Ensayos de inhibición del crecimiento de brotes y ráfagas oxidativas desencadenadas por patrones en Arabidopsis thaliana

Immunology and Infection

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Summary

Este artículo describe dos métodos para cuantificar las respuestas de defensa en Arabidopsis thaliana después de la exposición a los impulsores inmunes: la ráfaga oxidativa transitoria y la inhibición del crecimiento de la plántula.

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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).

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Abstract

Las plantas han desarrollado un sistema inmunitario robusto para percibir patógenos y protegerse contra las enfermedades. Este artículo describe dos ensayos que se pueden utilizar para medir la fuerza de la activación inmune en Arabidopsis thaliana después del tratamiento con moléculas de eliitor. Presentado primero es un método para capturar la ráfaga oxidativa dinámica y inducida rápidamente, que se puede monitorear usando un ensayo a base de luminol. El segundo presentado es un método que describe cómo medir la inhibición inducida por el inmune del crecimiento de las plántulas. Estos protocolos son rápidos y confiables, no requieren capacitación especializada o equipo, y se utilizan ampliamente para entender la base genética de la inmunidad de las plantas.

Introduction

Para percibir y defenderse de patógenos, las plantas han evolucionado receptores de reconocimiento de patrones ligados a la membrana (PRR) que detectan moléculas microbianas conservadas fuera de la célula conocida como patrones moleculares asociados a microbios (MMP)1. La unión de los MAPP a sus PRR cognados inicia la señalización inmunemediada por proteínas quinasa, lo que da como resultado una resistencia a las enfermedades de amplio espectro 2. Una de las primeras respuestas después de la activación de PRR es la fosforilación y activación de proteínas de membrana plasmática integral RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) que catalizan la producción de especies de oxígeno reactivo extracelular (ROS)3 , 4. ROS desempeña un papel importante en el establecimiento de la resistencia a la enfermedad, actuando tanto como mensajeros secundarios para propagar la señalización inmune como agentes antimicrobianos directos5. La primera observación de una ráfaga oxidativa inmune provocada se describió utilizando tubérculos de patata de cv. Rishiri después de la inoculación de Phytophthora infestans 6. La producción de ROS se ha evaluadoen varias especies vegetales utilizando discos de hojas 7, cultivos de suspensión celular8y protoplastias6. Aquí se describe un método simple para la determinación de la producción de ROS activada por patrones en discos de hojas de Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

Como respuesta a la percepción de MAMP, las proteínas RBOH activadas catalizan la producción de radicales de superóxido (O2-), radicales hidroxilo (•OH) y oxígeno singlete (1O2) que se convierten en peróxido de hidrógeno (H2O 2) en el espacio extracelular9. H2O2 se puede cuantificar mediante quimioluminiscencia a base de luminol en presencia del agente oxidante de peroxidasa de rábano picante (HRP)10. HRP oxida H2O2 generando un ion hidróxido (OH)y gas oxígeno (O2) que reaccionan con luminol para producir un intermedio inestable que libera un fotón de luz10. La emisión de fotones se puede cuantificar como unidades de luz relativa (RPU) utilizando un lector de microplacas o un imager capaz de detectar luminiscencia, que se han convertido en piezas estándar de equipos en la mayoría de los laboratorios moleculares. Mediante la medición de la luz producida en un intervalo de 40-60 minutos, se puede detectar una ráfaga oxidativa transitoria tan pronto como 2-5 minutos después del tratamiento del elicitor, alcanzando un máximo de 10-20 minutos y volviendo a los niveles basales después de 60 minutos11. La luz acumulativa producida a lo largo de este tiempo puede utilizarse como medida de la fuerza inmune correspondiente a la activación de las proteínas RBOH12. Convenientemente, este ensayo no requiere equipo especializado o preparación de muestras engorrosa.

Alcanzando el pico poco después de la detección de MAMP, la ráfaga oxidativa se considera una respuesta inmune temprana, junto con la activación mapK y la producción de etileno5. Las respuestas inmunitarias posteriores incluyen la reprogramación transcripcional, el cierre estomatal y la deposición de callosa2,5. La exposición prolongada a los MamPS activa continuamente la señalización inmune energéticamente costosa que resulta en la inhibición del crecimiento de las plantas, indicando un equilibrio entre el desarrollo y la inmunidad13. La inhibición del crecimiento de las plántulas activada por patrones (SGI) se utiliza ampliamente para evaluar la producción inmunitaria en Arabidopsis y ha sido parte integral de la identificación de varios componentes clave de la señalización inmune, incluidos los PRR14,15 ,16. Por lo tanto, este artículo presenta además un ensayo para SGI activado por patrón en Arabidopsis,por el cual las plántulas se cultivan en placas multipocillos que contienen medios estándar o medios complementados con un elicitor inmune durante 8-12 días y luego se pesan utilizando una escala analítica.

Para demostrar cómo se pueden utilizar los ensayos ROS y SGI para monitorear la señalización mediada por PRR, se eligieron tres genotipos que representan diferentes salidas inmunitarias: (1) el tipo salvaje Arabidopsis adhesión Columbia (Col-0), (2) el bak1-5 dominante-negativo mutante en el que el coreceptor multifuncional PRR BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) no es funcional en la señalización inmune17,18,y (3) el mutante recesivo cpk28-1, que carece de la proteína reguladora CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) y muestra respuestas inmunitarias activadas19,20. Los ensayos ROS y SGI se presentan en respuesta a un epítopo de péptido elf18 producido sintéticamente de Factor de elongación bacteriano Tu (EF-Tu), reconocido en Arabidopsis por el PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Estos protocolos se pueden utilizar con otros eliitores inmunes como la proteína de motilidad bacteriana flagelina14 o las proteínas endógenas del elicitor vegetal (AtPeps)16, sin embargo, debe tenerse en cuenta que la capacidad de respuesta de la planta difiere dependiendo de la elicitor21. Juntos, los ensayos ROS y SGI se pueden utilizar para la evaluación rápida y cuantitativa de las respuestas mediadas por PRR tempranas y tardías.

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Protocol

1. Detección de ráfaga de ROS en los discos de la hoja de Arabidopsis después de la elicitation inmune

  1. Crecimiento y mantenimiento de la planta.
    1. Para sincronizar la germinación, estratificar las semillas de Arabidopsis suspendiendo aproximadamente 50 semillas en 1 ml de agar estéril 0.1% [w/v] y almacenar a 4oC (sin luz) durante 3-4 días.
      NOTA: Estratifica ralentí un control de fondo de tipo salvaje (por ejemplo, Col-0) y genotipos con salidas inmunes altas y bajas (por ejemplo, cpk28-1 y bak1-5, respectivamente) para servir como controles internos.
    2. Sembrar semillas en el suelo y germinar en condiciones estándar de día corto (22 oC, 10 h de luz, 150 mE/m 2/s de intensidad lumínica y 65-70% de humedad relativa).
    3. Después de aproximadamente 7 días, utilice fórceps para trasplantar plántulas individuales a nuevas macetas, separadas por al menos 4 cm para permitir el desarrollo completo de rosetas. Trasplante 6-12 plántulas por genotipo y volver a condiciones estándar de días cortos. Agua y fertilizar regularmente las plantas (1 g/L de fertilizante 20-20-20 cada 2 semanas).
  2. Recoger discos de hoja en placas de 96 pocillos para la recuperación durante la noche.
    1. A las 4-5 semanas después de la germinación (Figura1A),utilice un punzón de biopsia agudo de 4 mm para extraer un disco de hoja por planta, evitando la vena media y teniendo cuidado de limitar la herida (Figura1B). Coloque los discos de hoja en una placa luminómetro de 96 pocillos no utilizada que contenga 100 ml de ddH2O con el lado adaxial hacia arriba para evitar la desecación22 (Figura1C). Si evalúa varios eliitores, retire 1 disco de hoja de la misma hoja para cada tratamiento de elicitor.
      NOTA: Hojas de muestra que están completamente expandidas, del tercer al quinto lugar desde la parte superior de la roseta, y aproximadamente del mismo tamaño y edad para limitar la variabilidad. Si es posible, corte los discos de hoja por la mitad utilizando una cuchilla de afeitar antes de la recuperación durante la noche, ya que esto aumenta la superficie expuesta a la solución de elicitor23.
    2. Recuperar durante la noche a temperatura ambiente para evitar la interferencia de ROS producida por la herida durante la recolección del disco de la hoja. Cubra las placas con una tapa para evitar la evaporación.
  3. Realice el tratamiento del elicitor y mida la producción de ROS.
    1. Programe el lector de placas antes de agregar la solución de reacción, ya que esto reducirá el tiempo entre el inicio de la ráfaga ROS y las primeras mediciones registradas. Utilice un software comercial que sea apropiado para el lector de placas. En nuestro caso (consulte Tabla de contenido), haga clic en Configuracióny seleccione el cartucho LUM96 y el Tipo de lectura cinética. Haga clic en la categoría Leer área y arrástrela para seleccionar un subconjunto de pozos o toda la placa que se va a leer. En la pestaña PMT y óptica, establezca el tiempo de integración en 1.000 ms. En la pestaña Tiempo de temporización, establezca el Tiempo total de ejecución en 40-60 min y el Intervalo en 2 min.
    2. Retire el agua de cada pocal con una pipeta multicanal.
      NOTA: No perfore los discos de las hojas, ya que esto puede causar tensión en las heridas y dar lugar a salidas ROS más variables.
    3. Preparar una solución de reacción que contenga 100 m de luminol, 10 g/ml de HRP y la concentración deseada de elicitor (por ejemplo: elf18 a 1 nM, 10 nM, 100 nM o 1.000 nM) en ddH2O estéril utilizando 10 ml de solución para una placa de 96 pocillos.
      NOTA: Disolver los péptidos liofilizados en H2O estériles en tubos de unión baja para hacer un material de 10 mM, congelar el flash en líquido N2y almacenar a -80 oC. Cuando esté listo para usar, diluir las existencias en H2O estéril para generar un stock de trabajo de 100 M y almacenar a -20 oC.
    4. Utilice una pipeta multicanal para dispensar 100 ml de la mezcla de reacción a cada pocal, añadiendo la solución a todos los discos de hoja del mismo tratamiento al mismo tiempo22. Incluir una reacción de control (sin electique) para cada genotipo para evaluar los niveles basales de ROS en ausencia de elicitation. Mida inmediatamente la emisión de luz para todas las longitudes de onda del espectro visible utilizando un lector de microplacas.
      NOTA: Prepare y aplique la solución de reacción con poca luz, ya que luminol y HRP son reactivos sensibles a la luz. Mantenga los reactivos en hielo o a -20 oC a menos que estén en uso.
    5. Mida la emisión de luz con un tiempo de integración de 1.000 ms en intervalos de 2 minutos durante un período de 40-60 min en un lector de microplacas para capturar la ráfaga oxidativa dinámica (Figura1D).
      NOTA: Utilice un tiempo de integración más largo para mejorar la sensibilidad del ensayo11,a la vez que asegúrese de que todas las muestras de una placa de 96 pocillos se puedan medir en un intervalo.
  4. Interpretación de datos.
    1. Para cada genotipo, utilice una aplicación de hoja de cálculo para calcular el recuento medio de fotones y el error estándar en cada punto de tiempo, y muestre la producción de ROS en función del tiempo mediante una gráfica de dispersión.
      Equation 1
      Donde t á cada punto de tiempo
    2. Alternativamente, sume los recuentos de fotones para cada disco hoja y presente el promedio de estos valores para cada genotipo utilizando un gráfico de barras con barras de error estándar o una gráfica de caja y bigote.
      Equation 2

2. Ensayo de inhibición del crecimiento de la plántula

  1. Esterilice las semillas y siembre en las placas Murashige y Skoog (MS).
    1. Preparar medio grado estéril (0,5x) medio DeM (2,16 g/L) que contenga 0,8% de agar [p/v]. Vierta el medio en placas (90 x 15 mm) en una campana de flujo laminar.
    2. Esterilice aproximadamente 100 semillas en un tubo de microcentrífuga lavando con 1 ml de etanol al 70% durante 2 min y retírelas por aspiración. Añadir 1 mL de 40% de lejía y rociar suavemente durante 17 minutos a temperatura ambiente. Retire la lejía por aspiración y lave tres veces en 1 ml de agua estéril durante 5 min. Resuspender en 1 ml de agar estéril 0,1%.
      NOTA: Alternativamente, utilice un protocolo de esterilización de semillas de gas de cloro24.
    3. Sembrar aproximadamente 100 semillas por genotipo en placas de agar MS usando una pipeta y sellar con cinta de microporo en una campana de flujo laminar.
      NOTA: Evite colocar las semillas cerca, ya que esto dificultará el trasplante de plántulas más adelante.
    4. Estratificar las semillas colocando las placas a 4oC (sin luz) durante 3-4 días para sincronizar la germinación (Figura2A).
  2. Trasplante de plántulas en placas de 48 pocillos que contienen péptidos elicitores inmunes.
    1. Después de la estratificación, mueva las placas a la luz en condiciones de día corto (22 oC, 10 h de luz, 150 mE/m2/s de intensidad lumínica y 65-70% de humedad relativa) durante 3-4 días para permitir la germinación.
    2. En una campana de flujo laminar, prepare diluciones de péptido sicitor (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM y 1,000 nM) en medios líquidos estériles 0,5x MS que contengan 1% de sacarosa [p/v], utilizando 25 ml de MS para cada placa de 48 pocillos. Preparar las placas pipeteando 500 ml de medio líquido de LA MS o medio de SM que contenga péptidos por poca. Si está disponible, utilice un pipeteador repetido para la preparación de placas para acelerar el proceso.
      NOTA: Para cada genotipo, cultivar plántulas en LA MS sin elicitor para explicar cualquier diferencia inherente en el crecimiento de las plántulas.
    3. Usando fórceps estériles cuidadosamente trasplantaunar una plántula a cada pozo del mismo tamaño y edad, asegurando que no haya daño a la plántula o rotura en la raíz y que la raíz esté sumergida en los medios. Para cada genotipo, trasplantar un mínimo de 6-8 plántulas en cada dilución de péptidos (Figura2B).
      NOTA: Las plántulas de trasplante a los 4 días después de la germinación, ya que las raíces cortas son más fáciles de manipular, y las plántulas más antiguas pueden producir resultados menos óptimos.
    4. Sellar las placas con cinta adhesiva de microporos y volver a la luz en condiciones estándar de días cortos (22 oC, 10 h de luz, 150 mE/m2/s de intensidad de luz y 65-70% de humedad relativa). Permita que las plántulas crezcan durante 8-12 días.
  3. Determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento.
    1. Retire cuidadosamente las plántulas de los platos de 48 pocillos y séquelo con una toalla de papel. Pesar las plántulas en una escala analítica y registrar valores. Si está disponible, utilice una báscula analítica equipada con salida USB para registrar valores de peso fresco en una hoja de cálculo. Antes de pesar las plántulas, tome una foto para mostrar visualmente la inhibición del crecimiento (Figura 2C).
    2. Determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento de las plántulas tratadas con elicitor en comparación con las plántulas cultivadas solo en LA MS (Figura2D)de la siguiente manera:
      Equation 3
    3. Trazar datos utilizando un gráfico de barras con barras de error estándar o utilizando un diagrama de caja y bigote para mostrar mejor la varianza interexperimental.

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Representative Results

Mutantes cpk28-119,25 y bak1-517,se utilizaron18 plantas para demostrar los resultados esperados para los genotipos con respuestas inmunitarias altas y bajas, respectivamente, en ráfaga oxidativa y SGI ensayos relativos a un control de fondo de tipo salvaje (Col-0). Para evaluar los efectos dependientes de la dosis, se utilizó una serie de dilución de péptidos de 10 veces (1-1.000 nM) de elf18. Como era de esperar, las líneas de pérdida de función cpk28-1 tenían una ráfaga ROS acumulada más alta (Figura3A)y promedio (Figura3B) en comparación con el Col-0, mientras que bak1-5 mostraba una producción reducida de ROS a concentraciones entre 10 nM y 1.000 nM (Figura3). Se podían discernir las diferencias esperadas en SGI entre todos los genotipos cultivados en 100 nM y 1.000 nM elf18 (Figura4A),que también podrían observarse visualmente en el tratamiento de 1.000 nM elf18 (Figura4B). Característica de la señalización inmune alta, los mutantes cpk28-1 eran notablemente más pequeños que Col-0 cuando se cultivaban en 1.000 nM elf18, mientras que los mutantes bak1-5 mostraban una inhibición del crecimiento débil en relación con Col-0 debido a la detección de MAMP alterada.

Figure 1
Figura 1. Ensayo de ráfaga oxidativa a base de luminol después de la inducción inmunitaria en Arabidopsis. (A) Cultivar plantas en el suelo en condiciones de días cortos durante 4-5 semanas. (B) Utilice un punzón de biopsia de 4 mm para recoger los discos de hoja de cada planta y recuperarse durante la noche en ddH2O. (C) Añadir solución de reacción (100 m luminol, 10 g/mL HRP, y la concentración deseada de elicitor) y medir la emisión de luz durante 40-60 min, en intervalos de 2 minutos, en intervalos de 2 minutos y con un tiempo de integración de 1.000 ms. (D) Determinar recuentos medios de fotones para cada genotipo en relación con Col-0 (mostrado en verde), un control ROS alto como cpk28-1 (mostrado en púrpura) y un control ROS bajo como bak1-5 (mostrado en naranja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Ensayo de inhibición del crecimiento de plántulas inducido por el elicitor en Arabidopsis. (A) Sembrar plántulas en el agar MS y crecer durante 3-4 días bajo condiciones estándar de días cortos. (B) Plántulas de trasplante a placas de 48 pocillos que contengan UN medio o EM que contengan diferentes concentraciones de elf18. (C) Después de 8-12 días, evalúe visualmente el tamaño de la plántula y luego mida el peso fresco utilizando una escala analítica para determinar el porcentaje de inhibición del crecimiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Explosión oxidativa inducida por elf18 en tres genotipos de Arabidopsis. Las plantas de cuatro semanas de edad fueron tratadas con una serie de dilución de elf18 (0 nM 'mock', 1 nM, 10 nM, 100 nM y 1,000 nM). Col-0 representa el control de fondo de tipo salvaje, con cpk28-1 y bak1-5 que representan fenotipos ROS altos y bajos, respectivamente. (A) Recuento total de fotones representado como unidadesde luz relativa después del tratamiento con elf18 (n discos de hoja 6 de plantas independientes). Las diferencias estadísticas se representan mediante letras minúsculas y se calcularon utilizando un ANOVA unidireccional con una prueba de diferencia significativa honesta de Tukey post-hoc (p<0.05). (B) Recuento medio de fotones, representados como unidades de luzrelativas, más de 40 minutos después del tratamiento con elf18 (n discos de hojas de plantas independientes). Las barras de error representan un error estándar de la media. Se obtuvieron resultados similares en dos de los tres experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Inhibición representativa del crecimiento de las plántulas inducida por Elf18 en tres genotipos de Arabidopsis. Las plántulas de tipo salvaje (Col-0), cpk28-1y bak1-5 se cultivaron en una serie de dilución de 10 veces (0-1,000 nM) de elf18. (A) La inhibición del crecimiento porcentual se calculó comparando el peso delas plántulas individuales cultivadas en elf18 (n plántulas individuales) con el peso medio de las plántulas del mismo genotipo cultivadas únicamente en LA ('mock') (n plántulas individuales) durante un período de 10 días. Las diferencias estadísticas se representan mediante letras minúsculas y se calcularon utilizando un ANOVA unidireccional con una prueba de diferencias significativas honestas de Tukey post-hoc (p<0.05). (B) Demostración visual de SGI en dos plántulas representativas de Col-0, cpk28-1 y bak1-5 en respuesta al aumento de las concentraciones de elf18. Se obtuvieron resultados similares en tres de los cuatro experimentos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este artículo describe dos métodos para evaluar las respuestas inmunitarias activadas por patrones en Arabidopsis,ofreciendo enfoques cuantitativos para evaluar la producción inmune sin el uso de equipos especializados. En combinación, ROS y SGI activados por patrones se pueden utilizar para evaluar las respuestas tempranas y tardías a la percepción de los microbios, respectivamente.

La principal limitación del ensayo de ráfaga oxidativa es la variabilidad. Por razones que no se entienden completamente, las RPU absolutas a menudo difieren por un orden de magnitud entre experimentos. Dado que la variabilidad entre experimentos es alta, es aconsejable incluir controles de referencia internos con alta (por ejemplo,cpk28-1) y baja (porejemplo, bak1-5) ráfagas oxidativas además de un control de tipo salvaje (porejemplo, Col-0). Sin embargo, se pueden tomar medidas para aumentar la reproducibilidad entre los experimentos. Las condiciones ambientales tales como la temperatura, la humedad, el fotoperiodo y la intensidad de la luz deben ser idénticas entre las réplicas. La edad y la salud de las plantas también deben tenerse en cuenta al tomar muestras. Los discos de hoja se pueden recoger de plantas de entre 4 y 7 semanas de edad cultivadas en condiciones de días cortos (6-10 horas de luz). Como anécdota, los resultados más consistentes se encontraron con plantas de más de 6 semanas después de la germinación, pero aún no floreciendo o senescing. Es importante cultivar plantas en cámaras ambientales limpias para que no estén expuestas a plagas comunes de invernaderos como el moho polvoriento o los insectos masticadores. Dado que las plántulas para SGI se cultivan en medios estériles de EM, y por un tiempo más corto, las fluctuaciones ambientales no son en gran medida una preocupación. Sin embargo, la variación puede ocurrir si las plántulas se dañan durante el trasplante, si las plántulas seleccionadas para tratamientos de elicitor son de diferentes tamaños, o si los medios de crecimiento se contaminan. Se recomienda incluir también los genotipos de control de referencia interna descritos anteriormente en los experimentos SGI.

La concentración de elicitor es otra consideración importante al realizar ensayos inmunológicos. Los elicitors son percibidos por los PRR, lo que resulta en una ráfaga ROS rápida y robusta que alcanza su pico 10-20 minutos después del tratamiento con elicitor (Figura2B). Sin embargo, la magnitud de la ráfaga depende tanto del elicitor como del genotipo de la planta. Por lo tanto, se recomienda una serie de dosis de elicitor, como se presenta en la Figura 3 y la Figura 4,con el fin de identificar una concentración de elicitor adecuada. El ROS activado por patrones también se puede analizar inoculando discos de hojas con microbios vivos23,26 o extractos microbianos26,27,28. Por ejemplo, se pueden detectar ráfagas ROS transitorias y dependientes de la dosis en Arabidopsis en respuesta a los patovares virulentos de Pseudomonas syringae,alcanzando un máximo de 35-40 minutos y alcanzando niveles basales de aproximadamente 70 minutos después de la elirición 23 , 29. En respuesta a las bacterias avirulentes29 o al patógeno fúngico P. infestans30,31, se produce una segunda acumulación más pronunciada de ROS que puede ser monitoreada 6-10 horas después Inoculación. Para los eliitores más débiles, como la quitina fúngica32 o el chitosan33,se pueden utilizar indicadores luminiscentes más sensibles, como el derivado de luminol L-012, sin embargo, la señal de fondo producida es a menudo más alta32, 34. Es importante destacar que el ecotipo de la planta también dictará su capacidad de respuesta a los impulsores específicos35,36. Por ejemplo, mientras que la flagelina bacteriana es capaz de obtener respuestas inmunitarias en varios ecotipos de Arabidopsis, incluido El Col-0, el ecotipo Wassilewskija (Ws-0) expresa una variante no funcional del PRR FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) y es por lo tanto insensible a flagelelina14,37.

ROS inducido por el sistema inmune también se puede observar en discos de hojas de otras plantas dicotiledas, incluyendo Brassica napus38, tomate39, Nicotiana benthamiana22,40,41,y varias otras especies de Solanaceous41. Se han desarrollado ensayos adicionales de detección ROS a base de luminol para plantas que utilizan extractos de tejido10,cultivos de suspensión celular8,42y protoplastias43,y son particularmente útiles en sistemas donde los protocolos de disco hoja no son efectivos42. Por ejemplo, se han descrito ráfagas de ROS inducidas por elicitor utilizando cultivos de suspensión celular en arroz42,44 y trigo45,46, así como el gimnosperma Araucaria angustifolia 47 y el musgo Physcomitrella patens48. SGI no se ha utilizado tan ampliamente para medir la señalización inmune. Sin embargo, la inhibición del crecimiento en respuesta a los eliitores se ha demostrado en N. benthamiana41 y B. napus38,49. La inhibición del crecimiento rápido también se ha demostrado en P. patens en respuesta a la quitina fúngica que ocurre dentro de 2 minutos de exposición, que se puede observar utilizando la fotografía de lapso de tiempo48.

Con la modificación, tanto sGI como ensayos de ráfaga oxidativa se pueden utilizar para pantallas de alto rendimiento para identificar reguladores inmunes. Por ejemplo, las poblaciones mutagenizadas de Arabidopsis pueden ser cultivadas en medio de la SM e inundadas de eliitores para identificar mutantes insensibles15,50,51,52,53. Alternativamente, las poblaciones mutagenizadas pueden ser evaluadas para ROS activado por elicitor, que se ha ejecutado con éxito con ambos discos hoja54 y plántulas enteras cultivadas en placas MS19. Otro método de cribado útil es la expresión transitoria de proteínas en N. benthamiana para el análisis ROS antes del desarrollo de las líneas de sobreexpresión transgénica22,40,55. Sin embargo, la variación intraexperimental es mayor que en las líneas estables de Arabidopsis debido a la expresión diferencial de proteínas en N. benthamiana hojas22, aunque esto puede ser parcialmente mitigado por la infiltración de referencia controles en la misma hoja que las muestras experimentales.

En resumen, la ráfaga oxidativa inducida por el sistema inmunitario y los ensayos SGI son métodos rápidos y fiables para evaluar la señalización mediada por PRR en Arabidopsis. Estos métodos pueden extenderse a otros sistemas y utilizarse para pantallas a gran escala para descubrir nuevos reguladores inmunológicos.

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Disclosures

Ninguno.

Acknowledgments

El trabajo en nuestro laboratorio se financia a través del Programa de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Recursos Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC), el Fondo de Líderes John R. Evans de la Fundación Canadiense para la Innovación y la Universidad de Queen. KS e IS cuentan con el apoyo de becas de posgrado en tándem Ontario y becas de posgrado NSERC Canadá para estudiantes de maestría (CGS-M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG Store at room temperature.
White Polystyrene 96-Well Plates Fisher Scientific 07-200-589

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References

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