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Utilisant amélioré Fluorescence verte exprimant protéines Escherichia Coli pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris

* These authors contributed equally
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Immunology and Infection

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Summary

Nous présentons ici un protocole pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux de souris aide améliorée fluorescence verte exprimant protéines Escherichia coli.

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Zhang , Y., Wang, G., Lu, J., Xu, L. m., Xiong, J. y. Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis. J. Vis. Exp. (143), e58751, doi:10.3791/58751 (2019).

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Abstract

Ce manuscrit décrit une méthode simple et reproductible pour effectuer un test de la phagocytose. La première partie de cette méthode consiste à construire un vecteur animal-SUMO-EGFP (SUMO = petite ubiquitin-comme modificateur) et exprimant accrue de protéine de fluorescence verte (EGFP) chez Escherichia coli (BL21DE). Exprimant EGFP e. coli est co-incubée avec macrophages pendant 1 h à 37 ° C ; le groupe témoin négatif est incubé sur glace pendant le même laps de temps. Ensuite, les macrophages sont prêts pour évaluation. Les avantages de cette technique sont ses étapes simples et clairs, et phagocytose peut être mesurée par les deux flux cytomètre et fluorescence microscope. Les e. coli exprimant EGFP sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte même après que les macrophages sont fixés avec du paraformaldéhyde. Cette méthode est non seulement approprié pour l’évaluation de lignées de cellules macrophages ou macrophages primaires in vitro mais convient également pour l’évaluation des granulocytes et macrophages phagocytose dans les cellules mononucléaires de sang périphérique. Les résultats montrent que la capacité phagocytaire des macrophages péritonéaux de jeunes souris (huit semaines) est supérieure à celui des macrophages de souris âgées de (16 mois). En résumé, cette méthode mesure phagocytose du macrophage et est adaptée pour l’étude de la fonction du système immunitaire inné.

Introduction

Tests de phagocytose des macrophages sont souvent utilisés pour étudier le système immunitaire inné. La réponse immunitaire innée peut indiquer la susceptibilité à l’infection. Lignées de cellules macrophages sont largement utilisées dans les études d’immunologie. Toutefois, le passage prolongé peut causer la perte de gènes et compromis les fonctions immunitaires dans ces lignées de cellules. Ainsi, les macrophages péritonéaux primaires font l’objet idéal permettant d’étudier la fonction des cellules1.

Bien que la réponse immunitaire innée pensait être intacte dans le corps âgé, la capacité phagocytaire peut diminuer par rapport à que dans le jeune corps2,3. Ici, nous allons démontrer une méthode pour évaluer la phagocytose des macrophages péritonéaux d’young (huit semaines) et les personnes âgées (16 mois) souris aide exprimant EGFP e. coli, qui est pratique, rapide et rentable.

L’utilisation d’une souche exprimant EGFP e. coli est un des avantages de ce test, car ces bactéries sont stables et de visualiser un signal de fluorescence forte, même après que les macrophages sont fixés par la paraformaldéhyde à 4 % (p/v). En outre, en utilisant l' exprimant EGFP e. coli, les chercheurs n’ont pas besoin de coloration plus loin après la phagocytose, qui fait gagner du temps. En outre, les macrophages sont immunoresponsive pour l’antigène de surface d’e. coli , ce e. coli davantage adapté pour le dosage de la phagocytose que d’utiliser les champignons exprimant EGFP ou perles marqué à la fluorescéine.

Avec exprimant EGFP e. coli, un dosage de phagocytose peut être facilement réalisé en 2 h et mesuré par les deux microscopie écoulement cytometry et fluorescence, selon le but du chercheur. Étant donné que cette méthode permet de mesurer directement la capacité phagocytaire, les résultats sont plus reproductibles que d’autres méthodes indirectes.

Cette méthode a également été validée dans une lignée de cellules RAW264.7 et des cellules mononucléaires de sang périphérique humain4. Le texte ci-dessous fournit les instructions détaillées pour la réalisation de cet essai et met en évidence les étapes critiques que les chercheurs peuvent modifier pour répondre aux besoins de leurs expériences.

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Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées en vertu de la National Institutes of Health Guidelines pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et les protocoles ont été approuvées par le Comité emploi de Dalian Medical University et animalier. Seize mois (avec un poids de 30-35 g) et huit semaines (20-25 g) SPF (spécifique-exempts de micro-organismes pathogènes) C57BL/6 des souris mâles ont été obtenues du centre animaux SPF de l’université médicale de Dalian. Toutes les souris étaient gardés dans la stabulation avec accès à la nourriture et l’eau ad libitum. La température a été maintenue entre 20 et 24 ° C, l’humidité était de 40 % - 70 %, et l’éclairage était 12 h lumière/12 h d’obscurité. Les animaux ont été admis à s’acclimater à l’environnement pendant au moins 7 jours avant l’expérience.

1. construction du pET-SUMO-EGFP plasmide et induction de l’expression EGFP

  1. Synthétiser le fragment de gène EGFP (une séquence de bp 717 synthétisé par un service de synthèse de gène personnalisé, voir Table des matières et 1 de fichier supplémentaire pour la séquence) et amplifier le fragment avec l’apprêt avant ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') et amorce de marche arrière (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), à l’aide de polymérase de Taq DNA de haute fidélité.
  2. Pour garantir que les produits de réaction en chaîne (PCR) polymérase adénine porte-à-faux unique de 3' pour le clonage de TA à l’étape suivante, utilisez une extension de 30 min à 72 ° C après le dernier cycle (voir 1 de fichier supplémentaire pour des conditions d’amplification). Vérifier le produit PCR par électrophorèse sur gel d’agarose.
  3. Cloner le produit de la PCR dans le vecteur animal-SUMO (voir Table des matières) à l’aide de la TA clonage méthode5 avec T4 DNA ligase. Incubez la réaction à la température ambiante (20-25 ° C) pendant 30 min. Le vecteur est linéarisé entre nucléotides 653 et 654 avec un 1 bp 5′ T-surplomb sur chaque brin.
  4. Transformer le produit de ligation dans la souche BL21(DE) de e. coli chimiquement compétente comme suit : ajouter 5 µL (100 ng) du produit PCR à 100 µL de cellules capables de BL21(DE) par un choc thermique à 42 ° C pendant 90 s ; garder le mélange sur la glace pendant 3 min et ensuite, ajouter 400 µL de milieu de bouillon (LB) de lysogénie préalablement chauffé à 37 ° C, secouant pendant 1 h à 37 ° C et 120 tr/min.
  5. Ensemencer 100 µL des bactéries sur la surface d’une plaque en LB-kanamycine (100 µg/mL) avec le lactose inducteur (0,5 mmol/L), ce qui donne de la souche d’expression EGFP. Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit.
    Remarque : Si l’EGFP est exprimée avec succès, certaines colonies s’observe comme feu de vert brillant dans l’obscurité.
    1. Vous pouvez sélectionner des colonies pour vérifier le fragment inséré de EGFP par séquençage de l’ADN. Les amorces pour le séquençage de l’ADN sont : vers l’avant, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; inverse, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
  6. Ensemencer une colonie positive dans 5 mL de milieu LB avec 100 kanamycine µg/mL. Incuber dans un 37 ° C, agitation incubateur à 120 tr/min pendant 2 h et ensuite, ajouter le lactose inducteur à une concentration finale de 0,5 mmol/L et continuez à secouer pendant 6 h, induisant expression EGFP. Empiriquement, en agitant pendant 6 h, la densité optique à 600 nm (DO600) peut atteindre 0,7 ou supérieur.
  7. Ajouter 10 µL de milieu de culture bactérien sur une lame, recouvrir d’une lamelle et examiner l’expression de EGFP sous un microscope à fluorescence inversé. Les bactéries exprimant EGFP peuvent être stockés dans le milieu entre 2 et 8 ° C pendant plusieurs semaines.

2. isolement des macrophages péritonéaux et culture primaire de souris

  1. Ajouter 3,5 g de thioglycolate dans 100 mL d’eau distillée et stériliser le mélange à la stérilité avant utilisation. Pomper le milieu thioglycolate dans la seringue stérile 1 mL dans la hotte pour l’injection péritonéale de la souris. Une souris par seringue permet d’éviter l’infection. L’utilisation de thioglycolate peut augmenter le nombre de macrophages. Les macrophages péritonéaux résidents peuvent être isolés sans thioglycolate mais avec bas conduit à macrophage.
  2. Anesthésier la souris à l’aide d’une méthode approuvée par le Comité de l’utilisation et le soin des animaux locaux. Injecter 1 mL de milieu de thioglycolate de 3,5 % dans la cavité péritonéale de la souris avec la seringue de 1 mL, à l’aide d’une aiguille de 23 G.
    Remarque : En induisant l’anesthésie, l’injection péritonéale peut être effectuée facilement et réduit le risque de blessures aux organes internes causées par injection.
  3. Maintenir la souris avec de l’eau et l’alimentation ad libitum pendant 3 jours. Surveiller la prise de poids et de la nourriture des corps de l’animal tous les jours. Si la perte de poids est supérieure à 10 % dans les 3 jours, exclure l’animal de l’expérience.
  4. Après 3 jours, euthanasier la souris par dislocation cervicale après induisant rapidement anesthésie par sévoflurane dans une boîte fermée. Vous pouvez également utiliser une méthode qui a été approuvée par le comité local de soin et l’utilisation d’animaux à euthanasier la souris.
  5. Placez la souris dans un plat (avec un diamètre de 10 cm) avec 75 % d’éthanol à stériliser et transférer rapidement dans la hotte. Placez la souris sur une assiette et la broche de la patte avant à l’Office de fixer la position de la souris.
  6. À l’aide d’une seringue de 5 mL, attachée à un 20 G aiguille, en plaçant le biseau de l’aiguille vers le haut à un angle de 30° à 40°, injecter physiologique 5 mL de froid (4-10 ° C) tamponnée au phosphate (PBS) au bas de l’abdomen dans la cavité péritonéale de la souris, en évitant toute perforation de l’intestin. Si l’intestin (ou tout autre organe) est percé, la souris et ses cellules n’est plus utilisable pour des expériences, comme cela peut activer les cellules qui ne sont pas adaptés pour la culture de cellules primaires.
  7. Effectuer un massage doux sur les deux côtés de l’abdomen de la souris. Ensuite, aspirer le liquide lentement et doucement. Diluer le liquide péritonéal dans un tube à centrifuger 50 mL. Répéter ces étapes 2 x ou 3 x.
  8. Centrifuger les cellules suspendues pendant 10 min à 400 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 à 8 ° C). Jeter le surnageant et resuspendre le culot dans un milieu RPMI 1640 avec 10 % sérum fœtal (SVF). Compter les cellules non vides. Empiriquement, la densité cellulaire est approximativement égale à 5 x 106 cellules/mL quand les cellules sont remises en suspension dans 10 mL de milieu.
  9. Ajouter 5 x 106 cellules dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pour le dosage de cytométrie en flux et 5 x 105 cellules / puits dans une plaque de 24 puits pour un microscope à fluorescence. La culture des cellules à 37 ° C dans une étuve à2 CO 5 % du jour au lendemain. Le milieu de culture peut être actualisé après 3 h pour éliminer les cellules non adhérentes, car la plupart d'entre eux sont des lymphocytes. Les cellules adhérentes sont principalement les macrophages, et elles peuvent adhèrent parfaitement à la plastique de tissu-culture-traitée.

3. dosage de phagocytose macrophage à l’aide de la microscopie à fluorescence

  1. Observer des cellules au microscope lumineux-zone pour évaluer la viabilité des cellules et la densité cellulaire.
  2. Retirer le milieu de culture de la plaque 24 puits. Ajouter 100 µL de milieu de culture frais et 10 µL de la suspension bactérienne (environ 2 x 107 cellules) dans chaque puits comme décrit dans le tableau 1. Incuber pendant 1 heure dans un 37 ° C, 5 % CO2 incubateur.
  3. Laver délicatement 3 x x-5 avec 500 µL de PBS froid / puits pour laver les bactéries noninternalized.
  4. Incuber les cellules avec 4 % de formaldéhyde dans du PBS à température ambiante pendant 30 min.
  5. Laver les cellules fixes 3 x avec du PBS (500 µL/puits).
  6. Ajouter 200 µL de la fluorescence de la phalloïdine 633 teindre conjugué solution de travail (voir Table des matières) pour colorer l’actine-F. Conserver dans un endroit sombre et humide (60-80 %) à température ambiante pendant 60 min. rincer les cellules 3 x avec du PBS (500 µL/puits) pour enlever tout excès phalloïdine. Par coloration de l’actine-F, le cytoplasme peuvent être esquissées et aider à distinguer les bactéries intériorisées.
  7. Ajouter 200 µL de solution de travail DAPI (4', 6-diamidino-2-phénylindole) (1 µg/mL) pour souiller le noyau de la cellule et incuber pendant 5 min dans un endroit sombre et humide à température ambiante. Rincez 1 x avec du PBS (500 µL/puits) et 1 x avec le même volume d’eau distillée. Ensuite, les cellules sera prêts pour l’observation sous un microscope à fluorescence inversé.

4. dosage de phagocytose macrophage utilisant l’écoulement cytometry

  1. Pour minimiser les erreurs expérimentales et faire une interprétation correcte des résultats, définir les groupes et contrôler les tubes pour l’expérience telles qu’énumérées dans le tableau 2.
    1. Pour le groupe témoin, qui sera mis sur la glace (groupe de 4 dans le tableau 2), retirer le support de la plaque de 6 puits et lavez-le 1 x avec du PBS. Ensuite, ajouter 1 mL d’EDTA froid 70 mM dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie de flux. Ajouter 50 µL de la suspension bactérienne dans le tube et placez-le sur la glace pendant 1 h.
    2. Pour les autres groupes, enlevez le milieu de culture. Ajouter 1 mL de milieu frais dans chaque puits. Ajouter 50 µL de la suspension bactérienne dans les puits selon le paramètre de groupe, tel que décrit dans le tableau 2. Ensuite, placez la plaque 6 puits dans les 37 ° C, 5 % CO2 incubateur pendant 1 h.
  2. Pour étancher la fluorescence de la noninternalized e. coli, ajouter 200 µL de solution d’eau de 0,8 % cristal violet (CV) dans le puits et se balancent sous peu, évitant ainsi un résultat faussement positif par la liaison exprimant EGFP e. coli à la surface de la macrophages mais pas intériorisé. Laver les cellules 3 x avec PBS pour enlever n’importe quel CV résiduelle.
  3. Ensuite, ajouter 1 mL d’EDTA froid 70 mM dans le puits pour détacher les cellules et les transférer dans le tube de cytométrie de flux.
  4. Centrifuger les tubes à 400 x g pendant 5 min et éliminer le surnageant.
  5. Ajouter 100 µL de PBS pour remettre en suspension les cellules. Ajouter 5 µL d’anticorps F4/80-PE-conjugué (un antigène de surface exprimé sur les macrophages de souris) dans les tubes ou isotype IgG2a-PE d’usage, selon le paramètre de groupe. Vortex brièvement et incuber les échantillons sur la glace pendant 5-10 min à l’obscurité.
  6. Ajouter 1 mL de PBS dans chaque tube et centrifuger à 400 x g pendant 5 min. éliminer le surnageant. Remettre en suspension les granules cellulaires avec 200 à 300 µL de PBS pour analyse en cytométrie en flux. Exécutez chaque tube et acquisition de données au moins 10 000 événements de cellules F4/80+ .

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Representative Results

Le vecteur de pET-SUMO utilise un modificateur d’ubiquitin-comme petit pour permettre l’expression des protéines natives dans le e. coli. Fusion de SUMO peut considérablement améliorer la solubilité EGFP, lui permettant d’être détecté facilement. Si l’expression EGFP est induite avec succès en lactose, vous peuvent observer des colonies vertes dans l’obscurité (Figure 1 a). Les points verts, qui représentent l' exprimant EGFP e. coli, peuvent être observées sous un microscope à fluorescence à l’aide d’une lentille d’objectif 40 x (Figure 1 b).

Analyse de microscopie montre des images de fluorescence (Figure 1) des macrophages péritonéaux appartenant aux groupes de jeunes et âgés. La figure 1 montre la fluorescence rouge F-actine, la fluorescence verte d’exprimant EGFP e. coli, la fluorescence bleue de la coloration des noyaux au DAPI et l’image fusionnée de tous les trois canaux de fluorescence. Les souris de 16 mois, considérés comme des souris âgées, représentaient des humains âgés de 60 à 65 ans. Ces images donnent à penser que les macrophages des souris jeunes présenté une plus forte capacité de phagocytose que ceux des souris âgées.

Cytométrie en flux (Figure 2) a été utilisé pour quantifier et comparer la phagocytose des macrophages du groupe jeune et âgé. Figure 2 a montre une analyse de cytométrie de flux représentant des jeunes, personnes âgées et des groupes témoins. L’anticorps F4/80-PE a été utilisée pour identifier et porte les macrophages et signaux positifs EGFP indiquent les macrophages qui phagocytés e. coli. La proportion de F4/80+ et cellules EGFP+ indiquent la capacité phagocytaire des macrophages. Le résultat (Figure 2 b) du groupe de jeune a été de 62,7 % ± 5,1 % (moyenne ± SEM), qui a été significativement plus élevée que les 35,2 ± 2,9 % (moyenne ± SEM) du groupe âgé. Ces résultats sont en accord avec la tendance des résultats de la microscopie de fluorescence.

Figure 1
Figure 1 : Exprimant EGFP E. coli et sa phagocytose par les macrophages. (A) colonies exprimant EGFP e. coli . Le plasmide de pET-SUMO-EGFP a été transformé en cellules BL21(DE) ; les bactéries ont été inoculés sur une plaque de LB-kanamycine (100 µg/mL). Une couche de 0,5 lactose mmol/L sur la surface de la plaque LB a été utilisée comme inducteur, ce qui donne l’expression EGFP. Si l’EGFP est exprimée avec succès, les colonies verts jaunâtres sont observés à l’aide de la lumière dans l’obscurité UV. (B) microscopie de Fluorescence d’exprimant EGFP e. coli. Le signal vert représente exprimant EGFP e. coli. Echelle = 50 images de fluorescence multicanal µm. (C) des macrophages qui ont été phagocytants des e. coli. Les cellules sont incubées avec exprimant EGFP e. coli (vert) pendant 1 h, suivie d’un lavage avec du PBS, fixation avec 4 % de paraformaldéhyde et coloration pour l’actine-F à l’aide de la solution de travail conjugué phalloïdine 633 (rouge) et le DAPI (bleu). Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Flow cytometry résultats. (A) analyse de cytométrie de flux représentant des jeunes, personnes âgées et des groupes témoins. Les macrophages péritonéaux ont été colorées avec F4/80-PE après incubation avec exprimant EGFP e. coli. F4/80+ et cellules EGFP+ étaient rares dans le négatif contrôle et contrôle (groupe 4 : groupe de jeune sur la glace) groupes. Les parcelles de cytométrie en flux de jeunes et âgés représentent les groupes 5 et 6, respectivement. (B) les résultats de l’analyse de cytométrie de flux des groupes de jeunes et âgés. Un test de Mann-Whitney a été utilisé pour examiner la différence entre ces deux groupes. La proportion de F4/80+ et cellules EGFP+ dans le groupe de jeune a été significativement plus élevée que dans le groupe d’âge (*P < 0,05). Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne (SEM). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Groupe Nom Cellules EGFP E. coli Temps d’incubation co
1 Young 2 x 10,5 2 x 107 1 h
2 Âgés de 2 x 10,5 2 x 107 1 h

Tableau 1 : groupe de réglage pour la microscopie de fluorescence. Deux groupes, le groupe d’âge (16 mois C57BL/6, n = 3) et le groupe de jeune (âgés de 8 semaines C57BL/6, n = 3), ont été utilisées pour préparer des macrophages péritonéaux. Les macrophages péritonéaux de chacune des souris ont été ajoutés aux différents puits. S’ajoutaient environ 2 x 105 cellules dans un volume de 100 µL à chaque puits ; Ensuite, environ 2 x 107 exprimant EGFP e. coli cellules dans un volume de 10 µL ont été ajoutés à chaque puits et co-incubée pendant 1 h à 37 ° C.

Groupe Nom et état Cellules EGFP F4/80-PE ISOTYPE PE
E. coli
1 Contrôle d’isotype à 37° C 2 x 106 Ajouter 5 μL
2 Contrôle positif PE à 37° C 2 x 106 Ajouter 5 μL
3 Contrôle positif EGFP à 37° C 2 x 106 1 x 108
4 Groupe de jeunes sur la glace 2 x 106 1 x 108 Ajouter 5 μL
5 Groupe de jeunes à 37° C 2 x 106 1 x 108 Ajouter 5 μL
6 Groupe d’âge à 37° C 2 x 106 1 x 108 Ajouter 5 μL

Tableau 2 : paramètre pour cytométrie groupe. Les macrophages péritonéaux primaires des souris jeunes et âgés ont été fixées en six groupes. Groupe 1 a été mis sous contrôle de l’isotype ; groupes 2 et 3 ont été mis sous le seul contrôle positif pour le canal PE ou EGFP, respectivement. Pour s’assurer que la fluorescence intériorisée est spécifique à la phagocytose, group 4 a été incubé sur la glace. La phagocytose est arrêtée sur la glace à cause de la basse température. Le temps d’incubation était de 1 h pour tous les groupes.

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Discussion

Les étapes décrites dans le présent protocole sont assez simples et clairs. Une des étapes essentielles est d’induire l’expression EGFP sur e. coli. Habituellement, lorsqu’un gène d’eucaryotes, comme EGFP, est prévu d’exprimer chez les procaryotes comme e. coli, il y a un risque que la protéine se forment des agrégats inactifs (corps d’inclusion), qui modifie la structure native et l’activité de la protéine. En utilisant le vecteur animal-SUMO et construire le plasmide de pET-SUMO-EGFP, la protéine de fusion EGFP-SUMO exprimé avec succès, et le signal lumineux était assez fort pour être détectée par un microscope à fluorescence et un cytomètre en flux.

L’autre étape critique est d’étancher la fluorescence des bactéries qui n’ont pas intériorisé par les macrophages. Bien que le bleu Trypan a été montré pour étancher la fluorescence de l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-étiqueté, bactéries tuées par la chaleur, il n’a pas fonctionné pour le live d’e. coli. À l’aide d’une solution d’eau de cristal violet 0,8 % peut étancher la plupart de la fluorescence de l' e. coli qui se lient à la surface cellulaire. Certaines études suggèrent que le lavage avec antibiotiques plutôt qu’avec le bleu Trypan peuvent aider pour étancher la fluorescence, mais ce n’était pas efficace pour cette expérience10.

La densité cellulaire peut limiter cette technique. Parce que les cellules se composent d’un mélange de lymphocytes et les macrophages, les macrophages sont généralement plus faible que la densité des cellules calculée à partir du hémocytomètre lorsqu’ils pêchent les cellules de la cavité péritonéale de souris, qui peut aboutir à un nombre insuffisant des cellules pour la cytométrie en flux et la microscopie de fluorescence. Dans le cas de nombre insuffisant des macrophages, des cellules de deux à trois souris au sein du même groupe peuvent mélanger pour le dosage de la phagocytose. Lorsque cette technique est appliquée aux lignées de cellules macrophages, tels que RAW264.7, la perte de cellules peut poser problème, parce que ces cellules sont relativement non adhérentes ; ainsi, les cellules peuvent être perdues au cours de la procédure de nettoyage. Laver doucement ou utiliser des plaques de culture avec des surfaces imprégnées sur la cellule, ce qui peuvent augmenter l’adhérence de la cellule.

Il y a beaucoup d’autres méthodes pour évaluer la capacité de phagocytose. Parmi les méthodes classiques, érythrocytes de poulet ou des cellules mortes colorées ont été utilisés comme marqueurs de la phagocytose. La sensibilité de ces méthodes a été limitée par la variation considérable des résultats. Une autre méthode alternative pour étudier la phagocytose consiste à utiliser des cellules infectées par des bactéries pendant plusieurs heures, puis lyser les cellules avec Triton X-100 et la plaque sur une gélose LB pétri pendant une nuit à 37 ° C. La capacité phagocytaire est déterminée en comptant le nombre de formatrices d’unités (UFC)6. Cette méthode requise tant que 2 jours pour obtenir les données de l’UFC, et la variance des nombres comptés est grande car les lysats cellulaires sont dilués plusieurs fois. Puis, marqué au FITC perles7 ou e. coli ont été introduites pour les dosages de phagocytose8. Parce que ces perles n’avaient pas les antigènes de surface spécifiques, preopsonization supplémentaire était nécessaire pour une absorption optimale. En outre, la méthode d’utilisation de la bactérie marqué FITC risquent d’entraver la phagocytose car la FITC compromise la virulence bactérienne9.

Une autre méthode nouvellement introduite consiste à utiliser des colorants commercialisées, qui sont sensible au pH et réagissent en seulement une fois qu’ils sont à l’intérieur du lysosome acide, ce qui élimine la trempe de l’étape10. Toutefois, le kit commercialisé peut être inabordable. Une fois que la souche exprimant EGFP e. coli est construite, les bactéries sont facilement reproduits et la fluorescence est stable depuis plusieurs semaines, ce qui rend cette méthode simple et économique. Parce que l’EGFP a une forte fluorescence, cette méthode peut également être modifiable à une technique de dosage fluorimétrique haut débit afin d’évaluer la phagocytose des macrophages, qui peut être réalisée dans une plaque à 96 puits opaque11.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

La Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (no 31800046) et la Fondation sciences naturelles de la Province de Liaoning (no 20170540262) prise en charge de ce travail. Ce travail a été accompli dans les laboratoires du centre de recherche scientifique à l’Université deuxième hôpital de Dalian Medical. Les auteurs aimeraient remercier Xiao-Lin Sang pour son aide avec la cytométrie en flux, ainsi Bo Qu et Dong-Chuan Yang pour leur aide dans la production de la vidéo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD FACSCanto II Flow cytometer BD Biosciences -
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody Biolegend Cat101303
Champion pET SUMO Protein Expression system Invitrogen K300-01
Custom Gene Synthesis Service Takara Biotech. -
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) ThermoFisher D1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS Biolegend Cat123110
Leica DMI3000 B  Inverted Microscope Leica Microsystems -
PE Rat IgG2a, κ-isotype control Biolegend Cat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution AAT Bioquest Cat23125
Thioglycollate medium Sigma-Aldrich T9032

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References

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