Name: Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: Leer uitsteekselkrachten kwantificeren met atoomkrachtmicroscopie bij macrofagen. Deze methode meet podosoom-vervorming op compliant films en zet deze om in krachtwaarden voor celbiologisch onderzoek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

De auteurs zijn Anna Labernadie, Guillaume Charrière en Patrick Delobelle dankbaar voor hun eerste bijdrage aan dit werk en Matthieu Sanchez en Françoise Viala voor hun hulp bij de video filmen en bewerken. Dit werk werd ondersteund door l'Agence Nationale de la Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM Plan kanker, Fondation Toulouse kanker en Human Frontier Science Program (RGP0035/2016).

1. bereiding van Formvar beklede rasters
<ol><li>Elektronenmicroscopie rasters met pure aceton schoon en droog ze op filterpapier. Vervolgens schoon een microscoopglaasje met pure ethanol, veeg met een lens papier en verwijder stof met een blower.</li>
	<li>Plaats een glasplaatje met ethanol-schoongemaakt, verticaal in de trechter van een film gieten apparaat met een oplossing van Formvar in het onderste deel. Betrekking hebben op de top van de trechter.</li>
	<li>Pomp 100 mL oplossing van Formvar (0,5% in ethyleendichloride) met de verstuiver lamp, totdat het niveau tweederde van de dia bereikt.</li>
	<li>Houd de dia in de oplossing voor 1 min.</li>
	<li>Open de klep van het apparaat voor de afvoer van de Formvar-oplossing in een gestage stroom. Een debiet van 10 tot 15 mL/s levert een film van de Formvar van 30-80 nm. De dikte van de film wordt bepaald door de concentratie van de oplossing van de Formvar en het tarief van de riolering. Opmerking: Het tarief van de drainage kan worden gecontroleerd door de ontluchting de druk via het ventiel lucht-out door het ventiel langzaam te openen. Hoe sneller de drainage, hoe dikker de film. In de praktijk, want het is moeilijk te voorspellen de laagdikte van het debiet van de Formvar, wij bereiden meerdere batches van Formvar films en controle van hun dikte door de AFM (zie stap 2).</li>
	<li>Verwijderen van de dia uit de zaal en droog het fijn op filterpapier te verwijderen van een vloeibare Formvar.</li>
	<li>Knip een rechthoek 20 x 50 mm uit de Formvar film met een scheermesje.</li>
	<li>Vul een bekerglas met zuiver gedestilleerd water en langzaam duik de dia verticaal in het water te zweven uit de film: de film moet drijven op het wateroppervlak.</li>
	<li>Plaats droge aceton gereinigd rasters op de film, glanzende onder ogen zien.</li>
	<li>Plaats een ronde glazen dekglaasje aan (Ø 12 mm) op een paar van de rasters. Deze dekglaasje aan zal dienen om de laagdikte te meten (zie stap 2).</li>
	<li>Bedek een microscoopglaasje met een witte sticker aangepast zodat het past. Dompel de dia verticaal aan de grens van de zwevende Formvar film totdat de hele film houdt zich aan de dia. Verwijderen van overtollig water uit de dia met filtreerpapier en laten drogen bij kamertemperatuur 's nachts.</li>
</ol>2. meting van de laagdikte
<ol><li>Snijd de Formvar rond het dekglaasje aan met een pincet om het loskoppelen van de dia.</li>
	<li>De locatie van het raster onder het dekglaasje aan Markeer met een pen.</li>
	<li>Snijd de Formvar rond de gemarkeerde raster om het loskoppelen van het dekglaasje aan. Er zal dus een gat in de resterende Formvar blad, dat toelaten zal om de laagdikte te meten. Bedek het dekglaasje aan met PBS en plaats het op een glasplaatje op de Microscoop.</li>
	<li>Monteer een siliciumnitride cantilever op het AFM glazen blok, ervoor te zorgen dat de gouden streep wordt niet gedekt door het uiteinde van de veer. Opmerking: De gevoeligheid en de lente-constante van de uitkraging moeten hebben eerder gekalibreerd in PBS.</li>
	<li>Monteren van het blok glas op de AFM-module en plaats vervolgens de module naar de Microscoop.</li>
	<li>Plaats de Formvar beklede dekglaasje aan op de kamer observatie en bedek het met 500 µL van PBS.</li>
	<li>Scannen van de rand van het gat in het blad van de Formvar met behulp van AFM in contact modus en een 0.5 nN kracht instelpunt.</li>
	<li>Gebruik het glasoppervlak dekglaasje aan als de referentie voor hoogte metingen, en evalueren van de dikte van de Formvar als de hoogte van de dwarsdoorsnede (uitvoeren ten minste 10 metingen per Formvar partij).</li>
</ol>3. enten van cellen op rasters
<ol><li>Onder een steriele motorkap, zetten een strook (12 mm x 3 mm) van dubbelzijdige plakband een dekglaasje aan.</li>
	<li>Knip uit een raster van Formvar-coating met een pincet en leg het ondersteboven op de zelfklevende strip (alleen de rand van het raster moet worden aangesloten op de tape). De film van de Formvar moet onder ogen zien het dekglaasje aan.</li>
	<li>Dit apparaat op een cultuur goed zetten.</li>
	<li>Plaats een droplet 10 µL van RPMI zonder FCS met 104 macrofagen onderscheiden van menselijke monocyten16. Opmerking: Zorg ervoor dat niet aan te raken van het raster met de pipet tip Voorkom beschadiging van de Formvar-coating.</li>
	<li>Incubeer gedurende 30 min (37 ° C, 5% CO2) om te laten cellen houden.</li>
	<li>Vul de put met 2 mL RPMI met 10% FCS.</li>
	<li>Laat het apparaat gedurende 2 uur bij 37 ° C en 5% CO2 cellen houden voordat AFM observatie laten inwerken.</li>
</ol>4. topografie metingen van Podosome-geïnduceerde vervormingen
<ol><li>Plak twee stroken plakband verdubbeld-zijdige op een glazen bodem petrischaal. Opmerking: De afstand tussen de twee stroken moet kleiner zijn dan de diameter van het raster.</li>
	<li>Zorgvuldig het loskoppelen van de grid verguld met macrofagen van het plakband.</li>
	<li>Schakel het raster ondersteboven om de cellen tegenover het glas en plak het net tussen de twee zelfklevende strips.</li>
	<li>Fix het raster met twee nieuwe strips van een double-sided lijm: de grid zal dus worden ingeklemd tussen twee zelfklevende strips, toegankelijk naar de AFM tip verlaten van het centrale gedeelte van het raster. Opmerking: Zorg ervoor dat het raster is goed vast en niet verdraaid; anders misschien de AFM uitkraging niet zitten kundig voor aanpak van het Formvar oppervlak.</li>
	<li>Vul de petrischaal met 2 mL van het kweekmedium voorverwarmde 37 ° C (RPMI met 10% FCS) aangevuld met 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	<li>Zet de schotel van cultuur op een 37 ° C schotel verwarmingssysteem.</li>
	<li>Installeer de schotel kachel in het werkgebied van de AFM.</li>
	<li>Laat het systeem stabiliseren bij 37 ° C.</li>
	<li>Breng een eerste globale beeld te vinden podosomes in contact modus met een 0.5 nN kracht, en vervolgens scannen de topografie van de Formvar bij 3 Hz met een ongeveer 20 nm-grote pixel. Opmerking: Vermijd scannen in de buurt van de randen van het raster.</li>
</ol>

<ol><li>Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Cells+Feel+and+Respond+to+the+Stiffness+of+Their+Substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate.</a> Science. 310, 1139-1143 (2005).</li>
<li>Paszek, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensional+Homeostasis+and+the+Malignant+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tensional Homeostasis and the Malignant Phenotype.</a> Cancer Cell. 8, 241-254 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Elasticity+Directs+Stem+Cell+Lineage+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Gilbert, P. M., Weaver, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Adaptation+to+Biomechanical+Stress+across+Length+Scales+in+Tissue+Homeostasis+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+%26+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Adaptation to Biomechanical Stress across Length Scales in Tissue Homeostasis and Disease.</a> Seminars in Cell & Developmental Biology. 67, 141-152 (2017).</li>
<li>Vining, K. H., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+Direct+Stem+Cell+Behaviour+in+Development+and+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces Direct Stem Cell Behaviour in Development and Regeneration.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. , (2017).</li>
<li>Roca-Cusachs, P., Conte, V., Trepat, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Forces+in+Cell+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantifying Forces in Cell Biology.</a> Nature Cell Biology. 19, 742-751 (2017).</li>
<li>Labernadie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protrusion+Force+Microscopy+Reveals+Oscillatory+Force+Generation+and+Mechanosensing+Activity+of+Human+Macrophage+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Protrusion Force Microscopy Reveals Oscillatory Force Generation and Mechanosensing Activity of Human Macrophage Podosomes.</a> Nature Communications. 5, 5343(2014).</li>
<li>Proag, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+Together%3A+Spatial+Synchrony+in+the+Force+and+Actin+Dynamics+of+Podosome+First+Neighbors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Working Together: Spatial Synchrony in the Force and Actin Dynamics of Podosome First Neighbors.</a> ACS Nano. 9, 3800-3813 (2015).</li>
<li>Proag, A., Bouissou, A., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Force+and+Spatial+Dynamics+of+Macrophage+Podosomes+by+Multi-Particle+Tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Force and Spatial Dynamics of Macrophage Podosomes by Multi-Particle Tracking.</a> Methods. 94, 75-84 (2016).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Migration+of+Macrophages+Requires+Hck+for+Podosome+Organization+and+Extracellular+Matrix+Proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Migration of Macrophages Requires Hck for Podosome Organization and Extracellular Matrix Proteolysis.</a> Blood. 115, 1444-1452 (2010).</li>
<li>Cougoule, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+Leukocytes+and+Macrophages+of+Various+Phenotypes+Have+Distinct+Abilities+to+Form+Podosomes+and+to+Migrate+in+3d+Environments%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blood Leukocytes and Macrophages of Various Phenotypes Have Distinct Abilities to Form Podosomes and to Migrate in 3d Environments.</a> European Journal of Cell Biology. 91, 938-949 (2012).</li>
<li>Guiet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Mesenchymal+Migration+Requires+Podosome+Stabilization+by+Filamin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Macrophage Mesenchymal Migration Requires Podosome Stabilization by Filamin A.</a> Journal of Biological Chemistry. 287, 13051-13062 (2012).</li>
<li>Maridonneau-Parini, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Macrophage+3d+Migration%3A+A+Therapeutic+Challenge+to+Limit+Tissue+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Review%22%5BJournal%5D)">Control of Macrophage 3d Migration: A Therapeutic Challenge to Limit Tissue Infiltration.</a> Immunology Review. 262, 216-231 (2014).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+Phosphorylation+of+Wiskott-Aldrich+Syndrome+Protein+%28Wasp%29+by+Hck+Regulates+Macrophage+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tyrosine Phosphorylation of Wiskott-Aldrich Syndrome Protein (Wasp) by Hck Regulates Macrophage Function.</a> Journal of Biological Chemistry. 289, 7897-7906 (2014).</li>
<li>Van Goethem, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+Podosomes+Go+3d%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Macrophage Podosomes Go 3d.</a> European Journal of Cell Biology. 90, 224-236 (2011).</li>
<li>Van Goethem, E., Poincloux, R., Gauffre, F., Maridonneau-Parini, I., Le Cabec, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Architecture+Dictates+Three-Dimensional+Migration+Modes+of+Human+Macrophages%3A+Differential+Involvement+of+Proteases+and+Podosome-Like+Structures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Matrix Architecture Dictates Three-Dimensional Migration Modes of Human Macrophages: Differential Involvement of Proteases and Podosome-Like Structures.</a> Journal of Immunology. 184, 1049-1061 (2010).</li>
<li>Verollet, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hiv-1+Reprograms+the+Migration+of+Macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Hiv-1 Reprograms the Migration of Macrophages.</a> Blood. 125, 1611-1622 (2015).</li>
<li>Bouissou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podosome+Force+Generation+Machinery%3A+A+Local+Balance+between+Protrusion+at+the+Core+and+Traction+at+the+Ring%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Podosome Force Generation Machinery: A Local Balance between Protrusion at the Core and Traction at the Ring.</a> ACS Nano. 11, 4028-4040 (2017).</li>
<li>Lizarraga, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diaphanous-Related+Formins+Are+Required+for+Invadopodia+Formation+and+Invasion+of+Breast+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Diaphanous-Related Formins Are Required for Invadopodia Formation and Invasion of Breast Tumor Cells.</a> Cancer Research. 69, 2792-2800 (2009).</li>
<li>Carman, C. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcellular+Diapedesis+Is+Initiated+by+Invasive+Podosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Transcellular Diapedesis Is Initiated by Invasive Podosomes.</a> Immunity. 26, 784-797 (2007).</li>
<li>Sage, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+Recognition+Is+Facilitated+by+Invadosome-Like+Protrusions+Formed+by+Memory%2FEffector+T+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Antigen Recognition Is Facilitated by Invadosome-Like Protrusions Formed by Memory/Effector T Cells.</a> Journal of Immunology. 188, 3686-3699 (2012).</li>
<li>Sens, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Invasive+Podosome-Like+Structure+Promotes+Fusion+Pore+Formation+During+Myoblast+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">An Invasive Podosome-Like Structure Promotes Fusion Pore Formation During Myoblast Fusion.</a> Journal of Cell Biology. 191, 1013-1027 (2010).</li>
<li>Takito, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transient+Appearance+of+Zipper-Like+Actin+Superstructures+During+the+Fusion+of+Osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The Transient Appearance of Zipper-Like Actin Superstructures During the Fusion of Osteoclasts.</a> Journal of Cell Science. 125, 662-672 (2012).</li>
<li>Shilagardi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-Propelled+Invasive+Membrane+Protrusions+Promote+Fusogenic+Protein+Engagement+During+Cell-Cell+Fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin-Propelled Invasive Membrane Protrusions Promote Fusogenic Protein Engagement During Cell-Cell Fusion.</a> Science. 340, 359-363 (2013).</li>
<li>Freeman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrins+Form+an+Expanding+Diffusional+Barrier+That+Coordinates+Phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrins Form an Expanding Diffusional Barrier That Coordinates Phagocytosis.</a> Cell. 164, 128-140 (2016).</li>
</ol>

Geen belangenconflicten verklaard.

Materiaaleigenschappen
De keuze van het materiaal voor het vervormbare membraan, in ons geval Formvar, moet aan een aantal voorwaarden voldoen. Het materiaal moet worden transparant voor zichtbaar licht en fluorescentie vertonen beperkte auto zodat opmerkingen in helder veld en fluorescentie microscopie. De ruwheid van de dunne film moet goed minder dan 10 nm te vermijden topografische effect op cel adhesie en duidelijke observatie van de cel-geïnduceerde uitsteeksels door AFM...

Dierlijke cellen interactie fysiek met de matrix en de andere cellen die hun omgeving1vormen. Dit is vereist voor hen om te migreren, internaliseren van organen, externe informatie verwerven of differentiëren. In dergelijke processen, de cel mechanische krachten moet genereren en, zoals tal van studies hebben getoond in de afgelopen jaren, de mogelijkheid van een cel te genereren van krachten en sonde zijn omgeving beïnvloedt de biologische werking, leiding bijvoorbeeld proliferatie of differentiatie2,3. Op zijn beurt, is de meting van cellulaire krachten een grote steun te bestuderen van de regulering van de strijdkrachtgeneratie en begrijpen de implicatie in cel gedrag en weefsel lot4,5.
De afgelopen jaren getuige geweest van de ontwikkeling van talrijke technieken voor het meten van de krachten die een cel op de omgeving-6 uitoefenen kan. De meerderheid van deze geweest instrumenteel in het openbaren van dat de tractie dwingt dat cellen uitoefenen als zij trek op mobiele sondes of een vervormbare substraat. Echter de mechanische krachten die betrokken zijn in uitsteeksel in de extracellulaire omgeving lijden onder een gebrek aan meettechnieken en zijn tot nu toe niet goed gekenmerkt.
Om deze beperking ondervangen, presenteren we een methode voor het meten van krachten uitgeoefend orthogonaal op de ondergrond. Het bestaat uit het plating levende cellen op een dunne elastische blad dat in de orthogonale richting vervormen kan, waardoor het mogelijk is om te meten van substraat vervorming door de cellen en het afleiden van de krachten die betrokken zijn. Topografie van het substraat wordt gemeten met de nanoschaal resolutie met behulp van atomaire kracht microscopie en de evaluatie van de troepen uit vervorming is gebaseerd op de kennis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren7,-8, 9.
Hier beschrijven we de opstelling en de toepassing ervan voor het meten van de krachten die worden gegenereerd door podosomes, protrusive hechting structuren gevormd door macrofagen voor hun mesenchymale migratie in driedimensionale omgevingen10,11, 12,13,14,15,16,17. Wij zijn van mening dat deze techniek het begrip van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel zal vooraf.

<table><tbody><tr><td>200 mesh nikkel roosters</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>G200-Ni</td><td></td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Microscoopglaasjes</td><td>Fisher Scientific</td><td>10235612</td><td></td></tr><tr><td>Witte stickers 26 x 70 mm</td><td>Avery</td><td>DP033-100</td><td></td></tr><tr><td>Filmgietapparatuur met klep in de uitlaat</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71305-01</td><td></td></tr><tr><td>Vleesmessen</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72000</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>1.08543.0250</td><td></td></tr><tr><td>Aceton</td><td>VWR</td><td>20066.321</td><td></td></tr><tr><td>Formvar 0,5% oplossing in ethyleendichloride</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15820</td><td></td></tr><tr><td>12 mm dekglasjes</td><td>VWR</td><td>631-0666</td><td></td></tr><tr><td>Omgekeerd microscoop</td><td>Carl Zeiss</td><td>Axiovert 200</td><td></td></tr><tr><td>Atomaire krachtmicroscoop</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoWizard III</td><td></td></tr><tr><td>Temperatuurgestuurde monsterhouder&nbsp;</td><td>JPK Instruments</td><td>BioCell</td><td></td></tr><tr><td>Siliciumnitride cantilever met een nominale veerconstante van 0,01 N/m</td><td>Veeco Instruments</td><td>MLCT-AUHW</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Dubbelzijdig plakband</td><td>APLI AGIPA</td><td>118100</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>31870-025</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>35 mm glazen bodem Petri-schaaltjes</td><td>WPI</td><td>FD35-100</td><td></td></tr></tbody></table>

uitsteeksel force microscopie: een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions

In talrijke biologische contexten moeten dierlijke cellen fysiek interageren met hun omgeving door de ontwikkeling van mechanische krachten. Onder deze, tractie krachten goed gekarakteriseerd zijn geweest, maar er is een gebrek aan technieken waardoor de meting van uitsteeksel krachten uitgeoefend door cellen orthogonaal op hun ondergrond. We ontwierpen een experimentele opstelling het uitsteeksel krachten uitgeoefend door Adherente cellen aan hun substraat te meten. Cellen verguld op een compatibele Formvar vel vervormen dit substraat en de resulterende topografie wordt toegewezen door atomaire kracht microscopie (AFM) op de nanometerschaal. Geldende waarden worden vervolgens geëxtraheerd uit een analyse van het profiel van de vervorming op basis van de geometrie van de protrusive cellulaire structuren. Vandaar, de door de individuele vooruitstekende eenheden van een levende cel uitgeoefende krachten kunnen worden gemeten na verloop van tijd. Deze techniek kan de studie van strijdkrachtgeneratie en de verordening in de vele cellulaire processen waarbij uitsteeksel. Hier beschrijven we de toepassing de protrusive krachten gegenereerd door podosomes gevormd door menselijke macrofagen te meten.

Het bovenstaande protocol beschrijft hoe voor te bereiden van de experimentele opstelling te kwantificeren uitsteeksel krachten door macrofaag podosomes op een substraat Formvar toegepast. Dit wordt bereikt met behulp van AFM en wordt geïllustreerd in Figuur 1.
Bij het analyseren van een topografische beeld van uitstulpingen onder podosomes de JPK gegevensverwerking softwarematig, moet een derdegraa...

Hier, detail we de experimentele technieken gebruikt om te evalueren van de uitsteeksel krachten die podosomes van toepassing op een compatibele film, vanaf de voorbereiding van de film naar de geautomatiseerde analyse van topografische beelden.

Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

In numerous biological contexts, animal cells need to interact physically with their environment by developing mechanical forces. Among these, traction ...

Het algemene doel van deze procedure is om uitsteekselkrachten te kwantificeren met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Dit wordt bereikt door eerst de met formvar beklede rasters voor te bereiden en de dikte van deze film te meten. De derde stap van dit proces bestaat uit het plaatsen van cellen op de rasters en ze laten hechten.De laatste stap van de procedure is om de forma-film onder de cellen te beeldvormen met behulp van atoomkrachtmicroscopie. Bij het hechten aan het substraat, vormen microfagocyt microscopische hechtingsstructuren, zogenaamde podosomen. Uiteindelijk zal de vervorming van de film door podosomen worden gekwantificeerd en omgezet in krachten met behulp van een zelfgemaakt mechanisch model.Plaats een met ethanol gereinigd glazen licht in het trechtervormige filmafgietapparaat en dek de bovenkant van de trechter af. Doe de fomvar-oplossing in de trechter tot het niveau twee derde van de dia bereikt. Laat het een minuut staan en laat vervolgens de fomvar-oplossing in een gelijkmatige stroom wegvloeien.Merk op dat de dikte van de film afhangt van zowel de stroomsnelheid als de concentratie van de fomvar-oplossing. Droog dit licht donker en snijd er rechthoeken uit

protrusion-force-microscopy-method-to-quantify-forces-developed-cell

Research

JoVE Journal

Biology

Biologie

Microscopische beeldvorming van levende endotheliale cellen die GFP-actine maakt karakterisering van dynamische veranderingen in het cytoskelet structuren. In tegenstelling tot technieken die vaste exemplaren te gebruiken, deze methode geeft een gedetailleerde evaluatie van de tijdelijke veranderingen in het actine cytoskelet in dezelfde cellen voor, tijdens en na de diverse fysieke, farmacologische of inflammatoire stimuli.

Studie van het actine cytoskelet in Live endotheliale cellen die GFP-actine

Deze paper toont een protocol om de mechanische eigenschappen van levende cellen te karakteriseren door middel van microindentation gebruik van een Atomic Force Microscope (AFM).

Het meten van de mechanische eigenschappen van levende cellen door gebruik Atomic Force Microscopy

In dit protocol beschrijven we een micropipet-methode om een gecontroleerde kracht direct toepassen in de kern in een levende cel. Deze bepaling laat ondervraging van nucleaire mechanische eigenschappen in de cel levend, aanhangend.

Een directe kracht sonde voor het meten van de mechanische integratie tussen de kern en het cytoskelet

Hier presenteren we een op mechanica gebaseerd protocol om de gap junction connexin 43 te verstoren en de daaropvolgende impact te meten die dit heeft op endotheliale biomechanica via observatie van tracties en intercellulaire spanningen.

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Dit protocol bevat instructies voor het implementeren van multiphoton-lithografie om driedimensionale arrays van fluorescerende fiducial markers te fabriceren die zijn ingebed in op poly (ethyleenglycol) gebaseerde hydrogels voor gebruik als referentie vrij, tractiekracht microscopie platforms. Door deze instructies te gebruiken, wordt het meten van de 3D-materiaal stam en de berekening van cellulaire tracties vereenvoudigd om de tractiekracht van hoge doorvoer te bevorderen.

Fabricage en implementatie van een referentie vrije aandrijfkracht microscopie platform

Hier presenteren we een protocol dat wordt gebruikt om tractiekracht microscopie experimenten uit te voeren op B-cellen. We beschrijven de voorbereiding van zachte polyacrylamide gels en hun functionalisering, evenals data-acquisitie aan de microscoop en een samenvatting van data-analyse.

Traction Force Microscopie naar Studie B Lymphocyte Activatie

Hier presenteren we een protocol om de intracellulaire mechanische eigenschappen van geïsoleerde embryonale zebraviscellen in driedimensionale opsluiting te onderzoeken met directe krachtmeting door een optische val.

Directe krachtmetingen van subcellulaire mechanica in opsluiting met behulp van optische pincetten

Het Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) platform automatiseert het proces van het gelijktijdig meten van een breed scala aan chemische en mechanische signalen in aanhangende cellen. iTACS is ontworpen om community-driven ontwikkeling te vergemakkelijken en onderzoekers in staat te stellen alle platformfuncties te gebruiken, ongeacht hun educatieve achtergrond.

Integratieve toolkit om cellulaire signalen te analyseren: krachten, beweging, morfologie en fluorescentie

Dit protocol heeft tot doel de dynamische parameters (uitsteeksels, retracties, ruches) van uitsteeksels aan de rand van zich verspreidende cellen te meten.

Cell-Edge uitsteekseldynamiek meten tijdens het verspreiden met behulp van Live-Cell Microscopie

Om vooruit te komen, moeten groeikegels tractiekrachten uitoefenen tegen de externe omgeving. Het genereren van trekkrachten is afhankelijk van actinedynamiek en koppeling. De huidige studie beschrijft methoden voor het analyseren van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekrachten voor groeikegelvoortgang.

Analyses van actinedynamica, koppelingskoppeling en tractiekracht voor groeiconusvooruitgang

We beschrijven verbeteringen aan een standaardmethode voor het meten van cellulaire tractiekrachten, gebaseerd op microcontactprinten met een enkele subtractieve patroonstap van puntarrays van extracellulaire matrixeiwitten op zachte hydrogels. Deze methode zorgt voor een eenvoudigere en consistentere fabricage van eilandpatronen, essentieel voor het regelen van de vorm van de celcluster.

Patroongeneratie voor micropatterntractiemicroscopie

Leer uitsteekselkrachten kwantificeren met atoomkrachtmicroscopie bij macrofagen. Deze methode meet podosoom-vervorming op compliant films en zet deze om in krachtwaarden voor celbiologisch onderzoek.

Uitsteeksel Force microscopie: Een methode om te kwantificeren krachten ontwikkeld door cel uitsteeksels

Meer video's verkennen