Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Quintanilla, L. J., Yeh, C. Y., Bao, H., Catavero, C., Song, J. Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells. J. Vis. Exp. (149), e59237, doi:10.3791/59237 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

La neurogénesis adulta es un proceso dinámico mediante el cual las células madre neurales recién activadas (NSC) en la zona subgranular (SGZ) del gyrus dentado (DG) generan nuevas neuronas, que se integran en un circuito neural existente y contribuyen a funciones específicas del hipocampo . Es importante destacar que la neurogénesis adulta es altamente susceptible a los estímulos ambientales, lo que permite la regulación dependiente de la actividad de varias funciones cognitivas. Una amplia gama de circuitos neuronales de varias regiones cerebrales orquesta estas complejas funciones cognitivas. Por lo tanto, es importante entender cómo los circuitos neuronales específicos regulan la neurogénesis adulta. Aquí, describimos un protocolo para manipular la actividad del circuito neural utilizando el receptor de diseño activado exclusivamente por la tecnología de drogas de diseño (DREADD) que regula los NSC y la progenie neonatal en roedores. Este protocolo integral incluye inyección estereotaxcócica de partículas virales, estimulación quimiogenética de circuitos neuronales específicos, administración analógica de timidina, procesamiento de tejidos, etiquetado de inmunofluorescencia, imágenes confocales e imágenes análisis de varias etapas de las células precursoras neuronales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre las técnicas de recuperación de antígenos utilizadas para visualizar los NSC y su progenie y describe una forma simple, pero eficaz de modular los circuitos cerebrales utilizando el óxido N de clozapina (CNO) o el agua potable que contiene CNO y Virus que expresan dREADDs. La fuerza de este protocolo radica en su adaptabilidad para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales que influyen en la neurogénesis adulta derivada de los NSC.

Introduction

La neurogénesis adulta es un proceso biológico por el cual nacen nuevas neuronas en un adulto e integradas en las redes neuronales existentes1. En los seres humanos, este proceso se produce en el gyrus dentalado (DG)del hipocampo, donde nacen alrededor de 1.400 nuevas células cada día 2. Estas células residen en la parte interna de la DG, que alberga un nicho neurogénico, llamado zona subgranular (SGZ). Aquí, las células madre neurales adultas hipocampales (NSC) se someten a un complejo proceso de desarrollo para convertirse en neuronas completamente funcionales que contribuyen a la regulación de funciones cerebrales específicas, incluyendo el aprendizaje y la memoria, regulación del estado de ánimo, y la respuesta al estrés3 ,4,5,6. Para influir en los comportamientos, los SCN adultos están altamente regulados por varios estímulos externos de una manera dependiente de la actividad respondiendo a una serie de señales químicas locales y distales. Estas señales químicas incluyen neurotransmisores y neuromoduladores y actúan de una manera específica de circuito de varias regiones cerebrales. Es importante destacar que la convergencia de circuito según estas señales químicas en los SCN permite una regulación única y precisa de las decisiones de activación, diferenciación y destino de células madre.

Una de las formas más efectivas de interrogar la regulación del circuito de los NSC adultos in vivo es emparejando el análisis de inmunofluorescencia con manipulaciones de circuitos anchos. El análisis de inmunofluorescencia de los SCN adultos es una técnica comúnmente utilizada, donde los anticuerpos contra marcadores moleculares específicos se utilizan para indicar la etapa de desarrollo de los SCN adultos. Estos marcadores incluyen: nestin como célula de glia radial y marcador de progenitor neural temprano, Tbr2 como marcadorde progenitor intermedio, y dcx como marcador de neurona neuroblast e inmaduro 7. Además, mediante la administración de análogos de timidina como BrdU, CidU, Idu, y Edu, las poblaciones celulares sometidas a la fase S se pueden etiquetar y visualizar individualmente8,9,10. Mediante la combinación de estos dos enfoques, se puede investigar una amplia gama de preguntas que van desde cómo se regula la proliferación en etapas específicas del desarrollo, hasta cómo diversas señales afectan a la diferenciación de nSC y la neurogénesis.

Existen varias opciones para manipular eficazmente los circuitos neuronales, incluyendo la estimulación eléctrica, la optogenética y la quimiogenética, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. La estimulación eléctrica implica una cirugía extensa donde los electrodos se implantan en una región cerebral específica que más tarde se utilizan para transmitir señales eléctricas para modular una región cerebral dirigida. Sin embargo, este enfoque carece de especificidad celular y de circuito. La optogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor activado por luz que es estimulado por un láser emitido a través de una fibra óptica implantada, pero requiere manipulaciones extensas, gran costo y cirugías complejas11. La quimiogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor de diseño activado exclusivamente por fármacos de diseño o DREADD, que posteriormente son activados por un ligando específico y biológicamente inerte conocido como óxido N de clozapina (CNO)12 . La ventaja de utilizar DREADD para manipular circuitos neuronales locales que regulan los SCN adultos radica en la facilidad y varias rutas de administración de CNO. Esto permite un enfoque menos lento con un manejo animal reducido, que es fácilmente adaptable para estudios a largo plazo para modular los circuitos neuronales.

El enfoque descrito en este protocolo es una colección completa de varios protocolos necesarios para interrogar con éxito la regulación del circuito de la neurogénesis del hipocampo adulto que combina tanto técnicas de inmunofluorescencia como manipulaciones de circuitos uso de la quimiogenética. El método descrito en el siguiente protocolo es adecuado para estimular o inhibir uno o varios circuitos simultáneamente in vivo para determinar su función reguladora en la neurogénesis adulta. Este enfoque se utiliza mejor si la pregunta no necesita un alto grado de resolución temporal. Las preguntas que requieren un control temporal preciso de la estimulación/inhibición a una frecuencia determinada, pueden abordarse mejor utilizando optogenética13,14. El enfoque descrito aquí se adapta fácilmente para estudios a largo plazo con un manejo mínimo de animales, especialmente cuando el estrés es una preocupación importante.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Todos los procedimientos, incluidos los sujetos de animales, han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Capilla de la Universidad de Carolina del Norte.

1. Inyección estereotaxica de partículas virales

  1. Determine los circuitos neuronales en cuestión. Esto determinará el virus y la línea del ratón utilizado para el siguiente procedimiento.
    NOTA: Para este ejemplo, se estimulan las proyecciones celulares musgosas contralaterales para analizar sus efectos en la neurogénesis adulta. Las partículas virales que codifican AAV5-hSyn-DIO-hM3Dq-mCherry se entregan a la DG de ratones 5ht2A-Cre15.
  2. Administrar meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) al menos 30 minutos de forma preoperatoria para proporcionar analgesia preventiva a un ratón heterocigoto 5ht2A-Cre macho de 8 semanas de edad.
  3. Anestetiza el ratón usando una mezcla de oxígeno isoflurano del 4% hasta que su respiración se desacelere y el ratón esté inconsciente usando una cámara de isoflurano. Pellizcar el ratón para asegurarse de que no responde.
  4. Coloque el ratón en el estereoimpuesto en una pequeña almohadilla de calentamiento animal para la regulación térmica y aplique lubricante para los ojos en cada ojo. Reducir el isoflurano a 1,5% una vez que el animal esté dentro de la estereotasa.
    NOTA: La colocación de la barra de oído durante esta etapa es importante. Asegúrese de que la cabeza esté nivelada después de la colocación de la barra del oído. Las instrucciones más detalladas se pueden encontrar en Geiger et al.16.
  5. Coloque el producto de depilación en la cabeza y déjelo reposar hasta 1 minuto como máximo. Retire el cabello limpiando la cabeza con toallitas de etanol. Si el cabello no se elimina por completo, repita este proceso hasta que la parte superior de la cabeza no sea saldepiz.
  6. Desinfectar la zona sin pelo con una solución de povidona-yodo al menos 3 veces.
  7. Colocar la solución tópica de lidocaína en la piel sin pelo de la cabeza y esperar 1 min. Retire la lidocaína tópica de la cabeza y haga una pequeña incisión en la cabeza desde el inicio de los ojos hasta el inicio de las orejas de unos 2 mm usando un bisturí quirúrgico.
    NOTA: Pellizcar el ratón con el dedo del ratón para asegurarse de que está completamente sedado antes de hacer cualquier incisión.
  8. Retraiga el cuero cabelludo y limpie el tejido conectivo en la parte superior de la cabeza usando hisopos de algodón esterilizados hasta que el bregma sea fácilmente identificable.
  9. Localice el bregma y ajuste la cabeza para que el bregma y el lambda estén en el mismo plano colocando el taladro en ambas coordenadas y asegurándose de que se alineen. Además, alinee el hemisferio izquierdo y derecho colocando el taladro a la izquierda/derecha de una región entre bregma y lambda.
    NOTA: Este paso es muy importante; la colocación de la cabeza mal alineada interrumpirá las coordenadas estereotaxias.
  10. Taladre las siguientes coordenadas de bregma utilizando una broca de 0,5 mm: eje posterior anterior (AP) -2,00 mm, eje lateral medial (ML) +1,50 mm. Haga un agujero de taladro de 0,5 mm a 1 mm de diámetro.
    NOTA: Modifique este paso con coordenadas específicas del circuito en cuestión. Este ejemplo se dirige a un génóxido dentado unilateral que contiene células musgosas y determina su efecto en las células madre neurales adultas en el lado contralateral.
  11. Cambie la broca a una jeringa de 5 l y una aguja de 26 a 33 G. Cero en bregma y luego inyectar en las siguientes coordenadas colocando la aguja en el orificio de perforación en el eje anterior anterior -2,00 mm, eje lateral medial -1,50 mm, eje ventral dorsal -2,3 mm.
  12. Infundir 500 nL de virus asociadoa a adeno (AAV) desde un núcleo viral o una fuente comercial al hemisferio adecuado, a 50 a 100 nL/min utilizando una bomba de perfusión (Tablade materiales). Espere al menos 5 minutos después de la inyección antes de retirar lentamente la aguja del cerebro.
    NOTA: Estas coordenadas pueden requerir un ajuste basado en la edad y el tamaño del ratón. Ciertos serotipos virales tienen diferentes patrones de difusión, es mejor realizar experimentos piloto para probar la propagación viral antes de un experimento completo.
  13. Limpie el cuero cabelludo y la piel alrededor de la incisión usando salina, luego selle la incisión usando adhesivo de tejido (Tablade Materiales)mientras sostiene la piel junto con pinzas. Realice todos los procedimientos postoperatorios, como la monitorización durante la recuperación en una almohadilla de calentamiento hasta que el ratón esté activo, la aplicación de analgésicos en la herida y la administración de analgésicos durante dos días.
    NOTA: Muchos experimentos requieren un tiempo de espera de 2 a 4 semanas después de la perfusión viral para una expresión viral adecuada.

2. Administración de óxido n de clozapina

  1. Preparar una solución de CNO en stock disolviendo 10 mg de CNO en 100 ml de dimetilsulfóxido (DMSO) y vórtice.
    NOTA: Si la solución no se disuelve por completo, aumente el volumen de DMSO, pero demasiado DMSO puede hacer que el agua amarga. No exceda el 0,1% de DMSO en la solución de agua CNO o más de 200 ml de DMSO para una solución de 200 ml. La solución de stock CNO se puede almacenar a -20 oC durante un máximo de dos semanas.
  2. Añadir una solución de CNO de 10 a 50 l de 10 mg/100 l a cada 200 ml de agua para una concentración final de 1 x 5 mg/200 ml. Prepare la mezcla de agua CNO fresca todos los días.
    NOTA: Algunos grupos han suplementado hasta 1% de sacarina en el agua para enmascarar la amargura si los ratones se abstienen de beber. El circuito investigado mostró una respuesta diferente basada en el grado de activación. En general, 1 mg CNO/200 ml es suficiente para estimular la mayoría de los circuitos17.
  3. Coloque la solución de CNO en un recipiente cubierto de papel de aluminio o protegido contra la luz cuando se administre a ratones dos semanas después de la recuperación de la inyección de esteretaxica del paso 1.13 durante un período de 4 días.
    NOTA: El CNO es sensible a la luz; reducir la exposición a la luz durante todo el proceso.
  4. Mida y registre la solución de agua CNO consumida todos los días al preparar una solución de CNO fresca. En promedio, un ratón adulto consumirá alrededor de 4 ml de mezcla de agua CNO. Además, registre el peso del ratón diariamente para asegurarse de que están bebiendo.
  5. Asegúrese de que se utilizan los controles adecuados para cada experimento. Incluya un control CNO y DREADD. Un ejemplo de una configuración experimental sería: (1) vehículo + vehículo anfibio autónomo (AAV) con reportero viral sin DREADD, (2) CNO + AAV con reportero viral sin DREADD, y (3) CNO + AAV DREADD.
    NOTA: Todos los grupos incluyen DMSO en la solución. Los controles DMSO no están incluidos porque los animales están recibiendo menos del 0,1% de DMSO, lo que no ha demostrado tener efectos adversos sobre las células madre neurales adultas en ratones. Si hay preocupaciones con respecto al uso de DMSO en el agua potable, agregue un adicional sin DMSO y control salino.

3. Etiquetado analógico de timidina

  1. El día de recolección de tejido, 4 días después de la administración de CNO, etiquetar las células que proliferan mediante la realización de una serie de inyecciones intraperitoneales análogas de timidina, 5-etil-2'-desoxiuridina (Edu).
    NOTA:
    Este protocolo utiliza Edu. Sin embargo, hay varios análogos de timidina que pueden etiquetar eficientementelas poblaciones celulares que proliferan, incluyendo Brdu, Idu y Cidu 8.
    1. Pesar Edu y disolver en grado veterinario 0.9% solución inyectable de cloruro de sodio a 4 mg/ml por vórtice y colocación en un rotor durante 15 min.
      NOTA: Los análogos de timidina son tóxicos y sensibles a la luz. Siga las hojas de datos de seguridad de materiales (MSDS) al manipular y cubrir la solución de la exposición a la luz utilizando papel de aluminio.
    2. Administrar Edu por vía intraperitoneal a 40 mg/kg o 0,1 mL/10 g de peso corporal de la solución Edu de 4 mg/ml 4 veces cada 2 h.
      NOTA: Las dosis superiores a 50 mg/kg alcanzan cerca de los niveles de saturación y no aumentarán significativamente la cantidad de células proliferantes etiquetadas18. Es crucial que todos los ratones reciban la misma cantidad de inyecciones de Edu, ya que el etiquetado incorrecto puede sesgar los resultados.

4. Preparación y procesamiento de tejidos

  1. Dos horas después de la última inyección de Edu, anestesia el ratón con una cámara de isoflurano hasta que la respiración se reduzca significativamente y pellizca los dedos de los dedos para asegurarse de que está completamente sedado.
  2. Asegure el ratón a la superficie usando agujas y haga una pequeña incisión exponiendo el corazón. Inserte una aguja de 25 G en la aorta izquierda y corte el ventrículo derecho para la perfusión transcardial con solución salina tamponada de fosfato (PBS) a un caudal de 1 x 4 ml/min hasta que se despeje el tejido hepático.
  3. Cambie la solución de perfusión a 4% de paraformaldehído (PFA) y percire alrededor de 15 a 20 ml para fijar el tejido cerebral.
    NOTA: Se pueden encontrar instrucciones más detalladas sobre el proceso de perfusión en Gage et al.19. Se observarán temblores de animales cuando se hagan correctamente.
  4. Retire la cabeza usando un par de tijeras grandes y luego realice una serie de incisiones cuidadosas para liberar el cerebro del cráneo. Almacene el tejido cerebral a 4 oC en 4% de PFA durante la noche para continuar la fijación.
  5. Retire el tejido cerebral de la solución de PFA al 4% y colóquelo en una solución de sacarosa al 10% en PBS para crioproteger el tejido durante 24 h a 4 oC. A continuación, transfiera el tejido a una solución de PBS de sacarosa del 30% para otras 24 h a 4 oC antes de la sección.
    NOTA: El tejido cerebral se hundirá en sacarosa cuando esté listo para la sección del microtome. El tejido cerebral se puede almacenar a largo plazo en 30% sacarosa.
  6. Seccionar el tejido cerebral coronalmente en secciones de 40 m utilizando un microtome. Recoger secciones que comienzan al inicio del gyrus dentate, alrededor de -1,20 mm de bregma, y terminando después de que la placa se completa con la primera sección siendo la más anterior y la última sección siendo la más posterior. Consulte un atlas cerebral de ratón para identificar con precisión la DG y las coordenadas de recolección de tejido inicial.
  7. Almacene en serie cada sección en filas de 6 en una placa de 48 pocillos llena de solución anticongelante (Tabla1).
Solución anticongelante Etilenglicol 150 mL + sacarosa 150 g + llenado a 500 mL 0,1 M PB para solución de 500 ml
Tampón de citrato 9 ml de caldo de ácido cítrico + 41 ml de tampón de citrato trisódico + 450 ml de ddH2O
Stock de ácido cítrico [0,1 M] Acido cítrico 21 g/1 L ddH2O
Stock de citrato de trisódico [0,1 M] Citrato de trisódico 29,4 g/1 L ddH2O
Tris Saline tamponado -Triton (TBS -Triton) 0.05% 100-x Triton en TBS
Zona de influencia de permeabilización 0.5% 100-x Triton en TBS
Bloqueo de búfer 0.33 mL Donkey Serum en 10 mL TBS-Triton
Solución de reacción Edu Realice una solución de CuSO4x 5H2O añadiendo 1 mg de CuSO4x 5H2O en una solución de 4 ml de [0,1 M] Tris pH 8,5. A continuación, agregue 1:40 de una solución Alexa488-azida de 600 m y 10 mg/ml de L-Na+ ascorbato a la solución de CuSO4x 5H2O antes de aplicarla sobre el tejido.

Tabla 1: Soluciones utilizadas para la inmunohistoquímica.

5. Inmunohistoquímica

  1. Protocolo flotante básico
    NOTA: Si tiñe la anidación, omita la sección 5.1 y proceda a la sección 5.2. El protocolo flotante básico es para Tbr2 o doublecortin (DCX) sólo sin tinción Edu analógica de timidina.
    1. Transfiera secciones de la solución anticongelante a la solución salina tris-buffered (TBS) en orden de serie en una placa de 48 pocillos.
    2. Lave las secciones dos veces en TBS-triton (0,05% TBS-triton, Tabla 1) durante 5 minutos aspirando la solución cada vez mientras agita o en un balancín a velocidades lentas.
    3. Permeabilice las secciones utilizando el búfer de permeabilización (0,5% TBS-triton, Tabla 1) durante 20 a 30 minutos mientras se agita a velocidades lentas.
    4. Realice el búfer de bloqueo agregando 0,33 ml de suero de burro a 10 ml de TBS-tritón. Hacer fresco y usar dentro de 3 días.
    5. Aspirar tampón de permeabilización e incubar secciones en tampón de bloqueo durante 30 min a 1 h a temperatura ambiente (RT).
    6. Haga la solución de anticuerpos primarios en el búfer de bloqueo y agréguela a cada pozo. 500 l/pozo es suficiente para que todas las secciones de tejido estén completamente sumergidas. Incubar durante la noche en RT en un balancín o coctelera.
    7. Aspirar las secciones de solución y enjuague en TBS-tritón 3x durante 10 min cada una para eliminar los rastros de anticuerpos primarios.
    8. Incubar en anticuerpos secundarios conjugados de fluoróforo contra anticuerpos primarios preparados en solución tampón de bloqueo durante 2 h a RT en un balancín.
    9. Lavar las secciones 3x durante 5 min cada una en TBS-triton y luego incubar secciones en solución de 4o,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (300 m de solución a 1:100) diluida en PBS durante 15 min.
    10. Lave las secciones 3x en PBS y monte secciones manteniendo el orden en serie de anterior a posterior en una diapositiva cargada positivamente. Deje que el tejido se seque en RT hasta que la humedad se haya ido visiblemente, generalmente unos 2 x 5 minutos, antes de cubrirse con medios de montaje.
  2. Recuperación de antígenos
    NOTA: Esta sección es necesaria solo para la anidación. Si tiñe la nido, realice esta sección antes de la tinción analógica de timidina (sección 5.3). Evite la tinción Tbr2 o DCX con Edu.
    1. Coloque las secciones de tejido en PBS y monte secciones de 5 a 8 en una diapositiva cargada positivamente manteniendo el orden en serie de anterior a posterior. Deje que las secciones de tejido se sequen en RT para adherirse completamente a los portaobjetos, lo que toma alrededor de 2 x 5 minutos.
    2. Prepare el tampón de citrato (Tabla1) en un recipiente, normalmente una caja de punta de pipeta de 1.000 ml.
    3. Caliente el tampón de citrato en un horno microondas (1.000 W) durante 5 min hasta que la solución esté hirviendo. Mientras la solución se está calentando, coloque las secciones montadas en un portaobjetos de vidrio de 20 diapositivas. Después de 5 min, coloque cuidadosamente el portaobjetos con secciones en la caja de pipetas.
    4. Ajuste la potencia del horno microondas al 50% y cocine el tiempo durante 7 minutos. Durante estos 7 minutos, detenga el microondas cuando la solución comience a hervir y continúe el microondas después de que se detenga la ebullición.
      NOTA: El objetivo de este paso es mantener la temperatura del agua justo debajo de la temperatura de ebullición durante 7 minutos. Las instrucciones más detalladas se pueden encontrar en Hussaini et al.20.
    5. Saque la caja caliente con tampón de citrato y diapositivas de tejido y colóquela en un cubo de hielo para enfriarla. Cubra para evitar que el hielo u otros materiales entren en la solución. Espere unos 30 minutos o hasta que la solución esté fresca para tocar.
    6. Proceda a la tinción analógica de timidina paso 5.3.2 si utiliza el análogo de timidina.
  3. Tinción análoga de timidina
    NOTA: Comience aquí si mancha edu y Tbr2 o Edu y DCX.
    1. Coloque las secciones de tejido en PBS y monte secciones de 5 a 8 en una diapositiva cargada positivamente manteniendo el orden en serie de la orientación anterior a posterior y la misma. Deje que las secciones de tejido se sequen para adherirse completamente a las diapositivas y luego dibuje un borde usando una pluma hidrófoba o una pluma PAP.
    2. Permeabilizar secciones con búfer de permeabilización (0,5% TBS-triton) durante 20 a 30 min. A continuación, lave las secciones 2x con TBS-triton durante 5 min cada una.
      NOTA: La permeabilización ayuda a la penetración de anticuerpos intracelulares. El tiempo de permeabilización se puede ajustar dependiendo del grosor del tejido y la eficiencia de los anticuerpos. Alternativamente, uno puede aumentar la concentración de detergente para aumentar la potencia de permeabilización. Sin embargo, se debe tener cuidado de no permeabilizar durante demasiado tiempo ya que la fragilidad del tejido aumenta con el tiempo de permeabilización prolongado.
    3. Prepare la solución de reacción Edu según la Tabla1. La concentración final de Alexa488-azida es de 15 m en 1 ml de solución de reacción Edu.
    4. Incubar secciones en solución de reacción Edu durante 30 min a 1 h y luego lavar 3 veces en TBS-tritón durante 5 min cada una. Cubra los portaobjetos en papel de aluminio para protegerlos de la luz después de este paso. En esta etapa, compruebe si la reacción de Edu funciona utilizando un microscopio fluorescente. Las células etiquetadas con Edu fluorarán bajo un microscopio de epifluorescencia.
  4. Protocolo de sección de tejido montado
    1. Bloquear las secciones de tejido montadas en una diapositiva del paso 5.3.4 utilizando tampón de bloqueo levantado en los mismos animales que el anticuerpo secundario, por ejemplo, suero de burro, durante 30 min a 1 h y luego lavar 2 veces en TBS-triton durante 5 min cada uno.
    2. Preparar la solución de anticuerpos primarios (es decir, antinestina de pollo) durante el paso de bloqueo mezclando anticuerpos primarios en la solución tampón de bloqueo a 1:200. 250 l por diapositiva es suficiente para garantizar que el tejido esté completamente sumergido en la solución.
    3. Incubar secciones de tejido en una solución primaria de anticuerpos durante la noche en RT después de bloquear los lavados. Modifique este paso en función del anticuerpo primario utilizado.
      NOTA: Si los anticuerpos tienen un fondo alto o una unión no específica, la incubación a 4 oC en lugar de RT puede mejorar los resultados. Los anticuerpos con mala penetración de tejido se pueden dejar incubar durante 2 días si es necesario.
    4. Incubar secciones de tejido 3x en TBS-tritón durante 5 min para eliminar el exceso de anticuerpos primarios. A continuación, incubar secciones de tejido en anticuerpos secundarios conjugados de fluoróforo (es decir, Alexa 647 anti-pollo a 1:200) preparados en solución tampón de bloqueo durante 2 horas a RT.
    5. Secciones de tejido de incubación 3x en TBS-triton durante 5 min para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios y aplicar 300 m de solución DAPI a 1:100 en PBS durante 15 min a RT.
    6. Incubar secciones de tejido 3x en PBS durante 5 min para eliminar el exceso de DAPI y eliminar el círculo de la pluma de papá pap de alrededor del tejido usando un hisopo de algodón o una toallita de tarea delicada. Deje que las secciones se sequen y luego aplique los medios de montaje y el resbalón de la cubierta. Deje que los medios de montaje se sequen antes de que se deslicen las imágenes.

6. Colección de imágenes

  1. Grupos experimentales ciegos de grupos de control cubriendo las etiquetas de las diapositivas y la imagen del mismo lado de la DG utilizando un microscopio confocal (Tablade materiales)con lente óptica de aumento de aceite de 40x a un tamaño de paso de 1 m o un zoom de 20x 2x a 1 m.
    NOTA: El aumento de aceite de 40x dará una mayor resolución, pero tomará más tiempo que el zoom de 20x 2x.
  2. Establezca la lente objetivo en 40x y luego haga clic en la pestaña localizar en la esquina superior izquierda en el software confocal (Tabla de materiales) y establezca la sección DG deseada en el centro del campo de visión.
  3. Busque DG, cambie a la pestaña de adquisición en la esquina superior izquierda y marque las siguientes casillas: Z-stack, tile-scany position.
  4. Establezca los ajustes del canal entre 600 y 750, una intensidad de láser del 1% y un 1% y un desplazamiento de 1 a 10. No exceda el 20% de intensidad láser para ninguno de los canales. Asegúrese de que ningún píxel esté sobresaturado al establecer la ganancia y la intensidad.
    NOTA: Estos rangos variarán dependiendo de la eficiencia del equipo utilizado y de la eficiencia de tinción.
  5. Establezca los mosaicos en 7 horizontales por 3 verticales en la ventana de escaneo de teselas y pulse la imagen de vista general del escaneo utilizando los mismos ajustes que los que se utilizan actualmente. Por ejemplo, utilice 7 horizontal por 3 vertical y el objetivo 20x con zoom 2x.
  6. Asegúrese de que la DG esté completamente dentro de la imagen esperada después del análisis de visión general. Si no es así, ajuste la vista de la DG hasta que esté completamente en la imagen de resumen, ya que se trata de una imagen representativa que se va a obtener.
  7. Establezca la profundidad de la imagen desplazándose a través de diferentes pilas Z utilizando la perilla de enfoque fino. Asegúrese de que toda la DG está dentro de los puntos inicial y final. Suponiendo un tamaño de paso de 1 m, cada imagen debe ser de aproximadamente 40 pasos.
  8. Establezca la velocidad de escaneo en 9 con escaneo bidireccional y sin promediación en la ventana del modo de adquisición. A continuación, añada posición en la ventana de posición.
    NOTA: Repita los pasos 6.3 a 6.8 para crear una imagen de varias tarjetas de trabajo a la vez. Aumentar la velocidad de escaneo reduce la calidad de la imagen, pero reduce el tiempo general de imagen. Si la calidad de la imagen es demasiado baja, reduzca la velocidad de escaneado o aumente el promedio.
  9. Haga clic en el botón Iniciar experimento cuando esté listo. Escanee 5 secciones de DG por ratón a lo largo del eje anterior a posterior. Por ejemplo, si la DG izquierda se muestra para la sección uno, idee la siguiente DG izquierda posterior para la sección dos.
  10. Coser imágenes separadas para formar una imagen completa del gyrus dentado utilizando la función de puntada debajo de la pestaña de proceso en el software confocal. Alternativamente, utilice FIJI (ImageJ) para unir imágenes para formar un giso dentado completo.
  11. Guarde las imágenes cosidas para la cuantificación.

7. Análisis de imágenes

  1. Abra cada imagen de cada sección de gyrus dentalado utilizando FIJI como proyección máxima y como imagen compuesta con los canales fusionados en colores distintos para visualizar fácilmente la colocalización.
  2. Mida el área de DG para cada sección de la imagen de proyección máxima utilizando la herramienta de selección de polígonos (tercer cuadro de la izquierda) y registre para cada sección de cada ratón. Este será el área de DG utilizada para calcular la densidad.
  3. Registre el número de celdas en DG desde la imagen compuesta que tienen anticuerpos primarios colocalizando (es decir, nestin) y el edu analógico de timidina, utilizando el contador de celdas del plugin FIJI que se encuentra en plugins analizar el contadorde células . Además, registre el número total de células positivas Edu y nestin con un proceso radial.
    NOTA: En el caso de la nestina, es muy importante prestar atención a la morfología. Si cuantifica las células madre neurales, asegúrese de que sólo se cuantifiquen las células con un proceso radial. Al cuantificar las secciones de giso sorteado, aplique los mismos criterios a todos, especialmente al visualizar celdas fuera de un plano focal. Si las celdas no están dentro del plano focal, no las cuente. Por favor, consulte West et al.21 para obtener instrucciones más detalladas sobre la cuantificación estereológica.
  4. Introduzca los recuentos de celdas en un software de hoja de cálculo para compilar todos los datos para su análisis posterior.
  5. Calcular la densidad de celdas colocalizadas para cada sección dividiendo el número total de células colocalizadas por el volumen total de cada sección en cada animal. Por ejemplo, obtenga la densidad de células madre dividiendo la suma de células nestin+/edu+ en un animal por la suma del volumen DG en un animal. Calcule el volumen de cada sección multiplicando el área con incrementos totales del paso Z asumiendo que cada paso es de 1 m.
    NOTA: En este protocolo, los pasos totales deben ser cercanos a 40, ya que el tejido se secciona a 40 m. Asegúrese de que cada animal es un punto de datos ya que el objetivo de este enfoque es estimar la cantidad total de células colocalizadas en un hemisferio de un hipocampo.
  6. Realice cálculos necesarios adicionales para la pregunta que uno está tratando de abordar. En este ejemplo, calcule el número total de células proliferantes, la población total de células madre y el porcentaje de células madre proliferantes después de estimular las células musgosas contralaterales.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Siguiendo los procedimientos experimentales descritos anteriormente (Figura1A,B), pudimos determinar los efectos de estimular las proyecciones celulares musgosas contralaterales en el nicho neurogénico dentro del hipocampo. Mediante la utilización de un virus DREADD estimulante dependiente de Cre-dependiente gq emparejado con un etiquetado de células musgosas 5-HT2A Cre-line, pudimos activar selectivamente proyecciones excitatorias de células musgosas en la DG contralateral y determinamos esa célula musgosa fuerte estimulación promovió la reposo a células madre (Figura1C). Verificamos el parto viral precisoantes del análisis del tejido (Figura 2A,B). Además, verificamos la activación de células musgosas a través de experimentos de inmunohistoquímica c-fos (datos no mostrados). En caso de inyección viral inadecuada, excluir al animal de un análisis posterior. Una inyección incorrecta es aquel que no apunta a las coordenadas deseadas, tiene la mayor parte de la expresión fuera de la región deseada o tiene poco o ningún parto viral. Para este experimento, las células musgosas en la hilus de la DG eran el objetivo previsto, y si las inyecciones estaban fuera de la hilus, fueron excluidas. Mediante el uso de un análogo de timidina, Edu, y la recuperación de antígenos para la tinción de anidación esbozada en las secciones 5.2 y 5.3, pudimos etiquetar con éxito las células madre neurales que proliferan (Figura3A). Además, al omitir el paso de recuperación de antígenos, sección 5.2, pudimos etiquetar tbr2 progenitor neural positivo y neuroblast, y neuroblast positivo DCX (Figura3A). Demostramos un ejemplo del área cuantificada y utilizada para calcular la densidad y proporcionar un ejemplo de tejido montado en una diapositiva (Figura3B y Figura 4A). Además, tanto los experimentos exitosos como los de menos de par se proporcionan como referencias para enfoques experimentales (Figura4B). Por último, hay varias cuantificaciones diferentes que se pueden obtener de un experimento exitoso (Figura5A-D)15. Las cuantificaciones incluyen la densidad de células madre neurales proliferantes (Nestin+/Edu+/volumen), el porcentaje de células madre neurales que proliferan (Nestin+/Edu+/nestin total), células proliferantes totales (Edu+/volumen) y la agrupación total de células madre (Nestin+/volumen ). Tras la estimulación contralateral de células musgosas, se observó una disminución en la proliferación de células madre neurales. Se pueden obtener cuantificaciones similares para el progenitor neural y las neuronas inmaduras utilizando el anticuerpo adecuado.

Figure 1
Figura 1: Enfoque experimental para la regulación del circuito de ensayo de células madre neurales adultas. (A) Esquema que representa los diferentes pasos descritos en el protocolo. (B) Cronología del enfoque experimental utilizado para estimular las células musgosas en roedores. (C) Inyección esquemática dirigida a células musgosas contralaterales para la estimulación. (D) Esquema del linaje del desarrollo de células madre neurales adultas en la zona subgranular (SGZ), capa de células gráulos (GCL) y capa molecular (ML) con anticuerpos correspondientes utilizados en diferentes etapas de desarrollo. Las diferentes etapas del desarrollo incluyen células madre neurales (NSC) inactivas o activadas, progenitores neuronales (NP), neuroblast (NB), células gráula inmaduras (GC) y GC maduro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Demostración de un parto viral eficaz. (A) Imágenes de inmunofluorescencia de un parto viral preciso. Las partículas virales expresan una etiqueta fluorescente mCherry que se dirige a las células musgosas en la hilus (región en caja blanca). Núcleos celulares de etiquetas DAPI. El lado de la imagen de la entrega viral precisa demuestra proyecciones claras de fibra musgosa desde el lado de la inyección contralateral. (B) Imágenes de inmunofluorescencia de inyecciones virales fuera de destino. Tenga en cuenta que en este caso las fibras musgosas contralaterales están ausentes en el lado de la imagen. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Análisis de la proliferación de células madre neurales y progenie. (A) Imágenes inmunohistoquímicas de Edu análogo de timidina colocalizando con marcadores de etapa celular específicos nestin (células madre neurales y progenitores), Tbr2 (células madre neurales, progenitores neurales) y DCX (neuroblast, neuronas inmaduras) indicado por puntas de flecha blancas. Barra de escala a 10 m.(B) Medición representativa del área dentro del gyrus dentado utilizado para calcular la densidad. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Demostración de la preparación de la inmunofluorescencia. (A) Esquema que demuestra la separación estereológica de las secciones de tejido montado del eje anterior al posterior. El cuadro rojo indica el lado de la imagen. (B) Demostración de experimentos de inmunofluorescencia exitosos y subpar para marcadores de linaje neuronal. Barra de escala de 50 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La activación contralateral de las células musgosas disminuye la proliferación de células madre neurales. (A) Las cuantificaciones inmunohistoquímicas de las células Nestin+/Edu+ en el gyrus dentado demuestran una disminución de la proliferación después de la estimulación de las células musgosas contralaterales. (B) Disminución en el porcentaje de células madre neurales proliferantes en el grupo con células musgosas contralaterales activadas. (C) No hubo ningún cambio significativo en la densidad de células madre neurales en ninguno de los grupos. (D) No hubo cambios en los niveles generales de células proliferantes en el gyrus dentado. Los valores representan las medias de error de medición estándar. p < 0,05 (n a 3 para el control, n a 5 para el grupo hM3D). Esta figura ha sido adaptada de Yeh et al.15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

El objetivo de este protocolo es evaluar cómo la manipulación de circuitos neuronales específicos regula la neurogénesis hipocampal en adultos in vivo utilizando una serie de técnicas de inmunohistoquímica. Decir regulación dependiente de la actividad de la neurogénesis adulta mediada por circuitos neuronales específicos es una técnica valiosa con gran potencial para modificaciones para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, incluyendo la administración viral precisa, la selección viral adecuada para la manipulación deseada, la entrega adecuada de un análogo de timidina, la edad animal, la eficiencia de inmunomanchas, el éxito perfusiones transcardiales y cuantificación imparcial de las imágenes. Por ejemplo, el parto viral inexacto puede causar efectos puntuales que dan lugar a un fenotipo no relacionado con el circuito en cuestión. Además, las técnicas de inmunofluorescencia de baja calidad pueden ocultar el número real de células actuales y, por lo tanto, producir un fenotipo que no es biológicamente relevante. Otro factor muy importante a controlar es la edad de los ratones al realizar experimentos, teniendo en cuenta que la neurogénesis adulta depende de la edad22. Por último, es importante que cada sección se puntúe imparcialmente. Para reducir el sesgo, tome un enfoque metódico y asegúrese de que la puntuación de la persona es competente para identificar las etapas del desarrollo de la NSC para adultos utilizando información morfológica. Además, ciega tanto los grupos de control como los de tratamiento y revela sus identidades después de las cuantificaciones de imagen. Como medida adicional para reducir el sesgo, dos individuos independientes pueden cuantificar el mismo conjunto de datos para validar los resultados observados.

Hay varias limitaciones asociadas con este enfoque para estudiar la regulación dependiente de la actividad del circuito de los NSC adultos y la progenie para recién nacidos. La primera limitación es que este enfoque no proporciona información sobre los tipos de células específicos dentro de un circuito que media nscelen el efecto general en los CNS de manipular el circuito en cuestión. Esto significa que aunque puede haber un efecto fenotípico en los NSC adultos, el efecto puede estar actuando a través de uno o varios tipos de células intermedias. Una manera eficiente de abordar esta preocupación es emparejar estos estudios con electrofisiología para fijar a los intermediarios. Una limitación adicional de este protocolo es la necesidad de tener una línea específica de ratón Cre (5-HTR2A) o una construcción viral (AAV5-camKII-hM3d-mcherry) que pueda apuntar al circuito deseado. Si una línea de ratón Cre específica de la célula efectiva no está disponible para una cuestión de interés, la capacidad de estudiar este circuito se vuelve cada vez más difícil. Sin embargo, muchos tipos de células en el cerebro tienen líneas de ratón específicas de Cre. Una limitación menor de este protocolo está relacionada con CNO como un ligando inerte eficaz. Recientemente, estudios demostraron que CNO, el químico inerte utilizado para activar DREADD, metaboliza a clozapina, que puede causar fenotipos conductuales23. Sin embargo, una manera eficiente de abordar es incluir controles adecuados en cada experimento. Un ejemplo de controles adecuados incluye un control CNO y DREADD, donde CNO se administra en combinación con un virus de reportero de control (AAV5-DIO-mCherry), y un control salino solo donde no se administra CNO a un grupo de virus de reportero. Al incluir estos controles, los efectos de sólo CNO pueden ser aislados. Alternativamente, un ligando inerte secundario conocido como C21, se ha demostrado recientemente que tiene eficacia y potencia similares sin efectos conductuales demostrados24. Por último, una limitación final de este protocolo es controlar la cantidad de CNO que cada animal consume durante el experimento. Diferentes animales beben agua que contiene CNO en diferentes grados y por lo tanto pueden tener una gama de efectos en la neurogénesis adulta. En general, un ratón tiende a beber unos 4 ml de agua CNO en un período de 24 horas. Esto significa que a la concentración de 1 mg/200 ml los animales reciben un total de 0,02 mg de CNO al día, lo que es comparable a la cantidad de una única dosis de CNO inyectada por vía intraperitoneal. Si la administración oportuna acoplada de CNO es una preocupación, cambiar a inyecciones intraperitoneales puede ser una mejor alternativa.

La ventaja de utilizar este protocolo es el grado de especificidad alcanzado al modular la neurogénesis adulta. Estudios anteriores de neurogénesis han utilizado sistémicamente agonista farmacológico o antagonista para modular los componentes del circuito. Estas manipulaciones no específicas pueden producir diferencias fenotípicas, pero proporcionan poca información sobre los mecanismos involucrados en la regulación de células madre neurales adultas. Además, este protocolo se puede modificar fácilmente para investigar varios efectos de circuito amplio en la neurogénesis adulta. Por ejemplo, cambiando a un DREADD inhibitorio, o apuntando a una o varias regiones cerebrales a la vez, uno puede hacer una serie de preguntas para entender la regulación específica del circuito de la neurogénesis adulta. Otra ventaja de utilizar este protocolo sobre enfoques anteriores es que, el uso de un anticuerpo nestin elimina la cría de animales transgénicos de reporteros de células madre neurales codificadas fluorescentemente como nestin:GFP, aumentando la eficiencia y reduciendo el tiempo por experimento8. Además, esta técnica limita el manejo de roedores al administrar CNO, lo que reduce el estrés de los roedores durante los experimentos. Es importante mitigar el estrés al estudiar los procesos sensibles al estrés. Por último, este enfoque es fácilmente modificable para incluir un ensayo conductual, por ejemplo, si uno estaba interesado en preguntar si el circuito celular de musgo contralateral que modula los NSC también desempeña un papel en el aprendizaje espacial o la resiliencia del estrés.

La principal dificultad técnica al utilizar este enfoque es la entrega viral precisa. Convertirse en un cirujano de roedores competente toma práctica y puede tomar problemas significativos. Por lo tanto, es aconsejable realizar una serie de experimentos piloto para probar el titer viral, la eficiencia del etiquetado y la propagación viral. Hemos encontrado que ciertos serotipos tienen diferentes patrones de propagación y que el serotipo AAV2 se extiende menos que AAV5 o AAV8. Además, es mejor tener un proveedor de empaque sorcto viral de confianza para cada uno de estos experimentos. Mediante la realización de cirugías piloto, muchas de estas preocupaciones se pueden abordar y uno puede ahorrar tiempo. También se recomienda que una prueba diferentes concentraciones de CNO para estimular o inhibir los circuitos deseados. En general, 1 mg/kg activará suficientemente los circuitos probados, pero ciertos tipos de células pueden requerir más o menos CNO. Es importante tener en cuenta que la dosis de administración de CNO puede afectar diferencialmente a ciertos circuitos específicamente cuando se mira algo como células musgosas15.

Las aplicaciones alternativas de este protocolo incluyen pruebas de comportamiento simultáneas, modulación de circuitos alternativos y análisis adicionales de características de neurogénesis. Para realizar pruebas de comportamiento, se podría seguir el protocolo descrito y después de administrar CNO, realizar una tarea de comportamiento específica, como un ensayo de ubicación novedoso o una tarea de navegación espacial. El beneficio de este enfoque es que un solo experimento produciría información específica de comportamiento y circuito que podría conducir a un fenotipo de comportamiento específico del circuito. Para modular circuitos alternativos, se puede utilizar una combinación de diferentes líneas Cre y vectores virales. Por ejemplo, si uno estuviera interesado en entender cómo inhibir las neuronas dopaminérgicas del área tegmental ventral (VTA) o VTA modula la neurogénesis adulta, se podría utilizar una línea de ratón de tirosina hidroxilasa Cre e inyectar un hM4D dependiente de Cre (inhibitorio) Virus DREADD en el VTA para determinar la regulación específica dopaminérgica de la neurogénesis adulta. Las posibilidades de apuntar a regiones cerebrales alternativas utilizando este enfoque son enormes y se pueden utilizar estratégicamente para interrogar circuitos neuronales convincentes. Por último, este enfoque permite investigar etapas adicionales de la neurogénesis adulta. Si, por ejemplo, se quisiera entender cómo estimular las células musgosas afecta la arborización o la longitud dendrítica de las neuronas inmaduras, se seguiría un protocolo similar pero realizaría análisis alternativos como el análisis de la eslorantes.

En resumen, este protocolo proporciona un proceso detallado paso a paso para probar la regulación dependiente de la actividad del circuito de los NSC adultos y la neurogénesis a través de la tecnología DREADD. La fuerza de este protocolo radica en su capacidad de ser fácilmente modificado para abordar una amplia gama de preguntas con respecto a la regulación de células madre neurales adultas específicas del circuito. Con el avance de la tecnología de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) regularmente interespaciadas, ahora es más fácil generar líneas de ratón Cre específicas de la célula para emparejarse con sofisticadas construcciones virales para abordar preguntas cada vez más complejas ampliando la aplicabilidad de este protocolo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

L.J.Q. fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo suplemento de diversidad R01MH111773, así como una beca de capacitación T32TS07431-20. Este proyecto fue apoyado por subvenciones otorgadas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160 y NS104530).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24 Well Plate Thermo Fisher Scientific 07-200-84
48 Well Plate Denville Scientific T1049
5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) Carbosynth NE08701
Alcohol 70% Isopropyl Thermo Fisher Scientific 64-17-5
Alcohol Prep Pads Thermo Fisher Scientific 13-680-63
Alexa-488 Azide Thermo Fisher Scientific A10266
Anti-Chicken Nestin Aves NES; RRID: AB_2314882
Anti-Goat DCX Santa Cruz Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494
Anti-Mouse Tbr2 Thermo Fisher Scientific 14-4875-82; RRID: AB_11042577
Betadine Solution (povidone-iodine) Amazon
Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) Sigma-Aldrich 251275
Clozapine N- Oxide Sigma-Aldrich C08352-5MG
Confocal Software (Zen Black) Zeiss Microscopy Zen 2.3 SP1 FP1 (black)
Copper (II) Sulfate Pentahydrate Thermo Fisher Scientific AC197722500
Cotton Swabs Amazon
Coverslip Denville Scientific M1100-02
Delicate Task Wipe Kimwipes Kimtech Science 7557
Drill Bit 0.5 mm Fine Science Tools 19007-05
Ethylene Glycol Thermo Fisher Scientific E178-1
Hamilton Needle 2 inch Hmailton Company 7803-05
Hamilton Syringe 5 μL Model 75 RN Hmailton Company Ref: 87931
High Speed Drill Foredom 1474
Infusion Pump Harvard Apparatus 70-4511
Injectable Saline Solution Mountainside Health Care NDC 0409-4888-20
Insulin Syringe BD Ultra-Fine Insulin Syringes
Isoflurane Henry Schein 29405
Stereotax For Small Animal KOPF Instruments Model 942
Leica M80 Leica
Leica Microtome Leica SM2010 R
LSM 780 Zeiss Microscopy
Nair (Hair Removal Product) Nair
Paraformaldahyde 4% Sigma-Aldrich 158127
Plus Charged Slide Denville Scientific M1021
Phosphate Buffered Solution (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010031
Puralube Vet Ointment Puralube
Slide Rack 20 slide unit Electron Microscopy Science 70312-24
Slide Rack holder Electron Microscopy Science 70312-25
Small Animal Heating Pad K&H
Sucrose Sigma-Aldrich S0389
Super PAP Pen 4 mm tip PolySciences 24230
Surgical Scalpel MedPride 47121
Tris Buffered Solution (TBS) Sigma-Aldrich T5912
Tri-sodium citrate Stock [0.1 M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) Sigma-Aldrich C8532
Triton X-100 Sigma-Aldrich 93443
Tweezers Amazon
Vet Bond Tissue Adhesive 3M 1469SB

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132, (4), 645-660 (2008).
  2. Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153, (6), 1219-1227 (2013).
  3. Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40, (10), 2368-2378 (2015).
  4. Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
  5. Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472, (7344), 466-470 (2011).
  6. Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. 1 (2018).
  7. Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. (2016).
  8. Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
  9. Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10, (2), 615-626 (2018).
  10. Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53, (1), 198-214 (2007).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, (9), 1263-1268 (2005).
  12. Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, (12), 5163-5168 (2007).
  13. Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. (2015).
  14. Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71, (1), 9-34 (2011).
  15. Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. 1-18 (2018).
  16. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
  17. Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89, (4), 683-694 (2016).
  18. Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
  19. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
  20. Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (2013).
  21. West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231, (4), 482-497 (1991).
  22. Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16, (6), 2027-2033 (1996).
  23. Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357, (6350), 503-507 (2017).
  24. Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72, (3), (2018).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics