Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne protokollen beskriver en kalibrering-fri tilnærming for å kvantifisere protein homo-oligomerization i vitro basert på fluorescens svingninger spektroskopi med kommersielle lyset skanning mikroskopi. Riktig oppkjøpet innstillingene og analyseteknologi vises.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Nolan, R., Alvarez, L. A., Griffiths, S. C., Elegheert, J., Siebold, C., Padilla-Parra, S. Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software. J. Vis. Exp. (137), e58157, doi:10.3791/58157 (2018).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Antall og lysstyrke er en kalibrering uten fluorescens svingninger spektroskopi (FFS) teknikk for å oppdage protein homo-oligomerization. Det kan anvendes ved hjelp av konvensjonelle AC confocal mikroskop utstyrt med digital detektorer. En protokoll for bruk av teknikken i vitro vises ved hjelp av et brukstilfelle der antall og lysstyrke kan sees å tallfeste nøyaktig oligomeric staten mVenus-merket FKBP12F36V før og etter tilsetning av det dimerizing stoffet AP20187. Betydningen av parameterne riktig mikroskop oppkjøp og de riktige data forbehandling og analyse metodene diskuteres. Spesielt er betydningen av photobleaching korreksjon understreket. Denne rimelige metoden kan brukes til å studere protein-protein interaksjoner i mange biologiske sammenhenger.

Introduction

Protein-protein interaksjoner jeg n Vitro

Tradisjonelt er krystallografi og kjernefysiske magnetisk resonans eksperimenter kombinert med cryo-elektronmikroskop (cryoEM) teknologien valgt å nøyaktig beskrive tredimensjonale arkitekturen av proteiner og utlede sin funksjon av studere deres høy oppløsning strukturelle detaljer. Proteiner, men er ikke statiske strukturer og kan gjennomgå en rekke conformational endringer og vibrasjoner i tid og rom. Derfor strukturelle informasjon fra krystallografisk eller CryoEM data må suppleres med andre teknikker (f.eks molekylære dynamikk simuleringer og ett molekyl teknikker): funksjonen av et protein er knyttet til sin conformational endringer og interaksjoner, og denne informasjonen finnes ikke i en statisk struktur. For å sondere for intra molekylære dynamikk, er teknikker basert på ett molekyl Forster resonans energi overføring (smFRET) svært effektiv1. Disse metodene kan vurdere ulike subpopulasjoner av molekyler i komplekse medier. Dette er svært viktig, som disse endringene er rask og oppstår under oppkjøpet av data (dvs. nanosekund andre utvalg).

To hovedfremgangsmåter er vanligvis brukes til å oppdage og kvantifisere endringene: proteiner i løsningen og overflaten-immobilisering. For påvisning av Inter molekylære interaksjoner og spesielt prosessen med dimerization av ligander, er smFRET ikke alltid det beste verktøyet. Faktisk bånd avhenger ikke bare på avstand (≈10 nm), men også på retningen på de to dipoler (giver og acceptor, χ2) og overlapping av donor utslipp med den acceptor absorpsjon spectra2, men kanskje denne siste tilstand er mindre forutsatt at experimentalist kan valgte viktig rett bånd paret. En særlig ulempe av smFRET for utprøvende homo-dimerization kommer fra merkingen av protein av interesse: for hetero smFRET, dimerization kan bare bli oppdaget opptil 50% (dvs hetero-bånd vil bare kunne oppdage donor-acceptor og Acceptor-giver homo-dimers men ikke giver-donor eller acceptor-acceptor, som er den andre 50% av dimers). Bruk av fluorescens korrelasjon spektroskopi (FCS) og derivater (FCCS, etc.3) å fastslå protein diffusjon konstanter og bindende konstanter i vitro er et annet alternativ. Disse metodene kan ikke fullt kvantifisere homo-dimerization enten, som FCS ett tiltak konsentrasjon og spredning, og radius og diffusion koeffisient av en spre partikkel er veldig dårlig avhengige molekylvekt; for eksempel vil en 10 ganger økning i Molekylvekten bare innebære en 2,15 fold endring i diffusjon koeffisienten4. Ved to farger FCS eller FCCS vises bare 50% av homo-dimers av samme grunn som ovenfor. Den mest praktiske og kvantitative tilnærminger å oppdage homo-dimerization i vitro og vivo er homo-bånd5 og tall og lysstyrke (N & B)6. Gitt faktum at homo-bånd krever bestemte instrumentering utvinning av anisotropy verdi (dvs. optiske elementer/Analysatorer gjenopprette parallelle og vinkelrette polarisering), N & B er presentert her som en gunstig teknikk oppdage protein homo-dimerization og aggregering. Det kan være ansatt i vitro og i vivo med en kommersiell oppsett.

Antall og lysstyrke

N & B er nylig gjennomgått7. At anmeldelsen fokusert på anvendelse av teknikken i live celler. Det er verdt å gjengi matematiske formalisme her som disse ligninger brukes til data samlet i vitro. Først er det nødvendig å definere noen vilkår og matematiske mengder:

  • En enhet er et sett av molekyler som er bundet sammen.
  • Lysstyrke -ε av en enhet er antall fotoner den avgir per enhetstid (per ramme).
  • n er antall enheter finnes.
  • For et gitt bildepunkt i løpet av en bildet serien er < i > dens mener intensitet og σ2 variansen i intensitet.

Så, med foto-telling detektorer og antar mobile enheter og ingen bakgrunn,

Equation 1
Equation 2

der N er klart nummeret og B er tilsynelatende lysstyrke. Dette resulterer i

Equation 3
Equation 4

Dalal et al. 8 viste at med analoge utstyr, må tre korreksjon vilkår: S faktor, bakgrunn forskyvningog avlesning støy σ02. Deretter igjen antar mobile enheter,

Equation 5
Equation 6

gi

Equation 7
Equation 8

Merk at ovenstående ligningen for ulike som gitt i Dalal et al. 8 og en påfølgende gjennomgang. 7 i Dalal et al. S i nevneren ble utelatt på grunn av en skrivefeil, og denne feilen ble reprodusert i anmeldelsen. Formelen ovenfor er riktig. Instruksjoner for å måle S, forskyvning og σ02 - en forklaring av deres betydning - er gitt av Dalal et al. 8

Lysstyrke-ε er proporsjonal i oligomeric delstaten spre enheter: ε vil være dobbelt så stor for dimers som det er for monomerer, tre ganger så stor for trimers som det er for monomerer, dobbelt så stor for hexamers som det er for trimers og så videre. På denne måten, måle lysstyrke-ε kan en kvantifisere alle typer multimerization.

Hvis det er en blanding av oligomeric stater stede, er antall og lysstyrke ikke kan gjenopprette personlige oligomeric statene stede. Dette er en begrensning av teknikken.

Detrend algoritmen og nandb

Viktigheten av å korrigere for photobleaching er blitt understreket tidligere9. Photobleaching uunngåelig oppstår under * lys eksperimenter i time-lapse modus. både levende celler og i vitro. Mange tilnærminger har blitt beskrevet i litteraturen til rette for bleking7. Den eksponentielle filtreringsmetode med automatisk valg av detrending parameteren T er dagens beste. Den er integrert i det fri, åpen kildekode programvare nandb9. Faktisk kan programvare som krever at brukeren manuelt velge sin detrending parameter føre til feil resultater fordi denne parameteren valg vil trolig være vilkårlig og feil. Automatisk algoritmen kontrollerer dataene og angir den riktige parameteren, uten bruker intervensjon9. Selv med den beste utvalg av utjevning parameteren, detrending har sine begrensninger og fungerer bare godt med photobleaching prosent lavere enn 25%, som vist med simuleringer9. Interessant, når du bruker den automatiske detrending rutinen, nøyaktigheten er slik at en kan arbeide med lav lysstyrkeverdier (selv B < 1.01), og dermed lav intensitet, og fremdeles være presise nok å kvantifisere homo-dimerization.

Photobleaching fører også til et annet problem: tilstedeværelsen av photobleached fluorophores i en multimer kompleks. Dette gjør f.eks en trimer vises som en dimer når en av de tre enhetene i trimer er ikke-fluorescerende. Hur og Mueller10 viste hvordan å løse dette og dette korreksjonen var også understreket i en senere gjennomgang7. Nandb programvaren inneholder denne korreksjonen9.

FKBP12 F36V systemet

FKBP12F36V er et protein som ikke naturlig oligomerize men er kjent for å dimerize på tillegg av det AP20187 stoff (også kjent som BB dimerizing ligand)11,12. Dette gjør det en ideell test sak for tall og lysstyrke: med merket FKBP12F36V, en dobling av oligomeric staten bør være observert på tillegg av BB.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. FKBP12 F36V - mVenus rensing

  1. Transformere (DE3) pLysS celler med pET22b vektor inneholder monomerized menneskelige FKBP12F36V12 og N-terminal His6 og mVenus koder (vektor tilgjengelig på forespørsel). Plate celler på LB agar supplert med 50 µg/mL Ampicillin og 34 µg/mL Chloramphenicol.
  2. Overføre transformert kolonier i 100 mL LB startkulturer og vokse i 16-20 timer på 37 ° C med skjelvende.
  3. Fortynne tett startkulturer (OD600 > 1) 1: 100 i LB medium (2 x 500 mL grupper) og vokse i 2-3 timer til OD600 = 0.6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
  4. Kul kulturer på is. Indusere med 250 µM IPTG og vokse i 16-20 timer ved 21 ° C, 200 rpm.
  5. Høste celler med sentrifugering 2000 x g i 20 minutter.
  6. Resuspend pellets i 40 mL IMAC bufferen en (20 mM natrium fosfat pH 7.5 500 mM NaCl, 3 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol) supplert med EDTA-fri proteasehemmere (1 tablett per celle pellet).
  7. Sonicate celler (500 watt, 20 kHz, 40% amplitude, 9 s på, 11 s av 15 min) på is og harvest løselig materiale med sentrifugering 20.000 x g.
  8. Overføre løselig lysate til en konisk kolbe og legge 2 mL av harpiks (se Tabell for materiale). Inkuber i 1 time med 105 rpm-rotasjon
    Merk: Nikkel sepharose kan også brukes for denne IMAC trinn.
  9. Høste harpiks og vask med 250 mL IMAC buffer A etterfulgt av 500 mL IMAC buffer B (20 mM natrium fosfat pH 7.5 500 mM NaCl, 7 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol).
    Merk: Øke til 50 mM imidazole hvis bruker nikkel sepharose harpiks.
  10. Elute His6-merket protein med IMAC buffer C (20 mM natrium fosfat pH 7.5 500 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1 mM β-mercaptoethanol).
  11. Sprøyte på en størrelse utelukkelse kolonne (se Tabell for materiale) equilibrated i 10 mM HEPES pH 7.5 150 mM NaCl, 1 mM DTT. FKBP12F36V har sin topp elueringsrør 87.71 mL på kolonnen vi brukte.
  12. Vurdere renhet via SDS side og basseng og konsentrere som kreves.

2. forberedelse av Multiwell Plate matrise

  1. Tine renset FKBP12F36V (eller merket protein av interesse) fra-80 ° C.
  2. Forberede en løsning av 100 nM renset FKBP12F36V (middels, 10 mM HEPES pH 7.5 150 mM NaCl, 1 mM DTT). Sonicate og sentrifuge (rask spinn av 13.000 rpm) for å hindre dannelsen av aggregater.
  3. Pipetter 100-200 µL i en 8 godt observasjon kammer med glass bunn.
  4. Legge til BB dimerizer siste konsentrasjoner av 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 og 500 nM12,13.
  5. Som henvisning, utarbeide en løsning av 100 nM i mVenus alene å vurdere potensielle aggregering og nedbør effekter og gjenopprette en lysstyrkeverdi for monomer med samme oppkjøpet innstillinger.

3. kalibrering uten AC Confocal oppkjøp

  1. Starte AC confocal systemet (figur 1). Alle lys skanning mikroskop AC confocal systemet utstyrt med digital detektorer eller godt karakterisert analoge detektorer8, og i stand til å holde en konstant holdetiden for hver piksel ervervet ville fungere.
  2. Angi eksitasjon strålen banen:
    1. Slå på 514 nm laser og sett den på 20-100 nW strøm ved utgangen av målet (for FKBP12F36V-mVenus).
    2. Velg 63X1.4NA målet eller en krage rettelsen vann nedsenking målsetting designet for FCS.
    3. Aktivere én HyD, APD eller kalibrert avdrag detektor. Detektorer kan Foton-telling er å foretrekke, som i dette tilfellet, beregning av S, forskyvning og σ02 er unødvendig.
    4. Velg vinduet utslipp fra 520-560 nm
    5. Angi hullet på 1 luftige enhet for den tilsvarende utslipp ~ 545 nm.
    6. Angi kjøp på 16 x 16 piksler
    7. Angi den piksel bor tid tbo slik at det tilfredsstiller tramme >> TD >> tbo, der D er botid spre protein og t ramme er bildefrekvens. Dette tilsvarte sette holdetiden til ~ 13 µs.
      Merk: Noen kommersielle produsenter hadde skannere som ikke var holde holdetiden per piksel konstant. Denne utholdenhet er avgjørende for den å arbeide.
    8. Angi pikselstørrelsen på ~ 120 nm.
    9. Velg xyt vinningen måte og velg antall rammer ervervet per anskaffelse og godt (for eksempel 5000).
    10. Hvis systemet er utstyrt med høy gjennomstrømming modus, innføre koordinatene for hver brønn og antall oppkjøp per brønn for å automatisere prosessen.
      Merk: Pass på å sikre tilstedeværelsen av en vannbeholder for hvis bruker et nedsenking mål.
    11. Hvis systemet er utstyrt med en perfusjonsmåling system, laste BB løsningen og program perfusjon å starte høyre etter 5000th rammen å evaluere the kinetics av dimerization samtidig tilegne seg f.eks 10.000 bilder.
  3. Legg en dråpe olje til nedsenking oljeobjektiv / vann hvis utnytte en krage rettelsen vann nedsenking målsetting designet for FCS.
  4. Montere 8 godt observasjon kammeret i scenen.
  5. Velg riktig brønnen og fokus på løsningen.
    Merk: Viktig: unngå fokusere nær bunnen glasset for å unngå refleksjon og spredning. Når fokus dypere i løsningen, koble alternativet automatisk fokus.
  6. Start oppkjøpet og lagre den resulterende stabelen av bilder i TIFF-format.

4. detrend og lysstyrke analyse ved hjelp av R-pakke nandb

  1. Som forbehandling kvalitetskontroll, bruke ImageJ14 å ta en titt på bildene og gjenopprette intensitet profilen, som vist i figur 2en. Dette er nyttig for å bestemme hvorvidt mye photobleaching oppstod. Hvis det er for mye bleking, er dataene ikke egnet for videre analyse.
    Merk: ImageJ kan også være nyttig å konvertere bilder til TIFF fra kommersielle formater. Nandb programvaren beskrevet nedenfor kan bare arbeide med TIFF-filer.
  2. Dataoverføre og installere R og RStudio15,16. Det er best å laste ned og installere R først, deretter RStudio.
    NOTE Det følgende er en beskrivelse av hvordan du bruker nandb R pakken. Kjennskap til R språket er ikke nødvendig å bruke nandb, men det gjør livet enklere.
  3. Installere nandb pakken.
    1. Åpne RStudio og i konsollen, skriver du inn install.packages("nandb") og vente på installasjonen.
  4. Bli kjent med nandb
    1. Gjennom den manuelle17.
    2. Gjennom den innebygde RStudio hjelpen for ulike funksjoner. Mest sannsynlig funksjon skal brukes vil være bruker vil være brightness(). Se hjelpefilen for denne funksjonen ved å skrive? Brightness() på konsollen.
  5. Beregne lysstyrke
    1. Si en har en bildefil på skrivebordet kalt img001.tif (Merk at "nandb" fungerer bare med TIFF-filer). Man kan beregne lysstyrken i bildet:
      b <-lysstyrke ("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Dette tilordner lysstyrken i bildet variabel b i R. Tau = "auto" sikrer at bildet er riktig detrended før lysstyrke beregning. Den vanligste tingen å gjøre her er å beregne gjennomsnittet eller medianen lysstyrken i bildet. En kan gjøre dette ved å skrive inn mean(b) eller median(b). Man kan også skrive lysstyrke bildet på skrivebordet ved hjelp
        ijtiff::write_tif (b, "~/Desktop/whatever_img_name")
    2. Si har mappe full av bilder images_folder på skrivebordet og man trenger å beregne brightnesses disse bildene og skrive lysstyrke bildene som TIFF-filer. Deretter se? brightness_folder(). Denne funksjonen behandler en hel mappe samtidig:
      brightness_folder ("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Dette er spesielt bra for de som har en programvare de foretrekker å R, fordi alle filene er behandlet i en enkelt kommando, og deretter en kan gå på arbeide med utgang lysstyrke TIFF-bilder i deres valgte programvare, være det ImageJ14 , Python eller noe annet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Detrending og monomerisk lysstyrke

Når dataene er anskaffet, kan man starte lysstyrke beregningene for å fastslå oligomeric staten av protein av interesse i løsningen. Selv om effekten av bleking i løsning ikke kanskje så drastisk som det kan være i vivo, intensitet spor må fremdeles sannsynligvis ikke stillestående gjennomsnittet, sannsynligvis photophysical effekter knyttet til fluorophore,18 men årsakene bak dette er ikke fullt ut forstått. Dette har innvirkning ved lysstyrken; Når prøver å avgjøre monomer-dimer overganger, er dette aspektet avgjørende. Ved å bruke automatiske detrend algoritmen til dataene vises i figur 2enintensitet spor er riktig rettet, gir mer nøyaktige verdier for lysstyrke på FKBP12F36V-mVenus i løsningen. Før addisjon av BB, uten detrending, B = 1.026, mens etter detrending, B = 1.005 (figur 2b).

Fastsettelse av FKBP12 F36V -mVenus monomer-dimer overganger i vitro

Sekvenser av 20.000 bilder av renset FKBP12F36V - mVenus i 100 nM løsning ble kjøpt som angitt i delen protokollen. Etter 10.000 bilder ble anskaffet, ble homodimerizer stoffet BB lagt til løsningen samtidig tilegne seg. Hver påfølgende serie av 5000 rammer ble analysert (Figur 3). Mener lysstyrken 5 minutter etter BB tillegg var B = 1.010, som er en 2-fold økning, som indikerer en FKBP12F36V dimer. The kinetics av prosessen er vist i Figur 3b; forsinkelsen mellom BB tillegg til full FKBP12F36V dimerization var ca 2 minutter.

Identifikasjon av protein aggregater

En rekke protein aggregater oppdaget både i et begrenset antall rammer, og også i intensitet spor (Figur 4). Disse aggregater finnes naturlig i løsningen når du arbeider med proteiner og kan bli eliminert av sonicating og/eller øke protein fortynning. Likevel, i noen biologiske problemer må man oppdage overganger mellom monomerer og store mengder. Figur 4 viser et eksempel der en FKBP12F36V protein samlet diffust gjennom observasjon volumet (bilder 16 x 16); for våre tidligere beregninger disse dataene ble forkastet, men vises et eksempel i Figur 4 å vise at disse aggregater kan oppdages og preget med samme innstillinger og tilnærming. Ved første øyekast, når du vurderer 5000 bildene, kan en gjenopprette gjennomsnittlig lysstyrken for FKBP12F36V-mVenus behandlet med BB (B = 1.010). Viser rå lysstyrke bildet, kan man tydelig se, skjønt, en region av interesse av ca 8 piksler med en høy verdi på B ≈ 1.080. Denne regionen rundt sammenfaller med noen bilder på t = 34-37 s der en FKBP12F36V mengde spredt rundt observasjonen området. Samlet forblir ikke i observasjon volumet for lenge nok til å nøyaktig bestemme størrelsen.

Figure 1
Figur 1 . Anvendelse av N & B til å oppdage protein monomer-dimer overganger i løsningen. (a) forenklet optiske banen til en laserskanning mikroskopet (LSM) utstyrt med laser kilde (satt på 514 nm i mVenus merket proteiner) regissert (blå piler) mot en nedsenkning målsetting (i vårt tilfelle en 63X1.4NA olje) lyser opp en 100 nM løsning av FKBP12F36V-mVenus løsning. Utslipp fluorescens (grønn pil) går gjennom en dichroic speil og er rettet mot et båndpassfilter som renser utslipp lys, og et pinhole satt til 1 luftige enhet ligger rett før en punkt digital detektor kan Foton teller. (b) et AC confocal volum av belysning er skannet gjennom 16 x 16 piksler belyse enkelt FKBP12F36V-mVenus-molekyler som kommer og går Gaussian figur AC confocal volumet produserer en rekke fluorescens intensitet svingninger. (c) Image serien kjøpt over tid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Automatisk detrending er nødvendig å måle innbyggere monomerer i løsningen. (a) en stabel av 5000 16 x 16 piksler bilder ble kjøpt som beskrevet under protokollen. Intensiteten i den første rammen vises sammen med gjennomsnittlig tid-løst intensitet profilen, som viser lang sikt svingninger som kan være knyttet til bleking og andre løsemidler og/eller photophysic effekter. Uansett årsak for disse langsiktige svingninger, de påvirker lysstyrken beregningene og dermed krever detrending. Uten automatiske detrend, får B = 1.026, mens etter automatisk detrending, B = 1.005. Også lysstyrken uten (venstre panel, andre rad) og (rett paneler, andre rad) glatt filtrering vises. (b) de samme dataene presenteres i (a) var detrended og resultatene i form av intensitet og lysstyrke vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 . In vitro N & B er løse overgangen mellom FKBP12F36V monomerer og dimers i sanntid. Tillegg av dimerizer BB resulterte i en to-fold økning i ekte lysstyrke rett etter 2 min (fra 0.005 til 0.010 i sann molekylær lysstyrke). (a) intensiteten i den første rammen vises sammen med mener intensitet profilen detrended bildet. Lysstyrken uten (venstre panel, andre rad) og (rett paneler, andre rad) glatt filtrering vises. (b) mener lysstyrke tegnes (hver 5000 rammer) bruker sann molekylær lysstyrke-ε. Dimerization oppstår 2 minutter etter BB (t = 1 min) på t = 4 min. Montert kurven er en sigmoidal funksjon å understreke tendensen til dimerization etter tillegg av dimerizer (BB). Feilfelt representerer standardfeilen for lysstyrke distribusjonen på hvert punkt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . In vitro N & B for å løse størrelsen på protein mengdefunksjoner i løsningen. (a) tid-løst intensitet detrended spor for kjøp av FKBP12F36V-mVenus vises sammen lysstyrke bilder (andre rad). (b) tid-løst detrended intensitet sporingen viser maksimalt intensitet som er markert med en prikket rød sirkel (øverste venstre panel). Den første intensitet rammen som tilsvarer denne gangen (t = 34 sekunder) vises, og en rød pil viser en FKBP12F36V-mVenus samlet inn området belysning. En nærmere titt inn i myke lysstyrke bildet viser en region av interesse som inneholder høy oligomeric USA og resten av bildet inneholder en blanding mellom monomerer og dimers med et gjennomsnitt på B = 1.008. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

N & B er en teknikk for å oppdage multimerization ved hjelp av kommersielle lys skanning AC confocal mikroskop utstyrt med digital detektorer. Denne tilnærmingen er ganske attraktivt forhold til ett punkt FCS FCCS og smFRET fordi det er kalibrering gratis og lysstyrke beregningen er enkelt og konsentrasjon uavhengig6. Det er av stor betydning, men å korrigere for bleking og langsiktig intensitet svingninger før du utfører lysstyrke beregninger9; en liten økning av lysstyrke på grunn av bleking og andre gjenstander kan feiltolkes som en endring i oligomeric tilstand (som vist i figur 2en) hvis detrending er neglisjert eller utført feil. Bruk av automatisk detrend algoritmen gir nøyaktig lysstyrke beregninger.

Det er viktig å følge en rekke regler da anskaffe bildene. Først bør oppholdstiden molekylene i AC confocal volumet, og derfor deres diffusjon konstant være kjent for å angi riktig parametere av AC confocal systemet; botid på merket molekyler må ligge mellom bildepunktet bor tid og ramme tid7. Velge riktig fluorophore er avgjørende. En lyse og stabile fluorophore er nødvendig for god signal til støy og minimal photobleaching. Laser makt bør holdes relativt lav å unngå bleking. Foton teller på 1 eller 2 per piksel er tilstrekkelig. Holde teller lav er også avgjørende å unngå detektor endte. Teknikken klarer med lav Foton budsjetter bedre enn det klarer med bleking. MVenus har vært ansatt i denne protokollen; som er en relativt lys fluorophore, sammenlignes med eGFP19. Et alternativ er bruk av nanoboosters som selektivt mot et fluorescerende protein; Disse kan være mye lysere enn tradisjonelle fluorophores20.

Når det gjelder maskinvare, digital foto-telling detektorer gjøre kvantifisering enklere, men N & B er mulig med analoge detektorer, forutsatt at en har igjen noen oppkjøpet parametere. 8

Selv om andre tilnærminger som anisotropy kan oppdage homo-dimerization, med bruk av ny programvare for å forenkle analyse, står N & B alene som en tilgjengelig tilnærming til å oppdage og kvantifisere protein interaksjoner og oligomerization, begge i vitro og lever celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet har vært støttet av Wellcome Trust gi 105278/Z/14/2 R.N. Wellcome Trust Centre for Human Genetics er finansiert av Wellcome Trust Core Award 203852/Z/16/2. Arbeid i CS gruppen støttes av kreftforskning Storbritannia (C20724/A14414) og europeiske forskningsråd under EUs horisonten 2020 forskning og innovasjon program Grant 647278.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RosettaTM (DE3) pLysS cells Novagen 70956-3
Ampicillin Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329824407
Chloramphenicol Sigma Aldrich PubChem Substance ID: 24892250
LB starter culture QIAGEN
LB medium QIAGEN https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/head/search/external-link-icon.gif
IPTG Sigma Aldrich PubChem Substance ID 329815691
IMAC buffer Medicago 09-1010-10
EDTA-free protease inhibitors  Sigma Aldrich 11873580001
TALON resin Clonetech
Nickel sepharose GE Healthcare
S200 16/60 column GE Healthcare
Glass bottom 8 well observation dish Ibidi 80827

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Voith von Voithenberg, L., Lamb, D. C. Single pair forster resonance energy transfer: A versatile tool to investigate protein conformational dynamics. BioEssays. 40, (2018).
  2. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Quantitative FRET analysis by fast acquisition time domain FLIM at high spatial resolution in living cells. Biophysical Journal. 95, 2976-2988 (2008).
  3. Padilla-Parra, S., Auduge, N., Coppey-Moisan, M., Tramier, M. Dual-color fluorescence lifetime correlation spectroscopy to quantify protein-protein interactions in live cell. Microscopy Research and Technique. 74, 788-793 (2011).
  4. Muller, J. D., Chen, Y., Gratton, E. Fluorescence correlation spectroscopy. Methods in Enzymology. 361, 69-92 (2003).
  5. Tramier, M., Coppey-Moisan, M. Fluorescence anisotropy imaging microscopy for homo-FRET in living cells. Methods in Cell Biology. 85, 395-414 (2008).
  6. Digman, M. A., Dalal, R., Horwitz, A. F., Gratton, E. Mapping the number of molecules and brightness in the laser scanning microscope. Biophysical Journal. 94, 2320-2332 (2008).
  7. Nolan, R., Iliopoulou, M., Alvarez, L., Padilla-Parra, S. Detecting protein aggregation and interaction in live cells: A guide to number and brightness. Methods. (2017).
  8. Dalal, R. B., Digman, M. A., Horwitz, A. F., Vetri, V., Gratton, E. Determination of particle number and brightness using a laser scanning confocal microscope operating in the analog mode. Microscopy Research and Technique. 71, 69-81 (2008).
  9. Nolan, R., et al. nandb-number and brightness in R with a novel automatic detrending algorithm. Bioinformatics. (2017).
  10. Hur, K. H., et al. Quantitative Measurement of Brightness from Living Cells in the Presence of Photodepletion. PLoS One. 9, (2014).
  11. Amara, J. F., et al. A versatile synthetic dimerizer for the regulation of protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94, 10618-10623 (1997).
  12. Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 10437-10442 (1998).
  13. Rollins, C. T., et al. A ligand-reversible dimerization system for controlling protein-protein interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 7096-7101 (2000).
  14. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Molecular Reproduction and Development. 82, 518-529 (2015).
  15. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Core. (2017).
  16. RStudio: Integrated Development Environment for R. R Team. (2016).
  17. Nolan, R. nandb R package. Available from: https://CRAN.R-project.org/package=nandb (2017).
  18. Jung, G., Wiehler, J., Zumbusch, A. The photophysics of green fluorescent protein: influence of the key amino acids at positions 65, 203, and 222. Biophysical Journal. 88, 1932-1947 (2005).
  19. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2, 905-909 (2005).
  20. Butkevich, A. N., et al. Hydroxylated fluorescent dyes for live-cell labeling: synthesis, spectra and super-resolution STED. Chemistry: A European Journal. 23, 12114-12119 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics