애기장대에서 패턴 트리거 산화 버스트와 모종 성장 억제 어세

Immunology and Infection

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Summary

이 논문은 면역 점구체에 노출 된 후 애기장대에서 방어 반응을 정량화하는 두 가지 방법, 즉 일시적인 산화 파열 및 모종 성장 억제에 대해 설명합니다.

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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).

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Abstract

식물은 병원균을 인식하고 질병으로부터 보호하기 위해 강력한 면역 체계를 발전시고 있습니다. 이 논문은 유도체 분자를 사용한 치료 후 애기장대에서 면역 활성화의 강도를 측정하는 데 사용할 수 있는 2개의 검정을 기술합니다. 먼저 제시된 것은 루미놀 계 분석법을 사용하여 모니터링될 수 있는 급속하게 유도되고 동적 산화 버스트를 포착하는 방법이다. 제시된 두 번째는 모종 성장의 면역 유발 억제를 측정하는 방법을 설명하는 방법이다. 이 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있으며 전문 교육이나 장비가 필요하지 않으며 식물 면역의 유전 적 기초를 이해하는 데 널리 사용됩니다.

Introduction

병원체에 대하여 인식하고 방어하기 위하여는, 식물은 미생물 관련 분자 패턴 (MAMPs)로 알려져 있는 세포 외부보존된 미생물 분자를 검출하는막 결합한 패턴 인식 수용체 (PRRs)를 진화했습니다 1. 그들의 동족 PR에 MAMPs의 결합은 광범위한 질병 저항성의 결과로 단백질 키나제 매개면역 신호질을 개시합니다 2. PRR 활성화 다음 초기 반응 중 하나는 세포 외 반응성 산소 종 (ROS)의 생산을 촉매 하는 일체형 플라즈마 막 호흡 버스트 OXIDASE HOMOLOG (RBOH) 단백질의 인산화 및 활성화3 , 4.ROS는 면역 신호를 전파하는 보조 메신저뿐만 아니라 직접 항균제로서모두 작용하여 질병 내성을 확립하는 데 중요한 역할을 한다 5. 면역 유도산화 파열의 첫번째 관측은 피토프토라 감염증 접종리시리의 감자 덩이줄기를 사용하여 기술되었다 6. ROS 생산은 잎 디스크 7, 세포현탁액 배양8,및 프로토 플라스톱 종6을사용하여 여러 식물 종에서 평가되었다. 여기서 설명된 것은 애기장대(애기장대)의 잎 디스크에서 패턴 트리거된ROS 생산을 위한 간단한 방법이다.

MAMP 지각에 대한 반응으로, 활성화된 RBOH 단백질은 과산화수소(H2O)로 변환되는 수퍼옥사이드 라디칼(O2-), 하이드록실 라디칼(•OH) 및 일중염 산소(1 O2)의 생산을 촉매합니다. 2)세포 외공간에서 9. H2O2는 산화제 고추냉이 과산화제(HRP)10의존재 에서 루미놀 계 케미발광에 의해 정량화될 수 있다. HRP는 H2O2를 산화하여 수산화이온(OH−)및 산소 가스(O2)를 발생시키고 루미놀과 반응하여 빛의 광자(10)를 방출하는 불안정한 중간체를 생성한다. 광자 방출은 대부분의 분자 실험실에서 장비의 표준 조각이된 발광을 감지 할 수있는 마이크로 플레이트 리더 또는 이미저를 사용하여 상대 광 단위 (RUS)로 정량화 될 수 있습니다. 40-60분 간격으로 생성된 빛을 측정함으로써, 과도 산화 파열은 유도체 처리 후 2-5분, 10-20분에서 정점에 도달하고, ~60분11후기저 수준으로 되돌아오는 것으로 조기에 검출될 수 있다. 이 시간 동안 생성된 누적 광은 RBOH 단백질(12)의 활성화에상응하는 면역 강도의 척도로서 사용될 수 있다. 편리하게, 이 분석법은 특수 한 장비 또는 성가신 샘플 준비를 필요로하지 않습니다.

MAMP 검출 직후에 피크, 산화 버스트는 MAPK 활성화 및 에틸렌 생산과 함께초기 면역 반응으로 간주됩니다 5. 이후 면역 반응은 전사 재프로그래밍, 구내 폐쇄 및 칼로오스증착 2,5를포함한다. MAMMp에 장기간 노출되면 식물 성장의 억제를 초래하는 에너지 비용이 많이 드는 면역 신호가 지속적으로 활성화되어개발과 면역 13 사이의 절충을 나타냅니다. 패턴 트리거 모종 성장 억제 (SGI)는 널리 애기장대에서 면역 출력을 평가하는 데 사용되며 PRRs14,15를 포함한 면역 신호의 여러 주요 구성 요소의 식별에 필수적이었다 ,16. 따라서, 이 논문은 또한 애기장대에서패턴 트리거 SGI에 대한 분석서를 제시하며, 이에 따라 모종은 8-12일 동안 면역 점구체로 보충된 표준 용지 또는 미디어를 포함하는 다중 웰 플레이트에서 재배된 다음 무게를 측정합니다. 분석 척도를 사용하여

ROS 및 SGI 분석이 PRR 매개 신호를 모니터링하는 데 사용되는 방법을 입증하기 위해 다양한 면역 출력을 나타내는 세 가지 유전자형이 선택되었습니다: (1) 야생 형 애기장대 수탁콜롬비아 (Col-0), (2) 지배적 인 음성 bak1-5 다기능 PRR 공동 수용체 브라시노스테로이드 무감각 1-관련 키나제 1(BAK1)이 면역 신호에 비기능성 인 돌연변이체17,18,및 (3) 열성 cpk28-1 돌연변이가 결여되어 있는 돌연변이체는 조절 단백질 칼슘 의존 단백질 키나제 28 (CPK28) 및 높게 한 면역 트리거 반응을 표시19,20. ROS 및 SGI 세포는 PRR EF-Tu 수용체(EFR)15에의해 애기장대에서 인식된 세균 신장률 투(EF-Tu)의 합성 생산 된 elf18 펩티드 에피토프에 대한 응답으로 제시된다. 이러한 프로토콜은 세균성 운동성 단백질 인 flagellin14 또는 내인성 식물 유도체 단백질 (AtPeps)16과같은 다른 면역 유도체와 함께 사용할 수 있지만 식물 반응성은 식물 반응성에 따라 다르다는 점에 유의해야합니다. 유도자21. 함께, ROS 및 SGI 분석제는 PRR 중재응답의 신속하고 정량적인 평가를 위해 사용될 수 있다.

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Protocol

1. 면역 유도 다음 애기장대 잎 디스크에서 ROS 버스트의 검출

  1. 식물 성장 및 유지 보수.
    1. 발아를 동기화하기 위해, 애기장대 씨앗을 멸균 0.1% 한천 의 1 mL에 약 50 개의 씨앗을 일시 중단하고 3-4 일 동안 4 °C (빛 없음)에 보관하십시오.
      참고: 야생형 배경 대조군(예를 들어, Col-0)과 높은 및 낮은 면역 출력을 가진 유전형(예: cpk28-1 bak1-5)을 계층화하여 내부 대조군역할을 합니다.
    2. 토양에 씨를 뿌리고 표준 단일 조건 (22 °C, 10 h 빛, 150 mE / m2 / s 의 빛 강도 및 65-70 % 상대 습도)에서 발아하십시오.
    3. 약 7 일 후, 포셉을 사용하여 개별 묘목을 새로운 냄비에 이식하고, 전체 로제트 개발을 허용하기 위해 적어도 4cm로 분리하십시오. 유전자형 당 6-12 개의 묘목을 이식하고 표준 단기 조건으로 돌아갑니다. 정기적으로 물과 식물을 비료 (2 주마다 20-20-20 비료의 1 g / L).
  2. 하룻밤 회복을 위해 96 웰 플레이트에 잎 디스크를 수집합니다.
    1. 발아 후 4-5주(그림1A)에서 날카로운 4 mm 생검 펀치를 사용하여 식물당 하나의 잎 디스크를 제거하고, 중간 정맥을 피하고 상처를 제한하는 데 주의를 기울여야 합니다(그림1B). 잎 디스크를 ddH2O의 100 μL을 포함하는 미사용 96웰 루미노미터 플레이트에 놓고, 탈수방지를 위해 아닥시알 면이 위쪽을 향하도록 한다(그림1C). 여러 인리포를 평가하는 경우, 각 인리세터 처리에 대해 동일한 잎에서 잎 디스크 1개제거합니다.
      참고 : 완전히 확장 된 샘플 잎, 로제트의 상단에서 세 번째에서 다섯 번째까지, 그리고 가변성을 제한하기 위해 거의 같은 크기와 나이. 가능하면, 리프 디스크를 하룻밤 회수하기 전에 면도날을 사용하여 반으로 자르고, 이는 유도액에 노출된 표면적을 증가시키기때문에(23).
    2. 잎 디스크 수집 중에 상처에 의해 생성 된 ROS의 간섭을 방지하기 위해 실온에서 하룻밤 복구. 증발을 방지하기 위해 뚜껑이 있는 접시를 덮습니다.
  3. 유도기 처리를 수행하고 ROS 생산을 측정합니다.
    1. 반응 용액을 추가하기 전에 플레이트 리더를 프로그래밍하면 ROS 버스트 개시와 기록된 첫 번째 측정 사이의 시간이 줄어듭니다. 플레이트 판독기에 적합한 상용 소프트웨어를 사용합니다. 이 경우(목표 참조) 설정을클릭하고 LUM96 카트리지 및 운동 읽기 유형을 선택합니다. 영역 읽기 범주를 클릭하고 드래그하여 읽을 웰 또는 전체 플레이트의 하위 집합을 선택합니다. PMT 및 광학 탭에서 타이밍 탭에서 통합 시간을 1,000ms로 설정하고 총 실행 시간을 40-60분으로 설정하고 간격을 2분으로 설정합니다.
    2. 멀티 채널 파이펫을 사용하여 각 우물에서 물을 제거합니다.
      참고: 리프 디스크에 구멍을 뚫지 마십시오.
    3. 100 μM 루미놀, 10 μg/mL HRP, 및 원하는 점구체 농도(예: 1 nM, 10 nM, 100 nM, 또는 1,000 nM)를 함유하는 반응 용액을 멸균 ddH2O에서 10 mL의 용액을 사용하여 96웰 플레이트 1개에 대해 준비합니다.
      참고 : 10 mMM 스톡을 만들고 액체 N 2에서 플래시 동결을 만들기 위해 저결합 튜브에멸균 H2O에 동결 건조 펩티드를 용해시키고 -80 °C에서 보관하십시오. 사용할 준비가 되면, 멸균H2O에 주식을 희석하여 100 μM의 작업 재고를 생성하고 -20°C에 보관한다.
    4. 다중 채널 파이펫을 사용하여 반응 혼합물의 100 μL을 각각의 웰에 분배하고, 동시에22의모든 잎 디스크에 용액을 첨가한다. 유도의 부재에서 기저 ROS 수준을 평가하기 위해 각 유전자형에 대한 제어 반응(무연구)을 포함한다. 마이크로플레이트 리더를 사용하여 가시 스펙트럼의 모든 파장에 대한 광 방출을 즉시 측정합니다.
      참고: 루미놀과 HRP는 빛에 민감한 시약이기 때문에 저조도에서 반응 용액을 준비하고 적용하십시오. 사용하지 않는 한 시약을 얼음 이나 -20°C에 보관하십시오.
    5. 동적 산화 버스트를 포착하기 위해 마이크로 플레이트 리더에서 40-60 분 간격으로 2 분 간격으로 1,000 ms통합 시간으로 발광을 측정합니다 (그림 1D).
      참고: 더 긴 통합 시간을 사용하여 분석 감도11을개선하는 동시에 96웰 플레이트의 모든 샘플을 한 간격 내에서 측정할 수 있습니다.
  4. 데이터 해석.
    1. 각 유전자형에 대해 스프레드시트 응용 프로그램을 사용하여 각 시점에서 평균 광자 수 와 표준 오차를 계산하고 분산형 플롯을 사용하여 ROS 생산을 시간 함수로 표시합니다.
      Equation 1
      여기서 t = 각 시간점
    2. 또는 각 리프 디스크에 대한 광자 수를 합산하고 표준 오차 막대 또는 상자 및 수염 플롯이 있는 막대 그래프를 사용하여 각 유전자형에 대한 이러한 값의 평균을 표시합니다.
      Equation 2

2. 모종 성장 억제 분석

  1. 씨앗을 살균하고 무라시게와 스쿠그 (MS) 접시에 뿌리세요.
    1. 0.8% 한천[w/v]을 함유한 멸균 반강도(0.5x) MS 배지(2.16 g/L)를 준비합니다. 라미나 흐름 후드에 용지(90 x 15mm)를 붓습니다.
    2. 1mL의 70% 에탄올로 2분 동안 세척하여 미세원심지 튜브에 약 100개의 씨앗을 살균하고 흡인에 의해 제거합니다. 40% 표백제 1mL를 넣고 실온에서 17분간 부드럽게 바위를 만드십시오. 흡인으로 표백제를 제거하고 멸균수 1 mL에서 3회 5분 간 세척합니다.
      참고: 대안적으로, 염소 가스 종자 살균 프로토콜24를사용한다.
    3. 파이펫을 사용하여 MS 한천 플레이트에 유전자형당 약 100개의 씨앗을 뿌리고 층류 후드에 마이크로포어 테이프로 밀봉합니다.
      참고 : 나중에 모종을 이식하기가 어려워지기 때문에 씨앗을 가까운 곳에 두지 마십시오.
    4. 발아를 동기화하기 위해 3-4 일 동안 4 °C (빛 없음)에플레이트를 배치하여 종자 계층화 (그림 2A).
  2. 면역 성 유도체 펩티드를 포함하는 48 웰 플레이트에 모종을 이식하십시오.
    1. 층화 후, 발아를 허용하기 위해 3-4 일 동안 짧은 일 조건 (22 °C, 10 h 빛, 150 mE /m2/ s 의 빛 강도 및 65-70 % 상대 습도)에서 빛으로 플레이트를 이동합니다.
    2. 층상 유동 후드에서, 1% 자당을 함유하는 멸균 0.5x MS 액체 매체에 인플루터 펩티드 희석물(0 nM, 1 nM, 10nM, 1,000 nM)을 준비하고, 각 48웰 플레이트에 25 mL의 MS를 사용한다. 웰당 펩타이드를 함유하는 MS 액상 배지 또는 MS 배지의 500 μL을 파이펫팅하여 플레이트를 준비한다. 가능한 경우 플레이트 준비를 위해 반복 파이펫터를 사용하여 공정을 신속하게 처리하십시오.
      참고 : 각 유전자형에 대해, 모종 성장에 내재 된 차이를 설명하기 위해 유도없이 MS에서 모종을 성장.
    3. 멸균 집게를 사용하여 동일한 크기와 나이의 각 우물에 하나의 모종을 조심스럽게 이식하여 모종이나 뿌리에 손상이 없고 뿌리가 미디어에 잠겨 있는지 확인합니다. 각 유전자형에 대해, 각 펩티드 희석에 최소 6-8개의모종을 이식한다(그림 2B).
      참고 : 짧은 뿌리가 조작하기 쉽고 오래된 모종은 덜 최적의 결과를 얻을 수 있기 때문에 발아 후 4 일 에서 이식 모종.
    4. 마이크로 기공 테이프로 밀봉 플레이트와 표준 단일 조건 (22 ° C, 10 h 빛,150 mE / m2 / s 의 빛 강도, 65-70 % 상대 습도)에서 빛으로 다시 이동합니다. 모종은 8-12 일 동안 자랄 수 있습니다.
  3. 백분율 성장 억제를 결정합니다.
    1. 조심스럽게 48 웰 접시에서 묘목을 제거하고 종이 타월에 두드려 건조. 분석 척도에 대한 묘목을 계량하고 값을 기록합니다. 사용 가능한 경우 USB 출력이 장착된 분석 척도를 사용하여 스프레드시트에 새로운 중량 값을 기록합니다. 모종을 계량하기 전에 사진을 찍어 성장 억제를 시각적으로 표시합니다(그림2C).
    2. MS만에서 자란 묘종에 비해 유도체 처리 된 묘목의 퍼센트 성장 억제를 결정하십시오 (그림2D)다음과 같이 :
      Equation 3
    3. 표준 오차 막대가 있는 막대 그래프를 사용하거나 상자 및 수염 플롯을 사용하여 실험 간 분산을 더 잘 표시하여 데이터를 플롯합니다.

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Representative Results

돌연변이 cpk28-119,25bak1-517,18 식물은 산화 버스트와 SGI에서 각각 높고 낮은 면역 반응을 가진 유전자형에 대한 예상 결과를 입증하는 데 사용되었습니다. 야생형 배경 대조군(Col-0)을 기준으로 합니다. 투여량 의존적 효과를 평가하기 위해, elf18의 10배 펩타이드 희석 계열(1-1,000 nM)을 사용하였다. 예상대로 cpk28-1 기능 손실 라인은 Col-0에 비해 누적(그림3A)및 평균(그림3B)ROS 버스트가 더 높았으며, bak1-5는 10nM 및 농도에서 ROS 생산량감소를 보였습니다. 1,000 nM(그림 3). SGI에 있는 예상된 다름은 100 nM및 1,000 nM elf18 (그림4A)에서성장한 모든 유전자형 사이에서 분별될 수 있고,이는 또한 1,000 nM elf18 처리에서 육안으로 관찰될 수 있었다 (그림4B). 높은 면역 신호의 특징, cpk28-1 돌연변이체는 1,000 nM elf18에서 성장할 때 Col-0보다 현저하게 작았고, bak1-5 돌연변이체는 MAMP 검출중단으로 인해 Col-0에 비해 약한 성장 억제를 나타냈다.

Figure 1
그림 1. 루미놀 계 산화 파열 분석은 애기장대에서면역 유도 다음. (A) 4-5 주 동안 짧은 하루 조건에서 토양에 식물을 성장. (B) 각 식물에서 잎 디스크를 수집하고 ddH2O. (C) 반응 용액 (100 μM 루미놀, 10 μg / mL HRP 및 원하는 농축물 농도)에서 하룻밤 을 복구하고 2 분 간격으로 40-60 분 동안 발광을 측정하기 위해 4mm 생검 펀치를 사용합니다. 통합 시간이 1,000ms(D)인 경우 Col-0(녹색으로 표시됨)에 대한 각 유전자형에 대한 평균 광자 수를 결정하고 cpk28-1(보라색으로 표시됨) 및 bak1-5(주황색으로 표시됨)와 같은 낮은 ROS 제어값을 확인합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. 유도자 유도 모종 성장 억제 애기장대에서분석. (A) MS 한천에 모종을 뿌리고 표준 단일 조건하에서 3-4 일 동안 자랍니다. (b) 엘프18의 상이한 농도를 함유하는 MS 배지 또는 MS를 함유하는 48웰 플레이트에 모종을 이식한다. (C) 8-12일 후, 육묘 크기를 시각적으로 평가한 다음 분석 척도를 사용하여 신선한 체중을 측정하여 성장 억제율을 결정합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 대표적인 elf18-유도된 3개의 애기장대 유전형에서의 산화 파열. 4주된 식물은 elf18의 희석 계열(0 nM 'mock', 1 nM, 10 nM, 100 nM, 및 1,000 nM)으로 처리하였다. Col-0은 야생형 배경 제어를 나타내며, cpk28-1과 bak1-5는 각각 높고 낮은 ROS 표현형을 나타낸다. (A) elf18 처리 후 상대 광자 단위로표현된 총 광자 수(n =6 리프 디스크 독립 식물로부터). 통계적 차이는 소문자로 표시되며, 포스트호크 Tukey의 정직한 유의한 차이 테스트(p&0.05)를 사용하여 단방향 ANOVA를 사용하여 계산되었습니다. (B) 상대광 단위로 표현된 평균 광자 수, elf18처리 후 40분 이상(독립 식물의 n =6 리프 디스크). 오류 막대는 평균의 표준 오류를 나타냅니다. 3개의 실험 중 2개에서 유사한 결과를 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4. 대표적인 elf18-유도 모종 성장 억제3대 애기장대 유전자형. 야생형(Col-0), cpk28-1,bak1-5 모종은 elf18의 10배 희석 계열(0-1,000 nM)에서 재배되었다. (a) 백분율 성장 억제는 elf18에서 자란 개별 묘목의 무게를MS에서 만 성장한 동일한 유전자형의 모종의 평균 무게와 비교하여 계산하였다('모의') (n =6 개별 묘목) 10일 동안 통계적 차이는 소문자로 표시되며, 포스트호크 Tukey의 정직한 유의한 차이 테스트(p&0.05)를 사용하여 단방향 ANOVA를 사용하여 계산되었습니다. (b) elf18의 농도 증가에 대응하여 Col-0, cpk28-1 및 bak1-5의 두 가지 대표적인 모종에서 SGI의 시각적 데모. 4개의 실험 중 3개에서 유사한 결과를 얻었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

이 논문은 애기장대에서패턴 트리거 면역 반응을 분석하는 두 가지 방법을 설명하며, 전문 장비를 사용하지 않고 면역 출력을 평가하는 정량적 접근법을 제공합니다. 조합에서, 패턴 트리거된 ROS 및 SGI는 각각 미생물 지각에 대한 초기 및 후기 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.

산화 파열 분석법의 주요 제한은 가변성입니다. 완전히 이해되지 않는 이유로 절대 RlUs는 종종 실험 간의 크기 순서에 따라 다릅니다. 실험 간 가변성이 높기 때문에, 야생형 대조군(예를들어, Col-0)에 더하여 높은(예를들어, cpk28-1)및 낮음(예를들어, bak1-5)을가진 내부 참조 대조군을 포함하는 것이 바람직하다. 그러나, 실험 간의 재현성을 높이기 위해 조치를 취할 수 있습니다. 온도, 습도, 광주 및 광강도와 같은 환경 조건은 복제본 간에 동일해야 합니다. 샘플링 할 때 식물의 나이와 건강도 고려해야합니다. 잎 디스크는 짧은 하루 조건 (빛의 6-10 시간)에서 재배 된 나이의 4 ~7 주 사이의 식물에서 수집 할 수 있습니다. 일화적으로, 가장 일관된 결과는 발아 후 6 주 이상 식물로 발견되었지만 아직 개화또는 노화가 아닙니다. 그들은 분말 곰팡이 또는 츄잉 곤충과 같은 일반적인 유리 집 해충에 노출되지 않도록 깨끗한 환경 챔버에서 식물을 성장하는 것이 중요합니다. SGI용 모종은 멸균 MS 매체에서 재배되기 때문에, 더 짧은 시간 동안 환경 변동은 크게 문제가 되지 않습니다. 그러나 이식 하는 동안 모종이 손상 되 면, 유도물 치료에 대 한 선택 된 모종은 다른 크기, 또는 성장 매체 오염 되 면 변화가 발생할 수 있습니다. SGI 실험에서 위에서 설명한 내부 참조 제어 유전자형도 포함하는 것이 좋습니다.

유도체 농도는 면역 측정실험을 실시할 때 또 다른 중요한 고려 사항입니다. 점구체는 회오리기 처리 후 10-20분 후에 신속하고 견고한 ROS 버스트 피크를초래하는 PRRs에 의해 인식된다(그림 2B). 그러나, 버스트의 크기는 식물 유전자형뿐만 아니라 유도체 모두에 의존한다. 따라서, 도 34에 제시된 바와 같이, 상기 유도체 투여량 계열은, 적합한 유도체 농도를 식별하기 위해 권장된다. 패턴 트리거된 ROS는 또한 살아있는 미생물23,26 또는 미생물 추출물26,27,28로잎 디스크를 접종함으로써 분석될 수 있다. 예를 들어, 과도 및 용량 의존ROS 버스트는 슈도모나스 주사기의악성 경로에 대한 응답으로 애기장대에서 검출 될 수있다, 35-40 분에 정점 과 기저 수준에 도달 약 70 유도 후 분지체 23세 , 29. avirulent 박테리아(29) 또는 곰팡이 병원균 P.감염증30,31에대한 응답으로, ROS의 두 번째 더 뚜렷한 축적은 6-10 시간 후에 모니터링 할 수 있습니다 생산된다. 접종. 곰팡이 치틴(32) 또는 키토산(33)과같은 약한 유도체의 경우 루미놀 유도체 L-012와 같은 보다 민감한 발광 지표를 사용할 수 있지만, 생성 된 배경 신호는 종종32가높다. 34. 중요한 것은, 식물 에코 타입은 또한 특정 유도체에 대한 응답성을 지시합니다35,36. 예를 들어, 세균성 기겔린이 Col-0을 포함한 여러 애기장대 에코타입에서 면역 반응을 유도할 수 있는 반면, 와실레브스키야(Ws-0) 에코타입은 PRR FLAGELLIN-SENSING 2(FLS2)의 비기능성 변이체를 표현하고 있으며, 따라서 플래그넬린14,37에민감하지 않습니다.

면역 유도 ROS는 또한 브라시카 나퍼스38,토마토39, 니코티아나 벤타미아나22,40,41,및 및 여러 가지 다른 Solanaceous 종41. 추가루미놀계 ROS검출세포는 조직추출물10,세포현탁배양8,42,및 프로토플라스트43을이용한 식물용으로 개발되었으며, 시스템에서 특히 유용하다. 잎 디스크 프로토콜이 효과적이지 않은 경우42. 예를 들어, 유도체 유도 ROS 버스트는 쌀42,44 및 밀45,46뿐만아니라 체육관 아라우카리아 angustifolia에서 세포 현탁액 배양을 사용하여 설명되었습니다 47 및 이끼 Physcomitrella patens48. SGI는 면역 신호를 측정하기 위해 광범위하게 사용되지 않았습니다. 그러나, 유도제에 대한 반응으로 성장 억제는 N. 벤타미아나41B. napus38,49에서입증되었다. 급속한 성장 억제는 또한 P. patens에서 노출의 2 분 이내 발생하는 곰팡이 키틴에 반응하여 입증되었으며, 이는 시간 경과 사진48을사용하여 관찰될 수 있다.

수정을 통해 SGI 및 산화 파열 성 검사 모두 고처리량 스크린에 사용하여 면역 조절기를 식별할 수 있습니다. 예를 들어, 애기장대의 돌연변이 집단은 MS 배지에서 성장하고 민감하지 않은 돌연변이체 15,50,51,52,53을식별하기 위해 유도체로 범람할 수 있다. 대안적으로, 돌연변이 집단은 리프 디스크54 및 MS 플레이트19에서성장한 전체 모종으로 성공적으로 실행된 유도체 트리거된 ROS에 대해 평가될 수 있다. 또 다른 유용한 스크리닝 방법은 형질전환 과발현 라인22,40,55의발달 이전에 ROS 분석을 위한 N. 벤타미아나에서 단백질의 과도 발현이다. 그러나, 실험내 변이는 N. 벤타미아나 22의차등 단백질 발현으로 인해 안정된 애기장대 라인보다 높지만, 이는 참조에 침투하여 부분적으로 완화될 수 있음 실험 샘플과 동일한 잎에 대한 제어.

요약하면, 면역 유도 산화 버스트와 SGI 세포는 애기장대에서 PRR 매개 신호를 평가하기 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 방법이다. 이러한 방법은 다른 시스템으로 확장하여 새로운 면역 조절제를 발견하기 위해 대규모 스크린에 사용할 수 있습니다.

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Disclosures

없음.

Acknowledgments

우리 실험실에서의 작업은 캐나다의 천연 자원 및 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 발견 프로그램, 캐나다 혁신 재단 존 R. 에반스 리더의 기금 및 퀸즈 대학을 통해 지원됩니다. KS와 IS는 온타리오 대학원 장학금과 NSERC 캐나다 대학원 장학금(CGS-M)의 지원을 받습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589

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