마우스 피 질 세포 조직의 대형 3-차원 영상

Neuroscience

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Summary

여기 우리는 지우기, 형광 라벨, 조직과 마우스 뇌 조직, 종류는 피 질에서의 3 차원 조직의 시각화를 가능 하 게의 대규모 영상에 대 한 절차를 설명 합니다.

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Yoneda, T., Sakai, S., Maruoka, H., Hosoya, T. Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex. J. Vis. Exp. (139), e58027, doi:10.3791/58027 (2018).

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Abstract

포유류 피 질 흥분 성의 억제 신경, 각각 특정 electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 종류의 구성 그리고 vivo에서 기능, 하지만 그들의 기본 기능과 해 부 조직 세포에서 네트워크 규모를 제대로 이해 하 고 있습니다. 여기 우리는 대뇌 피 질의 세포 조직의 조사에 대 한 두뇌의 큰 영역에 걸쳐 붙일 표시 된 신경 세포의 3 차원 영상에 대 한 메서드를 설명합니다. 특정 유형의 신경 형광 퇴행 성 신경 추적기의 주입 또는 유전자 변형 쥐에 형광 단백질의 식에 의해 표시 됩니다. 블록 뇌 샘플, 예, 반구, 고정 후 준비, 청소 방법, 조직으로 투명 하 게 만들 있으며 형광 immunolabeling는 특정 종류의 세포를 받게. 큰 지역 대형 작업 거리 목표 및 자동화 한 단계 또는 두 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 검색 합니다. 이 메서드는 마우스 피 질에는 셀 형식 관련 microcolumn 기능 모듈의 주기적인 조직을 해결할 수 있습니다. 절차는 다른 복잡 한 조직과 다양 한 뇌 영역에 3 차원 세포 구조의 연구에 대 한 유용할 수 있습니다.

Introduction

포유류 피 질 세포 유형, 각각 특정 유전자 표현 패턴, electrophysiological 및 생 화 확 적인 속성, 시 냅 스 연결의 많은 수의 구성 및 기능을 vivo에서 1,2 3,,45,,67. 이러한 세포 유형 반복 구조로 구성 됩니다 여부 되었습니다 분명. 시각적인 방향 열과 somatosensory 배럴을 포함 하 여 대뇌 피 질의 열 구조, 반복 하지만 그들의 세포 조직 남아 불분명8,9. 이들은 특정 대뇌 피 질의 영역에 존재 하 고 뇌 전체 시스템을 않습니다.

Neocortical 계층 5, 뉴런의 대다수는 4 개의 주요 유형으로 분류 됩니다. 주요 유형의 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 흥분 성의 뉴런 프로젝트 폰, 척수, 및 우량한 colliculus 바꾸어 대상에 축 삭 그리고, 따라서,10주요 외피 출력 경로 나타냅니다. 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 흥분 성의 뉴런의 다른 주요 유형10피 질 자극. 금지 신경 또한 두 개의 주요 클래스를 포함: parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 세포11.

최근 분석 나타냅니다 4 셀 유형 반복된 구조12,,1314로 구성 됩니다. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런12,,1314 및 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14 직경 1-2 셀의 셀 타입 특정 microcolumns로 구성. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 정렬 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 microcolumns로 아니라 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런14microcolumns. Microcolumns 스스로 형태는 6 각형 격자 배열14 와 마우스 뇌12,14 와 언어 somatosensory, 시각과 모터 분야를 포함 한 여러 피 질 지역에 있는지를 주기적으로 정렬 인간의 뇌는13의 지역입니다. 개별 microcolumn에 신경 동기화 된 활동을 전시 하 고 비슷한 감각 반응이14. 이러한 관측 레이어 5 셀 유형 반복 기능 모듈의 첫 번째 알려진된 뇌 전체 조직을 나타내는 microcolumn 격자 구조로 구성 나타냅니다.

Microcolumns 약 10 µ m의 반지름을가지고 있고 약 40 µ m의 공간 주기. 또한, microcolumns의 방향을 피14에서 그들의 위치에 따라 그들의 변화와 꼭대기 dendrites 평행 하다. 따라서, microcolumn 시스템은 마이크로 미터의 몇 수만의 전형적인 두께가 기존의 대뇌 피 질의 조각을 사용 하 여 분석 하기가 어렵습니다. 또한, 주기 분석 3 차원 데이터는 다양 한 뇌 영역, 그리고, 그러므로, confocal 현미경 검사 법의 일반적인 이미징 영역에서에서 또는 vivo에서 2 광자 영상 너무 좁고입니다.

최근, 기술 두꺼운 조직15,16를 개발 되었습니다. 여기는 microcolumn 시스템을 구성 하는 주요 셀 형식 마우스 neocortical 레이어 5에서에서의 대규모, 3 차원 이미지를 얻기 위해 이러한 방법을 응용 프로그램에 설명 합니다. Subcerebral 프로젝션 뉴런 역행 표시 또는 Crym egfp 유전자 변형 쥐12, 그리고 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런에는 레이블로 역행에 향상 된 녹색 형광 단백질의 식으로 표시 됩니다. 라벨 또는 Tlx3-cre/Ai9 마우스17에 tdTomato 식으로. Parvalbumin 표현 및 somatostatin 표현 셀 immunohistochemistry에 의해 표시 됩니다. (깊은 뇌 참조) SeeDB 방법19 다른 실험 사용 된다 실험, 얼룩이 지는 항 체 (항 체 규모 S) AbScale 방법18 사용 됩니다. 이러한 방법은 기존의 이미징 방법의 위에서 언급 한 어려움을 극복 하 고 레이어 514의 정확한 세포 조직 공개.

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Protocol

모든 실험 절차 RIKEN와 코 동물 실험 위원회 RIKEN 유전자 재조합 실험 안전 위원회에 의해 승인 되었고 RIKEN 뇌 과학의 동물 시설 기관 지침에 따라 수행 연구소입니다.

1입니다. 이미징 챔버의 준비

  1. 영상 실19
    1. 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 다양 한 두께의 약 5 m m와 바닥 플레이트의 두께 챔버를 준비 합니다. 또한, 접시와 유리 하단 (그림 1A) 없이 준비 합니다.
  2. 스페이서를 슬라이스
    1. 스페이서 두께 0.5 m m (그림 1C)의 실리콘 고무 시트를 사용 하 여 샘플을 준비 합니다.

2. 추적 프로그램 삽입

참고: 폰 (2.1) 또는 우량한 colliculus (2.2)에 주사를 합니다. 우량한 colliculus에 주입 하는 동안 시각 및 모터 지역 등 다양 한 뇌 영역에 폰 레이블 하위 대뇌 프로젝션 뉴런에 주입 시각적 영역에 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 라벨. 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B. 대신 식 염 수 주입 제어 실험에 대 한 멸 균 상태 유지에 대 한 소독된 장비 및 에탄올으로 청소 플라스틱 장갑을 사용 합니다.

  1. 성인 쥐의 주사는 폰으로 확인 합니다.
    1. 붙일 레이블 콜레라 독 소 단위 B의 1 µ L를 그리기 (25 µ g / µ L PBS에) 26 G 해밀턴 주사기로.
    2. 주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.
    3. Stereotaxic 악기에 퓰 레이 터의 도구 홀더에 주사기와 펌프를 배치 합니다. 조작자 12 ° 수직 축에서 뒤로 기울입니다.
    4. Intraperitoneally 나트륨 pentobarbital을 주입 하 여 남성 또는 여성 성인 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9) anesthetize (60 밀리 그램/kg 체중) 또는 isoflurane (2-3%)을 투여 하 여. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.
    5. Stereotaxic 악기에 마우스를 놓습니다.
    6. 감염 방지 및 bregma 및 람다 표시 되도록 두 피의 10 m m를 잘라 면도날을 사용 하 여 머리를 조심 스럽게 제거. 1 %lidocaine 피 펫을 사용 하 여 0.1 mL를 관리 합니다. 있도록 bregma 및 람다 동일한 z 레벨 stereotaxic 악기에 떠 벌이의 수직 위치를 조정 하 여 머리의 각도 설정 합니다.
    7. 주사기의 팁은 bregma 가까이 stereotaxic 악기에 슬라이딩 하 여 조작자의 위치를 조정 하 고 조작자의 위치를 기록 합니다. 조작자에 도구 홀더를 이동 하 여 주사기를 철회.
    8. 조작자 이동 5.4 m m 뒤로 및 0.4 m m 옆. 팁은 두개골에 진입점 가까이 있도록 주사기를 사전. 주사기를 철회 하 고 진입점을 표시 합니다.
    9. 표시 된 위치에서 약 1 m m의 직경을 가진 구멍을 드릴 합니다.
    10. 팁 깊이 6.9 m m 보다는 bregma에 측정 하는 구멍을 통해 주사기 끝을 삽입.
    11. 추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 1 µ L을 주입.
    12. 두뇌에서 주사기를 제거 합니다.
    13. 필요한 경우 microfibrillar hemostat 및 인스턴트 접착제의 작은 파편으로 노출 된 뇌를 커버.
    14. 감염을 방지 하 고 두 피를 봉합 하는 피 펫 제공 하는 염 분을 사용 하 여 노출 된 뇌를 씻어.
    15. Stereotaxic 악기에서 마우스를 제거 합니다. 일반적으로 1 시간에 30 ˚C에 인큐베이터에 마 취에서 회복 하기 위해 마우스를 허용 합니다. 두지 마십시오 마우스 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 완전히 복구 되었습니다 후에 다른 동물의 회사를 마우스를 반환 합니다.
    16. 3-7 일에 대 한 마우스를 유지.
  2. 성인 쥐의 우량한 colliculus에 주사를 확인 합니다.
    1. 팁 직경 30-50 µ m의 유리 피 펫을 준비 합니다.
    2. 플라스틱 튜브 (그림 2A)를 통해 해밀턴 주사기를 유리 피 펫을 연결 합니다.
    3. 파라핀 액체 유리 피 펫, 플라스틱 튜브, 그리고 해밀턴 주사기를 채우십시오.
    4. 주사기에는 인젝터 펌프를 배치 합니다.
    5. 조작자에 유리 피 펫을 놓고 조작 수직 축 (그림 2B)에서 뒤로 60 ° 기울기.
    6. 2.1.4–2.1.9을 수행 합니다. 조작자의 위치는 1.4 m m 후부, 람다를 0.5 m m 옆.
    7. 두개골에 작은 플라스틱 파라핀 영화 장소 다음 그것에 추적 솔루션의 약 1 µ L를 넣어. 신속 하 게 사전 유리 피 펫 및 추적 솔루션의 적어도 0.5 µ L로 그것을 채우십시오.
    8. 팁 깊이 뇌 표면에서 3.0 m m 유리 피 펫을 삽입 합니다.
    9. 추적기는 펌프를 사용 하 여 0.2 µ L/분의 0.5 µ L을 주입.
    10. 두뇌에서 유리 피 펫을 제거 합니다.
    11. 2.1.13–2.1.16을 수행 합니다.

3. 고정 및 트리밍

  1. Sodium pentobarbital (60 밀리 그램/kg 체중) 마우스 (C57BL/6J 또는 Tlx3-cre/Ai9, 또는 2 단계에서 설명한 대로 추적 프로그램 주입 없이 intraperitoneally 주입. 마우스 마우스 완전히 취 나타내는 집게와 꼬리 슬쩍가 때 응답 하 게 될 때까지 기다립니다.
  2. 0.9% 식 염 수와 마우스 transcardially20 perfusing에 의해 마우스를 고통 없이 안락사.
  3. Perfusing 여 마우스20 수정 4 %paraformaldehyde (PFA) 0.1 M 인산 버퍼 (pH 7.5).
  4. 설명된20으로 두개골 폭로 위를 사용 하 여 두 피를 잘라.
    1. 가 위를 사용 하 여 노출 된 두개골의 중간을 잘라. 집게를 사용 하 여 두개골을 제거 합니다.
    2. 람다와 bregma의 위치를 표시 하는 것이 필요한 경우 먼저 두개골의 한 반구를 제거 합니다. 뇌에 남아 있는 두개골에 람다와 bregma의 위치에 두뇌에 얇은 텅스텐 바늘을 삽입 한 다음 나머지 해골을 제거.
      참고: 뇌 수에 저장 PBS 4 ˚C에서.
  5. 항 체 억제 뉴런의 얼룩을 수행 하려면 두뇌 샘플 조각으로 잘라.
    1. 장소는 vibratome에 뇌 샘플입니다.
    2. 실 온에서 PBS에 두께가 500 µ m까지 조각을 삭감 하 고 단계 5 (AbScale 방법)를 진행.
  6. 항 체 얼룩이 필요 하지 않은 경우, 트림 뇌 샘플을 차단 (최대 3 밀리미터 두꺼운) 면도날 (그림 3)를 사용 하 여 및 단계 4 (SeeDB 메서드)를 수행 하십시오.
    참고: 두뇌 저장할 수 있습니다 PBS에 4 ° C에서 절단 또는 트리밍 후. SeeDB 메서드를 사용 하면 항 체 염색 법은 불필요 한 때 AbScale 방법 보다 적은 시간을 요구 하기 때문에 하는 것이 좋습니다.

4. 항 체 (SeeDB 메서드)를 얼룩 없이 지우기

  1. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 20% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
  2. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 40% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
  3. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 60% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 4 h에 품 어.
  4. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.
  5. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 100% (w/v)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 12 h에 품 어.
  6. 포함 된 0.5% α-thioglycerol 및 80.2% (w/w)과 당 20 mL 50 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 샘플을 전송 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 그것을 품 어.
    참고: 샘플 변형 가능한 작게 유지을 신중 하 게 처리 합니다. 샘플 신속 하 게 불투명 될 수 있는 이상, 샘플을 품 어 하지 마십시오.
  7. 80.2%과 당 솔루션 (그림 1B)으로 가득 이미징 약 실에 샘플을 포함 합니다. 필요한 경우 주변 고무 접착제의 작은 조각을 넣어 샘플을 수정. 챔버 너무 깊은 경우 샘플을 배치 하기 전에 챔버에는 바닥에 접시를 넣어.
  8. 이미징 챔버에 유리 커버와 함께 페 트리 접시를 놓고 접시, 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 여기 파장 및 방출 필터 표 1에서 설명 합니다. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.

5. 항 체 (AbScale 방법) 얼룩을 지우기

  1. 표 2에 설명 된 대로 시 약을 준비 합니다.
  2. Sca/eS0 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 전송 하 고 37 ° C (그림 4B)에서 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 그들을 품 어.
  3. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 36 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  4. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 및 Sca/eB4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 24 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  5. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/eA2 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  6. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.
  7. 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.
  8. AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C (그림 4C)에서 48-72 시간의 1 mL에 1 차 항 체 (표 3)와 품 어.
  9. 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 5 mL 플라스틱 튜브에 조각.
  10. AbScale 솔루션 2 번 부드러운 진동으로 실 온에서 2 h 4 mL에 품 어.
  11. 조심 스럽게 제거 주걱을 사용 하 여 2 mL 플라스틱 튜브에 조각.
  12. 붙일 표시 2 차 항 체 (테이블의 자료, 1: 100) AbScale 솔루션 부드러운 떨고와 37 ° C에서 48 h의 1 mL에 함께 품 어.
  13. 조심 스럽게 AbScale 솔루션의 4 mL를 포함 하는 5 mL 플라스틱 튜브에 주걱을 사용 하 여 분할 영역을 제거 하 고 실 온에서 부드러운 떨고와 6 h에 대 한 슬라이스를 품 어.
  14. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 AbScale 솔루션의 4 개 mL를 추가 2 h 2 시간 실 온에서 부드러운 흔들어 대 한 슬라이스를 품 어.
  15. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 4%의 4 개 mL를 추가 PFA 고 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.
  16. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 추가 4 mL PBS의 실 온에서 부드러운 동요와 1 시간에 대 한 슬라이스를 품 어.
  17. 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 솔루션을 제거 하 고 Sca/e s 4 솔루션의 4 mL를 추가 하 고 37 ° c.에 부드러운 떨고와 12 h에 대 한 슬라이스를 품 어
  18. 유리 슬라이드에는 스페이서를 배치 하 고 슬라이스는 공백에 놓고 Sca/e s 4 솔루션 분할 영역을 담가. 커버 유리 (그림 1D)와 공백 인감.
  19. 커버 글라스와 물 침수 긴 작동 거리 목표와 또는 2 광자 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지에 물을 넣어. 필요한 경우, 전동된 스테이지를 사용 합니다.
    참고: 중요 한 라벨 바이어스의 부재를 확인 표면 부분에는 샘플의 깊은 부분 마찬가지로 표시 여부를 확인 하십시오.
    참고: 테스트 항 체의 침투는 표 3에 설명 되어 있습니다.

6. 셀 위치 결정

  1. 스캔된 된 이미지에서 각 위치에 대 한 3 차원 이미지 필터14 (그림 5A-5D)를 사용 하 여 상관 관계 값을 계산 합니다.
  2. 상관 관계 값 (그림 5D)의 봉우리의 위치를 결정 합니다.
  3. 찾을 셀 (그림 5E) 봉우리 이미지 조사.

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Representative Results

우리 /Ai9 유전자 변형 마우스 Tlx3-cre에 tdTomato의 식으로 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런을 표시 하 고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 폰으로 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 시각. 두뇌의 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 복종 되었다 및 물 침수 긴 작동 거리 목표를 갖춘 2 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 (25 X, N.A. 1.1 작동 거리 2 m m)와 전동된 스테이지. 401 이미지의 스택 (512 x 512 픽셀; 픽셀 크기 = 0.99 µ m) z-단계 = 2.8 µ m 각 30 검색 위치에서 얻은. 두 종류의 세포 세포 시체 뇌 영역 (그림 6), 그리고 정기 microcolumns (그림 7A)를 보여 광학 섹션의 넓은 범위에 보였다. 또한, Crym egfp 마우스 (C57BL/6J 배경 heterozygotes 유지)의 두뇌는 SeeDB 방법에 의해 삭제 되었고 위에서 몇 군데. 셀 바디와 EGFP 표현 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 꼭대기 dendrites 광학 섹션 (그림 7B)에 볼 수 있었다.

우리는 또한 역행 C57BL/6J 쥐 CTB488를 사용 하 여 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 라벨을 수행 합니다. 고정된 뇌 약 500 µ m의 두께와 코로나 조각으로 잘라 되었고 AbScale 메서드 parvalbumin 표현 셀 (안티-parvalbumin, 1:1000;을 대상 반대로 마우스 IgG 붙일 레이블이)입니다. 이미지 스택 (512 x 512 픽셀, 픽셀 크기 = 1.24 µ m; z 단계 = 2.17 µ m, 268 이미지/스택) 물 침수 긴 작동 거리 목표와 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 가져온 (20 X, N.A. 1.0, 작동 거리 2 m m). 하위 대뇌 프로젝션 뉴런을 표현 하는 parvalbumin 세포 둘 다 조각 (그림 ℃)에 표시 했다.

Figure 1
그림 1: 챔버와 스페이서 이미지. (A) 가기: 수 제 유리 바닥 페 트리 접시 (오른쪽)와 페 트리 접시 유리 하단 (왼쪽) 없이. 하단: 챔버 (오른쪽)와 바닥 플레이트 (왼쪽) 실리콘 시트 했다. (B) 마우스 반구 우량한 colliculus CTB555 주입 챔버로 설정 후 SeeDB 메서드를 받게. 샘플 재사용 접착제의 조각으로 고정 됩니다. (C) 유리 슬라이드 (위)와 두께 0.5 m m (아래)와 실리콘 시트를 만든다. (D) 두 코로나 조각 마우스 뇌의 공백 요소에 설정 하 고 커버 유리로 덮여 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 추적 프로그램 삽입. (A) A 유리 피 펫 플라스틱 튜브를 통해 해밀턴 주사기에 연결 (B) 마우스 stereotaxic 악기에 배치 됩니다. 유리 피 펫을 기울이면 우량한 colliculus 주입에 대 한 수직 축에서 뒤로 약 60 °. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 뇌 샘플의 트리밍. (A) 우량한 colliculus 고정으로 CTB555의 주입 후 뇌 샘플. Bregma와 람다 텅스텐 바늘 (화살촉)로 표시 했다. (B) 같은 샘플 반구를 손질 합니다. 텅스텐 바늘 (화살촉) 유지 하는 참고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: SeeDB 및 AbScale 메서드에 대 한 솔루션에서 뇌 샘플의 침수. (A) A 반구 샘플에 0.5% α-thioglycerol 및 SeeDB 메서드에 대 한과 당 20% (w/v). (B) 코로나 조각 AbScale 메서드에 대 한 Sca/eA2 솔루션에. (C) 코로나 조각 AbScale 방법에 대 한 항 체를 포함 하는 AbScale 솔루션에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 셀 위치의 결정. 하위 대뇌 프로젝션 뉴런은 나이의 5 주에는 폰에 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 분류 했다. 왼쪽된 반구 SeeDB 메서드를 받게 되었고 두 광자 현미경으로 검사 (512 x 512 픽셀, 픽셀 크기 = 0.99 µ m; z 단계 = 2.8 µ m, 601 이미지/스택). (A)는 단일 이미지입니다. 단일 이미지 스택에서 이미지를 (B) 5. (C) 이미지 필터 CTB 표시 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런을 감지 하는 데 사용. (D) (C)에서 필터를 사용 하 여 5 개의 이미지 (B)에 대 한 상관 관계 값 계산. 검색 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런의 (E) 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 대규모 화상의 대표적인 결과. 대뇌 피 질의 프로젝션 뉴런 (녹색) tdTomato- Tlx3-cre/Ai9 유전자 변형 마우스에 있는 식으로 표시 했다 그리고 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 (마젠타)의 7 주에는 폰에 역행 추적 프로그램 CTB488를 주입 하 여 구상 했다 나 이입니다. 좌 반구는 SeeDB 메서드를 복종 되었다 그리고 2,690 µ m 옆에 지역 1, 250 µ m 및-3,400 µ m 1230 µ m는 bregma에 앞쪽에 두 광자 현미경을 사용 하 여 스캔 했다. (A) 최고 볼 수 있습니다. 대뇌 피 질의 영역의 대략적인 위치를 표시 했다. (DB-) CTB 488 형광 하위 대뇌 프로젝션 뉴런 (B), 보여주는 프로젝션 대뇌 피 질의 뉴런 (C), (D) 병합 된 이미지를 보여주는 tdTomato 형광의 간접 보기. A: 앞쪽; P: 후부; M: 중간; D: 등입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 대표 결과의 높은 확대 사진. (A) 그림 6D에 이미지의 광학 섹션. 이미지 두께 = 20 µ m. (B) 나이의 6 주에 heterozygous Crym egfp 마우스에서 EGFP 표시 된 하위 대뇌 프로젝션 뉴런. 두께 이미지 = 30 µ m. (C) Subcerebral 프로젝션 뉴런 (마젠타) 49, 및 parvalbumin 표현 셀 (녹색) AbScale 방법으로 시각화 했다 출생 후 하루에서 C57BL/6J 쥐의 폰으로 CTB488를 주입 하 여 분류 했다. 두께 이미지 = 55 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Fluorophore 예 (nm). 필터 (nm)
EGFP 910 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)
tdTomato 1000 578-633 (D605/55 m, 크로마)
알 렉 사 Fluor 488 750 500-550 (FF03-525/50-25, Semrock)
알 렉 사 Fluor 555 750 563-588 (FF03-575/25-25, Semrock)
알 렉 사 Fluor 594 750 601-657 (FF01-629/56, Semrock)
DAPI 700 400-480 (FF01-492/SP-25, Semrock)

표 1: 여기 파장 고 두 광자 현미경 검사 법에 대 한 필터.

표 2: AbScale 방법에 대 한 시 약. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

항 원 예방 접종된 동물 제품 ID 농도 3 m m 블록 500 μ m 조각
NeuN 마우스 MAB377 1: 500 ND +
NeuN 토끼 ABN78 1: 500 ND +
CTIP2 ab18465 1: 100 L1-L6 +
Statb2 마우스 ab51502 1: 100 - -
GAD67 마우스 MAB5406 1: 200 ND +
GABA 토끼 A2052 1: 100 - -
Parvalbumin 마우스 235 1:1000 ND +
Parvalbumin 염소 PV-가 서-Af460 1: 100 L1-L2/3 +
Parvalbumin 마우스 P3088 1:1000 ND +
Parvalbumin 토끼 ab11427 1: 500 ND -
Somatostatin 토끼 T-4103 1:1000 L1-L2/3 +
c-Fos 토끼 PC38 1:1000 ND +

표 3: 테스트 항 체의 침투. 3 m m 두꺼운 블록에 대 한 결과 표시 다음과 같습니다. 전체 피 질 두께;으로 L1-L6: 침투 계층 2/3;까지 L1-L2/3: 침투 -: 라벨; ND: 결정 되지. 500 µ m 두께 조각에 대 한 결과 표시 다음과 같습니다. +: 균일 한 라벨; -: 없음 또는 라벨.

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Discussion

우리는 마우스 neocortical 레이어 5에에서 주요 세포 유형의 셀 형식 관련 조직의 대규모 3 차원 이미지를 얻기 위해 절차를 제시. 기존의 조각 얼룩에 비해, 메서드는 결정 하는 피 질의 3 차원 조직에 더 유용 합니다. 메서드를 사용 하는 더 넓은에서 이미지 수집 그리고 깊은 두뇌 지구 2 광자 현미경 전형적인 vivo에서 또는 전통적인 confocal 현미경 검사 법에 비해, 따라서 neocortical 휴대의 포괄적인 분석을 허용할 수 있다 조직입니다.

방법의 중요 한 단계는 항 체 침투 이다. 항 체의 하위 집합으로 두꺼운 표본 (표 3), 불 쌍 한 침투를 보여줍니다 그리고, 따라서, AbScale 방법에 사용할 수 없습니다. 이 연구에 사용 된 항 체와 균일 한 라벨을 얻기 위해 500 µ m 조각으로 두뇌를 잘라 하는 데 필요한 했다. 작은 항 체 파편, 예를 들어, 팹 F(ab') 2 조각, 또는 다른 방법21,22,23,,2425,26, 비운의 사용 , 2728 결과 향상 시킬 수 있습니다.

항 체 항 원 묶는 특이성은 일반적으로 얇은 조직 조각에서 특징만 처리 될 수 있습니다 다른 두꺼운 조직에서 지우기에 대 한. 항 체 특이성에 대 한 제어, 공동 조직 추적 프로그램 주입 및 마커 유전자 발현 유전자 변형 동물에서을 표시 하 고 또한 항 원 단백질 및 펩 티 드14를 사용 하 여 차단 실험을 수행. 이러한 절차와 제어 실험 대상 항 부족 돌연변이 동물을 사용 하는 항 체의 특이성을 확인 하는 데 유용 해야 합니다.

방법의 한계는 시료의 일부 변형 부드러운 대량 샘플의 처리 때문에 불가피 하다입니다. Vivo에서 고정 및 참조 수정 같은 개 악 하는 데 도움이 됩니다 이러한 이미지를 사용 하 여 이전 이미지를 얻는.

현재 절차 neocortical 레이어 5의 분석을 위해 설계 되었습니다. 최근 분석 많은 분자 마커 다른 레이어4,5,,67, 그 레이블 신경 세포 유형 식별 및 현재 메서드에 이러한 제조 업체의 응용 프로그램 사용 다른 계층에 중요 한 세포 조직의 식별입니다. 또한, 그것은 정확한 세포 조직 microcolumns와 유사한 존재 인지를 조사 하는 뇌 이외의 장기에는 피 질 외 뇌 지역에 유사한 분석을 수행 가능 해야 합니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 감사 미 야와 키 아츠 시와 히로시 하 마 원고, 편집에 대 한 찰스 요코야마 AbScale 실험에 그들의 조언을 에리코 Ohshima 및 그들의 기술 지원에 대 한 미유키 Kishino. 이 작품은 과학적 연구에서 교육, 문화, 스포츠, 과학 및 기술 (MEXT) 일본의 남에 대 한 남 및 연구비 RIKEN에서 연구 자금에 의해 지원 되었다 (혁신적인 지역 "생체 Neurocircuitry"; 22115004)와 S.S. (25890023)입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Crym-egfp transgenic mice MMRRC 012003-UCD
Tlx3-cre transgenic mice MMRRC 36547-UCD
ROSA-CAG-flox-tdTomato mice Jackson Laboratory JAX #7909
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-01 0.5 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-02 1.0 mm thickness
Silicone rubber sheet AS ONE 6-611-05 3.0 mm thickness
Petri dishes Falcon 351008
Cover glass Matsunami C022241
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 488 conjugate Invitrogen C22841
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 555 conjugate Invitrogen C22843
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 594 conjugate Invitrogen C22842
Cholera toxin subunit B (recombinant), Alexa Fluor 647 conjugate Invitrogen C34778
26 G Hamilton syringe Hamilton 701N
Injector pump KD Scientific KDS 310 Pons injection
Injector pump KD Scientific KDS 100 Superior colliculus injection
Manipulator Narishige SM-15
Sodium pentobarbital Kyoritsu Seiyaku Somnopentyl
Isoflurane Pfizer
Lidocaine AstraZeneca Xylocaine injection 1% with epinephrine
Drill Toyo Associates HP-200
Avitene microfibrillar hemostat Davol Inc 1010090
Alonalfa Daiichi-Sankyo Alonalpha A
Surgical silk Ethicon K881H
Incubator UVP HB-1000 Hybridizer
Glass pipette Drummond Scientific Company 2-000-075
Electrode puller Sutter Instrument Company P-97
Paraffin Liquid, light Nacalai tesque 26132-35
Saline Otsuka 1326
Paraformaldehyde Nacalai tesque 26126-54
Tungsten needle Inter medical Φ0.1 *L200 mm
Vibratome Leica VT1000S
50 mL plastic tube Falcon 352070
α-thioglycerol Nacalai tesque 33709-62
D(-) Fructose Nacalai tesque 16315-55
BluTack Bostik CKBT-450000
Two-photon microscope Nikon A1RMP
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI Apo LWD 25XW, NA 1.1, WD 2 mm
Water-immersion long working distance objectives Nikon CFI LWD 16XW, NA 0.8, WD 3 mm
Motorized stage COMS PT100C-50XY
Filter Semrock FF01-492/SP-25
Filter Semrock FF03-525/50-25
Filter Semrock FF03-575/25-25
Filter Semrock FF01-629/56
Filter Chroma D605/55m
5 mL plastic tube AS ONE VIO-5B
2 mL plastic tube Eppendorf  0030120094
Urea Nacalai tesque 35905-35
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Glyserol Sigma-aldrich 191612
D(-)-sorbitol Wako 191-14735
Methyl-β-cyclodextrin Tokyo chemical industry M1356
γ-Cyclodextrin Wako 037-10643
N-acetyl-L-hydroxyproline Skin Essential Actives 33996-33-7
DMSO Nacalai tesque 13445-45
Bovine Serum Albumin Sigma-aldrich A7906
Tween-20 (1.1 g/mL) Nacalai tesque 35624-15
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21422
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 Invitrogen A21428
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Invitrogen A21235
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11029
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly CrossAdsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Invitrogen A21206
Confocal microscope Olympus FV1000
Water-immersion long working distance objectives Olympus XLUMPLFLN 20XW, NA 1.0, WD 2 mm
Anti-NeuN Millipore MAB377
Anti-NeuN Millipore ABN78
Anti-CTIP2 Abcam ab18465
Anti-Statb2 Abcam ab51502
Anti-GAD67 Millipore MAB5406
Anti-GABA Sigma A2052
Anti-Parvalbumin Swant 235
Anti-Parvalbumin Frontier Institute PV-Go-Af460
Anti-Parvalbumin Sigma P3088
Anti-Parvalbumin Abcam ab11427
Anti-Somatostatin Peninsula Laboratories T-4103
Anti-c-Fos CalbioChem PC38

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References

  1. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, (7124), 168-176 (2007).
  2. Defelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nature Reviews Neuroscience. 14, (3), 202-216 (2013).
  3. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350, (6264), aac9462 (2015).
  4. Sorensen, S. A., et al. Correlated gene expression and target specificity demonstrate excitatory projection neuron diversity. Cerebral Cortex. 25, (2), 433-449 (2015).
  5. Zeisel, A., et al. Brain structure. Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq. Science. 347, 1138-1142 (2015).
  6. Tasic, B., et al. Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics. Nature Neuroscience. 19, (2), 335-346 (2016).
  7. Zeng, H., Sanes, J. R. Neuronal cell-type classification: Challenges, opportunities and the path forward. Nature Reviews Neuroscience. 18, (9), 530-546 (2017).
  8. Horton, J. C., Adams, D. L. The cortical column: a structure without a function. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 360, (1456), 837-862 (2005).
  9. Costa, N. M., Martin, K. A. C. Whose cortical column would that be? Frontiers in Neuroanatomy. 4, Article 16 (2010).
  10. Molyneaux, B. J., Arlotta, P., Menezes, J. R. L., Macklis, J. D. Neuronal subtype specification in the cerebral cortex. Nature Reviews Neuroscience. 8, (6), 427-437 (2007).
  11. Hioki, H., et al. Cell type-specific inhibitory inputs to dendritic and somatic compartments of parvalbumin-expressing neocortical interneuron. Journal of Neuroscience. 33, (2), 544-555 (2013).
  12. Maruoka, H., Kubota, K., Kurokawa, R., Tsuruno, S., Hosoya, T. Periodic organization of a major subtype of pyramidal neurons in neocortical layer V. Journal of Neuroscience. 31, (50), 18522-18542 (2011).
  13. Kwan, K. Y., et al. Species-dependent posttranscriptional regulation of NOS1 by FMRP in the developing cerebral cortex. Cell. 149, (4), 899-911 (2012).
  14. Maruoka, H., Nakagawa, N., Tsuruno, S., Sakai, S., Yoneda, T., Hosoya, T. Lattice system of functionally distinct cell types in the neocortex. Science. 358, (6363), 610-615 (2017).
  15. Treweek, J. B., Gradinaru, V. Extracting structural and functional features of widely distributed biological circuits with single cell resolution via tissue clearing and delivery vectors. Current Opinion in Biotechnology. 40, 193-207 (2016).
  16. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical Principles in Tissue Clearing and Staining Protocols for Whole-Body Cell Profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, (1), (2016).
  17. Gerfen, C. R., Paletzki, R., Heintz, N. GENSAT BAC cre-recombinase driver lines to study the functional organization of cerebral cortical and basal ganglia circuits. Neuron. 80, (6), 1368-1383 (2013).
  18. Hama, H., et al. ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging. Nature Neuroscience. 18, (10), 1518-1529 (2015).
  19. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nature Neuroscience. 16, (8), 1154-1161 (2013).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
  21. Kim, S. -Y., et al. Stochastic electrotransport selectively enhances the transport of highly electromobile molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112, (46), E6274-E6283 (2015).
  22. Murray, E., et al. Simple, scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems. Cell. 163, (6), 1500-1514 (2015).
  23. Ke, M. T., et al. Super-resolution mapping of neuronal circuitry with an index-optimized clearing agent. Cell Reports. 14, (11), 2718-2732 (2016).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Scientific Reports. 6, 18631 (2016).
  25. Renier, N., et al. Mapping of Brain Activity by Automated Volume Analysis of Immediate Early Genes. Cell. 165, (7), 1789-1802 (2016).
  26. Kubota, S. I., et al. Whole-body profiling of cancer metastasis with single-cell resolution. Cell Reports. 20, (1), 236-250 (2017).
  27. Li, W., Germain, R. N., Gerner, M. Y. Multiplex, quantitative cellular analysis in large tissue volumes with clearing-enhanced 3D microscopy (Ce3D). Proceedings of the National Academy of Sciences. 114, (35), E7321-E7330 (2017).
  28. Liu, A. K. L., Lai, H. M., Chang, R. C. C., Gentleman, S. M. Free of acrylamide sodium dodecyl sulphate (SDS)-based tissue clearing (FASTClear): a novel protocol of tissue clearing for three-dimensional visualization of human brain tissues. Neuropathology and Applied Neurobiology. 43, (4), 346-351 (2017).

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