Asgezegde circuit specifieke regulering van volwassen Hippocampal neurale precursor cellen

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het analyseren van gedrag van volwassen neurale stam/voorlopercellen in reactie op chemogenetische manipulatie van een specifiek lokaal neuraal circuit.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Quintanilla, L. J., Yeh, C. Y., Bao, H., Catavero, C., Song, J. Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59237, doi:10.3791/59237 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Volwassen neurogenese is een dynamisch proces waarbij nieuw geactiveerde neurale stamcellen (nscs) in de subgranulaire zone (sgz) van de getand gyrus (DG) nieuwe neuronen genereren, die integreren in een bestaand neurale circuit en bijdragen aan specifieke hippocampal functies . Belangrijk, volwassen neurogenese is zeer gevoelig voor milieu stimuli, die het mogelijk maakt voor activiteit afhankelijke regulering van verschillende cognitieve functies. Een breed scala van neurale circuits uit verschillende hersengebieden organiseert deze complexe cognitieve functies. Het is daarom belangrijk om te begrijpen hoe specifieke neurale schakelingen volwassen neurogenese reguleren. Hier beschrijven we een protocol voor het manipuleren van neurale circuit activiteit met behulp van Designer receptor uitsluitend geactiveerd door designer drugs (DREADDs) technologie die NSCs en pasgeboren nakomelingen bij knaagdieren reguleert. Dit uitgebreide protocol omvat stereotaxic injectie van virale deeltjes, chemogenetische stimulatie van specifieke neurale circuits, thymidine analoge toediening, weefsel verwerking, immunofluorescentie labeling, confocale beeldvorming en beeldvorming analyse van verschillende stadia van neurale precursor cellen. Dit protocol bevat gedetailleerde instructies over de technieken voor het ophalen van antigeen die worden gebruikt om NSCs en hun nakomelingen te visualiseren en beschrijft een eenvoudige, maar effectieve manier om hersencircuits te moduleren met behulp van Clozapine N-oxide (CNO) of CNO-bevattende drinkwater en DREADDs-het uiten van virussen. De kracht van dit protocol ligt in het aanpassingsvermogen om een breed scala aan neurale circuits te bestuderen die invloed hebben op volwassen neurogenese die zijn afgeleid van NSCs.

Introduction

Volwassen neurogenese is een biologisch proces waarbij nieuwe neuronen worden geboren in een volwassene en geïntegreerd in de bestaande neurale netwerken1. Bij de mens, dit proces vindt plaats in de getand gyrus (DG) van de hippocampus, waar ongeveer 1.400 nieuwe cellen worden geboren elke dag2. Deze cellen bevinden zich in het binnenste gedeelte van het DG, dat een neurogene niche herbergt, aangeduid als de subgranulaire zone (SGZ). Hier, hippocampal volwassen neurale stamcellen (NSCs) ondergaan een complex ontwikkelingsproces volledig functionele neuronen die bijdragen aan de regulering van specifieke hersenfuncties, met inbegrip van leren en geheugen, stemming verordening, en stress response3 worden ,4,5,6. Om gedragingen te beïnvloeden, worden volwassen NSCs sterk gereguleerd door verschillende externe stimuli in een activiteitsafhankelijke manier door te reageren op een array van lokale en distale chemische signalen. Deze chemische aanwijzingen omvatten neurotransmitters en neuro modulatoren en handelen in een circuit specifieke manier uit verschillende hersengebieden. Belangrijk is dat de brede convergentie van deze chemische signalen op NSCs een unieke en precieze regulering van stamcel activering, differentiatie en noodlotbeslissingen mogelijk maakt.

Een van de meest effectieve manieren om circuit regulering van volwassen NSCs in vivo te interromen is door immunofluorescentie analyse te koppelen aan schakelingen met een breed circuit. Immunofluorescentie analyse van volwassen NSCs is een algemeen gebruikte techniek, waarbij antilichamen tegen specifieke moleculaire markers worden gebruikt om de ontwikkelingsfase van volwassen NSCs aan te duiden. Deze markers omvatten: nestin als een radiale glia cel en vroege neurale voorlopercellen marker, Tbr2 als een tussenliggende voorlopercellen marker, en DCX als een neuro blast en onvolgroeide neuron marker7. Bovendien, door het toedienen van thymidine analogen zoals Brdu, cidu, Idu, en edu, kunnen celpopulaties die S-fase ondergaan individueel worden gelabeld en gevisualiseerd8,9,10. Door deze twee benaderingen te combineren, kan een breed scala aan vragen worden onderzocht, variërend van hoe proliferatie wordt gereguleerd in specifieke ontwikkelingsstadia, tot hoe verschillende signalen de NSC-differentiatie en neurogenese beïnvloeden.

Verschillende opties bestaan om effectief te manipuleren neurale circuits met inbegrip van elektrische stimulatie, optogenetics, en chemogenetica, elk met hun eigen voor-en nadelen. Elektrische stimulatie omvat een uitgebreide operatie waarbij elektroden worden geïmplanteerd naar een specifieke hersenregio die later worden gebruikt voor het verzenden van elektrische signalen om een gerichte hersenregio te moduleren. Echter, deze aanpak mist zowel cellulaire en circuit specificiteit. Optogenetics omvat de levering van virale deeltjes die coderen een licht geactiveerde receptor die wordt gestimuleerd door een laser uitgezonden door een geïmplanteerde optische vezel, maar vereist uitgebreide manipulaties, grote kosten, en complexe operaties11. Chemogenetics omvat de levering van virale deeltjes die coderen een ontwerper receptor uitsluitend geactiveerd door designer drugs of DREADDs, die vervolgens worden geactiveerd door een specifieke en biologisch inert ligand bekend als Clozapine N-oxide (CNO)12 . Het voordeel van het gebruik van DREADDs voor het manipuleren van lokale neurale circuits die volwassen NSCs reguleren ligt in het gemak en verschillende routes van CNO administratie. Dit zorgt voor een minder tijdrovende aanpak met verminderde behandeling van dieren, die gemakkelijk aanpasbaar is voor lange termijn studies om neurale circuits te moduleren.

De aanpak beschreven in dit protocol is een uitgebreide verzameling van verschillende protocollen die nodig zijn om met succes te interroten circuit regulering van volwassen hippocampal neurogenese die zowel immunofluorescentie technieken en circuit manipulaties combineert met behulp van chemogenetica. De in het volgende protocol beschreven methode is geschikt voor het stimuleren of remmen van één of meerdere circuits tegelijkertijd in vivo om hun regelgevende functie bij volwassen neurogenese te bepalen. Deze aanpak wordt het best gebruikt als de vraag niet een hoge mate van temporele resolutie nodig heeft. Vragen die nauwkeurige temporele controle van stimulatie/remming op een bepaalde frequentie, kunnen beter worden aangepakt met behulp van optogenetics13,14. De hier beschreven aanpak is gemakkelijk aangepast voor lange termijn studies met minimale behandeling van dieren, vooral wanneer stress een grote zorg is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedures, waaronder dierproef personen, zijn goedgekeurd door het institutioneel Dierenzorg-en gebruiks Comité (IACUC) aan de Chapel Hill van de University of North Carolina.

1. stereotaxic injectie van virale deeltjes

  1. Bepaal de betrokken neurale circuits. Dit zal bepalen het virus en de muis lijn gebruikt voor de volgende procedure.
    Opmerking: Voor dit voorbeeld worden contralaterale Mossy celprojecties gestimuleerd om de effecten ervan op volwassen neurogenese te analyseren. Virale deeltjes coderen AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry worden geleverd aan het DG van 5ht2A-CRE muizen15.
  2. Toediening van Meloxicam (5 mg/kg, subcutaan) ten minste 30 min pre-operatief om preventieve analgesie te verlenen aan een 8-weekse mannelijke heterozygoot 5ht2A-CRE muis.
  3. Anesthetiseer de muis met behulp van een 4% Isofluraan zuurstof mengsel totdat de ademhaling vertraagt en de muis bewusteloos met behulp van een Isofluraan kamer. Teen knijp de muis om ervoor te zorgen dat het niet reageert.
  4. Plaats de muis in de stereotax op een kleine dieren verwarmingspad voor thermische regulatie en breng oogsmeer middel aan op elk oog. Reduceer Isofluraan tot 1,5% zodra het dier binnen de stereotax is.
    Opmerking: De plaatsing van de oorschelpen in deze fase is belangrijk. Zorg ervoor dat het hoofdniveau na de plaatsing van de oorstang is. Meer gedetailleerde instructies kunnen worden gevonden in Geiger et al.16.
  5. Plaats het ontharings product op het hoofd en laat het maximaal 1 min. maximaal zitten. Verwijder het haar door het hoofd met ethanol doekjes te vegen. Als het haar niet volledig is verwijderd, herhaalt u dit proces totdat de bovenkant van het hoofd haarloos is.
  6. Desinfecteer het haarloze gebied met een Povidon-jodiumoplossing ten minste 3 keer.
  7. Plaats actuele lidocaïne oplossing op de haarloze huid van het hoofd en wacht 1 minuut. Verwijder actuele lidocaïne uit het hoofd en maak een kleine incisie op het hoofd vanaf het begin van de ogen tot het begin van de oren ongeveer 2 mm met behulp van een chirurgische scalpel.
    Opmerking: Teen knijpen de muis om ervoor te zorgen dat het volledig is verdoofd voordat het maken van incisies.
  8. Trek de hoofdhuid in en reinig het bindweefsel op de bovenkant van het hoofd met behulp van gesteriliseerde wattenstaafjes totdat de bregma gemakkelijk identificeerbaar is.
  9. Lokaliseer de bregma en stel het hoofd zo in dat de bregma en Lambda beide in hetzelfde vlak liggen door de boor op beide coördinaten te plaatsen en te verzekeren dat ze zich uitlijnen. Daarnaast lijnt u de linker-en rechter hemisfeer uit door de boor links/rechts van een gebied tussen bregma en Lambda te plaatsen.
    Opmerking: Deze stap is zeer belangrijk; onjuist uitgelijnde hoofd plaatsing zal stereotaxic coördinaten verstoren.
  10. Boor op de volgende coördinaten van bregma met behulp van een 0,5 mm boor: anterieure posterieure as (AP)-2,00 mm, mediale laterale as (ML) + 1,50 mm. Maak een boorgat van 0,5 mm tot 1 mm diameter.
    Opmerking: Wijzig deze stap met coördinaten die specifiek zijn voor het betreffende circuit. Dit voorbeeld richt zich op een unilaterale getand gyrus met Mossy cellen en bepaalt hun effect op volwassen neurale stamcellen op de contralaterale zijde.
  11. Stel de boor in op een spuit van 5 μL en een naald van 26 − 33 G. Nul bij bregma en Injecteer vervolgens op de volgende coördinaten door het plaatsen van de naald in het boorgat op anterieure posterieure as-2,00 mm, mediale laterale as-1,50 mm, dorsale ventrale as-2,3 mm.
  12. Infuse 500 nL van adeno-geassocieerde virus (AAV) van een virale kern of commerciële bron naar de juiste hemisfeer, bij 50 − 100 nL/min met behulp van een infusiepomp (tabel met materialen). Wacht minstens 5 min na de injectie voordat u de naald langzaam uit de hersenen verwijdert.
    Opmerking: Deze coördinaten kunnen aangepast worden op basis van leeftijd en grootte van de muis. Bepaalde virale serotypes hebben verschillende diffusie patronen, het is het beste om proef experimenten uit te voeren om virale verspreiding te testen voor een compleet experiment.
  13. Reinig de hoofdhuid en de huid rond incisie met behulp van zoutoplossing, dan afdichting incisie met behulp van weefsellijm (tabel van materialen) terwijl het houden van de huid samen met pincet. Voer alle postoperatieve procedures zoals bewaking tijdens het herstel op een verwarmingspaneel uit totdat de muis actief is, pijnstillend op de wond toepast en pijnstillers gedurende twee dagen toedienen.
    Opmerking: Veel experimenten vereisen 2 − 4 weken wachttijd na virale infusie voor een goede virale expressie.

2. Clozapine N-oxide administratie

  1. Bereid een voorraad CNO oplossing door het oplossen van 10 mg CNO in 100 μL van Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) en vortexing.
    Opmerking: Als de oplossing niet volledig oplost, verhoging van het volume van DMSO, maar te veel DMSO kan het water bitter maken. Niet overschrijden 0,1% DMSO in CNO wateroplossing of meer dan 200 μL DMSO voor een 200 mL oplossing. CNO Stock Solution kan gedurende maximaal twee weken bij-20 °C worden bewaard.
  2. Voeg 10 − 50 μL 10 mg/100 μL CNO-stamoplossing toe aan elke 200 mL water voor een uiteindelijke concentratie van 1 − 5 mg/200 mL. Bereid het CNO water mengsel elke dag vers.
    Opmerking: Sommige groepen hebben tot 1% sacharine in het water aangevuld om bitterheid te maskeren als muizen afzien van drinken. Het onderzochte circuit toonde een andere respons op basis van de mate van activatie. Over het algemeen is 1 mg CNO/200 mL voldoende om de meeste circuits17te stimuleren.
  3. Plaats de CNO oplossing in een folie bedekt of licht beschermde container bij toediening aan muizen twee weken na herstel van stereotaxic injectie uit stap 1,13 over een periode van 4 dagen.
    Opmerking: CNO is lichtgevoelig; Verminder de blootstelling aan licht tijdens het hele proces.
  4. Meet en registreer verbruikte CNO water Solution elke dag bij het bereiden van verse CNO oplossing. Gemiddeld zal een volwassen muis ongeveer 4 mL CNO water mengsel consumeren. Bovendien, record muisgewicht dagelijks om ervoor te zorgen dat ze drinken.
  5. Zorg ervoor dat de juiste besturingselementen worden gebruikt voor elk experiment. Voeg zowel een CNO-als een DREADD-besturingselement toe. Een voorbeeld van een experimentele opstelling zou zijn: (1) voertuig + autonoom amfibische voertuig (AAV) met virale reporter no DREADD, (2) CNO + AAV met virale reporter no DREADD, en (3) CNO + AAV DREADD.
    Opmerking: Alle groepen bevatten DMSO in de oplossing. DMSO-besturingselementen zijn niet inbegrepen omdat dieren minder dan 0,1% DMSO ontvangen, waarvan niet is aangetoond dat ze nadelige effecten hebben op volwassen neurale stamcellen in muizen. Als er bezorgdheid over DMSO gebruik in drinkwater, voeg een extra geen DMSO en zoutoplossing controle.

3. thymidine analoge labeling

  1. Op weefsel verzameling dag, 4 dagen na toediening van CNO, label prolifererende cellen door het uitvoeren van een reeks van thymidine analoge, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (edu) intraperitoneale injecties.
    Opmerking:
    dit protocol maakt gebruik van edu. Er zijn echter verschillende thymidine-analogen die op efficiënte wijze prolifererende celpopulaties kunnen labelen, waaronder Brdu, Idu en Cidu8.
    1. Weeg edu af en los op in veterinaire klasse 0,9% natriumchlorideoplossing voor injectie op 4 mg/ml door grondig en gedurende 15 minuten op een rotor te plaatsen.
      Opmerking: Thymidine-analogen zijn giftig en lichtgevoelig. Volg materiaalveiligheidsinformatiebladen (MSD'S) bij het hanteren en afdekken van de oplossing tegen blootstelling aan licht met aluminiumfolie.
    2. Dien edu intraperitoneaal toe bij 40 mg/kg of 0,1 ml/10 g lichaamsgewicht van de 4 mg/ml edu-oplossing 4 maal elke 2 uur.
      Opmerking: Doses boven 50 mg/kg bereiken in de buurt van verzadiging niveaus en zal niet verhogen de hoeveelheid gelabelde prolifererende cellen aanzienlijk18. Het is van cruciaal belang dat alle muizen dezelfde hoeveelheid edu-injecties krijgen, omdat onjuiste labeling de resultaten scheef kan trekken.

4. weefsel voorbereiding en-verwerking

  1. Twee uur na de laatste edu-injectie, anesthetiseer de muis met behulp van een Isofluraan kamer totdat de ademhaling aanzienlijk is verminderd en teen knijpen om ervoor te zorgen dat het volledig is verdoofd.
  2. Bevestig de muis aan het oppervlak met behulp van naalden en maak een kleine incisie bloot het hart. Plaats een 25 G naald in de linker aorta en snijd de rechter ventrikel voor transcardial perfusie met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) met een debiet van 1 − 4 mL/min tot het leverweefsel wordt gewist.
  3. Schakel de perfusie oplossing naar 4% Paraformaldehyde (PFA) en parfumeer rond 15 − 20 mL om hersenweefsel te repareren.
    Opmerking: Meer gedetailleerde instructies over het perfusie proces zijn te vinden in Gage et al.19. Dieren tremoren zullen worden waargenomen wanneer ze goed worden gedaan.
  4. Verwijder het hoofd met een paar grote schaar en voer vervolgens een reeks zorgvuldige incisies uit om de hersenen van de schedel te bevrijden. Bewaar hersenweefsel bij 4 °C in 4% PFA 's nachts om de fixatie voort te zetten.
  5. Verwijder het hersenweefsel van 4% PFA-oplossing en plaats in een 10% sucrose-oplossing in PBS op cryoprotect-weefsel voor 24 uur bij 4 °C. Breng vervolgens weefsel over naar een PBS-oplossing van 30% sucrose voor nog eens 24 uur bij 4 °C vóór het snijden.
    Opmerking: Hersenweefsel zal zinken in sucrose wanneer klaar voor microtoom snijden. Hersenweefsel kan lange termijn worden opgeslagen in 30% sucrose.
  6. Sectie hersenweefsel coronally in 40 μm secties met behulp van een microtoom. Verzamel secties die beginnen bij het begin van de getand gyrus, ongeveer-1,20 mm van bregma, en eindigend nadat de plaat compleet is met het eerste deel dat de meest anterieure is en het laatste deel de meest posterior is. Raadpleeg een muis-hersen Atlas om nauwkeurig de coördinaten van het DG en de start weefsel verzameling te identificeren.
  7. Bewaar elke sectie in rijen van 6 in een 48-put gevuld met antivriesoplossing (tabel 1).
Antivriesoplossing Ethyleenglycol 150 mL + sucrose 150 g + vulling tot 500 mL 0,1 M PB voor 500 mL oplossing
Citraat buffer 9 mL citroenzuur kolf + 41 mL Tri-sodium citraat buffer + 450 mL ddH2O
Citroenzuur voorraad [0,1 M] Citroenzuur 21 g/1 L ddH2O
Tri-sodium citraat kolf [0,1 M] Tri-Natriumcitraat 29,4 g/1 L ddH2O
Tris gebufferde zoutoplossing-Triton (TBS-Triton) 0,05% 100-x Triton in TBS
Permeabilization buffer 0,5% 100-x Triton in TBS
Blokkerende buffer 0,33 mL Ezelserum in 10 mL TBS-Triton
Edu-reactie oplossing Maak een CuSO4· 5H2o oplossing door toevoeging van 1 mg CuSO4· 5H2o in 4 ml oplossing van [0,1 M] tris pH 8,5. Voeg vervolgens 1:40 van een 600 μM Alexa488-azide oplossing en 10 mg/mL L-na+ ascorbaat aan de CuSO4· 5H2O oplossing voor het aanbrengen op weefsel.

Tabel 1: oplossingen die worden gebruikt voor immunohistochemie.

5. immunohistochemie

  1. Basis zwevend Protocol
    Opmerking: Als kleuring nestin, overslaan sectie 5,1 en ga verder naar sectie 5,2. Het Basic Floating protocol is voor Tbr2 of doublecortin (DCX) alleen zonder thymidine analoge edu-kleuring.
    1. Transfer secties van de antivriesoplossing naar tris-buffered saline (TBS) in seriële volgorde in een 48 goed plaat.
    2. Was tweemaal in TBS-Triton (0,05% TBS-Triton, tabel 1) gedurende 5 minuten door de oplossing elke keer te zuigen tijdens het schudden of op een rocker bij lage snelheden.
    3. Permeabilize secties met behulp van permeabilization buffer (0,5% TBS-Triton, tabel 1) voor 20 − 30 min terwijl schudden bij lage snelheden.
    4. Maak de blokkerende buffer door 0,33 μL ezelserum toe te voegen aan 10 mL TBS-Triton. Maak vers en gebruik binnen 3 dagen.
    5. Aspirate permeabilization buffer en incuberen secties in blokkerende buffer voor 30 min tot 1 h bij kamertemperatuur (RT).
    6. Maak de primaire antilichaam oplossing in blokkerende buffer en voeg toe aan elke put. 500 μL/goed is voldoende om alle weefsel secties volledig te laten onderdompeling. Inincuberen 's nachts op RT op een rocker of Shaker.
    7. Aspirate-oplossing en spoel secties in TBS-Triton 3x voor 10 min elk om sporen van primair antilichaam te verwijderen.
    8. Inincuberen in de geconjugeerd secundair antilichaam tegen primaire antilichamen bereid in blokkerende bufferoplossing voor 2 uur op RT op een rocker.
    9. Was secties 3x voor 5 min elk in TBS-Triton en incuberen secties in 4 ′, 6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) oplossing (300 μM oplossing bij 1:100) verdund in PBS gedurende 15 minuten.
    10. Was secties 3x in PBS en monteer secties met behoud van seriële volgorde van voorste naar posterieure op een positief geladen glijbaan. Laat weefsel drogen bij RT totdat vocht zichtbaar verdwenen is, meestal ongeveer 2 − 5 min, voor het afdekken met de bevestigings media.
  2. Antigeen-opvraging
    Opmerking: Deze sectie is vereist voor nestin alleen. Als kleuring nestin, voer deze sectie voor de thymidine analoge kleuring (punt 5,3). Ga voor Tbr2 of DCX-kleuring met edu.
    1. Plaats weefsel secties in PBS en monteer 5 − 8 secties op een positief geladen Slide die de seriële volgorde van voorste naar posterior handhaaft. Laat weefsel secties drogen bij RT om zich volledig te houden aan dia's, wat ongeveer 2 − 5 minuten duurt. weefsel moet zichtbaar afwezig zijn van vocht.
    2. Bereid citraatbuffer (tabel 1) in een container, gewoonlijk een pipetpunt van 1.000 μL.
    3. Warmtecitraat buffer in een microgolf oven (1.000 W) gedurende 5 minuten totdat de oplossing kookt. Terwijl de oplossing is Verwarming, plaats gemonteerde secties in een 20-Slide glazen schuif houder. Plaats de schuif houder na 5 min voorzichtig met secties in de pipet doos.
    4. Stel de magnetron voeding in op 50% en kooktijd 7 min. Start een timer voor 7 minuten en kijk naar de magnetron. Tijdens deze 7 minuten, stop de magnetron wanneer de oplossing begint te koken en zet de magnetron na het koken stopt.
      Opmerking: Het doel van deze stap is om de watertemperatuur vlak onder de kooktemperatuur gedurende 7 minuten te houden. stop nadat de timer is opraakt, zelfs als de kooktijd op de magnetron niet is voltooid. Meer gedetailleerde instructies zijn te vinden in Hussaini et al.20.
    5. Neem de warme doos met citraat buffer en weefsel glaasjes en plaats deze in een ijsemmer om af te koelen. Deksel om te voorkomen dat ijs of andere materialen de oplossing binnendringen. Wacht ongeveer 30 minuten of totdat de oplossing cool is om aan te raken.
    6. Ga naar de thymidine analoge kleurings stap 5.3.2 als u de thymidine Analog gebruikt.
  3. Thymidine analoge kleuring
    Opmerking: Begin hier als kleuring edu en Tbr2 of edu en DCX.
    1. Plaats weefsel secties in PBS en monteer 5 − 8 secties op een positief geladen Slide die de seriële volgorde van voorste naar posterieure en dezelfde oriëntatie handhaaft. Laat weefsel secties drogen om volledig aan dia's te voldoen en teken vervolgens een rand met een hydrofobe pen of PAP.
    2. Permeabilize secties met permeabilization buffer (0,5% TBS-Triton) voor 20 − 30 min. Spoel vervolgens secties 2x met TBS-Triton voor 5 min elk.
      Opmerking: Permeabilization AIDS intracellulaire antilichamen penetratie. Permeabilization tijd kan worden aangepast afhankelijk van weefsel dikte en antilichaam efficiëntie. Als alternatief, kan men de concentratie van het wasmiddel verhogen om permeabilization potentie te verhogen. Echter, zorg moet worden genomen om niet permeabilize te lang omdat weefsel fragiliteit toeneemt met langdurige permeabilization tijd.
    3. Bereid de edu-reactie oplossing voor volgens tabel 1. De uiteindelijke concentratie van Alexa488-azide is 15 μM in 1 mL edu-reactie oplossing.
    4. Inbroed de delen in de edu-reactie oplossing gedurende 30 minuten tot 1 uur en spoel vervolgens 3x in TBS-Triton gedurende 5 minuten per stuk. Cover dia's in aluminiumfolie om te beschermen tegen licht na deze stap. Controleer in dit stadium of de edu-reactie werkt met behulp van een fluorescerende Microscoop. Edu gelabelde cellen zullen fluorescerenonder een epifluorescentie Microscoop.
  4. Gemonteerd weefsel sectie Protocol
    1. Blok weefsel secties gemonteerd op een dia van stap 5.3.4 met behulp van blokkerende buffer verhoogd in dezelfde dieren als het secundaire antilichaam, bijvoorbeeld, Donkey serum, voor 30 min tot 1 h en vervolgens was 2x in TBS-Triton voor 5 min elk.
    2. Bereid primair antilichaam (d.w.z. kip anti-nestin) oplossing tijdens de blokkerende stap door het mengen van primaire antilichamen in blokkerende bufferoplossing op 1:200. 250 μL per glijbaan volstaat om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig in de oplossing wordt ondergedompeld.
    3. Incuberen weefsel secties in een primaire antilichaam oplossing 's nachts op RT na het blokkeren van wasmiddel. Wijzig deze stap afhankelijk van het primaire antilichaam dat wordt gebruikt.
      Opmerking: Als antilichamen een hoge achtergrond-of niet-specifieke binding hebben, kan het inbroed bij 4 °C in plaats van RT de resultaten verbeteren. Antilichamen met een slechte weefsel penetratie kunnen worden overgelaten om 2 dagen te inbroed indien nodig.
    4. Inincuberen weefsel secties 3x in TBS-Triton gedurende 5 minuten om overtollig primair antilichaam te verwijderen. Vervolgens inincuberen weefsel secties in de geconjugeerde secundaire antilichamen (dat wil zeggen, Alexa 647 anti-kip op 1:200) bereid in blokkerende bufferoplossing voor 2 uur op rt.
    5. Inincuberen weefsel secties 3x in TBS-Triton gedurende 5 minuten om overtollig secundair antilichaam te verwijderen en 300 μM DAPI-oplossing toe te passen bij 1:100 in PBS gedurende 15 minuten bij RT.
    6. Inincuberen weefsel secties 3x in PBS gedurende 5 minuten om overtollige DAPI te verwijderen en verwijder de pap-pen cirkel van rond weefsel met behulp van een wattenstaafje of een delicate taak wissen. Laat de secties drogen en breng vervolgens de montage media en de Afdekstrook aan. Laat het monteren van media drogen voor de Imaging slides.

6. afbeeldingen verzamelen

  1. Blinde experimentele groepen uit controlegroepen door het bedekken van diapabels en beeld aan dezelfde kant van DG met behulp van een confocale Microscoop (tabel van materialen) met 40x olie vergroting optische lens bij 1 μm stapgrootte of een 20x 2x zoom op 1 μm.
    Opmerking: De 40x olie vergroting zal een hogere resolutie geven, maar duurt langer dan de 20x 2x zoom.
  2. Stel objectief objectief in op 40x en klik vervolgens op het tabblad zoeken in de linkerbovenhoek van de confocale software (tabel met materialen) en stel het gewenste DG-gedeelte in het midden van het gezichtsveld in.
  3. Ga naar DG, ga naar het tabblad acquisitie in de linkerbovenhoek en vink de volgende vakjes aan: Z-stack, tile-scanen Position.
  4. Stel Kanaalinstellingen in tussen 600 − 750 Gain, 1% − 15% laserintensiteit en 1 − 10 offset. De laserintensiteit van 20% niet overschrijden voor een van de kanalen. Zorg ervoor dat er geen pixels oververzadigd zijn bij het instellen van Gain en intensity.
    Opmerking: Deze bereiken zullen variëren afhankelijk van de efficiëntie van de gebruikte apparatuur en de kleuring-efficiëntie.
  5. Stel de tegels in op 7 horizontaal met 3 verticaal in het venster tegel scan en druk op Scan overzichts afbeelding met dezelfde instellingen als die welke momenteel worden gebruikt. Gebruik bijvoorbeeld 7 horizontaal door 3 verticaal en de 20x-doelstelling met 2x zoom.
  6. Zorg ervoor dat het DG volledig binnen de verwachte afbeelding na scan van het overzicht is. Zo niet, pas dan de weergave van het DG aan totdat het volledig in de overzichts afbeelding staat, aangezien dit een representatieve afbeelding is die men zal verkrijgen.
  7. Stel de beeld diepte in door met de fijne focus knop door verschillende Z-stacks te scrollen. Zorg ervoor dat het gehele DG binnen het begin-en eindpunt valt. Uitgaande van een stapgrootte van 1 μm, moet elke afbeelding ongeveer 40 stappen zijn.
  8. Stel de scansnelheid in op 9 met bi-directionele scans en geen gemiddeldenin het venster acquisitie modus. Voeg vervolgens positie toe in het positie venster.
    Opmerking: Herhaal stap 6.3 − 6.8 om meerdere Dg's tegelijk te kunnen afbeelnen. Het verhogen van de scansnelheid verlaagt de beeldkwaliteit, maar vermindert de algehele beeldvormings tijd. Als de beeldkwaliteit te laag is, verlaagt u de scansnelheid of verhoogt u het gemiddelde.
  9. Klik op de knop experiment starten wanneer u klaar bent. Scan 5 delen van DG per muis langs de voorste naar posterieure as. Bijvoorbeeld, als de linker DG wordt afgebeeld voor sectie één, afbeelding de volgende meest posterieure linker DG voor sectie twee.
  10. Steek afzonderlijke afbeeldingen samen om een compleet beeld te vormen van de getand gyrus met behulp van de steek functie onder het tabblad proces in de confocale software. U ook Fiji (imagej) gebruiken om afbeeldingen samen te voegen om een volledige getand gyrus te vormen.
  11. Sla gestikte afbeeldingen op voor kwantificering.

7. beeldanalyse

  1. Open elke afbeelding van elke getand gyrus sectie met behulp van Fiji als een maximale projectie en als een samengestelde afbeelding met de kanalen samengevoegd in verschillende kleuren om eenvoudig te visualiseren colokalisatie.
  2. Meet het gebied van DG voor elke sectie van de maximale projectie afbeelding met behulp van het gereedschap Veelhoek selecteren (derde vak van links) en noteer voor elke sectie van elke muis. Dit is het gebied van DG dat wordt gebruikt om de dichtheid te berekenen.
  3. Noteer het aantal cellen in DG van de samengestelde afbeelding die colocaliseren primair antilichaam (dat wil zeggen, nestin) en de thymidine analoge edu, met behulp van de FIJI plugin cell counter gevonden onder plugins | Analyseer | celteller |teller van de cel. Noteer bovendien het totale aantal positieve en nestin-cellen van edu met een radiaal proces.
    Opmerking: In het geval van nestin, het is zeer belangrijk om aandacht te besteden aan de morfologie. Als u neurale stamcellen kwantificeert, moet u ervoor zorgen dat alleen cellen met een radiaal proces worden gekwantificeerd. Bij het kwantificeren van getand gyrus secties, dezelfde criteria toepassen op alle, met name bij het visualiseren van cellen buiten een brandvlak. Als cellen zich niet in het brandvlak bevinden, telt u ze niet. Raadpleeg West et al.21 voor meer gedetailleerde instructies over stereologische kwantificering.
  4. Voer het aantal cellen in een spreadsheet software in om later alle gegevens voor analyse te compileren.
  5. Bereken de dichtheid van de cogelokaliseerde cellen voor elke sectie door het totale aantal cogelokaliseerde cellen te delen door het totale volume voor elke sectie in elk dier. U bijvoorbeeld stamcel dichtheid verkrijgen door de som van nestin +/edu + cellen in één dier te delen door de som van het DG volume in één dier. Bereken het volume van elke sectie door het gebied te vermenigvuldigen met totale Z-stappen, ervan uitgaande dat elke stap 1 μm is.
    Opmerking: In dit protocol moeten de totale stappen dicht bij 40, omdat weefsel is verdeeld op 40 μm. Zorg ervoor dat elk dier een gegevenspunt is, aangezien het doel van deze aanpak is om de totale hoeveelheid cogelokaliseerde cellen in één halfrond van een Hippocampus te schatten.
  6. Voer extra noodzakelijke berekeningen uit voor de vraag die u probeert op te lossen. Bereken in dit voorbeeld het totale aantal prolifererende cellen, de totale stamcel populatie en het percentage prolifererende stamcellen na het stimuleren van contralaterale Mossy cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Na de hierboven beschreven experimentele procedures (Figuur 1a,B), waren we in staat om de effecten van het stimuleren van contralaterale Mossy Cell projecties op de neurogene niche binnen de Hippocampus te bepalen. Door gebruik te maken van een CRE-afhankelijke GQ-gekoppelde stimulerende DREADD virus in combinatie met een Mossy Cell labeling 5-HT2A CRE-Line, konden we selectief excitatory projecties van Mossy cellen op het contralaterale DG activeren en bepaalden dat sterke Mossy Cell stimulatie bevorderd stamcel quiescentie (figuur 1c). We hebben de juiste virale levering geverifieerd vóór de analyse van weefsel (Figuur 2a, B). Daarnaast hebben we de activatie van Mossy cellen geverifieerd via c-fos immunohistochemie experimenten (gegevens niet weergegeven). In het geval van onjuiste virale injectie, uitsluiten dier van verdere analyse. Een onjuiste injectie is een die niet de gewenste coördinaten target, heeft de meeste van de uitdrukking buiten de gewenste regio, of heeft weinig tot geen virale levering. Voor dit experiment, Mossy cellen in de Hilus van het DG waren de beoogde doel, en als injecties waren buiten de Hilus, ze werden uitgesloten. Door gebruik te maken van een thymidine analoog, edu en antigeen-opvraging voor de nestin-kleuring zoals beschreven in de paragrafen 5,2 en 5,3, waren we in staat om prolifererende neurale stamcellen met succes te labelen (Figuur 3a). Bovendien, door het weglaten van de antigeen retrieval stap, sectie 5,2, waren we in staat om Tbr2 positieve neurale voorlopercellen en neuro Blast te labelen, en DCX positieve neuro blast en onvolgroeide neuronen (Figuur 3a). We demonstreren een voorbeeld van het gebied gekwantificeerd en gebruikt om de dichtheid te berekenen en een voorbeeld te geven van gemonteerd weefsel op een glijbaan (Figuur 3b en figuur 4a). Bovendien worden zowel geslaagde als sub-par-experimenten aangeboden als verwijzingen naar experimentele benaderingen (figuur 4b). Tot slot zijn er verschillende kwantificaties die kunnen worden verkregen uit een geslaagd experiment (figuur 5a-D)15. De kwantificaties omvatten de dichtheid van prolifererende neurale stamcellen (Nestin +/edu +/volume), het percentage van prolifererende neurale stamcellen (Nestin +/edu +/totaal nestin), totale prolifererende cellen (edu +/volume) en totale stamcel groep (Nestin +/volume ). Bij contralaterale stimulatie van een Mossy cellen werd een afname van de proliferatie van neurale stamcellen waargenomen. Vergelijkbare kwantificaties kunnen worden verkregen voor neurale voorlopercellen en onvolgroeide neuronen met behulp van het juiste antilichaam.

Figure 1
Figuur 1: experimentele benadering van de regulatie van het testcircuit van volwassen neurale stamcellen. (A) Schematische voorstelling van de verschillende stappen die in het protocol worden beschreven. B) tijdlijn van de experimentele benadering die wordt gebruikt om Mossy cellen bij knaagdieren te stimuleren. C) injectie schematisch gericht op contralaterale Mossy cellen voor stimulatie. D) Schematische voorstelling van de ontwikkelings afstamming van volwassen neurale stamcellen in de subgranulaire zone (sgz), de submodule Cell Layer (gcl) en de moleculaire laag (ml) met overeenkomstige antilichamen die in verschillende ontwikkelingsstadia worden gebruikt. De verschillende ontwikkelingsstadia omvatten ofwel trillings-of geactiveerde radiale neurale stamcellen (NSC), neurale voorlopercellen (NP), neuro Blast (NB), onvolgroeide submodules (GC) en mature GC. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: demonstratie van effectieve virale afgifte. A) immunofluorescentie beelden van accurate virale afgifte. Virale deeltjes uitdrukken een mCherry fluorescerende label die Mossy cellen in de Hilus (witte boxed regio) richten. DAPI-etiketten celkernen. De beeld zijde van accurate virale levering toont duidelijke Mossy Fiber projecties van de contralaterale injectie zijde. B) immunofluorescentie beelden van niet-doelwit virale injecties. Merk op dat in dit geval contralaterale Mossy vezels afwezig zijn in de beeld zijde. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: analyse van prolifererende neurale stamcellen en nakomelingen. A) immunohistochemie beelden van thymidine analoge edu colocaliseren met specifieke cel fase markers nestin (neurale stamcellen en voor ouders), Tbr2 (neurale stamcellen, neurale voor ouders), en DCX (neuro Blast, onvolgroeide neuronen) aangegeven door witte pijlpunten. Schaalbalk = 10 μm.B) representatieve meting van het gebied binnen de gedentate gyrus die wordt gebruikt om de dichtheid te berekenen. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: demonstratie van immunofluorescentie preparaat. A) Schematische voorstelling van stereologische scheiding van gemonteerde weefsel secties van voorste naar posterieure as. Het rode vak geeft de afbeelding aan de zijkant aan. B) demonstratie van succesvolle en sub-par immunofluorescentie experimenten voor neuronale Lineage markers. Schaalbalk = 50 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: contralaterale activering van Mossy cellen vermindert neurale stamcel proliferatie. A) immunohistochemie-quantificaties van nestin +/edu +-cellen in het dentaat gyrus vertonen een afname van de proliferatie na stimulatie van contralaterale Mossy cellen. (B) afname van het percentage van prolifererende neurale stamcellen in de groep met geactiveerde contralaterale Mossy cellen. (C) er was geen significante verandering in de dichtheid van de neurale stamcel in beide groepen. D) er was geen verandering in de totale concentratie van prolifererende cellen in de gedentate gyrus. Waarden vertegenwoordigen betekent ± standaard meetfout. p < 0,05 (n = 3 voor controle, n = 5 voor de groep hM3D). Dit cijfer is aangepast van Yeh et al.15. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het doel van dit protocol is om te beoordelen hoe het manipuleren van specifieke neurale circuits volwassen hippocampal neurogenese in vivo met behulp van een reeks van immunohistochemie technieken regelt. Asgezegde activiteit afhankelijke regulering van volwassen neurogenese gemedieerd door specifieke neurale circuits is een waardevolle techniek met een groot potentieel voor modificaties om een divers bereik van neurale circuits te bestuderen. Het succes van dit soort experimenten is afhankelijk van meerdere factoren, waaronder accurate virale levering, goede virale selectie voor de gewenste manipulatie, juiste afgifte van een thymidine analoog, dier leeftijd, immunokleurings efficiëntie, succesvolle en onbevooroordeelde kwantificering van beelden. Onnauwkeurige virale bezorging kan bijvoorbeeld leiden tot doel effecten die resulteren in een fenotype dat geen verband houdt met het betrokken circuit. Bovendien kunnen immunofluorescentie technieken van lage kwaliteit het werkelijke aantal aanwezige cellen verbergen en daarom een fenotype produceren dat niet biologisch relevant is. Een andere zeer belangrijke factor om te controleren is de leeftijd van de muizen bij het uitvoeren van experimenten, gezien het feit dat volwassen neurogenese leeftijd afhankelijk is22. Tot slot is het belangrijk dat elke sectie ongescoord wordt. Om bias te verminderen, een methodische aanpak te volgen en ervoor te zorgen dat de persoon scoren is bedreven in het identificeren van de stadia van de ontwikkeling van volwassen NSC met behulp van morfologische informatie. Bovendien blind zowel controle-als behandelingsgroepen en onthullen hun identiteiten na beeld kwantificaties. Als extra maatregel om bias te verminderen, kunnen twee afzonderlijke individuen dezelfde gegevensset kwantificeren om de waargenomen resultaten te valideren.

Er zijn verschillende beperkingen in verband met deze aanpak voor het bestuderen van circuit activiteit afhankelijke regulering van volwassen NSCs en pasgeboren nakomelingen. De eerste beperking is dat deze benadering geen informatie verschaft over de specifieke celtypen binnen een circuit dat het algemene effect op NSCs van het manipuleren van het circuit in kwestie bemiddelend. Dit betekent dat, hoewel er mogelijk een fenotypische effect op volwassen NSCs, het effect kan optreden door middel van een of meerdere tussenliggende celtypen. Een efficiënte manier om deze zorg aan te pakken is om deze studies te koppelen aan elektrofysiologie om de tussenpersonen te pinnen. Een extra beperking van dit protocol is de noodzaak om ofwel een specifieke CRE Mouse (5-HTR2A) lijn of een virale constructie (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) die het gewenste circuit kan richten hebben. Als een effectieve cel specifieke CRE muis lijn is niet direct beschikbaar voor een kwestie van belang, de mogelijkheid om te studeren dit circuit wordt steeds moeilijker. Echter, veel celtypen in de hersenen hebben CRE specifieke muis lijnen. Een lagere beperking van dit protocol is gerelateerd aan CNO als een effectieve inerte ligand. Onlangs, studies aangetoond dat CNO, de inerte chemische stof gebruikt voor het activeren van DREADDs, metaboliseert naar Clozapine, die kan leiden tot gedrags fenotypes23. Een efficiënte manier om het adres is echter om op te nemen van de juiste controles in elk experiment. Een voorbeeld van de juiste besturingselementen omvat zowel een CNO en DREADD besturingselement, waarbij CNO wordt beheerd in combinatie met een Control reporter virus (AAV5-DIO-mCherry), en een zoutoplossing alleen bepalen waar geen CNO wordt toegediend aan een reporter virus groep. Door deze controles op te vallen, kunnen de effecten van alleen CNO worden geïsoleerd. Als alternatief, een secundair inert ligand bekend als C21, is onlangs aangetoond dat vergelijkbare werkzaamheid en potentie met geen bewezen gedragseffecten24. Tot slot regelt een laatste beperking van dit protocol de hoeveelheid CNO die elk dier tijdens het experiment verbruikt. Verschillende dieren drinken CNO-bevattende water in verschillende mate en kunnen daarom een reeks effecten hebben op volwassen neurogenese. Over het algemeen heeft een muis de neiging om ongeveer 4 mL CNO water te drinken in een periode van 24 uur. Dit betekent dat bij de concentratie van 1 mg/200 mL dieren een totaal van 0,02 mg CNO per dag krijgen, wat vergelijkbaar is met de hoeveelheid van een enkelvoudige CNO dosis intraperitoneaal geïnjecteerd. Indien tijdige gekoppelde toediening van CNO een probleem is, kan overschakelen naar intraperitoneale injecties een beter alternatief zijn.

Het voordeel van het gebruik van dit protocol is de mate van specificiteit die wordt bereikt bij het moduleren van volwassen neurogenese. Verleden neurogenese studies hebben gebruikt systemisch toegediende farmacologische agonist of antagonist moduleren circuit componenten. Deze niet-specifieke manipulaties kunnen fenotypische verschillen opleveren, maar bieden weinig inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij de regulering van volwassen neurale stamcellen. Bovendien kan dit protocol eenvoudig worden aangepast om verschillende circuit-brede effecten op volwassen neurogenese te onderzoeken. Bijvoorbeeld, door over te schakelen naar een remmende DREADD, of door te richten op een of meerdere hersengebieden in één keer, kan men een reeks vragen om te begrijpen van circuit specifieke regulering van volwassen neurogenese vragen. Een ander voordeel van het gebruik van dit protocol ten opzichte van eerdere benaderingen is dat, het gebruik van een nestin antilichaam elimineert transgene dierlijke fokken van fluorescently gecodeerde neurale stamcel verslaggevers zoals nestin: GFP, verhogen van de efficiëntie en het verkorten van de tijd per experiment8. Bovendien beperkt deze techniek de behandeling van knaagdieren bij het toedienen van CNO, waardoor de stress van het knaagdier tijdens experimenten afneemt. Het is belangrijk om stress te verminderen bij het bestuderen van stress-gevoelige processen. Ten slotte is deze aanpak gemakkelijk te verstellen om een gedrags test op te nemen, bijvoorbeeld, als men interesse had om te vragen of het contralaterale Mossy Cell circuit dat NSCs moduleert ook een rol speelt in ruimtelijk leren of stressbestendigheid.

De belangrijkste technische moeilijkheid bij het gebruik van deze aanpak is nauwkeurige virale levering. Een bedreven knaagdier chirurg worden neemt de praktijk en kan aanzienlijke probleemoplossing te nemen. Het is daarom raadzaam om een reeks van proef experimenten uit te voeren om virale titer te testen, efficiëntie te labelen en virale verspreiding. We hebben geconstateerd dat bepaalde serotypen verschillende verspreidingspatronen hebben en dat het serotype AAV2 minder dan AAV5 of AAV8 verspreidt. Bovendien is het het beste om een vertrouwde virale verpakkings provider te hebben voor elk van deze experimenten. Door het uitvoeren van piloot operaties kunnen veel van deze zorgen worden aangepakt en kan men tijd besparen. Het is ook aanbevolen dat één test verschillende CNO concentraties te stimuleren of remmen van de gewenste circuits. Over het algemeen zal 1 mg/kg geteste circuits voldoende activeren, maar bepaalde celtypen kunnen meer of minder CNO vereisen. Het is belangrijk op te merken dat de dosis van CNO administratie kan differentieel beïnvloeden bepaalde circuits specifiek bij het kijken naar iets zoals Mossy cellen15.

Alternatieve toepassingen van dit protocol zijn gelijktijdige gedragstesten, modulatie van alternatieve circuits, en aanvullende analyse van neurogenese functies. Om gedragstesten uit te voeren, kan men het protocol volgen dat wordt beschreven en na het beheren van CNO, een specifieke gedrags taak uitvoeren, zoals een nieuwe locatie test of een ruimtelijke navigatie taak. Het voordeel van deze aanpak is dat een enkel experiment zowel gedrags-en circuit specifieke informatie zou opleveren die kan leiden tot een circuit specifiek gedragsfenotype. Om alternatieve circuits te moduleren, kan men een combinatie van verschillende CRE-lijnen en virale vectoren gebruiken. Bijvoorbeeld, als men geïnteresseerd in het begrijpen van hoe remming van de Dopaminerge neuronen uit het ventrale tegmental gebied (VTA) of VTA moduleert volwassen neurogenese, men zou kunnen gebruiken een Tyrosine hydroxylase CRE muis lijn en Injecteer een CRE afhankelijke hM4D (remmende) DREADD virus in de VTA om te bepalen van de Dopaminerge specifieke regulering van volwassen neurogenese. De mogelijkheden om alternatieve hersengebieden te targeten met behulp van deze aanpak zijn enorm en kunnen strategisch worden gebruikt om dwingende neurale circuits te ondervragen. Tot slot, deze aanpak maakt het mogelijk om te onderzoeken van extra stadia van volwassen neurogenese. Als men bijvoorbeeld zou willen begrijpen hoe stimulerende Mossy cellen de arboriisatie of dendritische lengte van onvolgroeide neuronen beïnvloeden, zou men een soortgelijk protocol volgen, maar een alternatieve analyse uitvoeren, zoals sholl-analyse.

Samenvattend, dit protocol biedt een gedetailleerd stapsgewijze proces om te testen van de activiteit afhankelijke regulering van volwassen NSCs en neurogenese via DREADD technologie. De kracht van dit protocol ligt in zijn vermogen om gemakkelijk te worden aangepast om een breed scala aan vragen over circuit specifieke volwassen neurale stamcel regulering aan te pakken. Met de vooruitgang van de geclusterde, regelmatig intergespreide korte palindroom herhalingen (CRISPR) technologie, is het nu gemakkelijker om celspecifieke CRE muis lijnen te genereren om te koppelen met geavanceerde virale constructies om steeds complexere vragen te beantwoorden uitbreiding van de toepasbaarheid van dit protocol.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

L.J.Q. werd gesteund door het National Institute of Mental Health van de National Institutes of Health onder diversiteits supplement R01MH111773 evenals een T32 training Grant T32NS007431-20. Dit project werd gesteund door subsidies toegekend aan J.S. van NIH (MH111773, AG058160 en NS104530).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well Plate Thermo Fisher Scientific 07-200-84
48 Well Plate Denville Scientific T1049
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) Carbosynth NE08701
Alcohol 70% Isopropyl Thermo Fisher Scientific 64-17-5
Alcohol Prep Pads Thermo Fisher Scientific 13-680-63
Alexa-488 Azide Thermo Fisher Scientific A10266
Anti-Chicken Nestin Aves NES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCX Santa Cruz Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2 Thermo Fisher Scientific 14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Solution (povidone-iodine) Amazon
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) Sigma-Aldrich 251275
Clozapine N- Oxide Sigma-Aldrich C08352-5MG
Confocal Software (Zen Black) Zeiss Microscopy Zen 2.3 SP1 FP1 (black)
Copper (II) Sulfate Pentahydrate Thermo Fisher Scientific AC197722500
Cotton Swabs Amazon
Coverslip Denville Scientific M1100-02
Delicate Task Wipe Kimwipes Kimtech Science 7557
Drill Bit 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Ethylene Glycol Thermo Fisher Scientific E178-1
Hamilton Needle 2 inch Hmailton Company 7803-05
Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN Hmailton Company Ref: 87931
High Speed Drill Foredom 1474
Infusion Pump Harvard Apparatus 70-4511
Injectable Saline Solution Mountainside Health Care NDC 0409-4888-20
Insulin Syringe BD Ultra-Fine Insulin Syringes
Isoflurane Henry Schein 29405
Stereotax For Small Animal KOPF Instruments Model 942
Leica M80 Leica
Leica Microtome Leica SM2010 R
LSM 780 Zeiss Microscopy
Nair (Hair Removal Product) Nair
Paraformaldahyde 4% Sigma-Aldrich 158127
Plus Charged Slide Denville Scientific M1021
Phosphate Buffered Solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20 slide unit Electron Microscopy Science 70312-24
Slide Rack holder Electron Microscopy Science 70312-25
Small Animal Heating Pad K&H
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Super PAP Pen 4 mm tip PolySciences 24230
Surgical Scalpel MedPride 47121
Tris Buffered Solution (TBS) Sigma-Aldrich T5912
Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) Sigma-Aldrich C8532
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Tweezers Amazon
Vet Bond Tissue Adhesive 3M 1469SB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, (4), 645-660 (2008).
  2. Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153, (6), 1219-1227 (2013).
  3. Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40, (10), 2368-2378 (2015).
  4. Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
  5. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472, (7344), 466-470 (2011).
  6. Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. 1 (2018).
  7. Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. (2016).
  8. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
  9. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10, (2), 615-626 (2018).
  10. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53, (1), 198-214 (2007).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  12. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (12), 5163-5168 (2007).
  13. Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. (2015).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  15. Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. 1-18 (2018).
  16. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
  17. Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, (4), 683-694 (2016).
  18. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
  20. Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (2013).
  21. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, (4), 482-497 (1991).
  22. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16, (6), 2027-2033 (1996).
  23. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, (6350), 503-507 (2017).
  24. Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72, (3), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics