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Vorsprung-Kraft-Mikroskopie: Eine Methode, um Kräfte entwickelt von Zelle Vorsprünge zu quantifizieren

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Biology

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Summary

Hier zeigen wir die experimentellen Techniken verwendet, um den Vorsprung Kräfte auszuwerten, die Podosomes auf einem konformen Film, von der Vorbereitung des Films für die automatisierte Analyse von topographische Bilder gelten.

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Bouissou, A., Proag, A., Portes, M., Soldan, V., Balor, S., Thibault, C., Vieu, C., Maridonneau-Parini, I., Poincloux, R. Protrusion Force Microscopy: A Method to Quantify Forces Developed by Cell Protrusions. J. Vis. Exp. (136), e57636, doi:10.3791/57636 (2018).

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Abstract

In zahlreichen biologischen zusammenhängen müssen tierische Zellen physisch mit ihrer Umgebung interagieren durch mechanische Kräfte zu entwickeln. Unter diesen Zugkräfte gut charakterisierten gewesen, aber es fehlt an Techniken ermöglichen die Messung der Kräfte, Vorsprung durch Zellen orthogonal zu ihrem Substrat. Wir entwarfen eine Versuchsanordnung, die Kräfte, Vorsprung durch adhärente Zellen auf ihrem Substrat zu messen. Zellen, die auf einem kompatiblen Formvar Blatt vergoldet verformen dieses Substrat und die daraus resultierende Topographie wird durch Rasterkraftmikroskopie (AFM) auf der Nanometerskala zugeordnet. Kraftwerte werden dann von einer Analyse der Verformung Profil basierend auf der Geometrie der hervorstehende zellulären Strukturen extrahiert. Daher können die Kräfte, die von den einzelnen hervorstehenden Einheiten einer lebenden Zelle im Laufe der Zeit gemessen werden. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung. Hier beschreiben wir ihre Anwendung auf die hervorstehende Kräfte erzeugte Podosomes gebildet durch menschliche Makrophagen zu messen.

Introduction

Tierische Zellen interagieren körperlich mit der Matrix und den anderen Zellen, die ihre Umwelt1darstellen. Dies ist erforderlich für sie zu migrieren, Körper zu verinnerlichen, externe Informationen zu erwerben oder zu unterscheiden. In solchen Prozessen muss die Zelle mechanische Kräfte erzeugen, und wie in den letzten Jahren zahlreiche Studien gezeigt haben, beeinflusst die Fähigkeit einer Zelle zu erzeugen Kräfte und seiner Umgebung Sonde sein biologische Verhalten, Regie zum Beispiel Verbreitung oder Differenzierung-2,-3. Die Messung von zellulären Kräften ist wiederum eine große Hilfe für die Regulierung der Truppenaufstellung zu studieren und verstehen seine Auswirkung in Zelle Verhalten und Gewebe Schicksal4,5.

Den letzten Jahren erlebt haben die Entwicklung von zahlreichen Techniken, um die Kräfte zu messen, die eine Zelle auf seine Umwelt6ausüben kann. Die meisten davon haben maßgeblich bei der Enthüllung, dass die Traktion erzwingt, dass Zellen ausüben, wie sie auf mobile Sonden oder einem verformbaren Untergrund ziehen. Jedoch die mechanischen Kräfte beteiligt Vorwölbung in die extrazellulären Umwelt leiden unter einem Mangel an Messtechniken und sind bis heute nicht gut charakterisiert.

Um diese Einschränkung zu umgehen, stellen wir Ihnen eine Methode zur Messung der Kräfte, die orthogonal zum Substrat. Es besteht in der Beschichtung von lebenden Zellen auf eine dünne elastische Folie, die in Richtung orthogonal, die es ermöglichen, Substrat Verformung von Zellen zu messen und daraus die beteiligten Kräfte verformen kann. Substrat Topographie mit nanoskaligen Auflösung mit Rasterkraftmikroskopie gemessen und die Bewertung der Kräfte von Verformung stützt sich auf das Wissen um die Geometrie der hervorstehende Zellstrukturen7,8, 9.

Hier beschreiben wir die Einrichtung und ihre Anwendung auf die erzeugte Podosomes, hervorstehende Adhäsion Strukturen gebildet durch Makrophagen für ihre mesenchymalen Migration in dreidimensionalen Umgebungen10,11Kräfte zu messen, 12,13,14,15,16,17. Wir glauben, dass diese Technik die Krafterzeugung und deren Regulierung in viele zelluläre Prozesse, die mit Vorsprung verstehen wird.

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Protocol

1. Vorbereitung des Formvar-beschichtete Netze

  1. Reinigen Sie Raster-Elektronen-Mikroskopie mit Aceton und trocknen Sie sie auf Filterpapier. Reinigen Sie anschließend einen Objektträger mit reinem Ethanol, mit einem Objektiv-Papier wischen Sie ab und entfernen Sie den Staub mit einem Gebläse.
  2. Stellen Sie eine Folie mit Ethanol gereinigt Glas senkrecht in den Trichter eines Film-Casting-Gerätes mit einer Lösung von Formvar im unteren Teil. Decken Sie die Spitze des Trichters.
  3. Pumpen Sie Formvar Lösung (0,5 % Ethylen Paraquatdichlorid) 100 mL mit Zerstäuber Birne, bis die zwei Drittel der Folie erreicht.
  4. Halten Sie die Folie in die Lösung für 1 min.
  5. Öffnen Sie das Ventil des Geräts, um die Formvar-Lösung in einem stetigen Strom abtropfen lassen. Ein Volumenstrom von 10 bis 15 mL/s wird einen Formvar Film von 30-80 nm ergeben. Die Dicke der Folie richtet sich nach der Konzentration der Lösung Formvar und die Entwässerung.
    Hinweis: Die Entwässerung-Rate kann durch entlüften der Druck über das Ventil Luft-Out durch langsames Öffnen des Ventils gesteuert werden. Je schneller die Entwässerung, je dicker die Folie. In der Praxis weil es schwierig ist, vorherzusagen, die Schichtdicke von Formvar Strömungsgeschwindigkeit, wir bereiten mehrere Chargen Formvar Filme und steuern ihre Stärke von AFM (siehe Schritt2).
  6. Entfernen Sie die Folie aus der Kammer und trocknen Sie es vorsichtig auf Filterpapier, flüssigen Formvar zu entfernen.
  7. Schneiden Sie ein Rechteck 20 x 50 mm aus dem Formvar Film mit einer Rasierklinge.
  8. Ein Becherglas mit destilliertem Wasser füllen und langsam Tauchen die Folie senkrecht ins Wasser schweben aus dem Film: der Film sollte auf der Wasseroberfläche schweben.
  9. Ort trocken Aceton gereinigt Raster auf dem Film, glänzende stellen.
  10. Legen Sie eine Runde Glas-Deckglas (Ø 12 mm) auf ein paar der Netze. Das Deckglas wird dazu dienen, die Schichtdicke zu messen (siehe Schritt2).
  11. Decken Sie einen Objektträger mit einem weißen Aufkleber geändert, um es zu passen. Tauchen Sie die Folie vertikal an der Grenze des schwimmenden Formvar Films, bis der ganze Film auf die Folie haftet. Entfernen Sie überschüssiges Wasser aus der Folie mit Filterpapier und über Nacht bei Raumtemperatur trocknen lassen.

2. Messung der Schichtdicke

  1. Schneiden Sie Formvar um das Deckglas mit Pinzette, um es von der Folie lösen.
  2. Markieren Sie die Position des Rasters unter dem Deckglas mit einem Stift.
  3. Schneiden Sie die Formvar rund um den markierten Gitter um es von dem Deckglas zu lösen. Daher werden ein Loch in die verbleibenden Formvar Blatt, die es erlauben Ihnen, um die Schichtdicke zu messen. Decken Sie das Deckglas mit PBS zu und legen Sie es auf einen Glasobjektträger am Mikroskop.
  4. Montieren Sie ein Silizium-Nitrid-Freischwinger auf dem AFM Glasblock, sicherstellen, dass die goldenen Streifen, die Spitze der Feder nicht gedeckt ist.
    Hinweis: Die Empfindlichkeit und die Federkonstante des nadelträgers sollte vorher mit PBS-Puffer kalibriert haben.
  5. Montieren Sie den Glasblock auf das AFM-Modul, und platzieren Sie das Modul auf das Mikroskop.
  6. Die Beobachtung Kammer legen Sie Formvar beschichteten deckgläschen auf und bedecken Sie es mit 500 µL PBS.
  7. Scannen Sie die Grenze des Lochs in der Formvar Blatt mit AFM in Kontakt-Modus und einem 0,5 nN Kraft-Sollwert.
  8. Verwenden Sie die Glasoberfläche Deckglas als Referenz für Höhenmessungen und bewerten die Formvar Dicke wie die Höhe des Querschnitts (mindestens 10 Messungen pro Formvar Charge).

3. Aussaat Zellen auf Gittern

  1. Unter einer sterilen Haube legte einen Streifen (12 x 3 mm) doppelseitiges Klebeband auf einem deckgläschen.
  2. Schneiden Sie ein Raster Formvar beschichtet mit einer Pinzette und legte es kopfüber auf den Klebestreifen (nur der Rand des Rasters muss das Band befestigt werden). Der Formvar Film muss das Deckglas konfrontiert.
  3. Setzen Sie dieses Gerät in einer Kultur gut.
  4. Platzieren Sie ein 10 µL Tröpfchen von RPMI ohne FCS mit 104 Makrophagen differenziert aus menschlichen Monozyten16.
    Hinweis: Stellen Sie sicher nicht, berühren Sie das Gitter mit der Pipettenspitze beschädigen die Formvar Beschichtung zu verhindern.
  5. Inkubieren Sie für 30 min (37 ° C, 5 % CO2) Zellen haften zu lassen.
  6. Füllen Sie den Brunnen mit 2 mL RPMI mit 10 % FCS.
  7. Inkubieren Sie das Gerät für 2 h bei 37 ° C und 5 % CO2 Zellen vor AFM Beobachtung halten zu lassen.

(4) Topographie Messungen der Podosome-induzierten Verformungen

  1. Ein Glasboden Petrischale zwei Streifen verdoppelt doppelseitigen Klebeband aufkleben.
    Hinweis: Der Abstand zwischen den beiden Streifen sollte kleiner als der Durchmesser des Rasters.
  2. Trennen Sie sorgfältig das Raster mit Makrophagen vom Klebeband überzogen.
  3. Umdrehen Sie die Gitter um die Zellen mit Blick auf das Glas und kleben Sie das Netz zwischen den zwei Klebestreifen.
  4. Fix das Raster mit zwei neu verdoppelt doppelseitigen Klebstoff Streifen: Raster wird somit zwischen zwei Klebestreifen, verlassen den zentralen Bereich des Rasters für die AFM-Spitze eingeklemmt werden.
    Hinweis: Stellen Sie sicher, dass die Gitter gut befestigt und nicht verdreht; ansonsten der AFM Cantilever nähern sich die Formvar Oberfläche möglicherweise nicht.
  5. Füllen Sie die Petrischale mit 2 mL Kulturmedium vorgewärmten 37 ° C (RPMI mit 10 % FCS) mit 10 mM HEPES (pH 7,4) ergänzt.
  6. Ort der Kulturschale auf 37 ° C Schale Heizung.
  7. Der Teller wärmer wird auf der AFM-Bühne.
  8. Lassen Sie das System stabilisieren bei 37 ° C.
  9. Im Kontakt-Modus mit einer 0,5 nN Kraft einen ersten globalen Bild, Podosomes zu finden, und dann Scannen Formvar Topographie bei 3 Hz mit einer ca. 20 nm große Pixel.
    Hinweis: Vermeiden Sie Scannen am Rand des Rasters.

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Representative Results

Das obige Protokoll beschreibt die Vorbereitung der Versuchsaufbau, Vorwölbung Krafteinwirkung durch Makrophagen Podosomes auf einem Formvar Substrat zu quantifizieren. Dies erfolgt über AFM und in Abbildung 1dargestellt ist.

Bei der Analyse der topographischen Bild Ausbuchtungen unter Podosomes mit JPK Datenverarbeitungs-Software sollte ein dritten Grades Polynom passen jede Scanzeile unabhängig voneinander abgezogen. Die maximale Höhe des Podosome-induzierten Unebenheiten kann durch Hinzufügen einer Z-Farbskala auf der Seite das Bild beurteilt werden. Nach im TIFF-Format exportiert werden, ist das topographische Bild weiter analysiert mit einem engagierten hausgemachte ImageJ Makro verfügbar online-8. Dieses Makro Ausbuchtungen auf das korrigierte Höhe Bild lokalisiert und ergibt eine Kraft Karte (Abbildung 2) nach den angegebenen Parametern: Formvar Film Dicke und Podosome Ring Radius. Das Makro liefert darüber hinaus auch eine Textdatei mit den Koordinaten, Höhe und berechnete Kraftwert für jeden erkannten Ausbuchtung auf der Formvar Oberfläche.

Dabei gilt auch im Falle von Time-Lapse übernahmen. Das Makro verfolgt jede Ausbuchtung aus der mittleren Zeitpunkt vorwärts und rückwärts, Benutzerüberprüfung anfordern, wenn irgendwelche Zweifel entsteht.

Figure 1
Abbildung 1 : Versuchsaufbau
Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus. Zellen sind in einem Elektronen-Mikroskopie-Raster beschichtet mit einem dünnen, konforme Formvar Film gesät und das Gitter befindet, Zellen nach unten in eine Petrischale. Wenn ein Substrat zu verbinden, bilden Makrophagen Submikron hochdynamische Adhäsion Strukturen, so genannte Podosomes. Die Topographie des Formvar Films unter den Zellen wird dann abgebildet mit AFM. Podosome wenden orthogonalen Kräfte auf das Substrat, die Ausbuchtungen an der Oberfläche führen.

Figure 2
Abbildung 2 : Substrat Verformung und Kräfte, die durch Podosomes
Topographie der Formvar Folie auf der Rückseite der Zellen zeigt Durchbiegung (links) und Höhe (Mitte, Farbcodes für Höhe). Die Ausbuchtungen auf dem Film beobachtet entsprechen die Verformung durch individuelle Podosomes. Die Kraft von jedem Podosome wird ausgewertet, indem das Modell (rechten Seite, jeder Punkt entspricht einem Podosome und Kraftwerte sind farblich markiert). Maßstab: 5 µm.

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Discussion

Materialeigenschaften

Die Wahl des Materials für die verformbare Membran, in unserem Fall Formvar, muss einige Voraussetzungen erfüllen. Das Material muss für sichtbares Licht transparent sein und weisen begrenzt Auto-Fluoreszenz um Beobachtungen im Hellfeld und Fluoreszenz-Mikroskopie erlauben. Die Rauheit des dünnen Films muss deutlich unter 10 nm eine topographische Beeinträchtigung Zelladhäsion zu vermeiden und klare Betrachtung der Zelle-induzierte Vorsprünge von AFM Bildgebung erlauben. Schließlich muss die Steifigkeit der Membran, die die Youngs Modulus und Dicke des Materials abhängig, die hoch genug induzieren die Bildung von Podosomes unter Beibehaltung einiger beobachtbaren Verformbarkeit für den typischen Belastungen an Podosome Standorten erzeugt werden Das sind rund 10-100 kPa. Formvar Material, vorbereitet in dünnen Schichten von 30-80 nm ist ein guter Kompromiss zwischen diesen Zwängen. Es lohnt sich zu bemerken, dass durch die Dicke der Membran Formvar-tuning, der Mechanosensing Eigenschaften von Podosomes7seine Steifigkeit eingestellt werden kann.

Reproduzierbarkeit und die Qualität der Formvar Vorbereitung

Einige Chargen von Formvar Falten in der Startaufstellung zu präsentieren und somit unbrauchbar sind: Dies kann im Voraus auf Hellfeld Bilder gesehen. In unserer Erfahrung, wir brauchen mehrere Netze für eine Bedingung denn manchmal die Befestigung des Gitters nicht perfekt ist und das Netz bewegt sich oder wird verdreht. Die Dicke des Films Formvar muss der erwartete Kraft angepasst werden. Je dicker die Folie, die steifere ist es, aber desto geringer die Verformungen werden, erschweren die Beobachtung. Umgekehrt, je dünner der Film, die empfindlicher ist und noch schwieriger zu bearbeiten, ohne zu zerreißen.

Einfluss der Kraft durch die Auskragung auf Topographie Messungen

Um eine Messung der Film Verformung zu erhalten ohne Auswirkungen auf die nanomechanische Aktivität der Podosome oder Verformung des Films mit der AFM-Sonde, ist es entscheidend, Kontrolle Kräfte während der AFM-Aufnahme. In der Tat kann die übermäßige Krafteinwirkung während der Bildgebung zu einer Überschätzung der Vorwölbung Höhe und damit der Vorsprung Kraft führen. Das heißt, gibt es eine Notwendigkeit, diese Kraft weit unter die Stall-Kraft der hervorstehenden Website zu begrenzen. Es wird empfohlen, die Krafteinwirkung während der Aufnahme um ein paar Hunderter Pico-Newton zu begrenzen.

Modell Protrusion Auswertung erzwingen

Um AFM topographische Messungen in Kraftwerte zu konvertieren, ist es notwendig, die Randbedingungen zu definieren und die räumliche Konfiguration der Kraftangriff kennen. Im Falle von Podosomes schlugen wir ein Modell basierend auf dem aktuellen Wissen der molekularen Organisation und festgestellt, dass dieses Modell Verformung Profile mit topographischen Beobachtungen8zur Verfügung gestellt. Genauer gesagt, modelliert wir dichten Kern dadurch vertikale actinfilamente umgeben von einem Ring der Adhäsion Proteine als ein zentrales Modul schieben das Substrat und einem peripheren Modul ziehen. Substrat Verformung durch diese beiden Module handeln wurde mit finite-Elemente-Simulationen, führt zu einer Kraft-Verformung Beziehung bestimmt. Dank dieser numerischen Ansatz gekennzeichnet wir den Einfluss der einzelnen geometrischen Parameter auf die Kraft-Verformung Beziehung zeigt, dass Durchmesser und Substrat Ringdicke präzise gemessen werden musste. Die Beziehung zwischen der Höhe h eine Beule in das Substrat und die Kraft F durch eine Podosome angewendet werden, als ausgedrückt kann F = C0 E / (1-υ2) e3/r2 h, wo E = 2.1 GPa ist der Elastizitätsmodul des Formvar und υ = 0,3 seine Poisson Verhältnis7C0 ist eine Konstante in Höhe von 2,7 und e und r bzw. Film Dicke und Podosome Radius8bezeichnen. Für jede Bedingung war der durchschnittliche Wert von r aus Fluoreszenzbilder der Podosomes erhalten.

Anwendungen der Protrusion Rasterkraftmikroskopie

Protrusion Rasterkraftmikroskopie war gewinnbringend in Makrophagen zu testen die Bedeutung spezifischer Proteine auf Podosome Krafterzeugung, zeigen die mechanische Rolle der Podosome Ring18 und räumlich-zeitliche Zusammenhänge von Gewalt zu offenbaren Generation zwischen engen Nachbarn innerhalb des Netzwerkes von Podosomes8.

Zellen wurden gefunden, um in ihrer Umgebung in mehreren biologischen Prozessen hineinragen. Invasiven Tumorzellen verwenden hervorstehende Strukturen, so genannte Invadopodia, die extrazelluläre Matrix Abbau19unerlässlich sind. Lymphozyten haben gezeigt, dass während ihrer transzelluläre Diapedese durch das Endothel-20in Endothelzellen ragen. Einige Fälle von Zell-Zell-Interaktion setzen auch auf zelluläre Strukturen hervorstehenden: Dies ist der Fall für Antigen-Anerkennung von T-Zellen auf Endothelzellen21und für die Einleitung der Zellfusion, die mehrkernigen Osteoklasten oder Myotubes führt 22 , 23 , 24. schließlich Internalisierung Prozesse wie z. B. Phagozytose Verwendung Mobilfunk Aktin-basierte Strukturen dieses Projekt rund um das Ziel Körper25. Studium der Kräfte durch überstehende Strukturen wird sicherlich dazu beitragen, Aufschluss über die Mechanismen spielen bei diesen Prozessen.

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Disclosures

Keine Interessenkonflikte erklärt.

Acknowledgements

Die Autoren sind dankbar, Anna Labernadie, Guillaume Charrière und Patrick Delobelle für ihren ersten Beitrag zu dieser Arbeit und Matthieu Sanchez und Françoise Viala für ihre Hilfe mit video Dreh und Schnitt. Diese Arbeit wurde von l ' Agence Nationale De La Recherche (ANR14-CE11-0020-02), la Fondation Pour la Recherche Médicale (FRM DEQ2016 0334894), INSERM planen Krebs, Fondation Toulouse Krebs und Human Frontier Science Program (RGP0035/2016) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
200 mesh nickel grids Electron Microscopy Sciences G200-Ni
Filter paper Sigma-Aldrich 1001-055
Microscope slides Fisher Scientific 10235612
White stickers 26 x 70 mm Avery DP033-100
Film casting device with valve in its outlet Electron Microscopy Sciences 71305-01
Razorblades Electron Microscopy Sciences 72000
Ethanol VWR 1.08543.0250
Acetone VWR 20066.321
Formvar 0.5% solution in ethylene dichloride Electron Microscopy Sciences 15820
12 mm coverslips VWR 631-0666
Inverted microscope Carl Zeiss Axiovert 200
Atomic Force Microscope JPK Instruments NanoWizard III
Temperature-controlled sample holder  JPK Instruments BioCell
Silicon nitride cantilever with a nominal spring constant of 0.01 N/m Veeco Instruments MLCT-AUHW
PBS Gibco 14190-094
Double-sided adhesive tape APLI AGIPA 118100
RPMI 1640 Gibco 31870-025
FCS Sigma-Aldrich F7524
HEPES  Sigma-Aldrich H0887
35 mm glass-bottom Petri dishes WPI FD35-100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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