Mikroelektroden-Impalement-Methode zur Aufzeichnung des Membranpotenzials aus einer kantigen mittleren Zerebralparese

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Summary

Das primäre Ziel dieses Artikels ist es, Details darüber zu liefern, wie Membranpotenzial (Vm) aus der mittleren Zerebrale mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode aufzuzeichnen ist. Die kanülierte mittlere Hirnarterie wird ausgeglichen, um myogenen Ton zu erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandigen Mikroelektroden aufgespießt.

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Reed, J. T., Sontakke, S. P., Pabbidi, M. R. Microelectrode Impalement Method to Record Membrane Potential from a Cannulated Middle Cerebral Artery. J. Vis. Exp. (149), e59072, doi:10.3791/59072 (2019).

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Abstract

Membranpotential (Vm) von vaskulären glatten Muskelzellen bestimmt den Gefäßtonund und damit den Blutfluss zu einem Organ. Veränderungen in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Pumpen, die Vm bei Krankheitszuständen regulieren, könnten möglicherweise Vm,Gefäßtonus und Blutfluss verändern. Daher sind ein grundlegendes Verständnis der Elektrophysiologie und die Methoden, die notwendig sind, um Vm in gesunden und kranken Zuständen genau aufzuzeichnen, unerlässlich. Diese Methode ermöglicht die Modulation von Vm mit verschiedenen pharmakologischen Mitteln zur Wiederherstellung von Vm. Obwohl es mehrere Methoden gibt, jede mit ihren Vor- und Nachteilen, bietet dieser Artikel Protokolle zur Aufzeichnung von Vm aus kanülierten Widerstandsgefäßen wie der mittleren Zerebralparese mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode. Mittlere Hirnarterien dürfen in einer Myographenkammer myogenen Ton erhalten, und die Gefäßwand wird mit hochwiderstandsstarken Mikroelektroden aufgespießt. Das V m-Signal wird über ein Elektrometer erfasst, digitalisiert und analysiert. Diese Methode ermöglicht ein genaues Ablesen des Vm einer Gefäßwand, ohne die Zellen zu beschädigen und ohne den Membranwiderstand zu verändern.

Introduction

Das Membranpotential (Vm) einer Zelle bezieht sich auf den relativen Unterschied der ionischen Ladung über die Plasmamembran und die relative Durchlässigkeit der Membran zu diesen Ionen. Der Vm wird durch die Differenzverteilung der Ionen erzeugt und durch Ionenkanäle und Pumpen aufrechterhalten. Ionenkanäle wie K+, Na+, und Cl- tragen wesentlich zum ruhenden Vmbei. Vaskuläre glatte Muskelzellen (VSMCs) exprimieren mehr als vier verschiedene Arten von K+ Kanäle1, zwei Arten von spannungsgegated Ca2+ Kanälen (VGCC)2, mehr als zwei Arten von Cl - Kanäle3, 4 , 5, speicherbetriebene Ca2+ Kanäle6, Stretch-aktivierte Kationenkanäle7,8und elektrogene Natrium-Kalium-ATPase-Pumpen9 in ihren Plasmamembranen, die alle an der Regulierung von Vmbeteiligt sind.

Der Vm von VSMCs hängt vom Lumendruck ab. In nicht unter Druck stehenden Gefäßen variiert Vm von -50 bis -65 mV, in Druckarteriensegmenten reicht Vm jedoch von -37 bis -47 mV10. Die Erhöhung des intravaskulären Drucks bewirkt, dass VSMCs11depolarisieren, den Schwellenwert für die VGCC-Öffnung verringern und den Kalziumzufluss erhöhen, der zur Entwicklung des myogenen Tonsbeiträgt 12. Im Gegenteil, in passiven oder nicht unter Druck stehenden Gefäßen wird die Membranhyperpolarisation aufgrund der hohen K +-Kanalaktivität verhindern, dass sich VGCC öffnet, was zu einem begrenzten Kalziumeintrag und einer Abnahme des intrazellulären Kalziums führt, was zu weniger Gefäßton13. Somit scheint Vm aufgrund von Veränderungen des Lumendrucks eine wesentliche Rolle bei der Entwicklung des Gefäßtonons zu spielen, und sowohl VGCC- als auch K +-Kanäle spielen eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Vm.

Vm variiert je nach Schiffstyp und Art. Vm ist -54 x 1,3 mV in Meerschweinchen überlegene meenterische arterielle Streifen14, -45 x 1 mV in den mittleren Hirnarterien der Ratte bei 60 mmHg Lumendruck12, und -35 x 1 mV in Rattenparenchymalarterien bei 40 mmHg Lumendruck15. Der ruhende Vm, der im ungestreckten Lymphmuskel der Ratte aufgezeichnet wird, beträgt -48 x 2 mV16. Vm zerebraler VSMCs ist negativer als in peripheren Arterien. Im Vergleich dazu wurden feline mittlere Hirnarterien mit einem Vm von etwa -70 mV berichtet, während mesentäre und koronare Arterien mit -49 bzw. -58 mV bzw.17,18berichtet enden. Unterschiede im Vm über Gefäßbetten können die Unterschiede in der Expression und Funktion von Ionenkanälen und elektrogenen Natrium-Kaliumpumpen widerspiegeln.

Erhöhungen und Abnahmen von Vm werden als Membrandepolarisation bzw. Hyperpolarisation bezeichnet. Diese Veränderungen in Vm spielen eine zentrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen, einschließlich Ionenkanalgating, Zellsignalisierung, Muskelkontraktion, und Aktion potenzielle Ausbreitung. Bei einem festen Druck verursachen viele endogene und synthetische Vasodilatatorverbindungen, die K+ Kanäle aktivieren, eine Membranhyperpolarisation, was zu Einer Vasodilatation1,13führt. Umgekehrt ist eine nachhaltige Membrandepolarisation bei agonistisch-induzierter oder rezeptorvermittelter Vasokonstriktion19von entscheidender Bedeutung. Vm ist eine kritische Variable, die nicht nur den Zustrom von Ca2+ durch VGCC13 reguliert, sondern auch die Freisetzung von Ca2+ aus den internen Lagern20,21 und Ca2+-Empfindlichkeit von die kontraktive Vorrichtung22.

Zwar gibt es mehrere Methoden zur Erfassung von Vm aus verschiedenen Zelltypen, aber die Daten, die aus der Mikroelektroden-Imprägemethode von kanülierten Gefäßen gesammelt wurden, scheinen physiologischer zu sein als Daten, die von isolierten VSMCs gewonnen wurden. Bei aufnahme von isoliertem VSMC mit aktuellen Klemmmethoden wird Vm als spontane transiente Hyperpolarisation in VSMCs24angesehen. Isolierte VSMCs befinden sich nicht im Syncytium, und die Änderungen im Serienwiderstand können zum Oszillatorverhalten von Vmbeitragen. Andererseits wird das Oszillationsverhalten nicht beobachtet, wenn Vm von intakten Gefäßen aufgezeichnet wird, wahrscheinlich aufgrund des Zell-Zell-Kontakts zwischen VSMCs, die sich in der Arterie im Syncytium befinden und im gesamten Gefäß summiert werden, was zu einem stabilen Vm führt. 24. Somit ist die Messung von Vm von Druckgefäßen mit Standard-Mikroelektroden-Impalement-Technik relativ nahe an den physiologischen Bedingungen.

Die Aufnahme von Vm von kanülierten Gefäßen könnte wichtige Informationen liefern, da Vm von VSMCs, die in Syncytium sind, eine der wichtigsten Determinanten des Gefäßtons und des Blutflusses ist und die Modulation des Vm eine Möglichkeit bieten könnte, Verengung der Blutgefäße. Daher ist es wichtig, die Methodik zu verstehen, die bei der Erfassung von Vmerforderlich ist. Dieser Artikel beschreibt die intrazelluläre Aufzeichnung von Vm aus kanülierten mittleren Hirnarterien (MCAs) mit einer Mikroelektroden-Impalement-Methode. Dieses Protokoll beschreibt, wie McAs, Mikroelektroden, die Einrichtung des Elektrometers und die Impalement-Methode zur Aufzeichnung von Vmdurchgeführt werden. Darüber hinaus werden repräsentative Daten, häufige Probleme, die bei der Verwendung dieser Methode aufgetreten sind, und potenzielle Probleme diskutiert.

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Protocol

Die männlichen Ratten wurden in der Animal Care Facility des UMMC untergebracht, die von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) zugelassen ist. Die Tiere hatten während der gesamten Studie freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Die Tiere wurden in einer kontrollierten Umgebung mit einer Temperatur von 24 °C bei 2 °C, einer Luftfeuchtigkeit von 60–80 % und 12 h Licht-/Dunkelzyklen gehalten. Alle Protokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der UMMC genehmigt.

1. Vorbereitung der Ausrüstung

  1. Platzieren Sie einen Zweikanal-Differentialelektrometerverstärker (siehe Materialtabelle) in der Nähe der Gefäßkammer und an der gewünschten Stelle.
  2. Schließen Sie den Ausgang des Verstärkerkanals A oder B mit einem BNC-BNC-Kabel an den Kanaleingang des Digitizers an.
  3. Montieren Sie die Sonde im Mikromanipulator und platzieren Sie sie in der Nähe des Mikroskops und des Myographen. Das Aufnahme-Setup muss auf einem vibrationsfreien Tisch installiert sein.
  4. Stellen Sie die Knöpfe und Schalter an der Vorderseite des Verstärkers in Positionen, die ihn für dieses Experiment konfigurieren, wie im Handbuch beschrieben.
  5. Verbinden Sie den Badegrund über eine entsprechende Elektrode mit dem Schaltungsboden des Verstärkers. Stellen Sie ebenfalls sicher, dass der Käfig auf das Gehäuse des Verstärkers geerdet ist.

2. Vorbereitung von Mikroelektroden und Montage

  1. Verwenden Sie Borosilikatglas-Mikroelektroden (siehe Materialtabelle) und ziehen Sie die Glasspitze, um eine Verjüngung von 8–10 mm, einen Durchmesser von <1 m und einen Widerstand von 80–120 M zu haben, wenn sie mit 3 M KCl gefüllt sind.
    1. Verwenden Sie einen Standard-Puller, um eine kurze allmähliche Verjüngung mit den folgenden Einstellungen zu erreichen: Hitze = 650; Geschwindigkeit = 20; Ziehen = 25; Zeit = 250 und Schleife zweimal für höhere Widerstände und kleinere Spitzen. Siehe Materialtabelle, da die Einstellungen instrumentspezifisch sind.
      HINWEIS: Spitzendurchmesser <1 m verursachen minimale Schäden an der Zelle, wenn sie aufgespießt werden.
  2. Füllen Sie die Mikroelektrode mit 3 M KCl mit einer Mikrofaserspritze (siehe Materialtabelle).
    1. Ziehen Sie den Kolben der Mikrofaserspritze langsam nach oben, während Sie den 3 M KCl in die Mikroelektrode injizieren, um Platz für die Flüssigkeit zu geben und die Bildung von Luftblasen innerhalb der Mikroelektrode zu verhindern.
    2. Füllen Sie die Mikroelektrode bis zur Vollentat und stellen Sie sicher, dass keine Luftblasen vorhanden sind, bevor Sie sie in den Mikroelektrodenhalter legen. Wenn Blasen vorhanden sind, tippen Sie vorsichtig mit einem Finger auf die Mikroelektrode, um die Blasen zu entfernen.
  3. Üben Sie Pflege, drücken Sie den Elektrodenschaft fest in den Halter durch das Bohrloch. Wenn überschüssige Flüssigkeit vorhanden ist, entfernen Sie sie mit einem Gewebe.
  4. Schließen Sie die Elektrodenhalterbaugruppe an die Verstärkersonde an. Führen Sie einen Elektrodentest durch, passen Sie den Eingangsversatz an, überprüfen Sie die Nulleinstellung und überprüfen Sie die Leckage des Sondeneingangs gemäß dem Verstärkerhandbuch.
  5. Messen Sie den Elektrodenwiderstand mit einem Elektrodentest, wie in Tabelle 1dargestellt.
  6. Beachten Sie, dass eine Arbeitselektrode eine positive Dc-Spannungsverschiebung von 1 mV/M a am Kanalausgang anzeigt. Wenn andererseits eine große Spannung am Kanalausgang und am Zähler auftritt, weist dies auf eine blockierte oder defekte Elektrode hin.
  7. Öffnen Sie die Aufnahmesoftware, weisen Sie der Datei einen Namen zu und speichern Sie sie für die zukünftige Analyse in einer Speichersoftware.

3. Isolierung und Cannulation der mittleren Zerebralen Arterie

  1. Zubereitung der Reagenzien.
    1. Bereiten Sie normale und kalziumarme physiologische Salzlösung (PSS) wie in Tabelle 2beschrieben vor.
  2. Bereiten Sie den Myographen vor.
    1. Spülen Sie die Myographenkammer (siehe Materialtabelle) mehrmals mit destilliertem Wasser, um sie frei von Schmutz zu halten. Laden Sie die Kammer mit 5 ml normalem PSS.
    2. Füllen Sie beide Glaskanülen mit gefilterten normalen PSS mit einer 5-10 ml Spritze. Füllen Sie sorgfältig die gesamte Kanüle und die angeschlossenen Schläuche, ohne Luftblasen einzuführen.
    3. Bereiten Sie zwei Monofilament Nylon Nähte (10-0, 0,02 mm) mit einem halben Knoten jeweils mit stumpfen Zangen.
    4. Platzieren Sie die teilweise geschlossenen Nahtknoten auf beiden Kanülen leicht von der Spitze entfernt mit Sezierzangen unter einem Seziermikroskop. Später werden diese Knoten abrutschen und sorgfältig an die kanülierten arteriellen Enden gebunden, um das Gefäß zu sichern.
  3. Isolieren und können die mittlere Zerebralparese isolieren.
    1. Induzieren Sie tiefe Anästhesie in einer Sprague Dawley Ratte, indem Sie 2–4% inhaliertes Isofluran verwenden.
    2. Enthaupten Sie die Ratte mit Guillotine unter tiefer Anästhesie.
    3. Entfernen Sie den Schädel vorsichtig mit einem Knochenschneider und einer Schere.
    4. Entfernen Sie das Gehirn aus dem Schädel und legen Sie es in 5 ml niedrigem Kalzium-PSS auf Eis.
    5. Identifizieren und sezieren Sie ein unverzweigtes Segment der mittleren Hirnschlagader (MCA) der Ratte mit einem Innendurchmesser von 100–200 m aus dem Gehirn mit Federschere und Zange.
    6. Montieren Sie den MCA mit feinen Zangen auf die Glaskanülen und sichern Sie die Nähte im Myographen, der normale PSS enthält.
    7. Schließen Sie die distale Kanüle, damit innerhalb der WAB kein Fluss entsteht.
    8. Schließen Sie die Zuflusspipette an ein Reservoir mit PSS an, um die Kontrolle des intraluminalen Drucks zu ermöglichen, der mit einem Inline-Druckwandler überwacht wird.
    9. Visualisieren Sie die kanülierten MCAs mit einer ladungsgekoppelten Gerätekamera (siehe Materialtabelle),die auf einem invertierten Mikroskop und einer Bildverarbeitungssoftware montiert ist.
    10. Stellen Sie die axiale Länge des MCA auf eine ungefähre Länge ein, in der sie weder starr noch schlaff erscheinen sollte.
    11. Ausgleich der Badlösung mit O2 (95%) und CO2 (5%) bei 37 °C, um eine ausreichende Sauerstoffversorgung, Temperatur und pH-Wert bei 7,4 zu gewährleisten.
  4. Impale (durchdringen Sie die Zellplasmamembran) die vaskulären glatten Muskelzellen.
    1. Schließen Sie die Masseelektrode an und halten Sie sie in der PSS des Myographen eingetaucht.
    2. Beleuchten Sie die Gefäßkammer und schauen Sie durch das Mikroskop, um die Spitze der Mikroelektrode in der Badlösung zu visualisieren.
      HINWEIS: Alternativ kann man die MCA und Mikroelektrode auf einem Computer mit einer Bildverarbeitungssoftware visualisieren.
    3. Verwenden Sie die Steuerung des Mikromanipulators, um die Spitze der Mikroelektrode in der Nähe der Außenwand des Blutgefäßes zu bewegen. Der Mikromanipulator und die Spitze der Mikroelektrode müssen sich in einer stabilen Position in Bezug auf das Gewebe befinden.
      HINWEIS: Bestätigen Sie vor Beginn der Experimente, dass sich die Membranspannung stabilisiert hat. Wenn die gemessene Spannung instabil ist, wird die Verbindung zwischen der Elektrode und der Zelle nicht abgedichtet, was auf ein Leck hindeutet.
    4. Beginnen Sie die Aufzeichnung.
    5. Bewegen Sie langsam die Spitze der Mikroelektrode in Richtung des Behälters, mit Blick auf die Mitte des Gefäßes mit Kurs oder feiner Kontrolle des Mikromanipulators.
      HINWEIS: Gelegentlich kann eine kleine Durchbiegung in der Aufzeichnung beobachtet werden, wenn die Mikroelektrodenspitze eine Muskelfasermembran kontaktiert.
    6. Wenn die Spitze in unmittelbarer Nähe zum Gefäß kommt, bringen Sie die Elektrode in einer schnellen Bewegung vorwärts, indem Sie den Mikromanipulator verwenden, um die Membran des Muskels zu aufpalest.
    7. An dieser Stelle kann man beginnen, die Änderungen in Vm zu beobachten, die aufgezeichnet werden. Berühren Sie den Mikromanipulator nicht, wenn die Mikroelektrode die Membran der Zelle aufspießt.
      HINWEIS: Der Spannungsunterschied zwischen der Aufnahme- und Referenzelektrode verringert sich von 0 mV auf -40 mV und -75 mV, abhängig vom Grad des intravaskulären Drucks oder anderen erregenden oder hemmenden Reizen. Diese Messwerte charakterisieren den Transmembranpotentialunterschied der aktuellen Zelle.
    8. Führen Sie mehrere Verbesserungen auf einem einzigen Schiff in verschiedenen Bereichen des Schiffes durch, ohne VSMCs zu beschädigen, um genaue Messungen zu erhalten.
    9. Nach der Aufnahme verwenden Sie den Manipulator, um die Mikroelektrode in einer schnellen Bewegung zu entfernen.
    10. Beenden Sie die Aufzeichnung und speichern Sie Datendateien zur weiteren Analyse.

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Representative Results

Die vorgestellte Methode kann zuverlässig zur Aufzeichnung von Vm in kanülierten Gefäßen eingesetzt werden. Eine kurze Prozedur, die beschreibt, wie MCA aus dem Gehirn isoliert werden kann, ist in Abbildung 1Adargestellt. Nach der Trennung des Gehirns vom Schädel wurde das MCA seziert und in eine Petrischale mit niedrigem Kalzium-PSS gelegt. Ein Teil des anhaftenden Bindegewebes wurde zusammen mit MCA mit Federschere und Zange seziert, um eine Schädigung von MCA während der Isolierung zu verhindern. Vorsichtig wurde auch Bindegewebe entfernt, und der sezierte MCA war bereit, auf den Myographen zu übertragen. MCA wurde auf den Kanülen montiert und mit Nahtknoten an beiden Enden der Kanülen im Myographen gebunden. Eine schematische Darstellung einer typischen Mikroelektroden-Impalement-Methode ist in Abbildung 1Bdargestellt. Über einen Halter in der Sonde wurde eine mit 3 M KCl gefüllte Mikroelektrode mit dem Elektrometer verbunden. Der Kanalausgang des Elektrometers wurde über ein BNC-BNC-Kabel an einen analogen Eingangskanal eines Digitizers angeschlossen. Der Digitizer-Ausgang wurde weiter mit einem Oszilloskop verbunden, um das Signal in der Aufnahmesoftware zu visualisieren. Der Boden wird mit einem AgCl-Pelletdraht hergestellt, der vom Gehäuse des Elektrometers bis zur Badlösung im Myographen erweitert wurde. Schließlich wurden digitale Spuren in der Aufnahmesoftware auf dem Computermonitor visualisiert.

Der MCA wurde dann in frisch zubereitetem warmem PSS inkubiert und auf 60 mmHg unter Druck gesetzt. Für die V-M-Aufnahme wurden nur Gefäße verwendet, die Anklang erhalten. Nachdem das Gefäß einen signifikanten Ton erhalten hatte, wurde die Mikroelektrode in die Gefäßwand vorgeschoben. Arteriendurchmesser und Aufhellung der Arterie wurden mittels Videomikroskopie visualisiert. Impalement gilt als erfolgreich, wenn es eine schnelle Ablenkung zu negativen Werten gibt, Vm für 30 s stabil ist und die Spannung bei Entfernung der Elektrode abrupt auf 0 mV zurückkehrt, wie in Abbildung 212,15dargestellt. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass bei einem MCA, das auf 60 mmHg unter Druck steht, der Vm -43,2 x 2,9 mV beträgt.

Nach einer erfolgreichen Aufhellung und Vm Stabilisierung wurden die Medikamente, die die Vm verändern, im Bad durchdrungen und Veränderungen im Vm wurden aufgezeichnet. Wir verwendeten 20 mM KCl zur Depolarisierung und 20 M NS1619, einen synthetischen Kaliumkanalöffner mit großer Leitfähigkeit, um die Membran zu hyperpolarisieren. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Durchblutung der Kammer mit KCl die Membran um 5,8 x 0,18 mV depolarisiert. Auf der anderen Seite hyperpolarisierte die Perfusion mit NS1619 die Membran um 3,8 x 0,4 mV.

Figure 1
Abbildung 1: Eine Abbildung der Isolierung der mittleren Hirnarterien und die Aufzeichnung des Membranpotentials mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode. (A) Schneiden Sie mit einer Federschere das Gehirn oder das Bindegewebe entlang der gepunkteten Linien. Übertragen und montieren Sie den MCA zwischen den beiden Glaskanülen und sichern Sie ihn mit Nähten in der mit PSS gefüllten Myographenkammer. (B) Eine mit 3 M KCl gefüllte Mikroelektrode wird in den Halter eingeführt und mit der Sonde verbunden. Änderungen des Transmembranpotentials von der Sonde zum Elektrometer und zum Digitizer über ein BNC-Kabel (BNC-Kabel wird vom Kanalausgang des Elektrometers und an einen analogen Eingang eines Digitizers angeschlossen). Das digitalisierte Potenzial wird in der Aufnahmesoftware auf dem Monitor angezeigt. Der Boden wird mit einem AgCl-Pelletdraht hergestellt, der vom Elektrometer mit der Badlösung im Myographen verbunden ist. MCA = mittlere Hirnarterie; PSS = physiologische Salzlösung; AgCl = Silberchlorid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Erfassung des Membranpotentials mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode aus kanülierten mittleren Hirnarterien. Repräsentative Spur von Vm. Impalement gilt als erfolgreich, wenn es eine abrupte Ablenkung zu negativen Werten beim Einlass der Elektrode gibt, Vm für 30 s stabil ist und die Spannung bei Entfernung der Elektrode abrupt auf 0 mV zurückkehrt. Die X-Achse stellt die Zeit dar, und die Y-Achse stellt das Membranpotential dar. Die gepunktete Linie stellt die angepasste Basislinie vor der Aufhellung des Schiffes dar. Sek = Sekunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Erfassung von Veränderungen des Membranpotentials mit der Mikroelektroden-Impalement-Methode, wenn Gefäße vasoaktiven Mitteln ausgesetzt sind. Vm wurde mit Dermikroelektroden-Impalement-Methode aus kanülierten mittleren Hirnarterien vor und nach der Exposition gegenüber vasoaktiven Wirkstoffen aufgezeichnet. Die Probenfolge stellt (A) eine Depolarisation als Reaktion auf die 20 mM KCl- und (B)-Hyperpolarisation als Reaktion auf 20 M NS1619 dar – einen großen Petheriermittel-Kaliumkanal-Agonisten. (C) Zusammenfassung s. Balkendiagramm der Änderungen in Vm vor und nach der Anwendung von KCl und NS1619. Die gepunktete Linie steht für ruhende Vm. Die Zahl in der Klammer stellt die Anzahl der in der Studie verwendeten Gefäße dar. Beachten Sie, dass Vm die Ausgangsbasis erreicht hat, sobald das Medikament ausgewaschen ist. Fehlerleiste stellt den Standardfehler des Mittelwerts dar. Sek = Sekunden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Einstellungen des Elektrometers zur Messung des Elektrodenwiderstands
Zählereingabe Kanal A oder B
Positionsumschalter in
Zählerreichweite Umschalten auf 200 mV
elektrode Im Bad
art Betrieb zum Elektrodentest
Zähleranzeige 1 mV/M

Tabelle 1: Einstellungen des Elektrometers zur Messung des Elektrodenwiderstands.

Chemikalien niedriges Kalzium PSS mM NormalPSS mM gesellschaft Katalog
1 Nacl 119,00 119,00 Sigma S7653
2 Kcl 4,70 4,70 Sigma P4504
3 MgSO4 1.17 1.17 Sigma M7506
4 CaCl2 0,05 1.60 Sigma C3881
5 HEPES 5,00 5,00 Sigma H7006
6 glukose 10.00 Uhr 10.00 Uhr Sigma G7021
7 NaH2PO4 1.18 1.18 Sigma S0751
8 NaHCO3 18.00 Uhr 18.00 Uhr Sigma S5761
pH-Wert: 7,4 pH-Wert: 7,4

Tabelle 2: Reagenzien, die bei der Herstellung von kalziumarmen und normalen physiologischen Salzlösungen verwendet werden.

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Discussion

Dieser Artikel enthält die notwendigen Schritte, wie eine scharfe Mikroelektroden-Impalement-Methode verwendet werden kann, um Vm aus einer kanülierten Gefäßzubereitung aufzuzeichnen. Diese Methode ist weit verbreitet und bietet qualitativ hochwertige, konsistente Aufnahmen von Vm, die eine Vielzahl von experimentellen Fragen beantworten.

Einige kritische Überlegungen und Schritte zur Fehlerbehebung werden hier beschrieben, um den Erfolg der Methode sicherzustellen. Die Qualität der Mikroelektrode (ihre Schärfe und Widerstand) und der zelluläre Prozess, den sie durchdringt, beeinflussen die Stabilität und Genauigkeit von Vm. Wenn das Signal kontinuierlich driftet oder sich über oder unter dem Aufnahmebereich des Verstärkers befindet, ist es sehr wahrscheinlich, dass die Elektrode blockiert ist oder die Spitze gebrochen ist. Wenn die Aufhellung nur partiell, unzureichend oder die Zelle beschädigt, steigt das aufgezeichnete Potential wieder auf 0 mV, was zu einem instabilen Signal oder keinem Signal führt. In einigen Fällen kann der Inhalt der Zelle auch die sehr hohe Widerstandselektrode blockieren. All diese Probleme können überwunden werden, indem man lediglich die Elektrode durch eine neue ersetzt.

Für eine erfolgreiche Impalement muss sichergestellt werden, dass der Gesamtwiderstand der Zellmembran unverändert bleibt und das gemessene Membranpotential stabil ist und keine Lecks zwischen Der Elektrode und Membran aufweist. Es ist entscheidend, dass die Elektrode durch einen stabilen Mikromanipulator zur Zelle vorgeschoben wird. Wenn es innerhalb weniger Mikrometer der Zelle vorrückt, ändert sich das Spitzenpotential, was zu einer leichten Umlenkung der erkannten Spannung führt. Um eine Beschädigung der Elektrodespitze oder Dehnung der Zellmembran zu vermeiden, ist ein schnelles Vorrücken der Elektrode erforderlich. Erfolgreiche Säuerung zeichnet sich durch einen schnellen Rückgang des Membranpotentials und eine Stabilisierung um das Ruhepotential der Membran aus. Wenn die mögliche Ablesung schwankt, ist es möglich, dass die Spitze der Elektrode die Membran gestört hat, wodurch Natrium in die Zelle und Kalium austreten, was zu einer progressiven Depolarisation führt. Ein weiteres Problem bei dieser Methode ist, dass Knotenpotentiale und Elektrodenspitzenpotentiale der V-m-Aufnahme ein unnötiges Artefakt hinzufügen können. Kreuzungspotentiale treten auf, wenn unterschiedliche Leiter in Kontakt kommen. Es gibt zwei verschiedene Arten von Anschlusspotentialen, Flüssigmetall und Flüssig-Flüssigkeit. Flüssigkeits-Metall-Verbindungen entstehen, wenn die Spitze der Sonde den Elektrolyten in der Mikropipette kontaktiert. Flüssigkeits-Flüssig-Knoten, auch Als Flüssigknotenpotential bezeichnet, treten auf, wenn zwei Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen in Berührung kommen. Die Diffusion der Ionen zwischen den Lösungen trägt zur Entwicklung des Potentials bei. Außerdem können die Eigenschaften der Glaselektrodenspitze, die mit Flüssigkeit interagiert, Spitzenpotenziale erzeugen. Um die Kreuzung sowie Die Spitzenpotentiale zu minimieren, könnte die Nullung des gemessenen Potenzials im Bad die unerwünschte Verzerrung verringern. Während der Impalement kann man nicht ausschließen, dass in einigen Experimenten versehentlich endotheliale, anstatt glatte Muskeln, Vm, beprobt werden könnten. Studien deuten jedoch darauf hin, dass die Endothel- und VSMC-Schichten elektrisch in kleinen Arteriolen gekoppelt sind und ähnliche V m-Antworten aufweisen23.

Letztendlich sind drei Schritte in diesem Prozess entscheidend für erfolgreiche Aufnahmen. Erstens müssen die Schiffe angemessen vorbereitet werden, um sicherzustellen, dass sie dabei nicht beschädigt werden. Zweitens müssen Mikroelektroden in die richtigen elektrischen Eigenschaften gezogen werden. Schließlich ist eine schnelle Aufhellung der Membran ohne Bruch der Spitze entscheidend für genaue Ergebnisse. Der Forscher muss die Elektrophysiologie verstehen, wie man lebensfähige Mikroelektroden erzeugt und wie ein Elektrometer aufgestellt und verwendet wird.

Trotz ihrer Bedeutung hat diese Methode verschiedene Einschränkungen. Erstens sind die Gesamtkosten für die Beschaffung aller Geräte hoch (30-40.000 USD). Zweitens werden für all diese Experimente frische Gefäße benötigt; Daher wird ein Tier für jedes Experiment eingeschläfert, was zu den Gesamtkosten führt. Drittens ist die Zerlegung der Hirnarterien, die Cannulation der Gefäße mühsam, teuer und hat eine Lernkurve. Viertens erfordert die Vorbereitung von Mikroelektroden, die Aufhellung und die Aufzeichnung von Vm ein gründliches Verständnis der Elektrophysiologie. Um diese Einrichtung im Labor einzurichten, bedarf es schließlich engagierter Mitarbeiter, Zeit und Mühe.

Vm ist eine wesentliche elektrophysiologische Eigenschaft, die den Gefäßton uston und damit den Blutfluss zu einem Organ bestimmt. Vm könnte durch mehrere vasoaktive Chemikalien verändert werden, die aus Neuronen, Endothel und Blutbestandteilen freigesetzt werden. Während Vasokonstriktoren die Membran depolarisieren, hyperpolarisieren Dilatoren die Membran. Mehrere Proteine einschließlich K+ Kanäle, VGCC, Natriumkalium ATPase, Ca2+ ATPase, Cl- Kanäle, speicherbetriebene und Stretchkanäle regulieren die Vm. Veränderungen in einem dieser Proteine unter Krankheitsbedingungen könnten potenziell Vm und damit Gefäßtonon und Blutfluss verändern. Die Mikroelektroden-Impalement-Methode ist nützlich, um Ruhe- und Veränderungen in Vm als Reaktion auf Vasokonstriktoren und Dilatoren aufzuzeichnen. Diese Methode könnte also zuverlässig eingesetzt werden, um normale und veränderte Vm im Zusammenhang mit Krankheiten zu verstehen, und kann bei der Entwicklung von pharmakologischen Wirkstoffen nützlich sein, die entwickelt wurden, um Vm,Gefäßtononus und Blutfluss zu modulieren.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde teilweise durch Stipendien des Intramural Support Research Program (IRSP) von UMMC, AHA Scientist Development Grant (13SDG14000006) an Mallikarjuna R. Pabbidi unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection instruments
Aneshetic Vaporiser Parkland scientific V3000PK
Dissection microscope Nikon Instruments Inc., NY Eclipse Ti-S
Kleine Guillotine Type 7575 Harvard Apparatus, MA 73-198
Littauer Bone Cutter Fine science tools 16152-15
Moria MC40 Ultra Fine Forceps Fine science tools 11370-40
Surgical scissors Sharp-Blunt Fine science tools 14008-14
Suture Harvard Apparatus 72-3287
Vannas Spring Scissors Fine science tools 15018-10
Electrophysiology Instruments
Charge-coupled device camera Qimaging, , BC Retiga 2000R
Differential electrometer amplifier WPI FD223A
In-line pressure transducer Harvard Apparatus, MA MA1 72-4496
Micromanipulator Thor labs PCS-5400
Microelectrodes Warner Instruments LLC, CT G200-6,
Micro Fil (Microfiber syringe) WPI MF28G67-5
Microelectrode holder WPI MEH1SF
Myograph Living Systems Instrumentation, VT CH-1-SH
Puller Sutter Instrument, San Rafael, CA P-97
Vibration-free table TMC 3435-14
Softwares
Clampex 10 Molecular devices
p Clamp 10 Molecular devices
Imaging software Nikon, NY NIS-elements
Chemicals
NaCl Sigma S7653
KCl Sigma P4504
MgSO4 Sigma M7506
CaCl2 Sigma C3881
HEPES Sigma H7006
Glucose Sigma G7021
NaH2PO4 Sigma S0751
NaHCO3 Sigma S5761

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References

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