आनुवंशिक वेरिएंट visualizing, लघु लक्ष्य, और रूपात्मक ऊतक संदर्भ में प्वाइंट उत्परिवर्तनों सीटू संकरण परख में एक आरएनए के साथ

Biology
 

Summary

यहां, हम एक सीटू संकरण परख जो संवेदनशील और एकल-कोशिका स्तर पर एकल न्यूक्लियोटाइड संकल्प के साथ ५० न्यूक्लियोटाइड के रूप में कम के रूप में दृश्यों का विशिष्ट पता लगाने में सक्षम बनाता है का वर्णन । परख, जो मैंयुअल रूप से या स्वचालित रूप से किया जा सकता है, ब्याह वेरिएंट के दृश्य सक्षम कर सकते हैं, छोटे दृश्यों, और ऊतक संदर्भ में उत्परिवर्तनों ।

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Anderson, C. M., Laeremans, A., Wang, X. M., Wu, X., Zhang, B., Doolittle, E., Kim, J., Li, N., Pimentel, H. X., Park, E., Ma, X. J. Visualizing Genetic Variants, Short Targets, and Point Mutations in the Morphological Tissue Context with an RNA In Situ Hybridization Assay. J. Vis. Exp. (138), e58097, doi:10.3791/58097 (2018).

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Abstract

क्योंकि सटीक दवा अत्यधिक पर निर्भर करता है के सटीक का पता लगाने के मार्क्स, वहाँ मानकीकृत और मजबूत प्रौद्योगिकियों के लिए एक बढ़ती जरूरत है कि उपाय के नैदानिक नमूनों में सीटू में आरएनए के मार्क्स. जबकि पीस और RNAseq और मात्रात्मक RT-पीसीआर की तरह बांध परख अत्यधिक संवेदनशील जीन अभिव्यक्ति माप सक्षम करते हैं, वे भी आरएनए निष्कर्षण की आवश्यकता होती है और इस तरह रूपात्मक ऊतक संदर्भ के भीतर मूल्यवान अभिव्यक्ति विश्लेषण को रोकने के । में सीटू संकरण (ISH) परख यहां वर्णित आरएनए लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के रूप में कम के रूप में ५० न्यूक्लियोटाइड एकल-न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर और एकल सेल स्तर पर कर सकते हैं । इस परख पहले विकसित वाणिज्यिक परख के पूरक है और संवेदनशील और ब्याह वेरिएंट, लघु लक्ष्य, और ऊतक के भीतर बिंदु उत्परिवर्तनों की सीटू का पता लगाने में विशिष्ट सक्षम बनाता है । इस प्रोटोकॉल में, जांच दो नैदानिक महत्वपूर्ण ब्याह वेरिएंट, EGFRvIII और METΔ14 के लिए अद्वितीय एक्सॉन जंक्शनों को लक्षित करने के लिए डिजाइन किए गए थे । लघु लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के विशिष्ट पता लगाने के द्वारा प्रदर्शन किया गया था टी-सेल रिसेप्टर्स α और β Jurkat टी-सेल लाइन में CDR3 अनुक्रम. यह भी दिखाया गया है आरएनए के भेद के लिए इस ISH परख की उपयोगिता एकल-न्यूक्लियोटाइड संकल्प (बिंदु उत्परिवर्तनों) में EGFR L858R और KRAS G12A के दृश्य के माध्यम से एकल-सेल लाइनों में न्यूक्लियोटाइड रूपांतरों स्वचालित धुंधला का उपयोग प्लेटफार्मों. संक्षेप में, प्रोटोकॉल एक विशेष आरएनए ISH परख है कि ब्याह वेरिएंट, छोटे दृश्यों का पता लगाने में सक्षम बनाता है, और मैनुअल प्रदर्शन के लिए और स्वचालित दाग पर सीटू में उत्परिवर्तन से पता चलता है ।

Introduction

उच्च-प्रवाह transcriptomic प्रौद्योगिकियों जैसे microarrays और अगली-gen आरएनए अनुक्रमण (RNAseq) तेजी से नैदानिक, शकुन, और सहित विभिन्न रोगों के लिए पूर्वानुमानित नैदानिक मूल्य के साथ आरएनए के निशान की खोज में सुधार हुआ है कर्क1,2. परिशुद्धता दवा में इन के प्रयोग अग्रिम करने के लिए, वहां मानकीकृत और मजबूत प्रौद्योगिकियों कि नैदानिक नमूनों के ऊतक संदर्भ के भीतर आरएनए के लिए उपाय कर सकते है के लिए एक उच्च की जरूरत है । जबकि व्यापक रूप से स्थापित पीसने और RNAseq और मात्रात्मक आर सी-पीसीआर की तरह बांध परख अत्यधिक संवेदनशील जीन अभिव्यक्ति माप सक्षम, आवश्यक ऊतक homogenization और आरएनए अलगाव vivo कोशिका प्रकार विशिष्टता के नुकसान का संकेत है और रूपात्मक सूचना3. पारंपरिक सीटू आरएनए का पता लगाने के तरीके में ऊतक संदर्भ4के भीतर दुर्लभ या कम-व्यक्त आरएनए के मार्क्स को मज़बूती से मापने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और विशिष्टता की कमी है ।

सीटू संकरण में एक वाणिज्यिक (ISH) परख (जैसे, RNAscope परख) एक तकनीक है कि इन चुनौतियों से निपटने के लिए और भी सक्षम बनाता है एक आरएनए के अति संवेदनशील और विशिष्ट दृश्य ३०० से अधिक अणुओं टिशू रूपात्मक प्रसंग के भीतर न्यूक्लियोटाइड । परख के इस प्रकार के लगभग 6 के एक अद्वितीय oligonucleotide जांच डिजाइन का उपयोग करता है-20 डबल जेड जांच एक उंनत संकरण-आधारित संकेत प्रवर्धन5के साथ संयुक्त जोड़े ।

इस अध्ययन में एक विशेष आरएनए ISH परख, BaseScope, पहले से डिजाइन व्यावसायिक प्रौद्योगिकी है कि एक न्यूक्लियोटाइड संकल्प पर ५० न्यूक्लियोटाइड के रूप में छोटा के रूप में आरएनए लक्ष्य अनुक्रम का पता लगा सकते हैं के पूरक का वर्णन. इस परख transcriptome के जटिल जटिलताओं पते और एक्सॉन जंक्शनों, लघु लक्ष्य दृश्यों, और ऊतक संदर्भ (तालिका 1) में अंक उत्परिवर्तनों का सही पता लगाने के लिए लागू है के रूप में एक डबल जेड जांच जोड़ी के रूप में छोटे का उपयोग कर । इस रिपोर्ट को पूरा परख प्रोटोकॉल और ब्याह वेरिएंट का पता लगाने में इसके उपयोग को दर्शाता है, टी के लिए CDR3 अनुक्रम-सेल रिसेप्टर क्लोन, और एकल-FFPE सेल लाइनों और ट्यूमर के ऊतकों में न्यूक्लियोटाइड उत्परिवर्तनों ।

Protocol

इस अध्ययन में प्रयुक्त मानव ट्यूमर नमूनों को अज्ञात और मानव अनुसंधान के लिए स्थानीय नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया ।

1. नमूना, उपकरण, और एजेंट की तैयारी

  1. FFPE नमुना तयारी
    1. ऊतकों
      1. तुरंत विच्छेदन के बाद, ऊतक को ठीक (3 के ब्लॉक में कटौती-4 मोटाई में मिमी) 10% तटस्थ में-बफर formalin (NBF) 16 के लिए-कमरे के तापमान पर 32 ज (आरटी) ।
        नोट: निर्धारण समय ऊतक प्रकार और आकार के आधार पर भिंन होगा ।
      2. 1x फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) और निर्जलीकरण के साथ नमूना धो एक मानक इथेनॉल (ेतोः) श्रृंखला का उपयोग (७०% ेतोः 30 के लिए-60 मिनट, 30 के लिए ८०% ेतोः – 60 मिनट, ९०% ेतोः 30 – 60 मिनट के लिए, ९५% ेतोः 30 – 60 मिनट के लिए, 3x १००% ेतोः 30 – 60 मिनट के लिए) xylene द्वारा पीछा किया ।
      3. मानक प्रक्रियाओं6 का उपयोग कर आयल में नमूना एंबेड करें और अतिरिक्त तेल हटाने के लिए की जरूरत के रूप में आयल ब्लॉक ट्रिम कर दीजिए ।
        नोट: ब्लॉक आकार ऊतक नमूना आकार के आधार पर भिन्न हो जाएगा, लेकिन एक ठेठ आकार ०.७५ x ०.७५ इंच2 या छोटे है.
    2. सेल लाइंस
      1. ले लीजिए और विशिष्ट सेल लाइन के लिए अनुशंसित तरीकों के अनुसार कोशिकाओं गोली ।
      2. 24 घंटे के लिए RT पर 10% formaldehyde में कक्षों को रोटेटर पर ठीक करें.
      3. गर्म प्रसंस्करण जेल (जैसे, Histogel) में एक गोली के रूप में कोशिकाओं को तैयार करें । गोली की अनुमति देने के लिए जेल-सेल गोली को बर्फ पर parafilm के एक टुकड़े पर रखकर जमना, और यह 2 के लिए बैठो-3 मिन । जेल-सेल गोली 1x पंजाब में जलमग्न ।
      4. निर्जलीकरण और सेल छर्रों एंबेड के रूप में 1.1.1 कदम में वर्णित है ।
    3. विभागात तयारी
      1. एक microtome का उपयोग कर 5 ± 1 माइक्रोन वर्गों में एंबेडेड ऊतक/कोशिकाओं में कटौती, electrostatically चिपकने वाला गिलास स्लाइड पर वर्गों माउंट, और हवा-आरटी में उन्हें रात सूखी ।
        नोट: स्लाइड सुखाना के तहत आरटी पर 3 महीने के लिए संग्रहित किया जा सकता है ।
      2. स्लाइड रैक में स्लाइड प्लेस और ६० डिग्री सेल्सियस पर एक परिसंचारी हवा ओवन में घुड़सवार ऊतक स्लाइड सेंकना 1 h के लिए परख प्रदर्शन करने से पहले ।
        नोट: तुरंत स्लाइड का उपयोग करें या उंहें 1 सप्ताह के लिए desiccants के साथ RT पर संग्रहीत । लंबे समय तक भंडारण आरएनए क्षरण में परिणाम हो सकता है ।
  2. उपकरणों की तैयारी
    1. ४० डिग्री सेल्सियस के लिए संकरण ओवन सेट करें । अच्छी तरह से humidifying कागज गीला और किसी भी अवशिष्ट डीएच2ओ निकालें नमी नियंत्रण ट्रे में कागज डालें, और संकरण ओवन में ट्रे डालने के लिए उपयोग करने से पहले ंयूनतम 30 मिनट के लिए गर्म ।
  3. एजेंट तैयारी
    1. xylene के २०० मिलीलीटर के साथ दो समाशोधन एजेंट व्यंजन भरें और १००% ेतोः, जो वर्गों के deparaffinization के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की २०० मिलीलीटर के साथ दो धुंधला व्यंजन भरें ।
    2. डीएच2O के 10x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति रिएजेंट के 20 मिलीलीटर के १८० मिलीलीटर जोड़कर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध 1x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति एजेंट के २०० मिलीलीटर तैयार करें । दो स्लाइड धारकों को एक स्टीमर में रखें । 1x लक्ष्य पुनर्प्राप्ति रिएजेंट की २०० मिलीलीटर के साथ एक स्लाइड धारक भरें और डीएच2ओ के २०० मिलीलीटर के साथ अंय स्लाइड धारक को भरने के लिए एक स्टीमर का उपयोग कर फोड़ा दोनों समाधान ।
    3. गर्म 50x धो बफर के लिए ४० ° c करने के लिए 10 – 20 min. कमजोर द्वारा 1x धो बफर के 3 एल तैयार डीएच2ओ के २.९४ l के साथ गरम 50x धो बफर के ६० मिलीलीटर ।
    4. एक धुएं के हुड में, ५०% गिल के डीएच2ओ के १०० मिलीलीटर को गिल के Hematoxylin की १०० मिलीलीटर जोड़कर Hematoxylin counterstaining समाधान तैयार करें । धुएं के हुड में, bluing रिएजेंट तैयार (०.०२% (डब्ल्यू/वी) अमोनिया पानी) जोड़कर 28 – 30% अमोनियम हीड्राकसीड की २५० मिलीलीटर से डीएच2O.
    5. पूर्व निर्धारित 10 मिनट के लिए ४० ° c पर पहले से लक्ष्य जांच संकरण और बढ़ाना रिएजेंट (AMP 0 – 6) RT करने के लिए लाने के लिए ।

2. सीटू में आरएनए संकरण परख

  1. Deparaffinization और निर्जलीकरण
    1. कदम 1.1.3.2 में वर्णित के रूप में पाक के बाद (वैकल्पिक रोक बिंदु 1), deparaffinize आंदोलन के साथ 5 मिनट के लिए xylene में वर्गों । Deparaffinize फिर से ताजा xylene में 5 min. निर्जलीकरण के लिए १००% ेतोः में आंदोलन के साथ 2 मिनट के लिए, और फिर से ताजा १००% ेतोः में 2 मिनट के लिए दोहराएं ।
    2. एयर ६० ° c में एक परिचालित हवा ओवन में 5 मिनट के लिए स्लाइड शुष्क या आरटी पर जब तक वे पूरी तरह से शुष्क कर रहे है (वैकल्पिक रोक बिंदु 2) ।
  2. नमूना उपचार
    1. अंतर्जात peroxidase गतिविधि बुझाने के लिए RT पर 10 मिनट के लिए तैयार करने के लिए उपयोग हाइड्रोजन पेरोक्साइड के ~ 4 बूंदें के साथ वर्गों की मशीन । स्लाइड से समाधान की खिचड़ी भाषा और डीएच2ओ के साथ उंहें दो बार कुल्ला ।
    2. एक स्टीमर में १०० डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए लक्ष्य पुनर्प्राप्ति एजेंट के २०० मिलीलीटर के साथ वर्गों की मशीन ।
      नोट: मशीन समय ऊतक के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, लक्ष्य पुनर्प्राप्ति दोनों ट्यूमर नमूने और सेल छर्रों के लिए 15 मिनट के लिए किया गया था ।
    3. स्लाइड से समाधान खिचड़ी भाषा, डीएच2हे, 3 मिनट के लिए १००% ेतोः में डुबकी के साथ दो बार कुल्ला, और एक परिचालित हवा ओवन में ६० ° c पर स्लाइड सूखी या आरटी पर पूरी तरह से सूख तक ।
    4. एक hydrophobic पेन का उपयोग कर अनुभाग के आसपास एक hydrophobic बाधा ड्रा, लगभग ०.७५ x ०.७५ इंच2
      नोट: यह एक छोटे बाधा आकर्षित करने के लिए अनुशंसित नहीं है. बड़े वर्गों के लिए, एक बड़ा बाधा तैयार करने की आवश्यकता होगी ।
    5. 1 मिनट के लिए पूरी तरह से सूखी बाधा चलो, या आरटी पर रात भर छोड़ (वैकल्पिक रोक बिंदु 3) ।
    6. स्लाइड्स को स्लाइड होल्डर में रखें और स्लाइड होल्डर को नमी कंट्रोल ट्रे में रखें । प्रत्येक स्लाइड को छेड़ने III के ~ 4 बूंदें जोड़ें और प्रोटीन पाचन के लिए संकरण ओवन में ४० डिग्री सेल्सियस पर 15-30 मिनट के लिए उन्हें गर्मी ।
      नोट: मशीन समय ऊतक के प्रकार के आधार पर भिन्न हो सकते हैं । इस प्रोटोकॉल में, को छेड़ो पाचन ट्यूमर के नमूनों के लिए 30 मिनट और सेल छर्रों के लिए 15 मिनट के लिए प्रदर्शन किया गया ।
    7. स्लाइड से समाधान की खिचड़ी भाषा और डीएच2ओ के साथ उंहें दो बार कुल्ला ।
  3. जांच संकरण
    1. जोड़ें ~ पूरे अनुभाग को कवर करने के लिए उपयुक्त तैयार करने के लिए उपयोग जांच समाधान के 4 बूंदें । यदि बड़े वर्गों का उपयोग कर, जोड़ें ~ 5-6 बूंदें ।
    2. संकरण संकरण ओवन में ४० डिग्री सेल्सियस पर 2 ज के लिए जांच । स्लाइड से समाधान नहीं कर सकते है और 1-सामयिक आंदोलन के साथ आरटी में 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के २०० मिलीलीटर में स्लाइड धो लो । इस चरण में वाशिंग प्रक्रिया दोहराएं ।
  4. संकेत प्रवर्धन
    1. 30 मिनट के लिए संकरण ओवन में ४० ° c पर AMP 0 प्रति स्लाइड की ~ 4 बूंदें के साथ वर्गों मशीन समाधान के लिए और धो स्लाइड २०० में 1x धो बफर के 2 मिनट के लिए सामयिक आंदोलन के साथ RT पर । इस चरण में वाशिंग प्रक्रिया दोहराएं ।
    2. 15 मिनट के लिए संकरण ओवन में ४० डिग्री सेल्सियस पर AMP 1 प्रति स्लाइड की ~ 4 बूंदें के साथ वर्गों के लिए मशीन और समाधान के लिए नहीं कर सकते है और कभी-कभार आंदोलन के साथ आरटी में 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के २०० मिलीलीटर में स्लाइड धो लो । धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    3. 30 मिनट के लिए संकरण ओवन में ४० ° c पर प्रति स्लाइड AMP 2 के ~ 4 बूंदें के साथ वर्गों को कम करना समाधान और धो स्लाइड २०० में 1x धो बफर के 2 मिनट के लिए सामयिक आंदोलन के साथ RT पर । धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    4. 30 मिनट के लिए संकरण ओवन में ४० डिग्री सेल्सियस पर AMP 3 की 4 बूंदें प्रति स्लाइड के साथ वर्गों के लिए मशीन के साथ गर्मी समाधान और धो स्लाइड २०० में 1x धो बफर के 2 मिनट के लिए सामयिक आंदोलन के साथ RT पर । धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    5. 15 मिनट के लिए संकरण ओवन में ४० डिग्री सेल्सियस पर 4 AMP के 4 बूंदें प्रति स्लाइड के साथ वर्गों को कम करना समाधान और धो स्लाइड २०० में 1x धो बफर के 2 मिनट के लिए सामयिक आंदोलन के साथ RT पर । धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    6. 30 मिनट के लिए आर टी पर स्लाइड प्रति AMP 5 में से ~ 4 बूंदें के साथ वर्गों मशीन समाधान और कभी कभार आंदोलन के साथ आरटी पर 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के २०० मिलीलीटर में स्लाइड धो लो । धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ ।
    7. 15 मिनट के लिए आर टी पर स्लाइड प्रति AMP 6 के ~ 4 बूंदें के साथ और समाधान के लिए नहीं कर सकते हैं । सामयिक आंदोलन के साथ आरटी में 2 मिनट के लिए 1x धो बफर के २०० मिलीलीटर में स्लाइड धो लो । धोने की प्रक्रिया को दोहराएँ ।
  5. सिग्नल डिटेक्शन
    1. तेजी से लाल डाई काम समाधान तैयार करते हैं । एक ०.७५ x ०.७५ इंच2 बैरियर के साथ एक स्लाइड के लिए, तेजी से लाल-एक ट्यूब में और अच्छी तरह से मिश्रण के १२० μL के लिए तेज लाल-बी डाई के 2 μL जोड़ें ।
      नोट: hydrophobic बैरियर और स्लाइड की संख्या के आकार के आधार पर, तेजी से लाल काम कर रहे समाधान के संस्करणों में भिंन होगा ।
    2. स्लाइड से अतिरिक्त तरल खिचड़ी भाषा और स्लाइड के लिए तेजी से लाल डाई काम समाधान जोड़ें । प्रकाश जोखिम से बचने के लिए एक कवर के साथ ट्रे में आरटी पर 10 मिनट के लिए स्लाइड बनाना ।
      नोट: तैयारी के 5 मिनट के भीतर तेजी से लाल काम समाधान का उपयोग करें, और यह प्रत्यक्ष सूर्य के प्रकाश या यूवी लाइट करने के लिए बेनकाब नहीं है ।
    3. तेज लाल समाधान नहीं कर सकते है और नल के पानी के साथ दो बार स्लाइड कुल्ला । स्लाइड रैक में वापस स्लाइड रखें ।
  6. Counterstaining
    1. आर टी पर 2 मिनट के लिए ५०% गिल के Hematoxylin समाधान के साथ ऊतक वर्गों Counterstain । नल के पानी के साथ स्लाइड धो और इस कई बार दोहराने जब तक स्लाइड स्पष्ट हैं, जबकि वर्गों बैंगनी रह रहे हैं । bluing के लिए ०.०२% अमोनिया पानी में स्लाइड डुबकी (डुबकी 2-3 बार) । अमोनिया के पानी को नल के पानी से बदलें और स्लाइड 3 – 5 बार धो लें ।
  7. स्लाइड बढ़ते
    1. 15 मिनट के लिए या आरटी पर पूरी तरह से शुष्क तक ६० ° c में एक परिचालित हवा ओवन में स्लाइड सूखी । प्लेस 1-प्रत्येक स्लाइड पर बढ़ते रिएजेंट के 2 बूंदें और प्रत्येक अनुभाग पर coverslips जगह है । हवा के बुलबुले के किसी भी फँसाने से बचें । हवा के लिए ंयूनतम 5 मिनट के लिए स्लाइड शुष्क ।
      नोट: तेजी से लाल सब्सट्रेट शराब के प्रति संवेदनशील है । शराब में स्लाइड्स को न करें निर्जला व्रत ।
  8. दृश्य
    1. एक मानक brightfield माइक्रोस्कोप के तहत स्लाइड का निरीक्षण ।

Representative Results

सीटू संकरण परख कार्यप्रवाह में :
कार्यप्रवाह चित्रा 1 में दिखाया गया है और चार भागों के होते हैं: लक्ष्य पुनः प्राप्ति और चिढ़ाना समाधान के साथ कोशिकाओं या ऊतकों के permeabilization, लक्ष्य आरएनए के लिए जांच के संकरण, संकेत प्रवर्धन, और संकेत के दृश्य. संकेत भी डिजिटल इमेजिंग सॉफ्टवेयर सिस्टम या एक अर्द्ध मात्रात्मक तरीके में प्रति सेल डॉट्स की संख्या के आधार पर quantified का उपयोग कर सकते हैं । चित्रा 2 में वर्णित मैनुअल प्रक्रिया भी वाणिज्यिक ऑटो-धुंधला सिस्टम में पूरी तरह से स्वचालित किया गया है ।

प्रतिनिधि एक्सॉन जंक्शन डिटेक्शन के लिए धुंधला (EGFRvIII ब्याह संस्करण): EGFRvIII एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर का एक संस्करण है कि एक में फ्रेम जीनोमिक विलोपन से उठता है exons 2 से 7, constitutively सक्रिय oncogenic संकेतन 7 के लिए अग्रणी . परख FFPE ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) ट्यूमर के नमूनों में EGFRvIII स्थिति की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । सिंगल डबल जेड जांच आदेश में या तो WT, उत्परिवर्ती, या दोनों टेप (आंकड़ा 3ए) का पता लगाने के लिए एक्सॉन जंक्शनों अवधि के लिए डिजाइन किए गए थे । WT EGFR जांच exons 1 और 2 (e1/E2) या exons 7 और 8 (E7/E8) के जंक्शनों तक फैला है, जबकि EGFRvIII-विशिष्ट जांच exons 1 और 8 (e1/E8) का जंक्शन है । एक आम जांच है कि exons 8 और 9 के जंक्शन spans (E8/E9) भी कुल EGFR (दोनों WT और EGFRvIII टेप) का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके बाद सभी जांच में FFPE जीबीएम नमूनों में EGFR की स्थिति का निर्धारण किया गया । चित्रा बी में दर्शाए गए दो प्रतिनिधि उदाहरण बड़े अध्ययन से लिए गए थे । EGFR स्थिति एक स्वतंत्र विधि, आरटी-पीसीआर द्वारा पुष्टि की गई थी । दोनों WT जांच दोनों नमूनों में संकेत का पता चला, संकेत है कि दो नमूने एक्सप्रेस WT EGFR (चित्र बी) । हालांकि, उत्परिवर्ती जांच केवल EGFRvIII + नमूना में संकेत का पता लगाने के लिए, पुष्टि की है कि इस नमूने वास्तव में EGFRvIII संस्करण के लिए सकारात्मक है (चित्र, बाएं पैनलों) दिखाया । इसके विपरीत, उत्परिवर्ती जांच EGFRvIII में संकेत का पता नहीं था-नमूना (चित्र बी, सही पैनलों) । एक साथ लिया, इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि एक्सॉन जंक्शन परख जीबीएम FFPE ट्यूमर के नमूनों में EGFRvIII स्थिति की पहचान कर सकते हैं ।

प्रतिनिधि कम लक्ष्य के लिए धुंधला:
CDR3, या पूरक 3 क्षेत्र का निर्धारण, टी सेल रिसेप्टर्स में एक उच्च चर डोमेन है । सामान्यतया, CDR3 अनुक्रम काफी कम हैं; उदाहरण के लिए, CDR3 α और β अनुक्रम Jurkat टी-सेल लाइन से ५१ और ४८ न्यूक्लियोटाइड लंबाई में हैं, क्रमशः (चित्र 4a) । Jurkat कोशिकाओं में व्यक्त विशिष्ट सीडीआर अनुक्रम की पहचान करने के लिए, antisense जांच CDR3 α और β कि Jurkat टी सेल लाइन में व्यक्त कर रहे हैं के लिए उत्पन्न किया गया था, नब्ज जांच के अलावा CDR3 α और β नकारात्मक नियंत्रण जांच के रूप में सेवा करने के लिए. इसके बाद सभी जांच परख के साथ FFPE-तैयार Jurkat कक्षों में परीक्षण किया गया । मजबूत धुंधला दोनों CDR3 α और Jurkat कोशिकाओं में β के लिए विरोधी भावना जांच के साथ मनाया गया था, जबकि नब्ज जांच कोई संकेत करने के लिए थोड़ा पता चला (चित्रा 4B). इन परिणामों को कम लक्ष्य परख की क्षमता के लिए उच्च चर लेकिन टी के लिए लघु सीडीआर अनुक्रम-सेल रिसेप्टर क्लोन के बीच विचार प्रदर्शन ।

प्रतिनिधि बिंदु उत्परिवर्तन EGFR L858R के लिए धुंधला:
प्वाइंट उत्परिवर्तन जांच एकल न्यूक्लियोटाइड रूपांतरों और छोटे सम्मिलन या विलोपन (INDELs) ट्यूमर संदर्भ में पता लगाने के लिए विकसित किए गए थे । चित्रा 5 प्वाइंट उत्परिवर्तन EGFR L858R (2573T > जी) के सीटू का पता लगाने में के लिए क्षमता को दर्शाता है । दो जांच डिजाइन किए गए थे: एक L858R रूपांतरित EGFR अनुक्रम का पता लगाने के लिए, और एक अंय EGFR L858 WT अनुक्रम का पता लगाने के लिए । दोनों जांच दो FFPE-तैयार सेल लाइनों में परीक्षण किया गया: H2229, जो केवल EGFR L858 WT व्यक्त करता है; और H1975, जो EGFR L858R उत्परिवर्तन के लिए heterozygous है । L858R उत्परिवर्ती जांच में पाया गया सिग्नल केवल H1975 सेल लाइन में नहीं बल्कि H2229 सेल लाइन में है । हालांकि, WT जांच में दोनों सेल लाइनों में सिग्नल का पता लगा । इसी तरह, चित्रा 5B बिंदु उत्परिवर्तन KRAS G12A (३५ जी > सी) के सीटू का पता लगाने में visualizes । दो जांच KRAS G12A मीट्रिक टन और KRAS G12 WT दृश्यों का पता लगाने के लिए डिजाइन किए गए थे और फिर HuT78 सेल लाइन पर परीक्षण किया (जो केवल KRAS G12 WT व्यक्त करता है) और SW116 सेल लाइन (जो heterozygous KRAS उत्परिवर्तन के लिए G12A है) । जबकि KRAS G12 WT जांच में पता लगा कि दोनों सेल लाइनों में सिग्नल लगा हुआ है, KRAS G12A जांच में केवल SW116 सेल लाइन में सिग्नल का पता लगा । एक साथ लिया, इन आंकड़ों के सेल और ऊतक संदर्भ में एकल न्यूक्लियोटाइड बहुरूपताओं का पता लगाने में बिंदु उत्परिवर्तन परख की तकनीकी क्षमता का प्रदर्शन ।

प्रतिनिधि सीटू परख में स्वचालित के लिए धुंधला:
स्वचालित परख नमूनों की अधिक से अधिक संख्या के लिए अनुमति देने के लिए और अधिक मज़बूती से चलाने के लिए, अंतर उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता और समय पर हाथ कम करने और लगातार reproducible परिणाम पैदा । इसलिए, परख के एक स्वचालित संस्करण विकसित किया गया था । इस परख, ब्याह संस्करण METΔ14 का पता लगाने के साथ स्वचालित धुंधला प्रदर्शित करने के लिए जांच की थी । इस संस्करण में 14 एक्सॉन का परिणाम है मिले जीन पूर्व के दौरान छोड़ दिया जा रहा है mRNA ब्याह, जो गठन सक्रियण और मुलाकात रिसेप्टर8,9के oncogenic परिवर्तन की ओर जाता है । विशेष रूप से METΔ14 वैरिएंट का पता लगाने के लिए, दो एक्सॉन जंक्शन जांच डिजाइन किए गए थे: एक कि exons 13 और 15 (E13/E15) के जंक्शन spans METΔ14 संस्करण प्रतिलिपि का पता लगाने के लिए, और एक और है कि exons 14 और 15 (E14/E15) के जंक्शन spans का पता लगाने के लिए मिले WT प्रतिलिपि (चित्रा 6A) । दोनों जांच तो 2 FFPE में परीक्षण किया गया सेल लाइनों तैयार: H596, जो METΔ14 संस्करण एक्सप्रेस, और A549, जो WT जीन से मुलाकात व्यक्त करता है । दोनों जांच पारस्परिक अनंय अभिव्यक्ति पैटर्न दिखाया, E13/E15 जांच केवल H596 कोशिकाओं में संकेत का पता लगाने और E14/E15 जांच केवल A549 कोशिकाओं (आंकड़े घमण्ड और 6C) में संकेत का पता लगाने के साथ । अंत में, dapB के लिए जांच कोई संकेत नहीं दिखाया, कोई पृष्ठभूमि संकेत संकेत (आंकड़े घमण्ड और 6C) । कुल मिलाकर, इस डेटा को स्वचालित BaseScope परख का उपयोग सीटू में मिले वैरिएंट METΔ14 का विशिष्ट पता लगाना दर्शाता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : परख कार्यप्रवाह । कार्यप्रवाह 4 प्रमुख चरणों के होते हैं: brightfield या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप के तहत दृश्य द्वारा आरएनए, संकेत प्रवर्धन, और संकेत का पता लगाने के लिए permeabilize कोशिकाओं या ऊतक, जांच संकरण को लक्षित करने के लिए उपचार । व्यक्तिगत डॉट्स एक डिजिटल छवि विश्लेषण मंच का उपयोग कर quantified जा सकता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : मैनुअल परख प्रोटोकॉल का चित्रण । पूरे परख 9 में पूरा किया जा सकता है एच उपचार बार ऊतक प्रकार के आधार पर भिंन हो सकते हैं, तो यह ऊतक के उपचार की सिफारिशों के लिए उपयोगकर्ता के मैनुअल में परिशिष्ट एक परामर्श की सलाह दी जाती है मशीन समय के बारे में । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : एक्सॉन जंक्शन का पता लगाने के प्रतिनिधि छवियां । () यहां दिखाया गया है EGFR WT और EGFRvIII टेप के लिए एक्सॉन संगठन और डबल जेड एक्सॉन जंक्शन जांच का चित्रण है कि जंक्शन में झीनी EGFR WT या EGFRvIII का पता लगाने के लिए एक योजनाबद्ध । () एक्सॉन जंक्शन परख दो FFPE ग्लियोब्लास्टोमा नमूनों पर (ए), साथ ही एक सकारात्मक नियंत्रण जांच, POLR2A, और नकारात्मक नियंत्रण जांच, dapB में सूचीबद्ध जांच का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : कम लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने के प्रतिनिधि छवियां । (A) यहां दिखाया गया है Jurkat कोशिकाओं में CDR3 अनुक्रम हैं । काले रंग में अनुक्रम एक पार्श्व आम अनुक्रम है और लाल रंग में अनुक्रम या तो CDR3α या CDR3β के लिए अद्वितीय है । सिंगल डबल-जेड शॉर्ट टारगेट सीक्वेंस की जांच इन जुगाड़ के खिलाफ तैयार की गई । () कम लक्ष्य परख Jurkat एक FFPE सेल विरोधी भावना या भावना (एक) में अनुक्रम लक्ष्यीकरण जांच का उपयोग कर गोली के रूप में तैयार की कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया था, और dapB एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : बिंदु उत्परिवर्तन का पता लगाने के प्रतिनिधि छवियां । (एक) परख H2229 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया (homozygous EGFR L858 के लिए) और H1975 कोशिकाओं heterozygous EGFR उत्परिवर्तन के लिए (L858R) एक FFPE सेल गोली के रूप में तैयार एक डबल जेड प्वाइंट उत्परिवर्तन EGFR L858 WT अनुक्रम या EGFR L858R लक्ष्यीकरण जांच का उपयोग कर रहा था रूपांतरित अनुक्रम । () बिंदु उत्परिवर्तन परख HuT78 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया (homozygous KRAS G12A के लिए) और SW116 कोशिकाओं heterozygous KRAS उत्परिवर्तन के लिए (G12A) एक FFPE सेल का उपयोग कर एक डबल जेड प्वाइंट उत्परिवर्तन जांच KRAS G12 WT अनुक्रम को लक्षित करने की गोली के रूप में तैयार किया गया था या KRAS G12A रूपांतरित अनुक्रम । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : एक्सॉन जंक्शन परख के साथ स्वचालित धुंधला के प्रतिनिधि छवियां । () यहां दिखाया गया है WT और METΔ14 टेप के लिए एक्सॉन संगठन है और एक एकल डबल-जेड एक्सॉन जंक्शन जांच कि जंक्शन झीनी को मिले पता लगाने के लिए WT या METΔ14 का चित्रण एक योजनाबद्ध । () और () स्वचालित एक्सॉन जंक्शन परख H596 कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया (METΔ14 व्यक्त) और A549 कोशिकाओं (WT मुलाकात व्यक्त) एक FFPE सेल गोली के रूप में तैयार (ए) में सूचीबद्ध जांच का उपयोग कर, साथ ही साथ नकारात्मक नियंत्रण जांच dapB । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

एक्सॉन जंक्शन लघु अनुक्रम प्वाइंट उत्परिवर्तन
ब्याह वैरिएंट/isoform ५० और ३०० nt के बीच अनुक्रम प्वाइंट उत्परिवर्तन
परिपत्र आरएनए (circRNA) अत्यधिक मुताबिक़ जुगाड़ अल् indel
जीन फ्यूजन TCR क्लोन के लिए CDR3 अनुक्रम जीन संपादन
जीन नॉकआउट (KO) प्री-miRNA
लघु nucleolar आरएनए (snoRNA)
जीन संपादन

तालिका 1: अनुप्रयोग सीटू में परख । इस परख के अनुप्रयोगों के लिए 3 मुख्य श्रेणियां हैं: एक्सॉन जंक्शन, लघु लक्ष्य अनुक्रम, और बिंदु उत्परिवर्तन । प्रत्येक स्तंभ में सूचीबद्ध प्रत्येक श्रेणी के लिए कुछ विशिष्ट अनुप्रयोग उदाहरण हैं ।

Discussion

इस रिपोर्ट में उपन्यास ISH परख प्रोटोकाल और उसके आवेदनों पर विस्तार से चर्चा की गई । परख एक्सॉन जंक्शनों, लघु लक्ष्य और उच्च मुताबिक़ दृश्यों, और ऊतक संदर्भ में बिंदु उत्परिवर्तनों के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता है । परख RNAscope प्रौद्योगिकी5 पर आधारित है और इसलिए एकल अणु का पता लगाने में सक्षम है । हालांकि, एक उंनत प्रवर्धन प्रणाली के कारण, संकेत जांच के साथ पता लगाया जा सकता है के रूप में एक डबल जेड जोड़ी के रूप में छोटे या एक लक्ष्य सिर्फ ५० न्यूक्लियोटाइड की लंबाई टेंपलेट के साथ । क्योंकि जांच एक एकल डबल लंबाई में जेड के रूप में के रूप में कम हो सकता है, यह एक्सॉन जंक्शनों, लघु लक्ष्य और उच्च मुताबिक़ दृश्यों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और बिंदु उत्परिवर्तनों (तालिका 1) ।

परख के सफल प्रदर्शन के लिए, वहां कई तकनीकी सिफारिशें की हैं । सबसे पहले, ऊतकों ताजा 10% तटस्थ में तय किया जाना चाहिए-16 के लिए कमरे के तापमान पर बफर formalin (NBF)-32 एच10। पुनर्निर्धारण (< 16 h) या अधिक से अधिक (> 32 h) परख के प्रदर्शन को ख़राब करेगा और अतिरिक्त अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । दूसरा, तापमान और आर्द्रता, जो मजबूत जांच संकरण और संकेत प्रवर्धन के लिए आवश्यक है के इष्टतम नियंत्रण सुनिश्चित करने के लिए, स्लाइड प्रसंस्करण प्रणाली और संकरण ओवन प्रोटोकॉल कदम के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए २.३ 5 (की जरूरत है, जांच को छेड़ो संकरण, संकेत प्रवर्धन, और संकेत पता लगाने) । तीसरे, अतिरिक्त अवशिष्ट बफ़र्स ठीक से प्रोटोकॉल भर में प्रत्येक कदम से पहले नहीं किया जाना चाहिए (लेकिन इतना नहीं है कि ऊतक वर्गों बाहर सूखी) । यदि स्लाइड्स सूख जाती हैं, तो महत्वपूर्ण गैर-विशिष्ट सिग्नल विकसित होंगे । चौथे, ऊतक के प्रकार पर निर्भर करता है, उपचार अनुकूलन आवश्यक हो सकता है । गलत को छेड़ने या समय की एक इष्टतम लंबाई के लिए प्रदर्शन का उपयोग कर के तहत या अधिक पाचन में परिणाम हो सकता है और नकारात्मक संकेत को प्रभावित करेगा । अंत में, यह हमेशा परीक्षण जांच के साथ सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण चलाने के लिए महत्वपूर्ण है । नकारात्मक नियंत्रण जांच सुनिश्चित करें कि कोई पृष्ठभूमि संकेत है, और सकारात्मक नियंत्रण जांच सुनिश्चित करें कि परख सही ढंग से किया गया है और कि नमूना में आरएनए गुणवत्ता परीक्षण जांच परिणामों की व्याख्या के लिए इष्टतम है । यदि सकारात्मक नियंत्रण जांच के साथ कोई संकेत नहीं है, तो नमूना में आरएनए गुणवत्ता की संभावना इष्टतम है और एक संकेत परीक्षण जांच के साथ नहीं देखा जा सकता है ।

मैनुअल परख के अलावा स्वचालित दाग लगाने वालों पर परख कर प्रदर्शन करने की क्षमता (चित्रा 6) का प्रदर्शन भी किया गया । इस स्वचालित ISH परख एक उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात पैदावार और 1 तालिकामें दिखाया गया है के रूप में एक ही आवेदन के लिए लागू; हालांकि, एक स्वचालित परख के लाभ परख शर्तों के मानकीकरण, अंतर के ंयूनतम उपयोगकर्ता परिवर्तनशीलता और हाथ समय पर, और एक विश्वसनीय तरीके से ऊतक के नमूनों की उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए भत्ता शामिल हैं ।

जबकि immunohistochemistry (आइएचसी) और qRT-पीसीआर ब्याह वेरिएंट का पता लगाने के लिए अनुमति (विशेष रूप से EGFRvIII), FFPE नैदानिक नमूनों में, इन तकनीकों आवश्यक विशिष्टता की कमी है और ब्याह के स्थानिक संकल्प में अंतर्दृष्टि की पेशकश नहीं कर सकते संस्करण अभिव्यक्ति, क्रमशः11,12। इस प्रोटोकॉल में परख का एक महत्वपूर्ण लाभ अपने बेहद संवेदनशील और ब्याह जंक्शनों के विशिष्ट दृश्य है, जबकि रूपात्मक ऊतक संदर्भ के संरक्षण । यहां, परख के लिए ठीक EGFRvIII और METΔ14 सहित कई ब्याह वेरिएंट, के लिए अद्वितीय एक्सॉन जंक्शनों लक्ष्य की क्षमता, (आंकड़े 3 और 6) का प्रदर्शन किया गया । इसके अलावा, परख के ब्याह संस्करण एआर का पता लगाने के लिए दिखाया गया है प्रोस्टेट कैंसर में V7, मस्तिष्क में ErbB4 के कई isoforms, और माउस मस्तिष्क3,13,14में परिपत्र आरएनए Cdr1as की पीटकर की पुष्टि ।

लघु लक्ष्य अनुक्रम का पता लगाने इस ISH परख द्वारा आरएनए दृश्यों के दृश्य के लिए अनुमति देता है के रूप में कम के रूप में ५० न्यूक्लियोटाइड लंबाई में, Jurkat कोशिकाओं से व्युत्पंन CDR3 दृश्यों का पता लगाने के द्वारा प्रदर्शन (चित्रा 3). परख भी जीन दृश्यों कि उच्च अंय परिवार के सदस्यों या प्रजातियों के लिए मुताबिक़ कर रहे है पता लगाने के रूप में Revêchon एट अलद्वारा दिखाया गया है, जो कम लक्ष्य परख इस्तेमाल के लिए मानव progerin का पता लगाने के चमड़े के नीचे सफेद वसा ऊतक में व्यक्त कर सकते है15। इसके अलावा छोटी nucleolar आरएनए (snoRNA), CRISPR-मध्यस्थता जीन एडिटिंग, और कम लक्ष्य की परख के साथ सीटू में प्रणेता-microRNA का पता लगाया जा सकता है । अभी हाल ही में, फू एट अल आइएचसी के साथ इस ISH परख संयुक्त पूर्व miRNA mir125b16व्यक्त रेटिना में सटीक कोशिकाओं की पहचान ।

ट्यूमर में दाखिल उत्परिवर्तन ट्यूमर की प्रगति का अध्ययन करने के लिए और लक्षित चिकित्सा विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । जबकि उत्परिवर्तन profiling उच्च प्रवाह अनुक्रमण के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है, इस प्रौद्योगिकी पूरी तरह से intratumoral विविधता या लिंक सेलुलर आकृति विज्ञान17,18के साथ आनुवंशिक परिवर्तन पता नहीं कर सकते । इस ISH परख का उपयोग कर बिंदु उत्परिवर्तनों का पता लगाने के एक एकल आधार संकल्प पर आरएनए लक्ष्य अनुक्रम के भेद के लिए अनुमति देता है, के रूप में EGFR L858R और KRAS G12A एकल न्यूक्लियोटाइड रूपांतरों का पता लगाने के द्वारा मान्य सेल लाइनों में (चित्रा 5). इसके अलावा, बेकर एट अल । बिंदु उत्परिवर्तन परख इस्तेमाल के लिए BRAF, KRAS में कई उत्परिवर्तनों लक्ष्य, और PIK3CA oncogenes कोलोरेक्टल कैंसर18में । वे पहचान करने के लिए और स्थानिक ट्यूमर कोशिकाओं के दुर्लभ उत्परिवर्ती उपक्लोनों नक्शा, अंततः दिखा कैसे वे अंतर ट्यूमर विविधता में योगदान करने में सक्षम थे ।

संक्षेप में, एक विशेष आरएनए ISH परख विकसित किया गया है । यह पद्धति ब्याह वेरिएंट, लघु दृश्यों का पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और सीटू मेंउत्परिवर्तनों । यह संवेदनशील है, विशिष्ट, quantifiable, और मैनुअल तरीके से और स्वचालित दाग पर दोनों के प्रदर्शन के लिए अनुकूलनीय ।

Disclosures

सभी लेखकों उंनत सेल निदान, Inc द्वारा नियोजित कर रहे है

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HybEZ Oven (110 or 220 VAC) or HybEZ II Oven (110 or 220V) ACD 310010 or 310013 (HybEZ™), 321710 or 321720 (HybEZ™ II)
HybEZ Humidity Control Tray (with lid) ACD 310012
ACD EZ-Batch Slide Rack (20 slide capacity) 1 rack 310017 ACD 310017
HybEZ Humidifying Paper ACD 310015
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen (required)  Vector Laboratory  H-4000
SuperFrost Plus Slides (required)  Fisher Scientific  12-550-15
10% neutral-buffered formalin (NBF)  MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paraffin wax MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microtome MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Gill’s Hematoxylin I  American Master Tech Scientific/MLS  HXGHE1LT MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Xylene  Fisher Scientific/MLS X3P-1GAL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Vertical 24 Slide Rack  American Master Tech Scientific/MLS LWSRA24 MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Staining Dishes  American Master Tech Scientific/MLS LWT4457EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tissue-Tek Clearing Agent Dishes, xylene resistant  American Master Tech Scientific/MLS LWT4456EA MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
100% alcohol (EtOH)  American Master Tech Scientific/MLS ALREACS MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
VectaMount Permanent Mounting Medium (required) Vector Labs  H-5000
Cover Glass, 24 mm x 50 mm Fisher Scientific/MLS  12-545-F MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Ammonium hydroxide, 28–30% Sigma-Aldrich/MLS 320145-500mL MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Carboy (>3L) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Oster Steamer Model 5712, Black and Decker Steamer HS3000, or the Braun Multiquick FS 20 Steamer / /
Digital thermometer MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Water bath or incubator, capable of holding temperature at 40 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Pipettors and tips, 1–1,000 μL MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Distilled water MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Tubes (various sizes) MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Fume hood MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Graduated cylinder MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Parafilm MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Paper towel or absorbent paper MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microcentrifuge MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Microscope and accessories MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Drying oven, capable of holding temperature at 60 +/– 1 °C MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Formaldehyde MLS / MLS Major Laboratory Supplier in North America. For other regions, please check Catalog Numbers with your local lab supplier.
Histogel Fisher Scientific/MLS 22-110-678
BaseScope Reagent Kit - RED Advanced Cell Diagnostics 322900
BaseScope Hs-EGFR-E1E2 Advanced Cell Diagnostics 701701
BaseScope Hs-EGFR-E1E8 Advanced Cell Diagnostics 701711
BaseScope Hs-EGFR-E7E8 Advanced Cell Diagnostics 701721
BaseScope Hs-EGFR-E8E9 Advanced Cell Diagnostics 701731
BaseScope Hs-MET-E14E15 Advanced Cell Diagnostics 701811
BaseScope Hs-MET-E13E15 Advanced Cell Diagnostics 701801
BaseScope Hs-KRAS-G12A Advanced Cell Diagnostics 705491
BaseScope Hs-KRAS-G12-nt35WT Advanced Cell Diagnostics 705531
BaseScope Hs-EGFR-L858R Advanced Cell Diagnostics 705451
BaseScope Hs-EGFR-L858WT Advanced Cell Diagnostics 705461
BaseScope Control Probe Pack Human Advanced Cell Diagnostics 322975

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References

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