Kalibratie-gratis In Vitro kwantificering van eiwit Homo-oligomerisatie met behulp van commerciële instrumentatie en Software van de analyse van de helderheid van gratis, Open Source

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Dit protocol beschrijft een kalibratie-vrije aanpak voor het kwantificeren van eiwit homo-oligomerisatie in vitro op basis van fluctuatiemarges Fluorescentiespectroscopie met behulp van commerciële licht scanning microscopie. De juiste overname-instellingen en de analysemethoden worden weergegeven.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nolan, R., Alvarez, L. A., Griffiths, S. C., Elegheert, J., Siebold, C., Padilla-Parra, S. Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software. J. Vis. Exp. (137), e58157, doi:10.3791/58157 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Aantal en helderheid is een kalibratie-vrije fluorescentie schommelingen spectroscopie (FFS) techniek voor het opsporen van eiwit homo-oligomerisatie. Het kan worden gebruikt met behulp van een conventionele confocal microscoop uitgerust met digitale detectoren. Een protocol voor het gebruik van de techniek in vitro wordt weergegeven door middel van een use-case waar nummer en helderheid te nauwkeurig het kwantificeren van de oligomere Braziliaanse deelstaat mVenus-gelabelde FKBP12F36V voor en na de toevoeging van de dimerizing drug AP20187 kunnen worden gezien. Het belang van het gebruik van de juiste Microscoop verwerving parameters en de juiste gegevens voorbewerken en analysemethoden worden besproken. In het bijzonder wordt het belang van de keuze van photobleaching correctie benadrukt. Deze goedkope methode kan worden gebruikt om te studeren van eiwit-eiwitinteractie in veel biologische contexten.

Introduction

Eiwit-eiwit interacties Ik n Vitro

Traditioneel, zijn kristallografie en nucleaire magnetische resonantie experimenten in combinatie met cryo-elektronenmicroscopie (cryoEM) de technologieën gekozen om te nauwkeurig beschrijven de driedimensionale structuur van eiwitten en hun functie door afleiden onderzoekend hun structurele details in hoge resolutie. Eiwitten, echter zijn niet statisch structuren en een scala aan conformationele wijzigingen en trillingen kunnen ondergaan in tijd en ruimte. Daarom is het structurele informatie uit kristallografische of CryoEM gegevens moet worden aangevuld met andere technieken (bijvoorbeeld moleculaire dynamica simulaties en enkel molecuul technieken): de functie van een eiwit is gerelateerd aan de conformationele wijzigingen en interacties, en deze informatie is niet aanwezig in een statische-structuurdiagram. Om de sonde voor intra moleculaire dynamica, zijn technieken op basis van één molecuul Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) zeer effectief1. Deze benaderingen zijn in staat om te beoordelen van verschillende subpopulaties van moleculen in complexe media. Dit is zeer belangrijk, aangezien deze veranderingen snelle zijn en tijdens de overname van de gegevens (dat wil zeggen, een nanoseconde naar tweede bereik optreden).

Twee van de belangrijkste benaderingen vaak werkzaam zijn voor het detecteren en kwantificeren van deze wijzigingen: eiwitten in oplossing en oppervlakte-immobilisatie. Voor de detectie van Inter moleculaire interacties en in het bijzonder, het proces van dimerisatie geïnduceerd door liganden, is smFRET niet altijd het beste instrument. Inderdaad, FRET niet alleen hangt af van de afstand (≈10 nm) maar ook op de oriëntatie van de twee dipolen (donor en acceptor, χ2) en de overlapping van de emissie van de donor met van de acceptor absorptiespectra2, maar misschien deze laatste voorwaarde is minder mits het Vejle kunt koos belangrijk de juiste FRET paar. Een bijzonder nadeel van smFRET voor het sonderen van homo-dimerisatie komt uit de etikettering van de proteïne van belang: voor hetero smFRET, dimerisatie kan alleen worden gedetecteerd tot 50% (dat wil zeggen, hetero-FRET zullen uitsluitend kundig voor speurder donor-acceptor en acceptor-donor homo-Dimeren maar niet donor-donor of acceptor-acceptor, die de overige 50% van de Dimeren). Het gebruik van fluorescentie correlatie spectroscopie (FCS) en derivaten (FCCS, etc.3) vast te stellen eiwit diffusie constanten en bindende constanten in vitro is een ander alternatief. Deze benaderingen zijn niet kundig voor homo-dimerisatie ofwel volledig te kwantificeren, zoals FCS één maatregelen concentratie en verspreiding, en de straal en diffusie coëfficiënt van een diffusing deeltje zijn zeer slecht afhankelijk van het molecuulgewicht; bijvoorbeeld zal een 10-fold verhoging van het molecuulgewicht alleen impliceren een verandering 2.15 vouwen in de diffusie coëfficiënt4. In het geval van twee kleuren FCS of FCCS, zal slechts 50% van de homo-Dimeren blijken om dezelfde reden als hierboven. De meest praktische en kwantitatieve benaderingen voor het detecteren van homo-dimerisatie in vitro en in vivo zijn homo-FRET5 en nummer en helderheid (N & B)6. Gezien het feit dat homo-FRET vereist specifieke instrumentatie herstel van de anisotropie waarde (bijvoorbeeld optische elementen/analysers om te herstellen van de parallelle en loodrechte polarisatie), N & B wordt gepresenteerd als een gunstige techniek om hier het detecteren van eiwitten homo-dimerisatie en aggregatie. Het kan worden gebruikt zowel in vitro als in vivo met een commerciële set-up.

Aantal en helderheid

N & B is onlangs herziene7. Die herziening gericht op de toepassing van de techniek in levende cellen. Het is de moeite waard om te reproduceren het wiskundig formalisme hier als deze vergelijkingen worden toegepast op de gegevens verzameld in vitro. Eerste plaats is het noodzakelijk om enkele voorwaarden en wiskundige hoeveelheden te definiëren:

  • Een entiteit is een verzameling van moleculen die met elkaar zijn verbonden.
  • De helderheid ε van een entiteit is het aantal fotonen die het stoot per tijdseenheid (per frame).
  • n is het aantal entiteiten aanwezig.
  • Voor een bepaalde pixel in de loop van een beeld-serie is < i > dat zijn gemiddelde intensiteit en σ2 is de afwijking in de intensiteit.

Vervolgens met het foton tellen detectoren en uitgaande mobiele entiteiten en geen achtergrond,

Equation 1
Equation 2

waarbij N staat voor het schijnbare aantal en B is de schijnbare helderheid. Dit resulteert in

Equation 3
Equation 4

Dalal et al. 8 bleek dat met analoge apparatuur, drie correctietermen moet: de S-factor, de verschuivingvan de achtergrond en de uitlezing lawaai σ0-2. Vervolgens, wederom ervan uitgaande dat mobiele entiteiten,

Equation 5
Equation 6

geven

Equation 7
Equation 8

Merk op dat de bovenstaande vergelijking voor verschillende dat gegeven in Dalal et al. 8 en een latere toetsing. 7 in Dalal et al. de S in de noemer als gevolg van een typfout werd weggelaten en deze fout werd gereproduceerd in de review. De bovenstaande vergelijking is de juiste is. Instructies voor het meten van S, offset en σ02 - samen met een verklaring van hun betekenis - worden gegeven door Dalal et al. 8

De helderheid ε is evenredig aan de oligomere staat voor de diffusing entiteiten: ε zullen twee keer zo groot voor Dimeren als voor monomeren, driemaal zo groot voor trimeren als voor monomeren, tweemaal zo groot voor hexamers als voor trimeren, enzovoort. Op deze manier, meten de helderheid ε, kan een het kwantificeren van elk type multimerization.

Als er een mengsel van oligomere Staten aanwezig, nummer en helderheid is niet geschikt voor het herstellen van de individuele oligomere Staten aanwezig. Dit is een beperking van de techniek.

Detrend-algoritme en nandb software

Het belang van het corrigeren van photobleaching geweest eerder benadrukt9. Photobleaching onvermijdelijk optreedt tijdens de lichte microscopie van experimenten in time-lapse modus; zowel in levende cellen en in vitro. Vele benaderingen zijn beschreven in de literatuur om te corrigeren voor het bleken van7. De exponentiële filteringtechniek met automatische keuze van detrending parameter T is de huidige beste. Het is geïntegreerd in de gratis, open source software nandb9. Inderdaad, software die de gebruiker handmatig kiezen hun detrending parameter vereist kan leiden tot onjuiste resultaten omdat deze parameter keuze waarschijnlijk willekeurige en onjuist zullen. De automatische algoritme inspecteert de gegevens en de juiste parameter bepaalt, zonder de noodzaak voor gebruiker interventie9. Zelfs met de beste keuze van smoothing parameter, detrending heeft zijn beperkingen en werkt alleen goed met photobleaching percentages lager is dan 25%, zoals met simulaties9. Interessant is dat bij het gebruik van de automatische detrending routine, de juistheid ervan is zodanig dat men met lage helderheidswaarden werken kan (zelfs B < 1.01), en dus lage intensiteit, en nog steeds nauwkeurig genoeg om het kwantificeren van homo-dimerisatie.

Photobleaching veroorzaakt ook een ander probleem: de aanwezigheid van photobleached fluorophores in een complexe multimer. Dit maakt bijvoorbeeld een trimeer verschijnen als een dimeer wanneer één van de drie units in de trimeer is niet-belichting fluorescerende. Hur en Mueller10 toonde hoe te corrigeren voor dit en deze correctie werd ook benadrukt in een latere herziening7. De software van de nandb bevat deze correctie9.

De FKBP12 F36V systeem

FKBP12F36V is een proteïne die doet natuurlijk niet oligomerize, maar is bekend dat bij de toevoeging van de AP20187 drug (gemeenzaam bekend als de BB dimerizing ligand)11,12dimerize. Dit maakt het een ideale testcase voor nummer en helderheid: met gelabelde FKBP12F36V, een verdubbeling van de oligomere staat moet worden nageleefd bij toevoeging van BB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. FKBP12 F36V - mVenus zuivering

  1. Tover het geluid (DE3) pLysS cellen met pET22b vector met monomerized menselijke FKBP12F36V12 en N-terminal His6 en mVenus tags (vector beschikbaar op aanvraag). De cellen van de plaat op LB agar aangevuld met 50 µg/mL ampicilline en 34 µg/mL chlooramfenicol.
  2. Pipetteer getransformeerde kolonies in 100 mL LB starter cultuur en groeien voor 16-20 uur bij 37 ° C met schudden.
  3. Verdun dichte starter cultuur (OD600 > 1) 1:100 in LB medium (2 x 500 mL partijen) en groeien voor 2-3 uur tot OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
  4. Cool culturen op het ijs. Met 250 µM IPTG veroorzaken en groeien voor 16-20 uur bij 21 ° C, 200 rpm.
  5. Oogsten van cellen door centrifugeren op 2.000 x g gedurende 20 minuten.
  6. Resuspendeer de pellet in 40 mL IMAC buffer (20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazool 3 mM, 1 mM β-mercaptoethanol) aangevuld met EDTA-vrije proteaseinhibitors (1 tablet per cel pellet).
  7. Bewerk ultrasone trillingen ten cellen (500 watt, 20 kHz, 40% amplitude, 9 s op, 11 s uit voor 15 min) op ijs en oogst oplosbaar materiaal door centrifugeren op 20.000 x g.
  8. Overdracht oplosbare lysate over in een erlenmeyer en voeg 2 mL hars (Zie Tabel van materialen). Incubeer gedurende 1 uur met 105 rpm rotatie
    Opmerking: Nikkel sepharose kan ook worden gebruikt voor deze stap van de IMAC.
  9. Oogsten van hars en wassen met 250 mL IMAC buffer A gevolgd door 500 mL IMAC buffer B (imidazol 7 mM, 20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, 1 mM β-mercaptoethanol).
    Opmerking: Oplopen tot 50 mM imidazool als nikkel sepharose hars gebruikt.
  10. Elueer His6-gelabeld eiwit met IMAC buffer C (20 mM natriumfosfaat pH 7.5, 500 mM NaCl, imidazool 300 mM, 1 mM β-mercaptoethanol).
  11. Injecteren op de uitsluiting van een grootte kolom (Zie Tabel van materialen) geëquilibreerd in 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V heeft haar piek elutie bij 87.71 mL op de kolom die we gebruikten.
  12. Beoordelen van zuiverheid via SDS-pagina en zwembad en concentreren zoals vereist.

2. voorbereiding van Multiwell plaat Array

  1. Het gezuiverde FKBP12F36V ontdooien (of het label van de proteïne van belang) van-80 ° C.
  2. Bereiden van een oplossing van 100 nM gezuiverd FKBP12F36V (middellange, 10 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Bewerk ultrasone trillingen ten samen en centrifugeer (snelle spin voor 13.000 rpm) om te voorkomen dat de vorming van aggregaten.
  3. Pipetteer 100-200 µL in een kamer 8 goed observatie met een glazen bodem.
  4. De BB-dimerizer aan de eindconcentraties van 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 en 500 nM12,13toevoegen.
  5. Als referentie, bereid een oplossing van 100 nM van mVenus alleen om te evalueren van potentiële effecten van de globalisatie en neerslag en een helderheidswaarde voor het monomeer met dezelfde overname-instellingen herstellen.

3. kalibratie-gratis Confocal overname

  1. Beginnen met de confocal systeem (Figuur 1). Geen licht scanning microscoop confocal systeem voorzien van digitale detectoren of goed gekarakteriseerd analoge detectoren8, en staat houden een constante Nadruktijd voor elke pixel verworven zou werken.
  2. Het pad van de lichtbundel van de excitatie instellen:
    1. Zet de 514 nm laser en reeks het op 20-100 nW macht bij de uitgang van de doelstelling (voor FKBP12F36V-mVenus).
    2. Selecteer het 63X1.4NA doel of een kraag correctie water onderdompeling doel ontworpen voor FCS.
    3. Zet één HyD, APD of gekalibreerde bet detector. Detectoren staat foton-tellen zijn te verkiezen boven, zoals in dit geval, berekening van S, offset en σ02 zijn overbodig.
    4. Selecteer het venster van de emissie van 520-560 nm
    5. Het gaatje vastgesteldop 1 luchtige eenheid voor de overeenkomstige emissie ~ 545 nm.
    6. De overname-modus instellen op 16 x 16 pixels
    7. De pixel Nadruktijd tijd twonen zo ingesteld dat het voldoet aan tframe >> TD >> twonen, waar D de verblijftijd van de diffusing eiwitten en t is frame wordt de framerate. Dit kwam overeen met het instellen van de nadruktijd op ~ 13 µs.
      Opmerking: Sommige commerciële fabrikanten had scanners die niet constant te de nadruktijd per pixel houden waren. Deze standvastigheid is cruciaal voor de methode om te werken.
    8. De pixelgrootte vastgesteldop ~ 120 nm.
    9. De xyt acquisitie-modus selecteren en selecteer het aantal frames aan te schaffen per acquisitie en goed (bijvoorbeeld 5000).
    10. Als het systeem is uitgerust met high-throughput modus, nemen de coördinaten van elk putje en het aantal overnames per putje om het proces te automatiseren.
      Opmerking: Wees voorzichtig om de aanwezigheid van een water dispenser voor als een streven naar onderdompeling.
    11. Als het systeem is uitgerust met een systeem van perfusie, laden de BB-oplossing en program de perfusie om te beginnen rechts-na het 5000th frame te evalueren van de kinetiek van dimerisatie terwijl bijvoorbeeld 10.000 afbeeldingen ophalen.
  3. Voeg een druppel olie in de olie-immersie-doelstelling / water als met behulp van een kraag correctie water onderdompeling doel ontworpen voor FCS.
  4. Monteer de zaal 8 goed observatie in het werkgebied.
  5. Selecteer de juiste bron en zich richten op de oplossing.
    Opmerking: Belangrijk: voorkomen gericht dicht bij het onderste glas om reflectie en verstrooiing te voorkomen. Bij het scherpstellen dieper in de oplossing, ontkoppel de optie Automatische focus.
  6. Start van de overname en de resulterende stapel afbeeldingen opslaan in TIFF-indeling.

4. detrend en helderheid analyse met behulp van de nandb R Package

  1. Als een pre-processing kwaliteitscontrole, gebruikt u ImageJ14 Neem een kijkje op de beelden en het herstellen van het profiel van de intensiteit, zoals weergegeven in Figuur 2een. Dit is handig om te bepalen al dan niet teveel photobleaching opgetreden. Als er teveel bleken, zijn de gegevens niet geschikt voor verdere analyse.
    Opmerking: ImageJ kan ook bruikbaar om afbeeldingen te converteren naar TIFF van commerciële formaten. De software van de nandb hieronder beschreven kan alleen functioneren met TIFF-bestanden.
  2. Download en installeer R en RStudio15,16. Het is het beste om te downloaden en installeren van R eerst, dan RStudio.
    Opmerking: Wat volgt is een beschrijving van het gebruik van de nandb R-pakket. Kennis van de taal R is niet verplicht te gebruiken nandb, maar het zal het leven makkelijker maken.
  3. Installeer het pakket nandb.
    1. Open RStudio en typ install.packages("nandb") in de console en wacht tot de installatie.
  4. Maak kennis met nandb
    1. Bekijk de handmatige17.
    2. Bekijk de ingebouwde RStudio help voor verschillende functies. De meest waarschijnlijke functie worden gebruikt zal worden met behulp van brightness() zal worden. Het help-bestand voor deze functie weergeven door te typen? Brightness() bij de console.
  5. Berekenen van de helderheid
    1. Men moet zeggen een image-bestand op het bureaublad genaamd img001.tif (merk op dat 'nandb' alleen met de TIFF-bestanden werkt). Men kan de helderheid van dat beeld berekenen:
      b <-helderheid ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Dit wordt de helderheid van de afbeelding toegewezen aan de variabele b in R. De tau = "auto" zorgt ervoor dat de afbeelding voorafgaand aan helderheid berekening correct is detrended. De meest voorkomende ding te doen vanaf hier is het berekenen van het gemiddelde of de mediaan helderheid van de afbeelding. Men kan dit doen door mean(b) of median(b) te typen. Men kan ook de helderheid afbeelding naar de desktop gebruiken schrijven
        ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
    2. Zeggen een map vol afbeeldingen images_folder op het bureaublad heeft en men moet berekenen van de helderheden van deze beelden en de beelden van de helderheid als TIFF-bestanden schrijven. Dan zien? brightness_folder(). Deze functie verwerkt ineens een hele map:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Dit is met name goed voor degenen die hebben een software die zij te R verkiezen, omdat alle bestanden worden verwerkt in één enkele opdracht, en vervolgens een blijven met de output helderheid TIFF-afbeeldingen in hun gekozen software werken kunt, worden het ImageJ14 , Python of iets anders.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detrending en monomeer helderheid

Zodra de gegevens heeft verkregen, kan men beginnen de helderheid berekeningen om te bepalen van de oligomere staat voor de proteïne van belang in de oplossing. Zelfs als het effect van bleken in oplossing mogelijk niet zo drastisch kan als het in vivo, de intensiteit trace zal waarschijnlijk niet nog stationaire bedoel, mogelijk als gevolg van fotofysische effecten aan de fluorophore,18 maar de redenen achter dit gerelateerde worden niet volledig begrepen. Dit heeft een impact bij het berekenen van de helderheid; Als u probeert om de monomeer-dimeer overgangen, is dit aspect van cruciaal belang. Door het toepassen van de automatische detrend algoritme om de gegevensset die wordt getoond in Figuur 2een, de intensiteit trace is goed gecorrigeerd, het verstrekken van een nauwkeurigere waarde voor de helderheid van de FKBP12F36V-mVenus in oplossing. Vóór toevoeging van BB, zonder detrending, B = 1.026, overwegende dat na de detrending, B = 1.005 (Figuur 2b).

Bepaling van FKBP12 F36V -mVenus monomeer-dimeer overgangen in vitro

Sequenties van 20.000 beelden van gezuiverde FKBP12F36V - mVenus in 100 nM oplossing werden verworven zoals opgegeven in de sectie protocol. Na 10.000 frames werden verworven, is de homodimerizer drug BB toegevoegd aan de oplossing terwijl verwerven. Elke opeenvolgende reeks van 5.000 frames werd geanalyseerd (Figuur 3). De gemiddelde helderheid 5 minuten na toevoeging van de BB werd B = 1.010, dat een stijging van het 2-fold is, die een FKBP12F36V-dimeer aangeeft. De kinetiek van het proces wordt weergegeven in Figuur 3, onderb; de vertraging tussen BB toevoeging aan de volledige FKBP12F36V dimerisatie was ongeveer 2 minuten.

Identificatie van eiwit-aggregaten

Een aantal van de eiwit-aggregaten werden ontdekt in een beperkt aantal frames, alsook in de intensiteit trace (Figuur 4). Deze aggregaten van nature in oplossing bij het werken met eiwitten en kan worden opgeheven door sonicating en/of verhogen van de eiwit-verdunning. Men moet echter in sommige biologische problemen, detecteren overgangen tussen monomeren en grote aggregaten. Figuur 4 ziet u een voorbeeld waar een FKBP12F36V eiwit statistische verspreid door het volume van de waarneming (foto's van 16 x 16); voor onze vorige berekeningen die deze gegevens werden weggegooid, echter is een voorbeeld weergegeven in Figuur 4 om te laten zien dat deze aggregaten kunnen worden opgespoord en gekenmerkt met de dezelfde instellingen en aanpak. Op het eerste gezicht, bij de beoordeling van de 5000 beelden, kan men de gemiddelde helderheid herstellen voor FKBP12F36V-mVenus behandeld met BB (B = 1.010). De ruwe helderheid afbeelding bekijkt, kan men duidelijk zien, echter een regio van belang van ongeveer 8 pixels met een hoge waarde van B ≈ 1.080. Deze regio van belang samenvalt met een paar frames op t = 34-37 s waar een FKBP12F36V aggregaat verspreid rond het gebied van de observatie. Het aggregaat niet gebleven in het volume van de waarneming voor lang genoeg om het nauwkeurig bepalen van de grootte.

Figure 1
Figuur 1 . Toepassing van de N & B te detecteren eiwit monomeer-dimeer overgangen in oplossing. (a) vereenvoudigd optische weglengte van een laser scanning microscoop (LSM) uitgerust met een laserbron (vastgesteld op 514 nm in het geval van mVenus met het label eiwitten) (blauwe pijlen) gericht op de doelstelling van een onderdompeling (in ons geval een 63X1.4NA olie) verlichten een 100 nM-oplossing van FKBP12F36V-mVenus de oplossing. De emissie-fluorescentie (groene pijlen) een dichroïde spiegel passeert en is gericht op een bandfilter filter die je het licht emissie reinigt en een gaatje vastgesteldop 1 luchtige eenheid gelegen vlak voor een punt digitale detector staat foton tellen. (b) een confocal volume van verlichting wordt gescand door middel van 16 x 16 pixels één FKBP12F36V-mVenus-moleculen die betreden en verlaten van het Gaussiaanse vorm confocal volume produceren een scala aan schommelingen van de intensiteit van de fluorescentie te verlichten. (c) Image serie verworven na verloop van tijd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 . Automatische detrending is nodig om de nauwkeurige meting van een bevolking van monomeren in oplossing. (a) een stapel van 5000 16 x 16 pixel beelden werd overgenomen, zoals beschreven in de sectie Protocol. De intensiteit van het eerste frame wordt weergegeven samen met het profiel van het gemiddelde time-resolved intensiteit, waaruit blijkt van lange termijn schommelingen die waarschijnlijk gerelateerd aan bleken en andere solvent en/of photophysic effecten. Wat ook de oorzaak voor deze op lange termijn schommelingen, ze invloed op de berekeningen van de helderheid en vandaar vereisen detrending. Zonder automatische detrend, men krijgt B = 1.026, overwegende dat na de automatische detrending, B = 1.005. Ook de helderheid zonder (panelen verliet tweede rij) en met (rechts panelen, tweede rij) glad filteren wordt weergegeven. (b) dezelfde gegevens gepresenteerd (a) was detrended en de resultaten in termen van de intensiteit en de helderheid weergegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3 . In-vitro N & B is in staat om op te lossen van de overgang tussen FKBP12F36V monomeren en Dimeren in real-time. De toevoeging van de dimerizer drug BB resulteerde in een twee-voudige toename in ware helderheid direct na 2 min (vanaf 0,005 naar 0.010 in ware moleculaire helderheid). (a) de intensiteit van het eerste frame wordt weergegeven samen met het profiel van de gemiddelde intensiteit van de detrended afbeelding. De helderheid zonder (panelen verliet tweede rij) en met (rechts panelen, tweede rij) glad filteren wordt weergegeven. (b) betekenen helderheid wordt uitgezet (elke 5000 frames) met behulp van de Epsilon waar moleculaire helderheid. De dimerisatie treedt op 2 minuten na toevoeging van de BB (t = 1 min) op t = 4 min. De ingerichte curve is een sigmoïdale functie om te wijzen op de neiging tot dimerisatie na toevoeging van de dimerizer drug (BB). Foutbalken vertegenwoordigen de standaardfout van de verdeling van de helderheid op elk tijdstip. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4 . In vitro N & B op te lossen van de grootte van eiwit-aggregaten in oplossing. (a) Time-resolved intensiteit detrended traceren voor de verwerving van FKBP12F36V-mVenus staan samen met helderheid afbeeldingen (tweede rij). (b) de trace van time-resolved detrended intensiteit toont een maximum intensiteit die is gemarkeerd met een rode gestippelde cirkel (bovenste linker paneel). Het eerste frame van de intensiteit die overeenkomt met deze bepaalde tijd (t = 34 seconden) wordt getoond en een rode pijl toont een FKBP12F36V-mVenus-aggregaat invoeren van het gebied van verlichting. Een kijkje in de helderheid van de afgevlakte afbeelding toont een regio van belang waarin hoge oligomere Staten en de rest van de afbeelding bevat een mix tussen monomeren en Dimeren met een gemiddelde van B = 1.008. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

N & B is een techniek voor het detecteren van multimerization met behulp van commerciële licht scannen confocal microscopen uitgerust met digitale detectoren. Deze aanpak is heel aantrekkelijk in vergelijking met aanspreekpunt FCS, FCCS en smFRET omdat het gratis kalibratie en de berekening van de helderheid is eenvoudig en concentratie onafhankelijke6. Het is van groot belang, echter om te corrigeren voor bleken en lange termijn intensiteit schommelingen voordat u helderheid berekeningen9; een lichte verhoging van de helderheid als gevolg van verbleking en andere artefacten kan verkeerd worden geïnterpreteerd als een verandering in de oligomere staat (zoals te zien in Figuur 2een) als detrending is verwaarloosd of onjuist uitgevoerd. Het gebruik van de automatische detrend algoritme zorgt voor nauwkeurige helderheid berekeningen.

Het is van belang, om een aantal regels bij het verwerven van de beelden. Eerst moet de verblijftijd van de moleculen in het confocal volume, en dus hun verspreiding voortdurend bekend zijn om de juiste parameters van de confocal systeem; de verblijftijd van de gelabelde moleculen moet zich bevinden tussen de pixel stilstaan tijd en de tijd frame7. Kiezen van het juiste fluorophore is cruciaal. Een heldere en stabiele fluorophore is noodzakelijk voor goede signaal aan lawaai en minimale photobleaching. Laser macht moet worden gehouden om te voorkomen dat bleken relatief laag. Foton graven van 1 of 2 per pixel volstaan. Houden telt laag is ook van cruciaal belang om te voorkomen dat de opeenhoping van de detector. De techniek omgaat met lage foton begrotingen beter dan het copes met bleken. In dit protocol heeft mVenus gewerkt; dat is een relatief lichte fluorophore, vergelijkbaar met eGFP19. Een alternatief is het gebruik van nanoboosters die zich selectief een fluorescente proteïne richten; Dit kunnen veel helderder dan traditionele fluorophores20.

In termen van hardware, digitale foton-tellen detectoren kwantificering gemakkelijker maken, maar N d ' hôtes is mogelijk met analoge detectoren, mits een aantal parameters van de verwerving is hersteld. 8

Hoewel andere benaderingen zoals anisotropie homo-dimerisatie, met de komst van nieuwe software detecteren kan te vereenvoudigen analyse, staat N & B op zichzelf als een toegankelijke aanpak voor het detecteren en kwantificeren eiwitinteractie en oligomerisatie, beide in vitro en in levende cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door de Wellcome Trust 105278/Z/14/2 toekennen R.N. De Wellcome Trust centrum voor menselijke erfelijkheid wordt gefinancierd door Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2. Werk in de groep C.S. wordt ondersteund door het Cancer Research UK (C20724/A14414) en de European Research Council van de Europese Unie Horizon 2020 onderzoek en innovatie programma Grant 647278.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosettaTM (DE3) pLysS cells Novagen 70956-3
Ampicillin Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329824407
Chloramphenicol Sigma Aldrich PubChem Substance ID: 24892250
LB starter culture QIAGEN
LB medium QIAGEN https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329815691
IMAC buffer Medicago 09-1010-10
EDTA-free protease inhibitors  Sigma Aldrich 11873580001
TALON resin Clonetech
Nickel sepharose GE Healthcare
S200 16/60 column GE Healthcare
Glass bottom 8 well observation dish Ibidi 80827

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
  2. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  3. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
  4. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  5. Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
  6. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
  7. Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. (2017).
  8. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
  9. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. (2017).
  10. Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
  11. Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
  12. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
  13. Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
  15. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. (2017).
  16. RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. (2016).
  17. Nolan, R. nandb R package. Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
  18. Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
  19. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  20. Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics