Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana

Immunology and Infection

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Summary

Cet article décrit deux méthodes pour quantifier des réponses de défense dans Arabidopsis thaliana suivant l'exposition aux eliciteurs immunisés : l'éclatement oxydant transitoire, et l'inhibition de la croissance de plant.

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Bredow, M., Sementchoukova, I., Siegel, K., Monaghan, J. Pattern-Triggered Oxidative Burst and Seedling Growth Inhibition Assays in Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (147), e59437, doi:10.3791/59437 (2019).

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Abstract

Les plantes ont développé un système immunitaire robuste pour percevoir les agents pathogènes et se protéger contre les maladies. Cet article décrit deux essais qui peuvent être employés pour mesurer la force de l'activation immunisée dans Arabidopsis thaliana suivant le traitement avec des molécules d'éveil. Présenté en premier est une méthode pour capturer l'éclatement oxydatif rapidement induit et dynamique, qui peut être surveillé à l'aide d'un analyse à base de luminol. La deuxième est une méthode décrivant comment mesurer l'inhibition induite par le système immunitaire de la croissance des semis. Ces protocoles sont rapides et fiables, ne nécessitent pas de formation ou d'équipement spécialisé, et sont largement utilisés pour comprendre la base génétique de l'immunité végétale.

Introduction

Pour percevoir et se défendre contre les agents pathogènes, les plantes ont évolué récepteurs de reconnaissance des modèles liés à la membrane (PRR) qui détectent les molécules microbiennes conservées en dehors de la cellule connue sous le nom de modèles moléculaires microbe-associés (MAMPs)1. La liaison des MMP à leurs PrR cognate initie la signalisation immunitaire médiée par la kinase protéique, ce qui entraîne une résistance aux maladies à large spectre2. L'une des premières réponses après l'activation de PRR est la phosphorylation et l'activation des protéines hydropètes DE membrane plasmatique intégrale RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG (RBOH) qui catalysent la production d'espèces d'oxygène réactif extracellulaires (ROS)3 , 4. ROS jouent un rôle important dans l'établissement de la résistance aux maladies, agissant à la fois comme messagers secondaires pour propager la signalisation immunitaire ainsi que les agents antimicrobiens directs5. La première observation d'une rafale oxydative immunisée a été décrite utilisant des tubercules depomme de terre de cv. Rishiri suivant l'inoculation d'infestans de Phytophthora 6. La production de ROS a été évaluéedans plusieurs espèces végétales utilisant des disques de feuille 7, cultures de suspension cellulaire8,et protoplastes6. Décrit ici est une méthode simple pour assainer la production de ROS déclenchée par des motifs dans les disques de feuilles d'Arabidopsis thaliana (Arabidopsis).

En réponse à la perception de MAMP, les protéines RBOH activées catalysent la production de radicaux de superoxyde (O2-), les radicaux hydroxyles (OH), et l'oxygène de singlet (1O2) qui sont convertis en peroxyde d'hydrogène (H2O 2) dans l'espace extracellulaire9. H2O2 peut être quantifié par chemiluminescence à base de luminol en présence de l'agent oxydant raifort peroxidase (HRP)10. HRP oxyde H2O2 générant un ion hydroxyde (OH)et un gaz d'oxygène (O2) qui réagissent avec le luminol pour produire un intermédiaire instable qui libère un photon de lumière10. L'émission de photons peut être quantifiée en tant qu'unités lumineuses relatives (RLUs) à l'aide d'un lecteur de microplaques ou d'un imageur capable de détecter la luminescence, qui sont devenues des pièces d'équipement standard dans la plupart des laboratoires moléculaires. En mesurant la lumière produite sur un intervalle de 40-60 minutes, une rafale oxydative transitoire peut être détectée dès 2-5 minutes après le traitement de l'incitation, avec un pic de 10-20 minutes, et revenir à des niveaux basaux après 60 minutes11. La lumière cumulative produite au cours de ce cours de temps peut être utilisé comme une mesure de la force immunitaire correspondant à l'activation des protéines RBOH12. Pratiquement, cet essai ne nécessite pas d'équipement spécialisé ou de préparation d'échantillons encombrants.

Le pic peu de temps après la détection de MAMP, l'éclatement oxydatif estconsidéré une réponse immunitaire tôt, avec l'activation de MAPK et la production d'éthylène 5. Les réponses immunitaires postérieures incluent la reprogrammation transcriptionnelle, la fermeture stomatal, et le dépôt de callose2,5. L'exposition prolongée aux MAMP active continuellement la signalisation immunitaire énergétiquement coûteuse entraînant l'inhibition de la croissance des plantes, ce qui indique un compromis entre le développement et l'immunité13. L'inhibition de la croissance des semis déclenchéepar par les motifs (SGI) est largement utilisée pour évaluer la production immunitaire dans l'Arabidopsis et a fait partie intégrante de l'identification de plusieurs composants clés de la signalisation immunitaire, y compris les PrR14,15 ,16. Par conséquent, cet article présente en outre un analyse pour le SGI déclenché par le modèle dans Arabidopsis, par lequel les semis sont cultivés dans des plaques multi-bien contenant des médias standard ou des médias complétés par un stimulant immunitaire pendant 8-12 jours, puis pesé à l'aide d'une échelle analytique.

Pour démontrer comment les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour surveiller la signalisation par le PRR, trois génotypes qui représentent des extrants immunitaires variables ont été choisis : (1) le type sauvage Arabidopsis accession Columbia (Col-0), (2) le bak1-5 dominant-négatif mutant dans lequel le multi-fonctionnel PRR co-récepteur BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED KINASE 1 (BAK1) est non fonctionnel dans la signalisation immunitaire17,18, et (3) le mutant récessif cpk28-1, qui n'a pas le protéine régulatrice CALCIUM-DEPENDENT PROTEIN KINASE 28 (CPK28) et affiche des réponses immunitaires accrues19,20. Les essais ROS et SGI sont présentés en réponse à un épitope de peptide d'elfe synthétiquement produit18 du facteur bactérien d'allongement Tu (EF-Tu), reconnu en Arabidopsis par le PRR EF-Tu RECEPTOR (EFR)15. Ces protocoles peuvent être utilisés avec d'autres stimulants immunitaires tels que la flagelline de protéine de motilité bactérienne14 ou les protéines endogènes d'incitation de plante (AtPeps)16,cependant, il convient de noter que la réactivité de plante diffère selon le l'obtenir21. Ensemble, les essais ROS et SGI peuvent être utilisés pour l'évaluation rapide et quantitative des réponses précoces et tardives de PRR-négociées.

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Protocol

1. Détection de l'éclatement de ROS dans les disques de feuilles d'Arabidopsis suivant l'obtention immunitaire

  1. Croissance et entretien des usines.
    1. Pour synchroniser la germination, stratifier les graines d'Arabidopsis en suspendant environ 50 graines dans 1 ml d'agar stérile de 0,1 % [w/v] et les stocker à 4 oC (pas de lumière) pendant 3 à 4 jours.
      REMARQUE : Stratisfier un contrôle de fond de type sauvage (par exemple, Col-0) et des génotypes à rendement immunitaire élevé et faible (par exemple, cpk28-1 et bak1-5, respectivement) pour servir de contrôles internes.
    2. Semer les graines sur le sol et germer dans des conditions de courte journée standard(22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m 2/s d'intensité lumineuse et 65 à 70 % d'humidité relative).
    3. Après environ 7 jours, utilisez des forceps pour transplanter des semis individuels dans de nouveaux pots, séparés d'au moins 4 cm pour permettre le développement complet de la rosette. Transplantez 6 à 12 semis par génotype et retournez à des conditions de courte journée standard. Arroser et fertiliser régulièrement les plantes (1 g/L de 20-20-20 engrais toutes les 2 semaines).
  2. Recueillir les disques de feuilles dans des assiettes de 96 puits pour la récupération pendant la nuit.
    1. À 4-5 semaines après la germination (Figure 1A), utilisez un poinçon de biopsie de 4 mm pour enlever un disque de feuille par plante, en évitant la veine moyenne et en prenant soin de limiter les blessures (Figure 1B). Placer les disques de feuilles dans une plaque de luminomètre inutilisée de 96 puits contenant 100 oL de ddH2O avec le côté adaxial orienté vers le haut pour empêcher la dessiccation22 (Figure 1C). Si vous évaluez plusieurs facteurs, retirez 1 disque de feuille de la même feuille pour chaque traitement de l'éveil.
      REMARQUE : Échantillondez les feuilles qui sont complètement élargies, de la troisième à la cinquième place du haut de la rosette, et à peu près de la même taille et de la même âge pour limiter la variabilité. Si possible, couper les disques de feuilles en deux à l'aide d'une lame de rasoir avant la récupération pendant la nuit, car cela augmente la surface exposée à la solution d'incitation23.
    2. Récupérer toute la nuit à température ambiante pour éviter l'interférence du ROS produit par la blessure lors de la collecte du disque de feuilles. Couvrir les plaques avec un couvercle pour éviter l'évaporation.
  3. Effectuer le traitement d'incitation et mesurer la production de ROS.
    1. Programmez le lecteur de plaque avant d'ajouter la solution de réaction, car cela réduira le temps entre l'initiation de l'éclatement ros et les premières mesures enregistrées. Utilisez un logiciel commercial qui convient au lecteur de plaques. Dans notre cas (voir Tableau des contenus),cliquez sur Paramètres, et sélectionnez le LUM96 Cartridge et le type de lecture cinétique. Cliquez sur la catégorie Zone lecture et faites glisser pour sélectionner un sous-ensemble de puits ou la plaque entière à lire. Sous l'onglet PMT et Optique, fixez le temps d'intégration à 1 000 ms. Sous l'onglet Timing, fixez le temps d'exécution total à 40-60 min et l'intervalle à 2 min.
    2. Retirer l'eau de chaque puits à l'aide d'une pipette multicanal.
      REMARQUE : Ne perforez pas les disques de feuilles, car cela peut causer un stress de blessure et entraîner des sorties DE ROS plus variables.
    3. Préparer une solution de réaction contenant 100 M de luminol, 10 g/mL HRP, et la concentration souhaitée de l'obspirateur (par exemple : elf18 à 1 nM, 10 nM, 100 nM, ou 1 000 nM) en ddH2O stérile en utilisant 10 ml de solution pour une plaque de 96 puits.
      REMARQUE : Dissoudre les peptides lyophilisés dans des h2O stériles dans des tubes à faible liaison pour faire un bouillon de 10 mm, un gel éclair dans le liquide N2et le stocker à -80 oC. Lorsqu'ils sont prêts à l'emploi, diluer les stocks dans le H2O stérile pour générer un stock de travail de 100 M et le stocker à -20 oC.
    4. Utilisez une pipette multicanal pour distribuer 100 L du mélange de réaction à chaque puits, en ajoutant la solution à tous les disques de feuilles du même traitement en même temps22. Inclure une réaction de contrôle (aucun sourceur) pour chaque génotype afin d'évaluer les niveaux de ROS basiques en l'absence d'obtention. Mesurez immédiatement les émissions de lumière pour toutes les longueurs d'onde du spectre visible à l'aide d'un lecteur de microplaques.
      REMARQUE : Préparez et appliquez la solution de réaction sous faible luminosité, car le luminol et le HRP sont des réactifs sensibles à la lumière. Gardez les réactifs sur la glace ou à -20 oC à moins d'être utilisés.
    5. Mesurer l'émission de lumière avec un temps d'intégration de 1 000 ms à intervalles de 2 min sur une période de 40 à 60 min dans un lecteur de microplaques afin de capturer l'éclatement oxydant dynamique (Figure 1D).
      REMARQUE : Utilisez un temps d'intégration plus long pour améliorer la sensibilité aux résultats11, tout en veillant à ce que tous les échantillons dans une plaque de 96 puits puissent être mesurés en un seul intervalle.
  4. Interprétation des données.
    1. Pour chaque génotype, utilisez une application de feuille de calcul pour calculer le nombre moyen de photons et l'erreur standard à chaque point de temps, et affichez la production DE ROS en fonction du temps à l'aide d'une parcelle de dispersion.
      Equation 1
      Où t - chaque point de temps
    2. Vous pouvez également résumer le nombre de photons pour chaque disque de feuille et présenter la moyenne de ces valeurs pour chaque génotype à l'aide d'un graphique à barres avec des barres d'erreur standard ou une boîte et une parcelle de moustaches.
      Equation 2

2. Seedling Growth Inhibition Assay

  1. Stériliser les graines et semer sur les assiettes De Murashige et Skoog (MS).
    1. Préparer une demi-résistance stérile (0,5x) moyenne de SP (2,16 g/L) contenant 0,8 % d'agar [w/v]. Verser le support dans des plaques (90 x 15 mm) dans une hotte à débit laminaire.
    2. Stériliser environ 100 graines dans un tube microcentrifuge en lavant avec 1 ml d'éthanol à 70 % pendant 2 min et retirer par aspiration. Ajouter 1 ml d'eau de Javel à 40 % et incorporer délicatement la roche pendant 17 min à température ambiante. Retirer l'eau de Javel par aspiration et laver trois fois dans 1 ml d'eau stérile pendant 5 min. Resuspendre dans 1 ml d'agar stérile de 0,1 %.
      REMARQUE : Vous pouvez également utiliser un protocole de stérilisation des graines de gaz chlore24.
    3. Semer environ 100 graines par génotype sur des plaques d'agar MS à l'aide d'une pipette et sceller avec du ruban adhésif micropore dans une hotte à écoulement laminaire.
      REMARQUE : Évitez de placer les graines à proximité, car cela rendra la transplantation des semis difficile plus tard.
    4. Stratifier les graines en plaçant les plaques à 4 oC (pas de lumière) pendant 3-4 jours pour synchroniser la germination (Figure 2A).
  2. Transplanter les semis dans des plaques de 48 puits contenant des peptides d'incitation immunitaire.
    1. Après stratification, déplacez les plaques à la lumière dans des conditions de courte journée(22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m 2/s d'intensité lumineuse et 65-70% d'humidité relative) pendant 3-4 jours pour permettre la germination.
    2. Dans une hotte à débit laminaire, préparer des dilutions peptidiques (0 nM, 1 nM, 10 nM, 100 nM et 1 000 nM) dans un média liquide stérile de 0,5x MS contenant 1 % de saccharose [w/v], en utilisant 25 ml de MS pour chaque plaque de 48 puits. Préparer les plaques en pipetilisant 500 l de milieu liquide MS ou de milieu MS contenant des peptides par puits. Si disponible, utilisez un pipettor répétitif pour la préparation de la plaque afin d'accélérer le processus.
      REMARQUE : Pour chaque génotype, cultiver des semis dans la SP sans obtenir de facteur à l'autre pour tenir compte des différences inhérentes à la croissance des semis.
    3. À l'aide de forceps stériles, transplantez soigneusement un semis à chaque puits de la même taille et de la même âge, en veillant à ce qu'il n'y ait aucun dommage au semis ou à la rupture de la racine et que la racine soit immergée dans les médias. Pour chaque génotype, transplanter un minimum de 6 à 8 semis dans chaque dilution peptidique (figure 2B).
      REMARQUE : Transplanter les semis à 4 jours après la germination, car les racines courtes sont plus faciles à manipuler, et les semis plus anciens peuvent donner des résultats moins optimaux.
    4. Plaques d'étanchéité avec du ruban adhésif micropore et retour à la lumière dans des conditions de temps court standard (22 oC, 10 h de lumière, 150 mE/m2/s intensité lumineuse et 65-70% d'humidité relative). Laisser pousser les semis pendant 8 à 12 jours.
  3. Déterminer l'inhibition de la croissance en pourcentage.
    1. Retirer soigneusement les semis des assiettes de 48 puits et les sécher en tapant sur du papier essuie-tout. Peser les semis à l'échelle analytique et enregistrer les valeurs. Si disponible, utilisez une échelle analytique équipée de sortie USB pour enregistrer les valeurs de poids frais sur une feuille de calcul. Avant de peser les semis, prenez une photo pour afficher visuellement l'inhibition de la croissance (figure 2C).
    2. Déterminer l'inhibition de la croissance en pourcentage des semis traités par l'un ou l'autre par rapport aux semis cultivés dans la SP seulement (figure 2D) comme suit :
      Equation 3
    3. Tracez les données à l'aide d'un graphique à barres avec des barres d'erreur standard ou à l'aide d'une parcelle de boîte et de moustaches pour mieux afficher la variance inter-expérimentale.

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Representative Results

Mutant cpk28-119,25 et bak1-517,18 plantes ont été utilisées pour démontrer les résultats attendus pour les génotypes avec des réponses immunitaires élevées et faibles, respectivement, en rafale oxydative et SGI tests par rapport à un contrôle de fond de type sauvage (Col-0). Pour évaluer les effets dépendants de la dose, une série de dilution peptide 10 fois (1-1 000 nM) d'elfe18 a été utilisée. Comme prévu, les lignes de perte de fonction cpk28-1 ont connu une augmentation plus élevée de la production cumulative (figure3A)et moyenne (figure 3B) DE ROS par rapport au Col-0, tandis que le bak1-5 affichait une production de ROS réduite à des concentrations comprises entre 10 nM et 1 000 nM (Figure 3). Les différences attendues dans l'IGS pourraient être discernées entre tous les génotypes cultivés en 100 nM et 1 000 nM elf18 (Figure 4A), qui pourraient également être observés visuellement dans le traitement 1 000 nM elf18 (Figure 4B). Caractéristiques de la signalisation immunitaire élevée, les mutants cpk28-1 étaient nettement plus petits que le Col-0 lorsqu'ils étaient cultivés chez 1 000 elfes nM18, tandis que les mutants bak1-5 présentaient une faible inhibition de la croissance par rapport au Col-0 en raison de la détection perturbée du MAMP.

Figure 1
Figure 1. Luminol-basé effort d'explosion d'analyse suivant l'induction immunitaire dans Arabidopsis. (A) Cultiver des plantes sur le sol dans des conditions de courte journée pendant 4-5 semaines. (B) Utiliser un poinçon de biopsie de 4 mm pour recueillir les disques de feuilles de chaque plante et récupérer toute la nuit dans ddH2O. (C) Ajouter une solution de réaction (100 M luminol, 10 M/mL HRP, et la concentration désirée de l'obspirateur) et mesurer l'émission de lumière sur 40-60 min, en 2 min d'intervalles avec un temps d'intégration de 1 000 ms. (D) Déterminer le nombre moyen de photons pour chaque génotype par rapport au Col-0 (en vert), un contrôle ROS élevé comme cpk28-1 (en violet) et un faible contrôle ROS comme le bak1-5 (en orange). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2. Exemple d'inhibition de la croissance des semis induitpar par l'incitation dans Arabidopsis. (A) Semer les semis sur l'agar de sP et pousser pendant 3-4 jours dans des conditions de courte journée standard. (B) Transplanter des semis dans des plaques de 48 puits contenant un milieu ou une SP contenant différentes concentrations d'elfes18. (C) Après 8-12 jours, évaluez visuellement la taille des semis et mesurez ensuite le poids frais à l'aide d'une échelle analytique pour déterminer l'inhibition de la croissance en pourcentage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3. Éclat oxydatif induit par elfe18 dans trois génotypes d'Arabidopsis. Les plantes de quatre semaines ont été traitées avec une série de dilution d'elfe18 (0 nM 'mock', 1 nM, 10 nM, 100 nM, et 1000 nM). Le Col-0 représente le contrôle de fond de type sauvage, avec cpk28-1 et bak1-5 représentant des phénotypes ROS élevés et faibles, respectivement. (A) Le nombre total de photons représentésen tant qu'unités lumineuses relatives après le traitement des elfes18 (n -6 disques de feuilles provenant de plantes indépendantes). Les différences statistiques sont représentées par des lettres minuscules et ont été calculées à l'aided'un ANOVA à sens unique avec un test de différence significative honnête de Tukey post-hoc (p 'lt;0.05). (B) Nombre moyen de photons, représentés en tant qu'unitéslumineuses relatives, plus de 40 min suivant le traitement des elfes18 (n -6 disques de feuilles provenant de plantes indépendantes). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Des résultats similaires ont été obtenus dans deux des trois expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. Inhibition représentative de la croissance des semis induite par l'elfe18 dans trois génotypes d'Arabidopsis. Les semis de type sauvage (Col-0), cpk28-1et bak1-5 ont été cultivés dans une série de dilution 10 fois plus (0-1 000 nM) d'elfe18. (A) L'inhibition de la croissance en pourcentage a été calculéeen comparant le poids des semis individuels cultivés chez les elfes18 (n -6 semis individuels) au poids moyen des semis du même génotype cultivés dans la SP seulement («mock») (n -6 semis individuels) sur une période de 10 jours. Les différences statistiques sont représentées par des lettres minuscules et ont été calculées à l'aide d'un ANOVA à sens unique avec un test post-hoc Tukey's Honest Significant Differences test(p'lt;0.05). (B) Démonstration visuelle de L'IGS dans deux semis représentatifs du Col-0, cpk28-1 et bak1-5 en réponse à l'augmentation des concentrations d'elfes18. Des résultats similaires ont été obtenus dans trois des quatre expériences. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

Cet article décrit deux méthodes pour assainer les réponses immunitaires déclenchées par modèle dans Arabidopsis, offrant des approches quantitatives à l'évaluation de la production immunitaire sans l'utilisation d'équipement spécialisé. En combinaison, le ROS et le SGI déclenchés par des motifs peuvent être utilisés pour évaluer les réponses précoces et tardives à la perception des microbes, respectivement.

La principale limitation de l'effort oxydatif est la variabilité. Pour des raisons qui ne sont pas complètement comprises, les RLUs absolus diffèrent souvent par ordre de grandeur entre les expériences. Étant donné que la variabilité entre les expériences est élevée, il est conseillé d'inclure des contrôles de référence internes avec des rafales oxydantes de type sauvage (p.ex. cpk28-1) et faibles (p. ex. bak1-5) en rafales oxydatives en plus d'un contrôle de type sauvage (p.ex., Col-0). Cependant, des mesures peuvent être prises pour accroître la reproductibilité entre les expériences. Les conditions environnementales telles que la température, l'humidité, la photopériode et l'intensité lumineuse doivent être identiques entre les répliques. L'âge et la santé des plantes devraient également être pris en considération lors de l'échantillonnage. Les disques de feuilles peuvent être prélevés sur des plantes âgées de 4 à 7 semaines cultivées dans des conditions de courte journée (6 à 10 heures de lumière). Anecdotiquement, les résultats les plus cohérents ont été trouvés avec des usines plus âgées que 6 semaines après la germination mais pas encore la floraison ou la sénégisation. Il est important de cultiver des plantes dans des chambres environnementales propres afin qu'elles ne soient pas exposées à des ravageurs communs de serre comme la moisissure poudreuse ou les insectes à mâcher. Étant donné que les semis pour l'IGS sont cultivés dans des médias stériles de SP, et pour une période plus courte, les fluctuations environnementales ne sont en grande partie pas une préoccupation. Cependant, la variation peut se produire si les semis sont endommagés lors de la transplantation, si les semis sélectionnés pour les traitements de l'incitation sont de tailles différentes, ou si le support de croissance est contaminé. Il est recommandé d'inclure les génotypes de contrôle de référence interne décrits ci-dessus dans les expériences SGI ainsi.

La concentration d'eliciteur est une autre considération importante en effectuant des essais immunisés. Les auteurs sont perçus par les RCR, ce qui donne lieu à une rafale de ROS rapide et robuste qui culmine de 10 à 20 minutes après le traitement de l'obtention (figure2B). Cependant, l'ampleur de l'éclatement dépend à la fois de l'enclenseur ainsi que du génotype de la plante. Par conséquent, une série de doses d'incitation, telle qu'elle est présentée dans la figure 3 et la figure 4,est recommandée afin d'identifier une concentration d'enclens. Le ROS déclenché par des motifs peut également être assidu en inoculant des disques de feuilles avec des microbes vivants23,26 ou des extraits microbiens26,27,28. Par exemple, des rafales de ROS transitoires et dépendantes de la dose peuvent être détectées dans Arabidopsis en réponse aux pathovars virulents de Pseudomonas syringae, atteignant des pointes à 35-40 minutes et atteignant des niveaux basaux environ 70 minutes après l'obtention 23 Ans, états-unis , 29. En réponse à la bactérie avirulente29 ou à l'agent pathogène fongique P. infestants30,31, une deuxième accumulation plus prononcée de ROS est produite qui peut être surveillée 6-10 heures après inoculation. Pour les plus faibles, comme le chitin fongique32 ou le chitosan33, des indicateurs luminescents plus sensibles peuvent être utilisés, comme le dérivé luminol L-012, cependant, le signal de fond produit est souvent plus élevé32, 34. Fait important, l'écotype de la plante dictera également sa réactivité à des soudateurs spécifiques35,36. Par exemple, alors que la flagelline bactérienne est capable d'obtenir des réponses immunitaires dans plusieurs écotypes d'Arabidopsis, y compris le Col-0, l'écotype Wassilewskija (Ws-0) exprime une variante non fonctionnelle du PRR FLAGELLIN-SENSING 2 (FLS2) et est donc insensible à flagellin14,37.

Le ROS induit par l'immunité peut également être observé dans les disques de feuilles d'autres plantes dicotyldonous, y compris Brassica napus38, tomate39, Nicotiana benthamiana22,40,41, et plusieurs autres espèces de Solanaceous41. D'autres essais de détection de ROS à base de luminol ont été développés pour les plantes utilisant des extraits de tissu10, cultures de suspension cellulaire8,42, et protoplastes43, et sont particulièrement utiles dans les systèmes où les protocoles de disque de feuille ne sont pas efficaces42. Par exemple, des éclats de ROS induits par l'auteur ont été décrits en utilisant des cultures de suspension cellulaire dans le riz42,44 et le blé45,46, ainsi que le gymnosperm Araucaria angustifolia 47 et la mousse Physcomitrella patens48. SGI n'a pas été utilisé aussi largement pour mesurer la signalisation immunitaire. Cependant, l'inhibition de la croissance en réponse aux réductables a été démontrée dans N. benthamiana41 et B. napus38,49. L'inhibition rapide de croissance a également été démontrée dans P. patens en réponse à la chitin fongique se produisant dans les 2 minutes de l'exposition, qui peut être observée utilisant la photographie de time-lapse48.

Avec la modification, les essais de SGI et d'éclatement oxydatif peuvent être utilisés pour les écrans à haut débit pour identifier les régulateurs immunitaires. Par exemple, les populations mutagénaires d'Arabidopsis peuvent être cultivées sur le milieu de la SP et inondées de facteurs d'incitation pour identifier les mutants insensibles15,50,51,52,53. Alternativement, les populations mutagénaires peuvent être évaluées pour le ROS déclenché par l'éveil, qui a été exécuté avec succès avec les disques de feuilles54 et les semis entiers cultivés sur des plaques de SP19. Une autre méthode de criblage utile est l'expression transitoire des protéines dans N. benthamiana pour l'analyse de ROS avant le développement des lignes transgéniques de surexpression22,40,55. Cependant, la variation intra-expérimentale est plus élevée que dans les lignées stables d'Arabidopsis dues à l'expression différentielle de protéine dans les feuilles de N. benthamiana 22,bien que ceci puisse être partiellement atténué par la référence infiltrante contrôle sur la même feuille que les échantillons expérimentaux.

En résumé, l'éclatement oxydatif induit par le système immunitaire et les essais de SGI sont des méthodes rapides et fiables pour évaluer la signalisation PRR-négociée dans Arabidopsis. Ces méthodes peuvent être étendues à d'autres systèmes et utilisées pour les écrans à grande échelle pour découvrir de nouveaux régulateurs immunitaires.

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Disclosures

aucun.

Acknowledgments

Les travaux de notre laboratoire sont financés par le Programme de découverte du Conseil canadien de recherches sur les ressources naturelles et le génie (CRSNG), le Fonds du chef de la Fondation canadienne pour l'innovation John R. Evans et l'Université Queen's. KS et IS sont appuyés par des bourses d'études supérieures de l'Ontario et des bourses d'études supérieures du CRSN Canada pour les étudiants à la maîtrise (CGS-M).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
20-20-20 Fertilizer Plant Prod 10529 Mix 1g/L in water and apply to plants every 2 weeks for optimal growth.
4 mm Biopsy Punch Medical Mart 232-33-34-P A cork borer set with a 0.125 cm^2 surface area can also be used.
48-Well Sterile Plates with Lid Sigma-Aldrich CLS3548
Analytical Scale with Draft Sheid VWR VWR-225AC Any standard analytical scale can be used for growth inibition assays, however, a direct computer output is optimal.
BioHit mLine Mechanical 12 Multichannel Pipette (30-300 uL) Sartorius 725240 Any multichannel pipette can be used, as can a single pipetter if necessary.
elf18 (Ac-SKEKFERTKPHVNVGTIG) EZ Biolab cp7211 Store 10 mM stock peptide at -80C in low protein binding tubes. When thawed, store 100 uM working stock at -20C.
Forceps Fisher Scientific 22-327379
Horseradish Peroxidase Sigma-Aldrich P6782 Dissolve in pure water. Store at -20C and away from light.
Luminol Sigma-Aldrich A8511 Dissolve in DMSO. Store at -20C and away from light.
Murisage and Skoog Basal Salts Cedarlane Labs MSP09-100LT Store at 4C.
Soil SunGrow Horticulture Sunshine Mix #1 Other soil types can also be used to grow Arabidopsis. Mix with water when filling pots.
SpectraMax Paradigm Multi Mode Microplate Reader with LUM Module Molecular Devices Must request a quote Any plate reader capable of detecting luminescence can be used for these assays.
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