الإنتاجية المتوسطة فحص فحوصات لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات ورد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

هنا، واثنين من فحوصات الإنتاجية المتوسطة لتقييم الآثار على Ca2 +-يرد وصف رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. يمكن استخدام هذه الاختبارات للشاشة بسرعة وسهولة كميات كبيرة من مركبات للآثار على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rehfeld, A., Egeberg Palme, D. L., Almstrup, K., Juul, A., Skakkebaek, N. E. Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm. J. Vis. Exp. (145), e59212, doi:10.3791/59212 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Ca2 +-مما يشير إلى أمر ضروري لوظيفة الخلية المنوية العادية وخصوبة الذكور. وبالمثل، رد فعل acrosome حيوية بالنسبة لقدرة خلية الحيوانات المنوية البشرية لاختراق بيلوسيدا زونا وتخصب البويضة. ولذا أهمية كبيرة لاختبار المركبات (مثلاً، المواد الكيميائية البيئية أو المرشحين المخدرات) لتأثيرها على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية أما إلى دراسة الآثار السلبية المحتملة على وظيفة الخلية المنوية البشرية أو للتحقيق في دور محتمل كوسائل منع الحمل. ويرد هنا، هما الإنتاجية المتوسطة فحوصات: 1) تحليل القائم على الأسفار لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات في الحيوانات المنوية البشرية، ومقايسة سيتوميتريك صورة 2) لتقييم رد الفعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. يمكن استخدام هذه الاختبارات لفحص عدد كبير من المركبات للآثار على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامها في فحوصات إنشاء منحنيات الاستجابة للجرعة محددة للغاية للمركبات الفردية، وتحديد الجمع/التآزر المحتملة لمركبات اثنين أو أكثر، ودراسة الوضع الدوائي للعمل عن طريق تثبيط المنافسة تجارب مع مثبطات كاتسبير.

Introduction

غرض فحوصات اثنين الموصوفة هنا دراسة الآثار على Ca2 +-رد فعل الإشارات وأكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية، كما أظهرت لمركبات متعددة في العديد من المنشورات التي توظف هذه فحوصات،1،2 3،،من45،،من67. Ca2 +-إشارات ورد فعل acrosome هي وظيفة الخلية المنوية البشرية الحيوية إلى وضعها الطبيعي وخصوبة الذكور.

والهدف العام لخلية الحيوانات المنوية البشرية تخصيب البويضة. لتكون قادراً على بنجاح وبشكل طبيعي تخصب البيضة، يجب أن ينظم وظائف الخلية المنوية محكم أثناء رحلة الخلية المنوية من خلال8،الأنثى التناسلي9. وتخضع العديد من وظائف الخلية المنوية عبر داخل الخلية Ca2 +-تركيز [Ca2 +]أنا (مثل الحيوانات المنوية حركية وانزيمية أكروسومي رد فعل)10. أيضا، هو عملية نضج تسمى تأهيلية، مما يجعل الخلية المنوية قادرة على إخصاب البيضة، ينظمها جزئيا [Ca2 +]أنا10. Ca2 +-البثق Ca2 +-ATPase مضخات11 الاحتفاظ إضعاف ما يقرب من 20.000 Ca2 +-التدرج عبر غشاء الخلية المنوية البشرية، مع يستريح [Ca2 +]أنا من 50-100 نانومتر. إذا Ca2 + يسمح بعبور غشاء الخلية (مثلاً، من خلال فتح Ca2 +-قنوات)، يحدث بتدفق إعداد كبيرة من Ca2 + ، مما أدى إلى ارتفاع من [Ca2 +]أنا. ومع ذلك، يحمل أيضا الخلية المنوية Ca داخل الخلية2 +-مخازن، والتي يمكن إصدار Ca2 + و، ولذلك، كما ترتفع تعطي ارتفاع من [Ca2 +]أنا12. من المثير للاهتمام، كل قناة بوساطة Ca2 +-حتى الآن تم العثور على التدفق في خلايا الحيوانات المنوية البشرية تحدث عن طريق كاتسبير (القطالقناة الأيونية جمعية مهندسي البترولrm)، التي يعبر عنها فقط في خلايا الحيوانات المنوية11. في خلايا الحيوانات المنوية البشرية، تنشيط كاتسبير البروجسترون يغاندس الذاتية والبروستاغلاندينات عن طريق يجند متميزة ملزم مواقع13،،من1415، مما أدى إلى كاليفورنيا سريع2 +-تدفق إلى الخلية المنوية. مصدرين رئيسيين قرب البيض توفير مستويات عالية من هذه يغاندس الذاتية. واحد هو سائل جرابي يحتوي على مستويات عالية من البروجسترون16. يتم تحرير السائل الجريبي من المسام ناضجة جنبا إلى جنب مع البيض في التبويض وتختلط مع السائل داخل أوفيدوكتس17. المصدر الرئيسي الآخر هو الخلايا الركام التي تحيط البيض والإفراج عن ارتفاع مستويات البروجسترون والبروستاغلاندينات. البروجسترون الناجمة عن Ca2 +-تدفق في خلايا الحيوانات المنوية قد ثبت للتوسط به نحو9،البيض18ومراقبة الحيوانات المنوية حركية19،20 وتحفز أكروسومي 21من رد الفعل. تحريك لهذه الفردية [Ca2 +[أنا-وظائف الحيوانات المنوية الخاضعة للتنظيم في الترتيب الصحيح وفي الوقت الصحيح أمر حاسم لاخصاب البيض8. وتمشيا مع هذا، دون المستوى الأمثل التي يسببها البروجسترون Ca2 +-تدفق تم العثور عليها لتكون مرتبطة مع انخفاض خصوبة الذكور22،،من2324،25،26 ،27،،من2829 وكاتسبير الفنية ضروري لخصوبة الذكور26،30،،من3132، 33،34،،من3536.

كما خلايا الحيوانات المنوية الوصول إلى البويضة، سلسلة أحداث يجب أن تتم للاخصاب تحدث: 1) خلايا الحيوانات المنوية يجب أن تخترق طبقة الخلايا الركام المحيطة، 2) ربط بيلوسيدا زونا، 3) اكسوسيتوسي محتوى أكروسومال، رد فعل ما يسمى أكروسومي 37, 4) اختراق بيلوسيدا زونا، و 5) تلتحم مع الغشاء البيض لإتمام الإخصاب38. لتكون قادرة على الذهاب من خلال هذه الخطوات وتخصب البيضة، الخلية المنوية أولاً يجب أن يخضع تأهيلية11، الذي يبدأ كما ترك السائل المنوي الذي يحتوي على "ديكاباسيتاتينج" عوامل39 خلايا الحيوانات المنوية وتسبح في السوائل للإناث المسالك التناسلية مع مستويات عالية من بيكربونات والزلال37. تأهيلية يجعل خلايا الحيوانات المنوية قادرة على الخضوع هايبراكتيفيشن، شكلاً من أشكال حركية مع ضربة قوية السوط، و رد فعل acrosome37. حركية هايبراكتيفاتيد مطلوب لتغلغل zona pellucida40، وأكروسومي يحتوي على الإنزيمات هيدروليكي المختلفة أن تساعد هذه العملية اختراق41. بالإضافة إلى ذلك، يجعل رد فعل acrosome خلايا الحيوانات المنوية القادرة على الصمامات مع البيض بتعريض بروتينات الغشاء محددة على سطح الحيوانات المنوية اللازمة للحيوانات المنوية-البيض الانصهار42. ونتيجة لذلك، القدرة على الخضوع لرد فعل هايبراكتيفيشن وأكروسومي على حد سواء اللازمة للاخصاب الناجح من40،البيض42. خلافا لما شهد للماوس الخلايا المنوية43،،من4445، يمكن ربط الخلايا المنوية البشرية إلا أن أكروسومي سليمة zona pellucida46. عندما خلايا الحيوانات المنوية البشرية بد أن بيلوسيدا زونا لديهم الخضوع لرد فعل أكروسومي لاختراق zona pellucida41 ولفضح بروتينات الغشاء محددة مطلوبة للانصهار مع البيض38. وهكذا توقيت رد الفعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية أمر حاسم للتسميد بحيث تحدث.

كما هو موضح أعلاه، Ca2 +-مما يشير إلى أمر حيوي للحيوانات المنوية طبيعية الخلية الدالة8، وأنها، لذلك، أهمية كبيرة تكون قادرة على شاشة إعداد كبيرة من المركبات للآثار على Ca2 +-الإشارات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية. وبالمثل، يمكن اختراق بيلوسيدا زونا خلايا الحيوانات المنوية إلا البشرية التي يخضع لها رد فعل أكروسومي في الوقت المناسب والمكان وتسميد46،البيض47، كما أنها ذات أهمية كبيرة لتكون قادرة على اختبار المركبات لقدرتها على تؤثر على رد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية. وتحقيقا لهذه الغاية، يتم وصف اثنين الفرز الإنتاجية المتوسطة فحوصات: 1) تحليل للآثار على Ca2 +-الإشارات في خلايا الحيوانات المنوية البشرية، ومقايسة 2) لقدرته على الحث على رد فعل أكروسومي في خلايا الحيوانات المنوية البشرية.

هو مقايسة 1 إنتاجية متوسطة Ca2 +-يشير التحليل. هذا الأسلوب القائم على قارئ لوحة fluorescence ترصد التغيرات في الأسفار كدالة للزمن في آبار متعددة في وقت واحد. Ca2 +-صبغة الفلورسنت الحساسة، فلوو-4 قد أ كد ل Ca2 +≈ 335 نيوتن متر وهو خلية بيرمينت على شكل إستر صباحا (أسيتوكسيميثيل). استخدام فلوو-4، من الممكن لقياس التغيرات في [Ca2 +[i مع مرور الوقت، وبعد إضافة مركبات للاهتمام بخلايا الحيوانات المنوية. المقايسة وضع المختبر من تيمو Strünker في 201113 واستخدم منذ ذلك الحين في عدة دراسات لمركبات الشاشة للآثار على Ca2 +-إشارات في الحيوانات المنوية البشرية1،2،3، 4،5. كما تم استخدام أسلوب مشابه لفحص المخدرات متعددة المرشحين48. وبالإضافة إلى ذلك، هذا التحليل أيضا مفيدة لتقييم طريقة العمل1،2،3،،من45، منحنيات الاستجابة للجرعة1، الدوائي 2،3،،من45وتثبيط المنافسة1،2، والجمع1،2، و التعاضد3 من المركبات ذات الأهمية.

المقايسة 2 مقايسة رد فعل acrosome الإنتاجية المتوسطة. هذا الأسلوب القائم على سيتوميتير صورة تدابير كمية قابلة للتطبيق acrosome رد فعل الخلايا المنوية في عينة، استخدام الأصباغ الفلورية ثلاثة: يوديد propidium (PI)، إلى جانب فيتك يكتين بسام بيسوم (فيتك-PSA)، و 33342 هويشت. تم تعديله من أسلوب يستند إلى قياس تدفق مماثل من قبل زوبينو et al.49 الفحص وقد استخدمت في عدة دراسات6،7. أما بالنسبة Ca2 +-يشير التحليل، يمكن أيضا استخدام هذا الفحص رد فعل أكروسومي لتقييم منحنيات الاستجابة للجرعة وتثبيط، والجمع، والتآزر من المركبات ذات الأهمية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جمع وتحليل عينات السائل المنوي البشري في البروتوكولات يتبع المبادئ التوجيهية "اللجنة الأخلاقيات البحثية المنطقة عاصمة" الدانمرك. وحصلت جميع عينات السائل المنوي بعد الموافقة المستنيرة من المانحين المتطوعين. وبعد التسليم، العينات كانت تماما تصبح مجهولة المصدر. للإزعاج تلقي كل جهة مانحة رسماً قدرة 500 كرونة دانمركية (حوالي دولار 75 دولار أمريكي) كل عينة. حللت في اليوم لتسليم العينات وثم دمرت فورا بعد التجارب المعملية.

ملاحظة: سرعة النقل المتوسطة Ca2 +-إشارات المقايسة يرد في الخطوات 4-5 والمقايسة رد فعل acrosome الإنتاجية المتوسطة في الخطوات من 6-7. بروتوكول إعداد متوسطة السوائل البشرية البوقي (HTF+) هو هو موضح في الخطوة 1 وهو وصف تنقية خلايا الحيوانات المنوية لفحوصات في الخطوات من 2-3.

1-إعداد متوسطة السوائل البشرية البوقي (HTF+)

ملاحظة: استخدام قوارير الحجمي أحجام مناسبة، 1 ل قياس اسطوانة، محرض مغناطيسية، وأملاح كما هو موضح في الجدول 1 و الجدول 2، تنقية المياه، 0.2 ميكرون المسام والتصفية وأنابيب بلاستيكية 50 مل.

  1. إعداد حلول الأسهم من الأملاح في المياه المنقاة (الجدول 1).
    1. إضافة كمية الملح المدرجة في الجدول 1 إلى دورق حجمي من الحجم المناسب وإضافة المياه المنقاة إلى قليلاً أدناه وحدة التخزين المطلوبة وكذلك استخدام محرض مغناطيسي مزيج.
    2. عندما يذوب الملح تماما، إزالة المغناطيس وملء مع الماء المنقي للحجم النهائي المطلوب.
  2. نقل الأسهم الحل باستخدام زجاجة وتخزين حتى الاستخدام.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالمخزون الحلول واستخدامها لفترات أطول من الوقت: السكر وهيبيس في-20 درجة مئوية والحلول الأسهم الأخرى في درجة حرارة الغرفة (RT).
  3. تحضير 1 لتر متوسطة HTF+ من حلول الأسهم (الجدول 2).
    1. التأكد من أن جميع الحلول الأسهم حلت تماما وتمتزج جيدا قبل الاستخدام.
    2. إضافة كمية الأسهم الحل والملح المدرجة في الجدول 2 إلى ل 1 قياس الاسطوانة وإضافة المياه المنقاة إلى 900 مل.
    3. المزيج جيدا باستخدام محرض مغناطيسية وضبط الأس الهيدروجيني إلى 7.35 بمحلول هيدروكسيد الصوديوم.
    4. إزالة المغناطيس وإضافة الماء المنقي لمل 1,000.
  4. فيلتراتي العقيمة HTF+ المتوسطة عن طريق 0.2 ميكرومتر المسامية التصفية، والمتوسطة HTF+ الكوة إلى 50 مل أنابيب بلاستيكية، ومخزن في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
  5. قبل تشغيل تجربة، إضافة 165 ميليلتر من بيروفات نا إلى قاسمة 50 مل للحصول على تركيز Na بيروفات نهائي من 0.33 ملم.
    ملاحظة: يمكن أيضا الحصول على البشرية المتوسطة السوائل البوقي من مختلف مقدمي الخدمات التجارية. عند استخدام متوسط3 HCO 4 مم، يمكن المحتضنة عينات مع أغطية مغلقة في حاضنة دون إضافي CO2 في الهواء دون الانجرافات كبيرة في درجة الحموضة. إذا كان متوفراً حاضنة2 CO، يمكن حساب المبلغ المقابل لشركة2 استخدام معادلة هندرسون--هاسيلبالشر واستخدامها. إذا كان استخدام المتوسط 25 مم HCO3 ، ينبغي المحتضنة عينات مع أغطية مفتوحة في حاضنة2 CO مع الهواء الذي يحتوي على مبلغ مماثل من أول أكسيد الكربون2 (يعتمد على الضغط الجوي، وعادة ما بين 5-10%) لتجنب من انجراف في الأس الهيدروجيني. ويمكن حساب المبلغ المحدد من CO2 استخدام معادلة هندرسون--هاسيلبالشر.

2-تنقية خلايا الحيوانات المنوية متحركة عبر السباحة إلى أعلى (الشكل 1)

ملاحظة: استخدام حاوية بلاستيكية نظيفة واسعة الفم عينة السائل المنوي، رف لوضع أنابيب بلاستيكية 50 مل في زاوية 45° والمتوسطة HTF+ (الخطوة أعد 1 أو تم الحصول عليها من موفر التجارية)، وأجهزة الطرد المركزي ومصل الدم البشري وحاضنة، وأنابيب بلاستيكية 50 مل الزلال (HSA).

  1. الحصول على عينة السائل المنوي بشرية المتبرع بها حديثا أنتجت عن طريق الاستمناء وأنزل في حاوية بلاستيكية نظيفة واسعة الفم. فقط استخدام عينات السائل المنوي التي تفي بالمعايير التي حددها دليل مختبر منظمة الصحة العالمية لدراسة ومعالجة السائل المنوي البشري.
  2. احتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة تسمح بذلك تسيل.
  3. الحرارة تصل 50 مل متوسطة HTF+ مع 4 مم HCO3 إلى 37 درجة مئوية.
  4. تنظيف مكان 50 مل أنابيب بلاستيكية في رف بزاوية 45 درجة (لزيادة المساحة السطحية بين السوائل). استخدام أنبوب 1 كل مل من السائل المنوي الخام.
  5. إضافة 4 مل الوسط HTF+ مسخن لكل من الأنابيب.
  6. بدقة "الماصة؛" 1 مل عينة السائل المنوي إلى الجزء السفلي من كل أنبوبة تحتوي على 4 مل HTF مسخن+. تجنب إطلاق فقاعات الهواء.
  7. إغلاق الأغطية واحتضان هذه الأنابيب عند 37 درجة مئوية ح 1.
  8. بلطف نضح ونقل قدر من الكسر العلوي (HTF+ مع خلايا الحيوانات المنوية متحركة) قدر الإمكان إلى أنبوب بلاستيك 15 مل جديدة، مع إيلاء اهتمام أن شيئا من الكسر أسفل (السائل المنوي مع الخلايا اسم والميت) يتم تضمين. وبصفة عامة، أنها آمنة لنقل 3.5 مل الكسر أعلى، دون الإخلال بالجزء السفلي. لتجنب الاضطرابات الشفط، قطع الأبعد 1-2 مم من الحافة ماصة بزاوية 45 درجة للحصول على فرصة أكبر.
  9. ملء الأنبوب البلاستيك 15 مل مع HTF+ لغسل الخلايا والطرد المركزي الأنبوب في 700 x ز لمدة 10 دقائق في الرايت
  10. نضح بلطف وإزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه خلية الحيوانات المنوية في 2 مل HTF+.
  11. نقل 20 ميليلتر لتعليق الحيوانات المنوية لاثنين من أنابيب بلاستيكية صغيرة لتقييم تركيز الحيوانات المنوية (راجع الخطوة 3).
  12. ملء الأنبوب البلاستيك 15 مل مع HTF+ لغسل الخلايا والطرد المركزي الأنبوب في 700 x ز لمدة 10 دقائق في الرايت
  13. بلطف نضح وإزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية المنوية إلى 10 × 106 خلايا/مل (استناداً إلى تركيز خلية المقررة في خطوة 2.11).
    1. لإجراء تجارب باستخدام الخلايا المنوية الأمم المتحدة كاباسيتاتيد (Ca الروتينية2 +-يشير التحليل)
      1. ريسوسبيند الخلايا في HTF+ مع 4 مم HCO3.
      2. إضافة 30 ميليلتر من ألبومين المصل البشري (HSA) (100 ملغ/مل) كل مل HTF+ للحصول على تركيز نهائي من 3 ملغ/مل.
      3. إغلاق الأغطية واحتضانها إيه وان ح في 37 درجة مئوية.
    2. لإجراء تجارب باستخدام مناطقية الخلايا المنوية (acrosome رد فعل الإنزيم)
      1. ريسوسبيند الخلايا في HTF+ مع 25 مم HCO3.
      2. إضافة 30 ميليلتر من يمتلكهما (100 مغ/مل) كل مل HTF+ للحصول على تركيز نهائي من 3 ملغ/مل.
      3. إرفاق أغطية فضفاضة واحتضان إيه ثري ساعة عند 37 درجة مئوية مع المبلغ المقابل لأول أكسيد الكربون2 (راجع الخطوة 1، عادة ما بين 5-10% CO2).

3-عد خلايا الحيوانات المنوية

ملاحظة: خلايا الحيوانات المنوية يمكن أما أن تحسب يدوياً50 أو استخدام صورة سيتوميتير51، كما هو موضح هنا. تستخدم صورة سيتوميتير، فورتيكسير، S100 المخزن المؤقت، وحزمة الخدمة SP1-كاسيت، السباحة حتى تنقية الخلايا المنوية (إعدادها في الخطوة 2).

  1. تضعف من 20 ميليلتر الكوة إلى عامل من 10 أو 20 أو 30، 50 أو 90 في المخزن المؤقت S100 باستخدام أنبوب 2 مل قاع جولة وفقا لتركيز المتوقعة (تقييم بواسطة التفتيش اليدوي لبيليه في الخطوة 2، 10). ومن المتوقع استخدام تمييع الأقرب إلى التركيز (أي، إذا كان تركيز 15 × 106 خلايا الحيوانات المنوية كل مل بعد السباحة ومن المتوقع ثم تمييع عينة الحيوانات المنوية 20 ميليلتر مع ميليلتر 380 S100 المخزن المؤقت [عامل إضعاف 20]).
  2. مزيج جيد ل 10 s باستخدام خلاط دوامة في القصوى 700 دورة في الدقيقة، تزج في حزمة الخدمة SP1 الكاسيت في العينة واضغط المكبس الأبيض كاملا وصولاً إلى أسبيراتي قاسمة للعينة في الكاسيت.
  3. فتح سيتوميتير الصورة ووضع الكاسيت في الدرج وتشغيل فحص عدد من PI الملون البشرية خلايا الحيوانات المنوية المقايسة وفقا لعامل التخفيف التطبيقية (تم اختيارها في الخطوة 3، 1).
  4. كرر الخطوة 3، 3، 1-3 مع آخر عينة 20 ميليلتر، استخدام عامل إضعاف أقرب إلى تركيز المقيسة التي تم الحصول عليها من العينة الأولى 20 ميليلتر.
  5. حساب تركيز يعني الحيوانات المنوية خلية من القياسات اثنين.
  6. يعني ضرب الحيوانات المنوية تركيز الخلية مع وحدة التخزين الأصلية للحصول على عدد مجموع الحيوانات المنوية خلايا (في الخطوة 2، وهذا الحجم الأصلي 2 مل).

4-قياس التغيرات في كاليفورنيا داخل الخلايا الحرة2 +-تركيز ([Ca2 +]أنا) استخدام Ca2 +-فلوريميتري (الشكل 2)

ملاحظة: استخدام قارئ لوحة الأسفار، لوحات متعددة جيدا 384، فلوو-4 صباحا، السباحة تنقية الخلايا المنوية (استعداد في الخطوة 2)، مركبات ذات الأهمية كعناصر جيدا أنها إيجابية وسلبية وماصة معيدات الإرسال تلقائي وماصة 12-قناة.

  1. إعداد 2 مم فلوو-4 صباحا المخزون عن طريق إضافة 22.7 ميليلتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد ([دمس]) إلى قنينة من 50 ميكروغرام فلوو-4 صباحا وخلط الأنبوب جيدا.
  2. إضافة قاسمة من 700 تعليق الحيوانات المنوية المستردة السباحة ميليلتر (مناطقية أو الأمم المتحدة كاباسيتاتيد المبين في الخطوة 2) إلى أنبوب اختبار جديد. 700 ميكروليتر من عينة الحيوانات المنوية هو المبلغ المطلوب لتحليل صف واحد من الآبار 24 في لوحة 384-ميكروويل (المستخدمة لاختبار عناصر التحكم 3 و 9 مركبات في دوبليتس).
  3. إضافة ميليلتر 3.5 من 4 قطع أنا فلوو-4 صباحا حل الأسهم ميليلتر 700 تعليق الحيوانات المنوية للحصول على تركيز نهائي من 10 ميكرون.
  4. احتضان العينة لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية، ومحمية من الضوء.
  5. الطرد المركزي عينة في 700 x ز لمدة 10 دقائق، ونضح وتجاهل المادة طافية لإزالة الزائدة فلوو-4.
  6. ريسوسبيند بيليه الملون في HTF+ إلى 5 × 106 خلايا/مل (أي، استخدام 2 × حجم تعليق خلية في الخطوة 4، 2)
  7. إعداد تخفيف من مركبات وعناصر تحكم (يمكن القيام به أثناء فترات حضانة والطرد المركزي في الخطوة 4-4 و 4-5، على التوالي).
    1. تضعف من المركبات، فضلا عن عنصر تحكم سلبية (المخزن المؤقت بمركبة) وعنصر إيجابي (البروجسترون) في HTF+. تضعف من مركبات وعناصر التحكم إلى 3 × التركيز النهائي المطلوب، كما هي المخفف 1:3 عند إضافتها إلى خلايا الحيوانات المنوية في الخطوة 4، 16.
    2. ضع الأنابيب مع تخفيف في رف مع مسافة بين أنابيب المقابلة للمسافة بين نصائح ماصة من ماصة 12-القناة المستخدمة في الخطوة 4، 16.
  8. استخدام ماصة معيدات الإرسال تلقائي (خطوات 24 من 50 ميليلتر).
    1. مزيج فلوو-4 عينة الحيوانات المنوية ملطخة بلطف من بيبيتينج كامل المبلغ الأعلى والأسفل مرة واحدة.
    2. إضافة مختبرين من 50 ميليلتر للآبار 24 صف في لوحة 384-ميكروويل.
  9. ضع لوحة ميكروويل في قارئ لوحة الأسفار عند 30 درجة مئوية وإغلاق الدرج.
  10. حدد البروتوكول المناسب لقطع-4. تثير fluorescence في 480 نانومتر وسجل الانبعاثات في 520 نانومتر. استخدام دورة في أسرع وقت ممكن مع الإعداد.
    ملاحظة: استخدام الهبات على الأقل 10 الواحد البصريات جيدا والسفلي، إذا كان ذلك ممكناً.
  11. حدد جيدا في الصف وضبط الربح إلى قيمة هدف بنسبة 20%.
  12. بدء القياس.
  13. مراقبة خط الأساس خلال الدورات الأولى 5.
    1. إذا هي قراءات الفلورسنت متزايدة أو متناقصة مع مرور الوقت، إيقاف التجربة وإعادة ضبط المكاسب وبدء التجربة مرة أخرى.
    2. إذا كان خط الأساس يختلف كثيرا بين الآبار الفردية في صف واحد، أما بيبيتينج في الخطوة 4، 8 وقد تم أونبريسيسي أو كان غير مختلطة العينة جيدا بما يكفي من قبل بيبيتينج. تجاهل هذه التجربة.
    3. إذا قراءات الفلورسنت المقارنة بين الآبار في الصف ومطردا خلال الدورات الأولى 5، الاستمرار في الخطوة التالية.
  14. بعد 10 دورات (تستخدم لخط الأساس)، إيقاف التجربة.
  15. إخراج الدرج مع لوحة ميكروويل.
  16. استخدام 12-قناة ماصة (2 خطوات من 25 ميليلتر)، بسرعة إضافة 25 ميليلتر من الحلول المعدة من مركبات وعناصر التحكم (من الخطوة 4، 7) للتكرارات 12 جيدا (الآبار 24) صف. تكون الحلول المخفف 1:3، الآبار التي تحتوي بالفعل على 50 ميكروليتر من عينة الحيوانات المنوية الملون.
  17. مواصلة القياس في أسرع وقت ممكن (درج ستغلق تلقائياً) لتجنب فقدان أي إشارات الفلورسنت الناجمة عن المركبات المضافة وعناصر التحكم. التغييرات في الأسفار (ΔF) بعد الآن سوف يتم القبض على إضافة مركبات وعناصر التحكم.
  18. تشغيل التجربة حتى سجلت إشارات مضيئة من عنصر التحكم الإيجابي والمجمعات السكنية للفائدة.
  19. إيقاف التجربة وتصدير البيانات الخام الأسفار لتحليل فإنه كما هو الحال في الخطوة 5.
    ملاحظة: عموما فلوو-4 صباحا وقد استخدمت ك Ca2 +-فلوروفوري الحساسة في التحليل، ولكن الأخرى Ca2 +-fluorophores حساسة يمكن أن تستخدم أيضا في حالة الإثارة وأطياف الانبعاث تتناسب مع عوامل التصفية في قارئ لوحة الأسفار. اعتماداً على اختيار فلوروفوري، تأكد من أن يتم تعيين مستوى تحقيق مكاسب على مستوى "آمنة" فيها قمم الفلورسنت المستحث في قياس نطاق الصك. يمكن اختبار هذا عن طريق إضافة إيونوميسين إلى بئر واحدة في تحديد مكاسب محددة. إذا كان هذا فعل إشارة مضيئة فوق العتبة، انخفاض الربح وحاول مرة أخرى. استخدام بعض F-127 بلورونيك للمساعدة في تحميل فلوو-41،13، ولكن تبين أن هذا ليس ضروريا2. أقصى حد عدد من الصفوف التي تقاس في نفس الوقت يعتمد على عاملين. 1) وقت دورة الصك: إذا كان وقت دورة طويلة جداً، قد غاب عن قمم المستحث في [Ca2 +]أنا . قياس أقصى قدر صفين في نفس الوقت للحفاظ على الوقت دورة منخفضة؛ 2) سرعة بيبيتينج في الخطوة 4، 16: استخدام ماصة 12-القناة، فمن الممكن لإضافة 12 مختلف الحلول بسرعة لآبار 12 مكرر (الآبار 24) الصفوف 1 أو 2 (مثلاً، صف واحد قبل المحتضنة مع السيارة وصف واحد المحتضنة مسبقاً مع المانع) ، دون Ca2 + قمم المستحث في عداد المفقودين. ومع ذلك، لا ينصح لمحاولة إضافة حلول مختلفة 24 إلى صفين لقياس واحد، سوف يكون بيبيتينج نصائح لتحل محلها ما بين خطوات متسلسلة بيبيتينج اثنين، حيث يمكن أن تضيع المستحث Ca2 + قمم.

5-تحليل البيانات من Ca2 +-فلوريميتري

  1. فتح البيانات الخام الأسفار التي تم الحصول عليها وتصديرها في الخطوة 4.
  2. حساب المتوسط من آبار مكررة. في حالة وجود اختلافات كبيرة بين التكرارات، تجاهل البيانات من آبار محددة.
  3. تحديد خط الأساس كدورات أول 10.
  4. حساب ΔF/و0 (%) كنسبة مئوية من تغيير في الأسفار (ΔF) مع مرور الوقت بعد إضافة مركبات والضوابط فيما يتعلق بالأسفار القاعدية يعني (و0) خلال الدورات الأولى 10 (الأساس).
  5. في حالة استخدام البيانات لجيل منحنيات الاستجابة للجرعة، طرح قراءات المراقبة السلبية من آبار أخرى، لإزالة القطع الأثرية بيبيتينج.

6-قياس رد فعل أكروسومي

ملاحظة: استخدام سيتوميتير صورة، وحاضنة، والأصباغ الفلورية: PI بسا فيتك وهويشت-33342، مركبات الفائدة، فضلا عن عناصر إيجابية وسلبية، حلاً إيموبيليزينج الذي يحتوي على 0.6 م NaHCO3 وفورمالدهايد 0.37% (v/v) في الماء المقطر، شريحة A2، ومناطقية السباحة تنقية الخلايا المنوية (إعدادها في الخطوة 2).

  1. تعد حلاً المصبوغة تتضمن PI (5 ميكروغرام/مل)، فيتك-PSA (50 ميكروغرام/مل) و 33342 هويشت (100 ميكروغرام/مل) في HTF+، خلط جيدا باستخدام خلاط دوامة وحمايته من الضوء حتى الاستخدام.
  2. إعداد الحلول من مركبات وعناصر التحكم في 10 × التركيز النهائي المطلوب، كما أنها تضعف 01:10 في الخطوة 6، 5. دائماً بتضمين عنصر تحكم سلبية (المركبات) واثنين من عناصر إيجابية: البروجسترون 10 ميكرون التركيز النهائي وإيونوميسين 2 ميكرومتر التركيز النهائي.
  3. نقل مختبرين من 240 ميليلتر (إعدادها في الخطوة 2) خلايا الحيوانات المنوية القادرة على أنابيب بلاستيكية.
  4. إضافة 30 ميليلتر لتلطيخ الحل لكل أنبوبة. وسوف يكون التركيز النهائي للبقع: 0.5 ميكروغرام/مل بي و 5 ميكروغرام/مل بسا فيتك 10 ميكروغرام/مل هويشت 33342.
  5. إضافة 30 ميليلتر من الحلول مع عناصر أو مركبات لكل أنبوبة (01:10 إضعاف).
  6. خلط العينات بلطف من بيبيتينج صعودا وهبوطاً عدة مرات أو فورتيكسينج خفيف. بسبب الإجهاد الميكانيكي، وتجنب الاختلاط المفرط.
  7. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  8. إعداد جديدة من أنابيب بلاستيكية مع 100 ميليلتر محلول إيموبيليزينج يحتوي على 0.6 م NaHCO3 وفورمالدهايد 0.37% (v/v) في الماء المقطر، واحد لكل أنبوبة الاختبار.
  9. وبعد الحضانة، تخلط العينات جيدا من قبل بيبيتينج وإضافة 50 ميكروليتر من عينة الاختبار إلى أنبوب مع 100 ميليلتر لشل حركة الحل.
  10. قبل تحميل الدوائر شريحة A2، خلط العينة جيدا من قبل بيبيتينج. تعبئة الدوائر بعناية مع حوالي 30 ميليلتر دون خلق فقاعات الهواء.
    ملاحظة: أثناء الاحتضان، خلايا الحيوانات المنوية متحركة تميل إلى تجميع. كتل الخلايا يمكن أن يعكر القياسات (على الرغم من أنها مستبعدة). ولذلك، خلط دقيق قبل بيبيتينج بعد الحضانة مهم جداً. وبالمثل، يمكن أن يعكر فقاعات الهواء في الغرف القياسات. لذلك، ملء الدائرة ببطء وتغيير زاوية الماصة إذا حواف السائل على وشك مواجهة وإنشاء فقاعة هواء.
  11. ضع الشريحة محملة على العلبة سيتوميتير الصورة وإغلاق علبة الورق.
  12. حدد بروتوكول فليكسيسيتي وتشغيل الصحافة.
    1. اختر الإعدادات التالية لبروتوكول فليكسيسيتي: عدد القنوات التحليلية: 2؛ إخفاء القناة: الأشعة فوق البنفسجية (LED365)، هذه هي القنوات المستخدمة لتجزئة الصورة؛ القناة 1: الأزرق (LED475)، ووقت التعرض 3,000 مرض التصلب العصبي المتعدد، تصفية الانبعاثات 560/35؛ القناة الثانية: الأخضر (LED530)، وقت التعرض 500 مللي، تصفية الانبعاثات 675/75؛ الحد الأدنى لعدد الخلايا تم تحليلها: 5000؛ استبعاد الخلايا المجمعة: نعم.
  13. كرر الخطوة 6.9-6.12 حتى تم قياس جميع العينات.

7-تحليل البيانات من الصورة الخلوي

  1. فتح البيانات التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.
  2. إنشاء قطعتي التالية لتقييم القياسات.
    1. إنشاء مؤامرة مبعثر من كثافة هويشت 33342 مقابل منطقة 33342 هويشت على جداول بيكسبونينتيال. يمكن أن تكون هذه الأرض المستخدمة لبوابة 33342 هويشت الكائنات الإيجابية التي أما أن تكون صغيرة جداً أو كبيرة جداً لتكون الخلايا المنوية البشرية.
    2. إنشاء مؤامرة مبعثر كثافة PSA فيتك وكثافة PI على جداول بيكسبونينتيال. يمكن استخدام هذه الأرض لتقويم رد مبلغ acrosome خلايا الحيوانات المنوية باستخدام بوابة رباعي، التي تفصل بين المجموعات الأربع على الأرض (الشكل 3): 1) مجموعة بي إيجابية وبسا فيتك الإيجابية: ردت Acrosome غلق الخلايا المنوية؛ 2) PI السلبية ومجموعة PSA فيتك الإيجابية: ردت Acrosome الخلايا المنوية قابلة للتطبيق؛ 3) PI إيجابية وبسا فيتك السلبية المجموعة: Acrosome سليمة الخلايا غلق الحيوانات المنوية؛ و 4) سلبية PI وبسا فيتك السلبية المجموعة: Acrosome سليمة قابلة للاستمرار في الخلايا المنوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يؤدي الممثل من تجربة اختبار تأثير مركبات 4 (ألف، باء، جيم ودال) جنبا إلى جنب مع إيجابية (البروجسترون) والسلبية (المخزن) السيطرة على [Ca2 +[i في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام متوسط الإنتاجية Ca2 +-إشارات التحليل يتبين في الشكل 4a. في الشكل 4 باء، منحنى استجابة جرعة من البروجسترون هو مبين، التي استمدت من ذروة ΔF/و0 (%) اختبار البيانات الناجمة عن تركيزات مخففة متسلسل من البروجسترون، في تجربة أخرى باستخدام متوسط الإنتاجية Ca2 +-يشير التحليل. تحليل البيانات من Ca2 +-يشير التحليل هو موضح في الخطوة 5. نتائج تمثيلية من تجربة اختبار التعريفي لرد فعل acrosome في مناطقية الحيوانات المنوية الخلايا البشرية باستخدام عنصر تحكم سلبية ([دمس]) أو عنصري تحكم إيجابية (البروجسترون وإيونوميسين) على يمكن مقايسة رد فعل acrosome الإنتاجية المتوسطة أن ينظر في لوحة أعلى من الرقم 3. وينظر إلى رباعي بوابات التبعثر مؤامرات من شروط الاختبار 3. تحليل بيانات رد فعل أكروسومي هو موضح في الخطوة 7.

الجدول 1: الأوراق المالية حلولاً لإعداد HTF + . يمكن الاحتفاظ بالمخزون الحلول واستخدامها لفترات أطول من الوقت، السكر وحبيس في-20 درجة مئوية والحلول الأسهم الأخرى في درجة حرارة الغرفة. التأكد من أن جميع الحلول حلت تماما وتمتزج جيدا قبل الاستخدام.

الجدول 2: إعداد HTF + مع 4 أو 25 مم HCO 3 - من حلول الأسهم من الأملاح (أعد في الجدول 1). يمكن إضافة نا-لاكتات كشراب، 60% (w/w)، أو مسحوق. يتم إضافة ناكو3 كمسحوق.

Figure 1
رقم 1: تنقية السباحة متحركة خلايا الحيوانات المنوية البشرية. اليسار: أنبوب مع HTF+ المتوسطة وقاسمه عينة السائل المنوي بيبيتيد أدناه المتوسطة HTF+ . الحق: بعد 1 ساعة من السباحة إلى أعلى عند 37 درجة مئوية، خلايا الحيوانات المنوية متحركة لها سابح تصل في المتوسط HTF+ . الخلايا المنوية اسم وقتلى فضلا عن الخلايا غير المنوية لا تزال في السائل المنوي دون المتوسطة HTF+ . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: رسم تخطيطي الإنتاجية المتوسطة Ca2 +-يشير التحليل. () خلايا الحيوانات المنوية يتم تحميلها مع Ca2 +-هي مطلي فلوروفوري الحساسة، غسلها ومختبرين لآبار صفيحة 384-جيدا. يتم وضع لوحة 384-جيدا (ب) في قارئ لوحة fluorescence في 30 درجة مئوية. (ج) الأسفار يتم تسجيلها قبل وبعد إضافة للمركبات بالسيطرة الإيجابية (البروجسترون) والسيطرة السلبية (المخزن المؤقت بالسيارة). قراءات في ΔF/و0 (%) بعد إضافة (الأسهم) لمراقبة سلبية وإيجابية تتجلى في الجزء السفلي من (ج). الرسم التوضيحي تستخدم بإذن من شيفر المسيحية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
رقم 3: تقييم رد فعل acrosome استخدام الخلوي الصورة. (اللوحة العلوية) رباعي، بوابات مبعثر مؤامرات من عنصر تحكم سيارة سلبية ([دمس])، وعناصر إيجابية البروجسترون (بروغ، 10 ميكرون) وإيونوميسين (الحيز، 2 ميكرومتر). زيادة في الخلايا في الربع العلوي الأيمن (acrosome تجاوب خلايا قابلة للتطبيق) ويعتبر عند مقارنة عناصر إيجابية لعنصر التحكم [دمس]. (أسفل اللوحة) الصور المجهرية المسمى فلوريسسينتلي الحيوانات المنوية الخلايا، بما في ذلك الخلايا من كل المجموعات الأربع. BF = مشرق الميدان، هويشت = هويشت-33342، PSA = بسام بيسوم Agglutinin، PI = يوديد Propidium. شريط المقياس = 10 ميكرون. لقد تم تعديل هذا الرقم من اجبيرج بالمه et al. عام 20187. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: مثال للبيانات من Ca2 +-فلوريميتري. () التغيرات في [Ca2 +]أنا الناجمة عن مراقبة سلبية، البروجسترون ومجمع ألف، باء وجيم ودال (ب) منحنى الاستجابة للجرعة البروجسترون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الإنتاجية المتوسطة Ca2 + إشارات والرزن هو استناداً إلى قياسات للأسفار من كل واحد ميكروويلس تحتوي على حوالي 250,000 الخلايا المنوية. هو المتوسط الإشارات الملتقطة من جميع خلايا الحيوانات المنوية الفردية في البئر. وهكذا تنص المقايسة يتم تغيير أية معلومات مكانية حول مكان على وجه التحديد في الخلية المنوية [Ca2 +]أنا ، في كيفية كبيرة نسبة من الخلايا المنوية تغييرا في [Ca2 +]i يأخذ مكان، أو الرد بكيفية غير متجانسة بين الخلايا الفردية. للحصول على هذه المعلومات، تجارب مع القرار خلية واحدة فقط (على سبيل المثال، كما هو موضح في،من5052) يجب استخدام. عيب آخر لهذا الأسلوب هو الأزمنة، وأمر من ثانية. على الرغم من أن عينات الحيوانات المنوية 50 ميليلتر مختلطة جيدا عند 25 ميليلتر الحلول تضاف، القياسات الأولى يمكن أن تبدأ بعد الدرج مع لوحة متعددة جيدا مرة أخرى داخل القارئ لوحة الأسفار. للحصول على أعلى الأزمنة، يجب أن تستخدم تقنيات أخرى (مثلاً، توقف تدفق فلوريميتري13،50). ميزة الإنتاجية المتوسطة Ca2 +-إشارات المقايسة، مقارنة بأساليب خلية واحدة أو واحد-جيدا أن قياس ميكروويلس متعددة باستخدام قارئ ميكروسكوبية المتزامنة يسمح لاختبار سريع وسهل متعددة مركبات جنبا بجنب مع عناصر إيجابية وسلبية (الشكل 4)1، 2، وسهل توليد منحنيات الاستجابة للجرعة من المركبات الفردية (الشكل 4)1،،من23 , 4 , 5وتقييم للجمع1،2 والتعاضد3 مركبات اثنين أو أكثر، وكذلك الدراسات المتعلقة بطريقة عمل المركبات تثبيط المنافسة على الرغم من التجارب واستخدام محددة مثبطات الدوائية (مثلاً، كاتسبير مثبطات1،2،3،،من45). وعلاوة على ذلك، بتغيير في فلوروفوري، يمكن استخدامها في التحليل لدراسة التغييرات داخل الخلايا الأخرى (مثل درجة الحموضةوأنا1،2). وأخيراً، يمكن استخدام فلوروفوري أكثر من مرة واحدة لقياس التغييرات داخل الخلايا متعددة في وقت واحد. في المستقبل، متوسط الإنتاجية Ca2 +-إشارات الإنزيم يمكن أن تستخدم للمركبات الشاشة ذات الاهتمام للآثار على Ca2 +-إشارات في الحيوانات المنوية البشرية (مثلاً، المواد الكيميائية البيئية أو المرشحين المخدرات) دراسة إمكانات الضارة الآثار على وظيفة الخلية المنوية البشرية أو للتحقيق في دور محتمل كوسائل منع الحمل.

تحليل رد فعل acrosome الإنتاجية المتوسطة يستند إلى الصورة الخلوي، الذي يشكل بديلاً جذابة لتقييم رد فعل acrosome البشرية مقارنة بتقييم دليل استخدام مجهر الأسفار. أنماط المصبوغة أكروسوميس سليمة أو الرد/رد غير واضحة دائماً، واختلاف داخل فردية كبيرة يمكن أن تكون النتيجة هذا العقد. مع صورة الخلوي، اكتسبت الصور وتحليلها تلقائياً. إخفاء القناة، في هذه الحالة هويشت 33342، يعرف الخلايا ويتم تضمين فقط نيون إشارات من هذه المجالات المحددة في تحليل البيانات. ومن ثم تلوين الهيئات انوكليتيد التي تحتوي على السيتوبلازم المتبقية غير المدرجة في تحليل البيانات. وعلاوة على ذلك، عد الإحصاءات متفوقة على الفحص المجهري الأسفار. لحساب عدد الخلايا 200 من خلال أوكولارس المجهر مهمة صعبة وتستغرق وقتاً طويلاً ولكن مع الخلوي الصورة يأخذ تحليل خلايا على الأقل 5,000 أقل من بضع دقائق. بيد نظراً لتضخم منخفض من سيتوميتير صورة، يتم فقدان القدرة على تقييم القياسات وواحد سيكون لإحضار العينة ملطخة مجهر الأسفار. ولذلك، إدراج عناصر تحكم ذات أهمية قصوى للتحقق من القياسات. إذا كان لا تتفاعل عناصر التحكم كما هو متوقع، يجب أن يتم تجاهل النتائج من تجربة. واستلهم البروتوكول الموصوفة هنا العمل الذي قام به زوبينو et al.49، الذين تقييم رد فعل acrosome البشرية بالتدفق الخلوي. ووصفوا كذلك بالوقت الحقيقي fluorescence المجهري كيف بسا يدخل حجرة acrosomal عندما تظهر مسام الغشاء-الانصهار بناء على تحريض من رد فعل acrosome. مرة واحدة داخل مقصورة أكروسومال، بسا السدادات، ويشكل علامة مستقرة لفترات أطول من الوقت. يتم تطبيق لا تثبيت أو بيرميبيليزيشن في البروتوكول، وذلك تفسير النتيجة واضحة: هيكل السلام والأمن داخل مقصورة acrosomal خلية الحيوانات المنوية سليمة يساوي acrosome رد فعل. أما بالنسبة Ca2 +-إشارات المقايسة، يمكن أيضا استخدام تحليل رد فعل أكروسومي لتقييم منحنيات الاستجابة للجرعة وتثبيط، والجمع، والتآزر من المركبات ذات الأهمية. في المستقبل، مقايسة رد فعل acrosome الإنتاجية المتوسطة أيضا يمكن أن المركبات الشاشة من الاهتمام للآثار على أكروسومي الحيوانات المنوية البشرية رد فعل (مثلاً، المواد الكيميائية البيئية أو المرشحين المخدرات) إلى دراسة الآثار السلبية المحتملة على هذا الإنسان الدالة cell الحيوانات المنوية أو للتحقيق في دور محتمل كوسائل منع الحمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

المؤلف يود أن ينوه المختبر من تيمو Strünker للإشراف على ع و DLE أثناء تلك الإقامة في مختبرة. وعلاوة على ذلك، نود أن نشكر زملائنا في إدارة النمو والتكاثر، مستشفى جامعة كوبنهاغن، ريجشوسبيتاليت لمساعدتها بإعداد هذه الاختبارات اثنين. وأيد هذا العمل منح من "صندوق الابتكار" الدانمرك (أرقام المنح 005-2010-3 و 14-2013-4).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm pore filter Thermo Fisher Scientific, USA 296-4545
1 L measuring cylinder Thermo Fisher Scientific, USA 3662-1000
1, 4, and 2 mL plastic tubes Eppendorf, Germany 30120086 and 0030120094
12-channel pipette Eppendorf, Germany 4861000813
384 multi-well plates Greiner Bio-One, Germany 781096
15 and 50 mL platic tubes Eppendorf, Germany 0030122151 and 30122178
A2-slide ChemoMetec, Denmark 942-0001
Automatic repeater pipette Eppendorf, Germany 4987000010
CaCl2
Centrifuge
Clean wide-mouthed plastic container for semen sample
Dimethyl sulfoxide (DMSO)
FITC-coupled lectin of Pisum sativum (FITC-PSA) Sigma-Aldrich, Germany L0770
Fluo-4 AM Thermo Fisher Scientific, USA F14201
FLUOstar OMEGA fluorescence microplate reader BMG Labtech, Germany
Glucose anhydrous
HEPES
Hoechst-33342 ChemoMetec, Denmark 910-3015
Human serum albumin (HSA) Irvine Scientific 9988 For addition to HTF+
Immobilizing solution containing 0.6 M NaHCO3 and 0.37% (v/v) formaldehyde in distilled water
Incubator
KCl
KH2PO4
Magnetic stirrer
MgSO4
Na-Lactate
NaCl
NaHCO3
NC-3000 image cytometer ChemoMetec, Denmark 970-3003
Pipettes and piptting tips
propidium iodide (PI) ChemoMetec, Denmark 910-3002
Purified water
Rack for placing 50 mL plastic tubes in 45° angle
S100 buffer ChemoMetec, Denmark 910-0101
SP1-cassette ChemoMetec, Denmark 941-0006
Volumetric flasks of appropriate sizes
Vortexer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrinology. 157, (11), 4297-4308 (2016).
  3. Brenker, C., et al. Synergistic activation of CatSper Ca2+ channels in human sperm by oviductal ligands and endocrine disrupting chemicals. Human Reproduction (Oxford, England). 33, (10), 1915-1923 (2018).
  4. Brenker, C., et al. The CatSper channel: a polymodal chemosensor in human sperm. The EMBO Journal. 31, (7), 1654-1665 (2012).
  5. Brenker, C., et al. Action of steroids and plant triterpenoids on CatSper Ca2+ channels in human sperm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115, (3), E344-E346 (2018).
  6. Rehfeld, A., et al. Chemical UV filters can affect human sperm function in a progesterone-like manner. Endocrine Connections. (2017).
  7. Egeberg Palme, D. L., et al. Viable acrosome-intact human spermatozoa in the ejaculate as a marker of semen quality and fertility status. Human Reproduction. Oxford, England. (2018).
  8. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  9. Publicover, S. J., et al. Ca2+ signalling in the control of motility and guidance in mammalian sperm. Frontiers in Bioscience. 13, 5623-5637 (2008).
  10. Publicover, S., Harper, C. V., Barratt, C. [Ca2+]i signalling in sperm--making the most of what you've got. Nature Cell Biology. 9, (3), 235-242 (2007).
  11. Lishko, P. V., et al. The control of male fertility by spermatozoan ion channels. Annual Review Of Physiology. 74, 453-475 (2012).
  12. Morris, J., et al. Cell-penetrating peptides, targeting the regulation of store-operated channels, slow decay of the progesterone-induced [Ca2+]i signal in human sperm. Molecular Human Reproduction. 21, (7), 563-570 (2015).
  13. Strünker, T., et al. The CatSper channel mediates progesterone-induced Ca2+ influx in human sperm. Nature. 471, (7338), 382-386 (2011).
  14. Lishko, P. V., Botchkina, I. L., Kirichok, Y. Progesterone activates the principal Ca2+ channel of human sperm. Nature. 471, (7338), 387-391 (2011).
  15. Miller, M. R., et al. Unconventional endocannabinoid signaling governs sperm activation via the sex hormone progesterone. Science (New York, N.Y.). 352, (6285), 555-559 (2016).
  16. Revelli, A., et al. Follicular fluid content and oocyte quality: from single biochemical markers to metabolomics. Reproductive Biology And Endocrinology RB&E. 7, 40 (2009).
  17. Lyons, R. A., Saridogan, E., Djahanbakhch, O. The effect of ovarian follicular fluid and peritoneal fluid on Fallopian tube ciliary beat frequency. Human Reproduction. 21, (1), Oxford, England. 52-56 (2006).
  18. Eisenbach, M., Giojalas, L. C. Sperm guidance in mammals - an unpaved road to the egg. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 7, (4), 276-285 (2006).
  19. Alasmari, W., et al. The clinical significance of calcium-signalling pathways mediating human sperm hyperactivation. Human Reproduction. 28, (4), Oxford, England. 866-876 (2013).
  20. Alasmari, W., et al. Ca2+ signals generated by CatSper and Ca2+ stores regulate different behaviors in human sperm. The Journal of Biological Chemistry. 288, (9), 6248-6258 (2013).
  21. Tamburrino, L., et al. The CatSper calcium channel in human sperm: relation with motility and involvement in progesterone-induced acrosome reaction. Human Reproduction. 29, (3), Oxford, England. 418-428 (2014).
  22. Krausz, C., et al. Intracellular calcium increase and acrosome reaction in response to progesterone in human spermatozoa are correlated with in-vitro fertilization. Human Reproduction. 10, (1), Oxford, England. 120-124 (1995).
  23. Oehninger, S., et al. Defective calcium influx and acrosome reaction (spontaneous and progesterone-induced) in spermatozoa of infertile men with severe teratozoospermia. Fertility and Sterility. 61, (2), 349-354 (1994).
  24. Shimizu, Y., Nord, E. P., Bronson, R. A. Progesterone-evoked increases in sperm [Ca2+]i correlate with the egg penetrating ability of sperm from fertile but not infertile men. Fertility and Sterility. 60, (3), 526-532 (1993).
  25. Falsetti, C., et al. Decreased responsiveness to progesterone of spermatozoa in oligozoospermic patients. Journal of Andrology. 14, (1), 17-22 (1993).
  26. Williams, H. L., et al. Specific loss of CatSper function is sufficient to compromise fertilizing capacity of human spermatozoa. Human Reproduction. 30, (12), Oxford, England. 2737-2746 (2015).
  27. Forti, G., et al. Effects of progesterone on human spermatozoa: clinical implications. Annales d'Endocrinologie. 60, (2), 107-110 (1999).
  28. Krausz, C., et al. Two functional assays of sperm responsiveness to progesterone and their predictive values in in-vitro fertilization. Human Reproduction. 11, (8), Oxford, England. 1661-1667 (1996).
  29. Kelly, M. C., et al. Single-cell analysis of [Ca2+]i signalling in sub-fertile men: characteristics and relation to fertilization outcome. Human Reproduction. 33, (6), Oxford, England. 1023-1033 (2018).
  30. Brown, S. G., et al. Homozygous in-frame deletion in CATSPERE in a man producing spermatozoa with loss of CatSper function and compromised fertilizing capacity. Human Reproduction. 33, (10), Oxford, England. 1812-1816 (2018).
  31. Avenarius, M. R., et al. Human male infertility caused by mutations in the CATSPER1 channel protein. American Journal of Human Genetics. 84, (4), 505-510 (2009).
  32. Smith, J. F., et al. Disruption of the principal, progesterone-activated sperm Ca2+ channel in a CatSper2-deficient infertile patient. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (17), 6823-6828 (2013).
  33. Hildebrand, M. S., et al. Genetic male infertility and mutation of CATSPER ion channels. European Journal of Human Genetics. 18, (11), 1178-1184 (2010).
  34. Avidan, N., et al. CATSPER2, a human autosomal nonsyndromic male infertility gene. European Journal of Human Genetic. 11, (7), 497-502 (2003).
  35. Zhang, Y., et al. Sensorineural deafness and male infertility: a contiguous gene deletion syndrome. BMJ Case Reports. 2009, (2009).
  36. Jaiswal, D., Singh, V., Dwivedi, U. S., Trivedi, S., Singh, K. Chromosome microarray analysis: a case report of infertile brothers with CATSPER gene deletion. Gene. 542, (2), 263-265 (2014).
  37. Visconti, P. E., Krapf, D., de la Vega-Beltrán, J. L., Acevedo, J. J., Darszon, A. Ion channels, phosphorylation and mammalian sperm capacitation. Asian Journal of Andrology. 13, (3), 395-405 (2011).
  38. Wassarman, P. M., Jovine, L., Litscher, E. S. A profile of fertilization in mammals. Nature Cell Biology. 3, (2), E59-E64 (2001).
  39. Leahy, T., Gadella, B. M. Sperm surface changes and physiological consequences induced by sperm handling and storage. Reproduction. 142, (6), Cambridge, England. 759-778 (2011).
  40. Suarez, S. S. Control of hyperactivation in sperm. Human Reproduction Update. 14, (6), 647-657 (2008).
  41. Liu, D. Y., Baker, H. W. Inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida. Biology of Reproduction. 48, (2), 340-348 (1993).
  42. Okabe, M. The cell biology of mammalian fertilization. Development. 140, (22), Cambridge, England. 4471-4479 (2013).
  43. Inoue, N., Satouh, Y., Ikawa, M., Okabe, M., Yanagimachi, R. Acrosome-reacted mouse spermatozoa recovered from the perivitelline space can fertilize other eggs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (50), 20008-20011 (2011).
  44. Jin, M., et al. Most fertilizing mouse spermatozoa begin their acrosome reaction before contact with the zona pellucida during in vitro fertilization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (12), 4892-4896 (2011).
  45. Hirohashi, N., Yanagimachi, R. Sperm acrosome reaction: its site and role in fertilization. Biology of Reproduction. 99, (1), 127-133 (2018).
  46. Liu, D. Y., Garrett, C., Baker, H. W. G. Acrosome-reacted human sperm in insemination medium do not bind to the zona pellucida of human oocytes. International Journal of Andrology. 29, (4), 475-481 (2006).
  47. Overstreet, J. W., Hembree, W. C. Penetration of the zona pellucida of nonliving human oocytes by human spermatozoa in vitro. Fertility and Sterility. 27, (7), 815-831 (1976).
  48. Martins da Silva, S. J., et al. Drug discovery for male subfertility using high-throughput screening: a new approach to an unsolved problem. Human Reproduction. Oxford, England. 1-11 (2017).
  49. Zoppino, F. C. M., Halón, N. D., Bustos, M. A., Pavarotti, M. A., Mayorga, L. S. Recording and sorting live human sperm undergoing acrosome reaction. Fertility and Sterility. 97, (6), 1309-1315 (2012).
  50. Mata-Martínez, E., et al. Measuring intracellular Ca2+ changes in human sperm using four techniques: conventional fluorometry, stopped flow fluorometry, flow cytometry and single cell imaging. Journal of Visualized Experiments. (75), e50344 (2013).
  51. Egeberg, D. L., et al. Image cytometer method for automated assessment of human spermatozoa concentration. Andrology. 1, (4), 615-623 (2013).
  52. Nash, K., et al. Techniques for imaging Ca2+ signaling in human sperm. Journal of Visualized Experiments. (40), (2010).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics