대기 시간 반전 HIV 전사 및 접합에 에이전트의 체 외 평가에서 높은 처리량

Immunology and Infection

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Summary

에이즈 효율적인 재 활성화의 기능 평가 및 잠재 proviruses의 높은 처리량 프로토콜 설명 이며 HIV 전사에 개입의 영향을 테스트 하 고 접합 하 여 적용 합니다. 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과의 대표적인 결과 제공 됩니다.

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Khoury, G., Purcell, D. F. High Throughput In Vitro Assessment of Latency Reversing Agents on HIV Transcription and Splicing. J. Vis. Exp. (143), e58753, doi:10.3791/58753 (2019).

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Abstract

HIV에 안정적이 고 잠재적인 바이러스, 면역 체계에 보이지 않는 유지 하 고 현재 항 레트로 바이러스 치료 (장바구니)에 의해 타겟이 되지 형태의 항구 셀의 저수지의 존재 때문에 불 치이 남아 있다. 전사 및 접합 CD4 + T 세포 휴식에서 HIV-1 대기 시간을 강화 하기 위해 표시 되었습니다. 대기 시간 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) "충격 및 죽이기" 접근의 사용에 의해의 반전이이 저수지를 제거 하기 위해에서 광범위 하 게 공부 하고있다 하지만 있다 지금까지 표시 되지 않습니다의 적절 한 개발의 부족으로 인해 임상 시험에 있는 성공 분자가이 저수지를 교란 효율적으로 수 있습니다. 여기에 제시 된 프로토콜에는 안정적이 고 효율적으로 HIV 전사에 대기 시간 반전 에이전트 (LRAs) 평가 및 접합 방법을 제공 한다. 이 방법은 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 동시에 전사 및 접합에 아이라의 효과 측정할 수 있는의 사용 cytometry에 의해을 기반으로 합니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 부착 셀에에서 셀에 대 한 적절 한입니다. 그것은 높은 처리량의 시스템에서 약물의 많은 수를 테스트 하기 위한 유용 합니다. 메서드는 기술적으로 구현 하는 간단 하 고 비용 효율적인. 또한, cytometry 사용 세포 생존 능력의 평가 허용 하 고 따라서 동시에 독성 약물.

Introduction

효과적인 장기 투여 요법에도 불구 하 고 HIV 메모리 CD4 + T 세포1에 통합된 provirus로 숨겨진 상태로 유지 됩니다. 에이즈-1 5의 염색 질 구조 ' 긴 단말기 반복 (LTR) 발기인 및 히스톤 메 틸 화 등 DNA methyltransferases (DNMT) 및 히스톤 deacetylases (HDAC) deacetylation 후 성적인 수정은에 지도 하는 중요 한 메커니즘 transcriptional 억제 하며 따라서 사후 통합 대기 시간2,3 대기 시간 역전 에이전트 (LRAs)의 큰 다양 한 생체 외에서 바이러스 생산을 유도 하기 위해 그들의 효 험에 대 한 조사 및에서 vivo에서 latently 감염 휴식 CD4 + T 세포4,,56,7 ,8. LRAs 중 테스트, HDACi (HDAC 저 해제)와 내기 bromodomain 억제제 (베티스) 유도 chromatin decondensation 및 긍정적인 녹음 방송 신장 요인 b (P-TEFb)의 출시 각각,는 transcriptional의 완화 후속으로 이어지는 5' LTR 억압 고 에이즈 식9,10,11,,1213의 활성화. 그러나 Ex vivo14,15셀 관련 unspliced HIV mRNA (미국 RNA), 바이러스 성 전사의 지표에 겸손 한 증가 관찰 했다, 이러한 LRAs 여 재 활성화의 크기 제한 되었다. 중요 한 것은, 이러한 LRAs latently 감염 된 세포의 주파수에 있는 감소를 유도 하지 못했습니다.

에이즈 식 비효율적인 접합16 곱하기 접합된 HIV RNA (MS RNA)17의 핵 수출에서 결함에 의해 더 제한 될 수 있습니다. 따라서, 식별 새로운 유형의 LRAs 더 강력한 바이러스 생산 후 통합의 영향을 미칠 수 필요 합니다. 또한, 대기 시간을 효율적으로 반대로 최적의 화합물을 정의 하는 데 도움이 소설 분석 실험의 개발이 필요 합니다.

여기, 프로토콜 제공 됩니다, 에이즈 LTR 기반 전사 및 접합에 개입의 영향의 기능 평가 위한 높은 처리량 접근 활용. 간단 하 게, 새로운 LTR 기반 듀얼 컬러 기자 시스템 pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (그림 1) cytometry HIV 재 활성화를 평가 하기 위해 사용 됩니다. 이 형광 기자에서 unspliced HIV mRNA (4 kb)의 식 접합된 mRNA (2 kb)의 표현 Discosoma sp. 레드 (DsRed) 형광 단백질 표정으로 이어질 것 이라고 하는 동안 향상 된 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식에 지도 한다. 간단히, 형광 환경을 EGFP 융해 단백질, gp140unc를 사용 했습니다. EGFP, EGFP의 코딩 시퀀스 봉투 (Env) 유엔 쪼개진 고 잘린 형태의 프레임에 배치 했다 Ablate 분열 사이트에 gp120 그리고 gp41 EGFP 환경의 분리를 방지 하 고 올바른 접는 용이 하 게 하는 수용 성 환경을 아날로그 만드는 막 횡단 도메인 이전 gp160 단백질 자를 변경 도입 된 및 EGFP의 표현입니다. 셀 내에서 식에 따라 계 그것 4 kb 환경 을의 핵-세포질 수출을 중재 하는 핵에 localizes mRNA (RRE) 계 반응 요소와 상호 작용을 통해. Env의 잘림 gp120 그리고 gp41, A7 3' 스플라이스 사이트 사이 RRE 타협 하지 않습니다. 이 시스템에 V-1에 접합 기증자 4 (SD4)를 결합 하 고 acceptor 7 (SA7) 2 kb의 생산에 결과 mRNA 아미노산 38에서 잘린 기능 비 계 단백질 인코딩 융합 DsRed 형광 단백질, RevΔ38-DsRed. 간단히, DsRed 중첩 확장18아미노산 38에 레 브의 2nd exon에 삽입 되었다. Unspliced mRNA의 핵 수출을 촉진 하기 위하여 포유류 표정 벡터 계 (pCMV-레 브NL4.3) 인코딩 형광 기자 구조 (그림 2)와 페 공동 했다. 여기에 설명 된이 독특한 기자 구문 HIV 전사 및 접합, 바이러스 성 벡터를 사용 하지 않고도 높은 처리량 평가에 유용 합니다.

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Protocol

참고: 복제에 대 한 절차, 변환 및 시퀀싱은 다른18,19논의. 본 프로토콜 transfection 포유류 식 벡터 (그림 3)에서 시작합니다.

1. 듀얼 컬러 기자와 HEK293T 세포의 transfection 구성

  1. Dulbecco의 수정된이 글의 중간 (DMEM) 10% (v/v) 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 페니실린 (100 U/mL)와 스 (100 μ g/mL) 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 보충에 HEK293T 세포 배양 녹고, 후 2-3 회 transfection에 그들을 사용 하기 전에 통행 HEK293T 세포 실험. 이 녹고 절차에서 회복 하기 위해 세포 시간을 줄 것 이다.
    주의: Mycoplasma 세포 배양의 오염 심각한 문제가 남아 있습니다. 좋은 실험실 연습 및 세포 배양의 일상적인 테스트 mycoplasma 오염의 위험을 감소 하 고 유포20방지에 필수적입니다.
  2. 뿌리기 전에 1:2 1 일 셀을 분할 하 고 신선한 DMEM 매체에 그들을 전송. 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에서 24 h에 대 한 셀을 육성
  3. Transfection, 전날 포부에 의해 플라스 크에서 매체를 제거 하 고 혈 청의 흔적을 제거 하려면 Dulbecco의 인산 염 버퍼 (DPBS) 염 칼슘 (캘리포니아2 +), 마그네슘 (마그네슘2 +)의 무료 셀을 세척.
  4. 문화 그릇에 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 5 mL을 분배 하 고 2 ~ 5 분 5% CO2 배양 기에서 37 ° C에서 그것을 배치.
  5. 세포를 분리 하는 때 더 세포를 손상 시킬 수 있는 트립 신 활동을 억제 하기 위해 10% (v/v) FBS 보충 DMEM의 5 mL을 추가 합니다.
  6. 부드럽게 아래로 풀 헤어 셀 정지를 pipetting으로 resuspend.
  7. Trypan 푸른 얼룩 (0.4%)에 셀 1시 10분 희석.
  8. 할을 차지 하지 trypan 블루 현미경 (10 x 목표)는 haemocytometer을 사용 하 여 라이브 셀을 계산 합니다.
  9. 세포 수의 평균 10000 곱한 여 밀리 리터 당 가능한 셀의 수를 계산 하 고 얼룩 trypan 블루에서 희석 비율 (1:10).
  10. DMEM 매체 10% 보충의 100 μ 2 × 104 셀 접시 바닥이-96-잘 빠진 접시 24 h에 대 한 항생제 없이 FBS.
  11. 각 잘 희석 400 pLTR.gp140/EGFP의 ng. RevD38/DsRed, 20 pCMV 계NL4.3 및 100의 ng pCMV Tat101AD8의 ng-혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 플래그 DNA. 부드럽게 혼합. 일치 빈 문신 벡터 pcDNA3.1 (-)을 사용 하 여 문신 없이 실험에 대 한 있습니다.
    참고: 내 무료 DNA의 사용이 좋습니다. 그것을 위해 내 무료 DNA midi 또는 maxiprep 핵 산 정화 키트를 사용 하 여 준비 합니다. 1.7와 1.9 사이 여야 260/280 세 비율을 측정 하 여 DNA의 순도 결정 합니다.
  12. 부드럽게 사용 하기 전에, 지질 시 약을 혼합 한 다음 희석 혈 청 자유로운 매체의 50 μ에 0.65 μ. 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 5 분 동안 품 어.
  13. 희석된 지질 시 약 희석된 DNA 결합 되어 있습니다.
  14. 부드럽게 혼합 하 고 실 온에서 20 분 동안 품 어. 솔루션은 흐린 나타날 수 있습니다.
    참고: 1.15 단계를 진행 합니다. 30 분 이내
  15. 100 μ 셀 위에 drop-wise 지질 시 DNA 복합물의 당 분배.
  16. 접시와 락으로 부드럽게 혼합.
  17. 5 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어
    1. 각 반응 혼합은 단일 잘 (96-잘) transfection에 대 한 충분 합니다. 조정 금액 및 약물 및 테스트, 조합 수에 따라 부품의 볼륨 및 pipetting 변형에 대 한 계정. 모든 조건 일반적으로 triplicates에서 테스트 합니다.
    2. 100 추가 우물 transfect CMV 구동 EGFP와 DsRed 익스프레스 DNA 플라스 미드 보상 목적의 ng.

2. Transfected HEK293T의 치료 대기 시간 반전 하는 에이전트와 세포

참고: 각 분석 결과 이전 셀 확산 분석 결과와 약물의 높은 복용량에 노출 된 후 세포의 생존 능력을 측정 하 여 각 아이라의 생리 상태를 결정 합니다.

  1. 각 아이라 성장 매체와 적절 한 작동 농도를 희석 (예:, JQ1(+))에 대 한 1 μ M.
    주의: 10 m m의 농도를 적절 한 용 매로 동결 건조 된 약 reconstitute 동결-해 동 주기를 반복된을 피하기 위해-80 ° C에서 모든 재고 LRAs 단일 사용 약 수 (각 5 μ)에 저장 합니다.
  2. 신중 하 게 transfection 매체는 멀티 채널으로 발음 하 고 적절 한 아이라 (표 1)를 포함 하는 100 μ 중간으로 바꿉니다. 매체 문화 플레이트 표면에서 쉽게 분리 알려져 있습니다 transfected HEK293T 셀을 분리 하지 않으려면 우물의 벽 함께 매우 부드럽게를 추가 합니다.
  3. 48 h 5% CO2 습도 인큐베이터에서 37 ° c.에 대 한 접시를 품 어

3. 교류 Cytometry 분석에 대 한 고칠 수 생존 염료와 Transfected 세포의 얼룩

주의: 죽은 세포와 파편 제거 가양성을 제거 하 고 최고 품질의 결과 얻기 위해 필수적 이다.

  1. 잘 당 고 부드럽게 pipetting 위아래 (~ 5 번)는 다중 채널와 미디어의 볼만 피하 면 서 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)의 100 μ를 사용 하 여 미디어에 셀을 분리 합니다. 필요한 경우, 트립 신-EDTA 용액 (0.05%-PBS에서 10 m m)의 당 35 µ L를 사용 하 여 혈 청을 포함 하는 매체와 중화 전에 37 ° C에서 5 분을 배양 접시에서 세포를 분리 합니다.
  2. 96-잘 V-하단 플레이트에 셀을 전송 합니다.
  3. 4 ° C에서 500 x g 에 5 분에 대 한 셀을 회전 다음 셀을 건드리지 않고 매체/PBS를 신중 하 게 발음 합니다.
  4. 워시 세포 단백질/혈 청 무료 PBS의 200 μ와 적어도 1 시간.
  5. 4 ° C에서 5 분 동안 500 x g 에서 centrifuge 다음는 상쾌한 접시를 기울이기 및 셀을 건드리지 않고 워시 버퍼를 제거 하 여 삭제 합니다.
  6. 단백질/혈 청 무료 PBS에 생존 염료 1:1000를 diluting 하 여 고칠 수 생존 염료의 작업 솔루션을 준비 합니다. 잘 당 희석된 얼룩의 50 µ L를 준비 합니다.
    참고: 생존 염료 파란색, 빨간색, 보라색 레이저와 함께 사용 하기 위해 적합 한 색상의 범위에서 사용할 수 있습니다. Resuspending 50 μ 무수 DMSO (구성 요소 B)으로 동결 건조 된 염료 (구성 요소 A)의 한 유리병으로 고칠 수 생존 염료의 재고 솔루션을 준비 합니다. 단일 사용 하는 aliquot (1 μ 각),-20 ° C에 게는 빛 으로부터 보호.
  7. 각 잘을 희석된 가능성 염료의 50 μ를 추가 하 고는 멀티 채널을 위아래로 pipetting으로 세포를 혼합.
  8. 얼룩 빛 으로부터 보호 4 ° C에서 10-15 분.
  9. 워시 버퍼 (1% 소 혈 청 알 부 민 및 2 mM EDTA와 PBS)의 150 μ 1-2 번 씻어.
  10. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
  11. 어둠 속에서 4 ° C에서 10-15 분에 대 한 워시 버퍼에서 갓된 1% 포름알데히드의 100 μ와 셀을 수정 합니다.
    주의: 포름알데히드는 매우 독성이 있다. 피하기 위해 장갑과 보호를 위한 안전 유리를 착용 하는 동안 흡입 증기 두건에서 1% 포름알데히드 솔루션을 준비 합니다.
  12. 워시 워시 버퍼의 100 μ로 1-2 번 셀.
  13. 4 ° c.에서 5 분 동안 500 x g 에서 원심 분리기 폐기는 상쾌한.
  14. 워시 버퍼의 70 μ에 셀 펠 릿을 resuspend.
    참고: 프로토콜 여기 일시 중지 될 수 있습니다. 고정된 셀 흐름 cytometer에 다음날 분석을 위해 어둠 속에서 4 ° C에서 저장 될 수 있습니다.

4. EGFP 및 DsRed Cytometry 및 데이터 분석에 의해 측정

참고: 교류 cytometer에 HIV 전사 (%EGFP) 및 접합 (DsRed %)를 분석 합니다. 70 μ m 세포-스 트레이너 또는 100 μ m 나일론 메쉬 노즐 막힘 방지를 실행 하기 전에 샘플을 필터링 합니다.

  1. 적어도 cytometer 및 컴퓨터를 시작 10 분 전에 워밍업 레이저를 사용 하 여.
  2. 샘플을 실행 하 고 데이터 수집을 시작, 이전에 칼 집 탱크 0.9% 식 염 수 솔루션와 염소 태블릿 폐기물 탱크에 추가 되도록.
  3. 기포의 흐름 셀을 확인 합니다.
  4. 탐지기와 필터는 실험에 대 한 적절 한 확인 합니다.
    참고: EGFP, 블루 레이저의 사용 (488 nm) 및 530/30 대역, DsRed 익스프레스 최적으로 노란 레이저를 사용 하 여 검색 하는 동안 (561 nm) 및 610/20 대역. 블루 레이저 (488 nm) 610/20 대역 또한 DsRed 식 검색을 사용할 수 있습니다.
  5. Cytometer 성능 및 감도 감지기에 걸쳐 교정 비즈를 실행 하 여 확인 합니다.
  6. 앞으로 조정 (FSC-A) 및 측면 (SSC-A) 분산형 전압으로는 주요 인구 화면 샘플 및 명확 하 게 뚜렷한 흠 없는.
    참고: FSC (앞으로 흩어져 빛)은 빛의 측정 SSC (측면-흩어져 빛) 동안 셀 셀 면적 (크기)의 볼륨에 따라 평면 각도에서 회절은 비례 하는 직각에 광 회절 측정 셀 단위 그리고 내부 복잡성입니다.
  7. 인구의 EGFP + DsRed 발견자와 반대로 최소 좀 보장 단일 스테인드 샘플을 사용 하 여 수동 또는 자동 보정을 수행 합니다.
    주의: 보상으로 각 셀 단독으로 고칠 수 생존 염료와 스테인드 뿐만 아니라 단 하나 색깔 형광 성 단백질을 표현 하는 세포의 샘플을 사용 합니다. FITC와 PE 보상 구슬 EGFP 및 DsRed 형광 단백질 보상 다른 스펙트럼 특성 때문에 사용 하지 마십시오. 보상 제어 충분히 밝은 긍정적이 고 부정적인 인구를 해결 해야 합니다.
  8. 플롯 만들고 게이츠 형광 마이너스 1 (FMO) 컨트롤을 사용 하 여 설정 합니다.
  9. 취득 하 고 샘플 당 10000 가능한 셀 이벤트의 최소. 남자 통과 레이저 요격을 피하기 위해 중간 또는 낮은 속도로 샘플을 실행 합니다. 펄스 형상 게이팅 같은 사용 SSC-A SSC-H 남자 제거 대. 안정성 확인 SSC-A 대 시간을 그려서 실행의 어떻게 볼 흐름은 실행 하는 동안.
  10. 실행의 끝에, 집중된 청소 에이전트와 교류 cytometry 응용 청소 다음 5 분 동안 물.
  11. 셧다운 시스템, 폐기물을 폐기 하 고 다시 취득 후 칼 집 탱크를 채우기.
  12. 교류 cytometry 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 데이터를 분석 합니다. 세포 파편과 덩어리 (남자) 앞으로 옆 분산형 기반 제외 다음 생존 색소 얼룩을 사용 하 여 죽은 세포를 제거 (부정 인구 라이브 셀에 =). 접합된 제품 DsRed의 비율 뿐만 아니라 EGFP와 DsRed (그림 4), 셀을 식별 /(DsRed + EGFP) (그림 5).
  13. HIV 전사 및 치료 세포와 개인 또는 LRAs (그림 5)의 조합에 노출 하는 셀을 비교 하 여 접합에 아이라의 효과 결정 합니다.

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Representative Results

에이즈-1의 표현 (EGFP) unspliced 및 bromodomain 억제제 JQ1와 치료 다음과 (DsRed) 제품을 접합에 대 한 대표적인 결과 그림 5 에 나와 있습니다. JQ1(+)와 문신 크게 EGFP 표현 세포의 비율 증가 (2.18 및 4.13 FC DMSO에 각각; n = 3) unspliced 성적 지표. 또한, JQ1(+) 크게 접합된 제품 (7.37 FC DMSO에) 문신으로 비슷한 레벨의 비율 뿐만 아니라 DsRed (46.6 FC DMSO에)를 표현 하는 세포의 백분율을 증가 (59.6 및 5.83 FC DMSO, 이상 각각) JQ1(+)의 능력을 확인 HIV 전사 및 접합 설정 하려면 다른 한편으로, stereoisomer 제어 JQ1(-)와 치료 곧 에이즈 전송 및 프로토콜의 성공을 확인 접합에 JQ1(+) 효과.

최근 간행물에서 우리는 RNA 분석 에이즈의 축적 접합 JQ1(+) 치료21다음 성적표에 의해 나타났습니다. 사실, 우리의 데이터가 모델 JQ1(+)와 치료 다음과 EGFP 및 DsRed 단백질 표정에 의해 미러 했다 unspliced 및 접합 성적 수준에 일관 된 변화를 밝혔다. 이 결과 EGFP 및 DsRed 세포 표현 반영 HIV 전사 및 접합을 유도 하는 bromodomain 억제 물 JQ1(+)의 기능을 나타냅니다.

요약 하자면, 우리는 pLTR.gp140/EGFP 사용 하 여 유효성 검사. 에이즈-1 전사 및 접합에 LRAs의 효과의 평가 대 한 높은 처리량 설정에서 RevΔ38/DsRed 기자. 아이라 또는 증가 독성의 최적의 금액 스커드 결과 발생할 수 있습니다. 세포 생존 능력을 유지 하면서 사용 하는 약물의 양을 최적화 결과의 정확도 높일 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 대기 시간 반전 LTR 기반 전사에 에이전트와 접합의 효과 결정 하는 데 사용 하는 모델의 도식. LTR 구문 표현 중 unspliced 봉투 (Env) 단백질을 융합 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 강화 또는 접합 DsRed와 Δ38rev 단백질. 이 그림 Khoury 외.21에서 재 인 쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 디자인 생성. (A) pLTR.gp140/EGFP입니다. RevΔ38/DsRed 접합 기자 EGFP (gp140-EGFP) 및 기능 비 계 단백질을 융합 하는 봉투의 식을 아미노산 38 DsRed 형광 성 단백질 (RevΔ38-DsRed)에 융합에서 잘릴 수 있습니다. (B) pCMV-레 브NL4.3 Rev 단백질의 표현 수 있습니다. (C) pCMV-Tat101AD8-플래그를 사용 하면 C 터미널 플래그-태그와 Tat101(AD8) 단백질의 표정. 식 플라스 미드 PCR 오버랩 및 제한 다이제스트를 사용 하 여 구성 됩니다. 모든 벡터 지도 버전 4.1.9 SnapGene 소프트웨어를 사용 하 여 만들어졌습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 분석 결과 에이즈 대기 시간 반전 하는 에이전트의 신속한 평가 위한 디자인. 에이즈-1 전사 및 접합에 LRAs의 효과의 평가 대 한 현재 메서드 i) 시드 HEK293T 세포의 transfection ii) 이전 1 일 뒤에 iii) 아이라 치료 식 벡터와 함께 포함 되어 있습니다. iv) 셀 흐름 cytometry 48 h 후 처리에 의해 분석 된다. 이 프로토콜을 사용 하 여, 96 조건 (3 중)에 32 접시 당 테스트 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1: 플레이트 설치 및 필요한 컨트롤의 대표적인 예. 문신 같은 긍정 (+) 컨트롤 뿐만 아니라 아무 약물 및 솔벤트만 (DMSO 1: 5000)와 네거티브 (-) 컨트롤에 해당 하는 열 1 ~ 3 (100 ng), PMA/PHA phorbol myristate 아세테이트/phytohaemagglutinin = (10 nM PMA, 10 μ g/mL PHA), JQ1 (+) (1 μ M), 포 vorinostat (= 0.5 μ M), 팬 및 panobinostat = (30 nM). 알 수 없는 LRAs 농도 (1000 nm 15.625)의 범위 3 중에서 테스트 합니다. 보상 목적 세포 뿐만 아니라 각 단 하나 색깔 형광 성 단백질 (EGFP +와 DsRed +)을 표현 하는 세포 생존 염료와 스테인드 하 고 흠 없는 세포 각 실행에 포함 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 교류 cytometry 분석에 사용 하는 전략을 게이팅. 제어 전략의 첫 번째 단계가이 세포의 크기와 단위 속성에 따라 관심의 세포의 구별을 허용 하 고 측면 분산형을 기반으로 합니다. 게이팅이 된다는 세포 파편과 밀도 플롯의 왼쪽된 하단에 있는 죽은 세포를 제거 하는 동안 모든 이벤트를 포함 하도록 최대한 관대 하는 것이 좋습니다. 펄스 형상 제어, SSC-A SSC-H 대 및 더 좁은 생존 염료를 사용 하 여 라이브 셀에 사용 하 여 데이터 집합에서 제거 하 고 남자. 마지막으로, 덤프 채널 (바이올렛)와 EGFP 또는 DsRed 관심의 셀을 정의 하 사용 된다. 1 (FMO) 컨트롤 마이너스 형광의 사용은 관심의 인구를 정의 하 고 관심의 채널에서 다른 형광 색소에서 유출의 문제 해결에 중요 합니다. 취득, 후 데이터 흐름 cytometry 데이터 분석 소프트웨어를 사용 하 여 분석 된다. 이 그림 적응된 양식 Khoury 외.21에서 재 인 쇄 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: HIV 전사 및 접합에 bromodomain 억제제의 효과의 대표적인 결과. (A) 예제 2-매개 변수 듀얼의 색상 형광 EGFP 밀도 플롯 untransfected 세포에서 DsRed 대 (-문신), 셀 100 페 pCMV Tat101AD8의 ng-플래그 (+ 문신)와 셀 DMSO, JQ1 처리 (+) 또는 JQ1 (-). EGFP, DsRed 또는 접합된 제품을 표현 하는 셀의 (B) 평균 백분율 (%) (DsRed / DsRed + EGFP) 3 독립적인 실험에서 표시 됩니다. DMSO에 각 조건의 비교 2-웨이 ANOVA 테스트를 사용 하 여 만들어졌다. 통계적 비교에만 표시 됩니다. p < 0.05; p < 0.01; p < 0.001입니다. 블랙 라인 대표는 mean±SEM. DMSO (1: 5000), JQ1 (+) 및 JQ1(-) (1 μ M). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

Ex vivo 바이러스 재 활성화를 측정에 어려움을 감안할 때, 모델 시간 내내 latently 포함 HIV 대기 시간을 공부 하기 위하여 개발 되었다 생체 외에서 다양 한 범위의 감염 T 세포-라인 (J-라트, ACH2, u 1), (휴식의 잠재 감염의 기본 모델 O'Doherty, Lewin, 그린 및 Spina 모델) 또는 미리 활성화 된 CD4 + T 세포 (Sahu, 마리니, Planelles, Siliciano, 깐 모델) 단일 라운드 또는 복제 유능한 기자 바이러스22. HIV CD4 + T 세포 휴식에서 대기 하는 시간의 생리 적 상태를, 듀얼 형광 기자 시스템 LTR 기반 개 그-eGFP 마커 및 장소에 CMV 구동 mCherry 이반 사도 스키의 그룹에 의해 개발 된 RGH (빨강-녹색-HIV) 기자 등 일어 났 죠 Nef23의. 비슷한 컬러 듀얼 기자 바이러스, 듀오-Fluo, LTR 구동 EGFP 식와 EF1α 발기인24에 의해 구동 mCherry 형광 마커 E. Verdin 연구소에 의해 개발 되었다. 이 시스템에는 EGFP Nef 대신 provirus의 3' 끝에 삽입 되었다. 이러한 두 시스템에서 봉투에 삭제 감염의 여러 라운드를 방지할 수 있습니다. 또한, 두 가지 형광 단백질의 조합 생산의 탐지 수 (eGFP + mCherry +) latently (eGFP-mCherry +) 감염 세포. 그러나, 듀얼 컬러 기자 바이러스의 몇 가지 단점 latently 감염 된 세포의 직접 감염 T-세포23,24의 세포 활성화 상태에 크게 의존으로 CD4 + T 세포에 눈에 띄는 했다. 사실, 감염의 매우 낮은 속도 CD4 + T 세포 휴식에서이 두 기자 바이러스를 사용 하 여 관찰 되었다: RGH23 0.1%, 0.2% DuoFluo25. 또한,는 CMV로 발기인 활성화 되지 않은 셀26,,2728, 비활성 CMV 하위 수준에서 표현 될 표시 되었습니다 또는 EF1α 발기인 latently 감염의 과소 이어질 것 이다 인구입니다.

우리는 생성 하 고 대기 시간 및 높은 처리량 분석 결과에 바이러스 재 활성화의 설립을 연구 하는 새로운 에이즈 기자 벡터 특징. 우리의 심사 방법에 몇 가지 장점을 포함 i) 비용 효과 전사 및 접합 동시에, ii) 하나의 실험의 3) 빠른 평가에서 많은 수의 약물 또는 조합을 테스트 하는 능력을 평가 하는 cytometry (30-45 분 일반 읽기 시간 96 잘 접시 형광 매개 변수 수의 독립에 대 한)에 의해 LRAs의 효과 iv) 높은 동적 범위, v) 높은 처리량 transfection 그리고 cytometry 로봇 팔, HTS 플랫폼을 사용 하 여 자동화에 적합 6) 빠른 흐름 cytometry 작업 영역 서식 파일, 7 세를 사용 하 여 데이터의 치료) 서 스 펜 션 및 부착 세포, 8 세에 대 한 최적의) 모델과 발광 및 플레이트 리더 측정 (듀얼 luciferase 반딧불 및 Renilla), 및 ix 적응성의 단순) 확장성 (96-384-잘 페이트 형식).

HIV LTR 기반 전사 및 따라서 EGFP 및 DsRed 형광 단백질 식 접합을 활성화 하는 아이라의 또는 조합 LRAs의 성향 cytometry 우리의 HIV 접합 기자를 사용 하 여 검사 수 있습니다. 그러나, 소설 LRAs의 시너지 효과 테스트 하기 전에 그것은 좋습니다 다양 한 단일 약물의 농도에 노출 된 후 세포의 생존 능력을 측정 하 여 각 아이라의 생리 상태를 확인 하. 따라서, 라이브 및 죽은 세포의 마커를 포함 하 여 가양성을 제거 하 고 최고 품질의 결과 얻기 위해 필수적 이다. 교류 cytometry 분석의 다른 중요 한 측면은 보상 컨트롤 또는 FMO. 그것은 인구의 EGFP + DsRed와 반대로 최소한의 파급을 보장 하는 단독으로 얼룩진된 샘플을 사용 하 여 좋습니다. 또한, 흠 없는 세포를 포함 하 여 셀의 autofluorescence에 대 한 계정에 필수적 이다. 마지막으로, cytometer 성능 및 감지기에 걸쳐 감도의 일반적인 컨트롤은 대부분 때 오랜 기간에 걸친 연구에 대 한 샘플 측정 중요 합니다.

프로토콜 섹션에 설명 하지, 하지만 우리의 접합 기자 시스템의 몇 가지 제한이 있습니다. 더 철저 한 토론에 대 한 우리의 이전 발행물 (Khoury 외., 2018)를 참조 하십시오. 수출에서 부분적으로 또는 HIV mRNA의 unspliced 변종 바이러스 성 단백질 계와의 그것의 협회와는 계 반응 요소 (RRE)이 mRNA 종29,30,,3132에 의해 촉진 된다. 곱하기의 핵 보유의 주요 블록을 우회 하는 우리의 시스템에 레 브의 overexpression 접합 및 unspliced mRNAs latently 감염 된 T 세포17 에 LRAs 전사 및 접합을 유도 하는 어떻게 이해에 집중 관찰 따라서 바이러스 재 활성화입니다. 또한, 우리의 시스템에 필요한 3 플라스 미드의 transfection는 우리 선택 HEK293T 세포 때문에이 세포의 높은 transfection 효율. T 세포는 암 세포 라인에 비해 세포 요소의 다른 시간적 및 공간 가용성 때문에, 접합 기자 HEK293T T-셀 라인 좋은 제공할 수 있는 1 차 셀 셀에 취득의 결과 확인 하는 것이 중요 하다 때문에 그들의 제한 된 transfectability 기술 과제입니다. 따라서, transfection는 현 탁 액 셀 (예를 들어, Jurkat)의 transfection 위해 특히 효과적 이기 위하여 보였다, DMRIE C 등 또는 네온 등 Amaxa nucleofector nucleofection 방법에 대 한 대체 DNA 배달 시 약의 사용 transfection 어려운 transfect 세포 주 CD4 + T 세포를 포함 하 여 단일 또는 여러 개의 플라스 미드의 효율적이 고 안정적인 납품을 촉진 하기 위하여 입증 된 시스템. 또는, 그것은 상기 transfection 방법을 사용 하 여 대기 시간의 1 차 셀 모델에 전체 바이러스의 맥락에서이 기자 시스템 테스트 흥미로울 것입니다. 사실, 호스트 전사, 신장 및 rCD4 + T 세포에서 접합의 가용성에 차이 영향을 하는 잠재 provirus 활성화 하는 아이라의 용량 수 있습니다. 마지막으로, 우리의 모델은 아이라 전사 및 방관자 세포의 접합에 영향을 미칠 수 있습니다 그리고 그것은 복제 유능한 바이러스를 일으킬 수 있다 주소 하지 않습니다. 그러나, 우리는 셀 관련 HIV 미국와 MS RNA의 증가 측정 하 여이 문화 상쾌한에 복제 유능한 바이러스의 생산으로 이어질 것 용의자 것 이다. 이 황금 표준 양적 바이러스 파생물 시험 (QVOA)33을 실시 하 여 확인 될 수 없었다.

특성상 복잡 한 대기 시간 및 효율적인 바이러스 재 활성화 되도록, 다각적인 조합 전략 필요34수 있습니다. 잠재적인 치료 필요 및 접합, 전사를 포함 하 여 여러 경로 자극 하는 이전 대기16,,3536, 의 설립에 필수적인 역할을 보여줘 왔다 37. 접합 기자 우리의 LTR 구동 시키는데 모두 단계, 전사 및 접합, 최적의 대상 약물의 높은 처리량 검열 찾는 분자의 효율적으로 synergize 수 낮은 초래할 기회 증가 수준 및 따라서 각 약물의 독성 복용량.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품 프로젝트 그랜트 APP1129320 및 호주의 NHMRC에서 프로그램 그랜트 APP1052979에 의해 지원 되었다. 우리가이 작업의 성공적인 완료를 위한 필수 구문 및 통보를 제공 하기 위한 박사 아담 틀리는, 박사 마리나 알렉산더, 박사 제니 L. 앤더슨과 미셸 Y.이 감사 합니다. 우리는 또한 그들의 조언과이 연구에 사용 된 교류 cytometer 유지에 관대 한 지원에 대 한 DMI 흐름 시설 직원을 감사 합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture
HEK293T cells (Human Embryonic Kidney cells) ATCC CRL-3216 Replicates vectors carrying the SV40 region of replication.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I) Gibco 10569-010 + 4.5 g/L D-Glucose + 110 mg/L Sodium Pyruvate
Fetal Bovine serum Gibco 10099-141 Origin Australia
Penicillin-Streptomycin Sigma P4458
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS), no calcium, no magnesium Gibco 14190-136
Trypan blue Stain, 0.4% Gibco 15250
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300054
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019 Lipid transfection reagent
Opti-MEM I (1x) reduced serum medium Gibco 31985-070 Serum free medium
NucleoBond Xtra Maxi Marcherey-Nagel 740414.50
pEGFP-N1 plasmid Clontech (TaKaRa) 6085-1 Expression of EGFP in mammalian cells, CMVIE promoter.
pDsRed-Express-N1 Clontech (TaKaRa) 632429 Expression of DsRed-Express in mammalian cells, CMVIE promoter.
pLTR.gp140/EGFP.RevD38/DsRed Addgene 115775
pCMV-RevNL4.3 Addgene 115776
pCMV-Tat101AD8-Flag Addgene 115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Millipore 67-68-5
JQ1(+) Cayman Chemical 11187 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
JQ1(-) Cayman Chemical 11232 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 1 μM
Phorbol Myristate Acetate (PMA) Sigma-Aldrich 16561-29-8 Stock at 100 μg/mL in DMSO; working concentration 10 nM
Phytohaemagglutinin (PHA) Remel HA15/R30852701 Stock at 1 μg/μL in PBS; working concentration 10 μg/mL
Vorinostat (VOR) Cayman Chemical 10009929 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 0.5 μM
Panobinostat (PAN) TRC P180500 Stock at 10 mM in DMSO; working concentration 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Promega 63581
Venor GeM Classic Minerva Biolabs 11-1100 Mycoplasma Detection Kit, PCR-based
Name Company Catalog Number Comments
Flow cytometry reagents
LSR Fortessa BD Biosciences Flow cytometer (4 lasers-blue, red, violet and yellow)
LSR II BD Biosciences Flow cytometer (3 lasers-blue, red and violet)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit Life Technologies L34976 Viability dye: for 633 or 635 nm excitation, 400 assays. Component A and B are both provided in the kit.
Bovine Serum Albumin Sigma A2153
EDTA 0.5M pH8 Gibco 15575-038
Formaldehyde Solution 37/10 (37%) Chem-Supply FA010
BD FACS Diva CS&T Research Beads BD Biosciences 655050 Calibration beads
Sphero Rainbow Calibration Particles (8 peaks) BD Biosciences 559123 3.0 - 3.4 mm
Sheath solution Chem-Supply SA046 90 g NaCl in 10 L water
HAZ-Tabs Guest Medical H8801 Chlorine release tablets for disinfection
Decon 90 Decon Laboratories Limited N/A Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution Decon 90 5%.
Sodium Hypochlorite (12-13% Solution) Labco SODHYPO-5L Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution bleach 1%.
7x MPBio IM76670 Concentrated cleaning agents of flow cytometer. Working solution 7x 1%.
Name Company Catalog Number Comments
Materials
Tissue culture flasks (75 cm2, canted neck, cap vented) Corning 430641U
Tissue culture plates (96 well flat bottom with lid) Costar 3599
Tissue culture plates (96 well V-bottom without lid) Costar 3896
Centrifuge tubes (10 mL) SARSTEDT 62.9924.284 100x16 mm
Centrifuge tubes (50 mL) CellStar 227261 30x115 mm
Microcentrifuge tubes (1.5 mL) Corning Axygen MCT-150-C
Serological Pipette (25 mL), sterile Corning CLS4489-200EA
Serological Pipette (10 mL), sterile Corning CLS4488-200EA
Serological Pipette (5 mL), sterile Corning CLS4487-200EA
Reagent reservoirs (50 mL), sterile Corning CLS4470-200EA
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, with cell-strainer cap Corning 352235 12 x 75 mm style, 70 mm
Nylon Mesh SEFAR 03-100/32 100 mm
Titertube Micro test tubes, bulk BIO-RAD 2239391 microfacs tubes
5 mL Round-Bottom polystyrene test tube, without cap Corning 352008 12x75 mm style
Snap Caps for 12x75 mm Test Tubes Corning 352032
Counting chamber, Neubauer improved double net ruling, bright-line (Haemocytometer, LO-Laboroptik) ProSciTech SVZ4NIOU 3x3 large squares of 1 mm2; Depth 0.100 mm; volume 0.1 mL; area minimum 0.0025 mm2
Coverslips (Menzel-Gläser) Grale Scientific HCS2026 20 x 26 mm
Microscope Nikon TMS 310528
Centrifuge 5810R refrigerated Eppendorf 5811000487 with rotor A-4-81 including adapters for 15/50 mL conical tubes
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech N/A Plate reader for cell proliferation assay. Filter 490 nm.
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Softwares
FACS Diva BD Biosciences Flow cytometer data acquisition and analysis program, version 8.0.1
FlowJo FlowJo FlowJo 10.4.2 Flow cytometer data analysis program, FlowJo Engine v3.05481
Omega BMG Labtech FLUOstar multi-user reader control, version 5.11
Omega - Data Analysis BMG Labtech MARS FLUOstar data analysis, version 3.20R2
Microsoft Excel Microsoft Excel:mac 2011 version 14.0.0
Prism GraphPad Prism 7 version 7.0c

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References

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