 때문에 SB 세포 활성화 vivo에서, 그들은 높은 자발적인 cytokine 방출으로 restimulation (그림 34)에 따라 특정 릴리스에 대 한 잠재력을 전시.

이 보고서는 CD4 + T 세포 면역에 주력합니다. 그림 2에서 설명 된, 격리 된 T-세포의 대부분은 실제로 CD4 +, 동안 있었다 거의 아무 CD8 + T-세포는 흡입에 물집이 액체. 이 낮은 비율 및 CD8 + T 세포 CD4 + T 세포2,8,,1023에 비해 열 등 한 철새 용량 보고 다른 SB PPD 리콜 연구 라인. CD8 + 기여의 더 특성 더 좋을 것 이다; 그러나,이이 보고서의 범위를 벗어납니다.

T-세포는 Mtb;의 면역 제어에 대 한 필수적인 것으로 간주 그러나, 그것은 혈액25,26에서 적합 한 면역 반응에 반영 하는 보호의 믿을 수 있는 상관을 식별 하기 위해 어렵게 되었습니다. 이 바리 케이트로 현재 크고 매우 비용이 많이 드는 효능 실험27대안이 새로운 결핵 백신의 개발을 심각 하 게 방해. 결핵 백신 개발자는 백신 immunogenicity 혈액28,29에 백신 관련 T 세포 인구에 있는 작은, 일시적인 변화를 평가 하 여 결정 합니다. 그러나, 그것은 의심 항 원 특정 T-세포는 혈액에 순환의 작은 분수 관련 인지 (, 감염 및 T-세포-풍부한 microenvironment 제어의 대표 사이트로 마이그레이션 가능 Mtb) 27 , 30 , 31 .

이전 연구와 여기에 소개 하는 데이터를 바탕으로, SB 피부 리콜 모델 백신 관련 T-세포의 연구에 대 한 미 개발된 잠재력을 나타냅니다. 뿐만 아니라 않는 모델 사용 전 백신 생성 된 응답 수십 회, 그것은 또한 조직 관련 컨텍스트15,18,,1921에 잠재적인 실제 메모리의 평가 있습니다. 소설, 특정 피부 테스트 후보 소 단위 결핵 백신의 구성 또한 항을 포함 하는이 모델28,32를 사용 하 여 백신 평가 위한 새로운 기회를 제안 합니다. 또한, transcriptomic 분석 PPD 도전 피부에 생성 된 셀-중재 면역 응답은 유사 Mtb에 응답 제안-폐18감염.

피부 펀치 생체 검사는 피부에서 세포 수확에 대 한 허용 하 고 SB 샘플링에 비해 공간 정보를 제공 하는 동안 메서드를 사용 하면 더 많은 침략 및 효소 또는 기계 처리 단일 셀 정지33준비 필요. Cytokines 및 셀 마커의 측정 두 가지 방법2,10사이 비교할 수 있습니다.

흡입 물집 방법 단독으로 또는 함께 조직 또는 지역 피부 도전 외에 피부과, 의료 연구의 많은 분야에서 적용 된 이미. 예로 패 혈 증, 엡 스타인-바 바이러스 관련 lymphoproliferative 질병, 당뇨병 신경 병, glucocorticoid 섭취 효과 및 치료 항 체 또는 T-세포 타겟 요법10 모델을 테스트 하는 인체 실험의 연구 ,3435,36,,3738.

치료 관점에서 SB 피부 리콜 방법 이점이 독특한 잠재적인 중앙 T-셀 메모리를 공부 하 고-의 관점-스킨 제공 관련 샘플링 구획2, 것 두 생물에서 및 기술 15,18,,1921. 특히, PBMCs 순환의 전통, 수동 샘플링에 비해, SB 피부 리콜 메서드를 수 있습니다 로컬을 완료 하 고 그들의 관련 항 원에 대 한 응답에서 림프절에서 마이그레이션할 능력 입증 된 T-세포의 연구에 대 한 확장 그리고 vivo에서 조직 관련 컨텍스트15,18,,1921에서 차별화.

결론적으로, 모델 여기 분야 내에서의 인간의 적응 면역과 T-셀 대상 에이전트 (, 전염병 백신 또는 암 연구에서) 연구자에 대 한 관련 될 수 있는 시연. TST 모델이이 프로토콜에 적용 되는, 물론, 결핵 백신 분야에 특별 한 관련성 의입니다. 그러나,이 모델의 기본적인 개념 연구의 다른 분야에도 적용 됩니다.

Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgements

우리는 그의 실용적이 고 학문적 인 조언을; Mads Radmer 젠 슨을 감사 하 고 싶습니다. 라우 Lindqvist 및 Kaare Svejstrup 제공 전문 기술; 헬렌 Bæk Juel, 조나단 Filskov, 로그인 토니 슈미트, Solveig W. Harpøth 그들의 기술 지원; PPD 관리;에서 그들의 훈련에 대 한 젠 토 프 트 TB 외래 환자 진료소에서 직원 그리고 연구에 참여에 대 한 모든 자원 봉사자. 이 프로젝트는 유럽 위원회 H2020 프로그램 [보조금 번호 TBVAC2020 643381]와 우리 컨소시엄 파트너 유익한 토론에 대 한 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gloves for laboratory use Imtex, Denmark 1013
Desinfection spray  Apotek, Denmark 82% alcohol, with glycerin, for human skin 
Alcohol swaps Mediq, Denmark 1131892
PPD RT 23 "SSI" (2 T.U./0.1ml) AJ Vaccines
 Myjector syringe with fixed needle  Terumo A236 1 ml/29G/12mm
Ruler  not relevant  for skin reaction evaluation
Ballpoint pen not relevant  for skin reaction evaluation
Portable Lung Suction Unit Laerdal Medical, Denmark 78000011 NOTE.  Modified for ranges below -40kPa and supplied with pressure gauge  (ref. 1031107) by the Technical Dept. , Hvidovre Hospital
Negative Pressure Chamber Assembly, unheated with connecting tubing Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Orifice Plate, 47mm, 10mm Hole Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative Pressure Instrument Seal Kit Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA
Negative pressure Chamber Strap  Electronic Diversities, Finksburg, MD, USA 12 inches
Micropore Surgical tape  3M 1533-1 2.5cm x 9.1m
Cap from 15ml plastic tube Sarstedt, Germany 62,547,254
Tubigrip bandage Mölnlycke Health Care, Sweden 1443
Cosmopor steril adhesive dressing Hartmann 9008337 7.2 x 5 cm
2ml Syringe Concentric Luer Slip  Becton Dickinson  300185
Microlance 23G/30mm needle Becton Dickinson 300700
Safe-Lock microcentrifuge tubes (autoclaved) Eppendorf  0030120086 Autoclaved
Minispin plus centrifuge Eppendorf 5453000011
Gibco AIM V Medium Life Technologies 12055-091

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