Технический аспект автоматизированного синтеза и кинетической оценки в реальном времениNo 11C'SNAP-7941

Chemistry
JoVE Journal
Chemistry
AccessviaTrial
 

Summary

Здесь мы представляем протокол для полностью автоматизированной радиомаркировкиNo 11C'SNAP-7941 и анализа кинетики в реальном времени этого ПЭТ-трассировщика на P-gp выражении и невыразительных клетках.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Vraka, C., Pichler, V., Pfaff, S., Balber, T., Hacker, M., Mitterhauser, M., Wadsak, W., Philippe, C. Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941. J. Vis. Exp. (146), e59557, doi:10.3791/59557 (2019).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) является важным методом молекулярной визуализации, обеспечивающим понимание путей и использование конкретных целевых радиолигандов для исследований in vivo. В рамках этого протокола описан надежный и надежный дистанционно управляемый радиосинтезNo 11C'SNAP-7941, антагонист к рецептору гормона, концентрирующего меланин 1. Радиосинтез начинается с циклотрона, произведенногоNo 11C'CO 2, который впоследствии дополнительно реагирует с помощью газофазного перехода кNo 11C'CH3OTf. Затем этот реактивный промежуточный вводится в раствор-предшественник и формирует соответствующий радиотрейстер. Химическая, а также радиохимическая чистота определяются с помощью RP-HPLC, регулярно внедряемого в процессе контроля качества радиофармацевтических препаратов. Кроме того, активность моляра рассчитывается так как она является необходимостью для следующих кинетарных исследований в реальном времени. Кроме того, для оценки влияния Экспрессии P-гликопротеинов (P-gp) на накопление клеток применяется11C'SNAP-7941. По этой причине, P-gp экспрессии клеточной линии (MDCKII-hMDR1) либо используется без или с блокированием до экспериментов с помощью P-gp субстрата (я)-вераполила и результаты сравниваются с теми, наблюдается для клеток дикого типа. Общий экспериментальный подход демонстрирует важность точного тайм-менеджмента, который необходим для каждого доклинического и клинического исследования с использованием ПЭТ-трассировок, оснащенных недолговечными нуклидами, такими как углерод-11 (половина жизни: 20 мин).

Introduction

11С. SNAP-7941 был разработан в качестве первого позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ)-трассировщик ориентации меланина концентрации гормона рецептора 1 (MCHR1) - рецептор в основном участвует в центральной регуляции аппетита и потребление пищи1. Углерод-11 маркировки SNAP-7941, хорошо характеризуется MCHR1 антагонист, дали подлинный ПЭТ-трейсер2,3,4,5. Тем не менее, полностью автоматизированный радиосинтез является весьма сложной задачей с точки зрения эффективности времени и воспроизводимости с недолговечной радионуклид углерода-11 предлагает период полураспада 20 мин6. Общее время синтеза должно быть сведено к минимуму, и, как правило, не должно превышать 2-3 период ыполудения (т.е. около 40-60 мин для углерода-11)7. Особенно, процедуры синтеза для радиотрейсеров ориентации рецепторных систем с низкой плотностью экспрессии должны быть широко оптимизированы для получения достаточной урожайности и, следовательно, высокой молярной активности8. Синтетическая стратегия часто следует за продукцией радионуклида внутри циклотрон и отпускомNo 11C'CO2 к синтезатору. Там,No 11C'CO2 сначала сводится к11C CH 4, а затем отреагировал ийодом, чтобы дать11C'CH3Я с помощью газофазного метода9,10. Дальнейшая обработка серебряным трифлом дает11C'CH3OTf непосредственно в режиме он-лайн. После этого реактивный углерод-11 помечены промежуточные вводится в раствор, содержащий молекулы-предшественника. Автоматизированный радиосинтез дополнительно включает в себя процесс очистки с полу-подготовкой RP-HPLC, включая последующую разработку продукта, пригодного для доклинических и клинических исследований.

Независимо от период полураспада радионуклида и времени усилия радиосинтеза, фармакокинетическая радиофармацевтической является наиболее важной частью для оценки во время развития ПЭТ-трассировки. С точки зрения нейровизуализации, ввод мозга ПЭТ-трекер является основным условием. Тем не менее, гематоэнцефалический барьер (BBB), "граница безопасности" мозга, высоко выражает efflux транспортеров, которые могут выгрузить небольшие молекулы (например, ПЭТ-трассы) и эффективно препятствовать их применимости.

Огромным недостатком во время доклинической оценки являются неожиданные взаимодействия с этими транспортерами efflux, которые часто не распознаются вэкспериментах in vitro и приводят к сбою ПЭТ-трасса in vivo, как это наблюдается в 11 C'SNAP-7941. Изображение ПЕТ у крыс продемонстрировало низкое накопление мозга, которое резко возросло после введения ингибитора P-gp tariquidar11. Эти данные свидетельствуют о том, чтоNo 11C'SNAP-7941 является субстратом этой системы транспортера efflux, препятствующей связыванию лиганда к центральному MCHR1. К сожалению, по-прежнему отсутствует адекватные модели in vitro, позволяющие прогнозировать проникновение BBB на ранней стадии развития трассировщика.

Здесь мы описываем автоматизированный синтезNo 11C'SNAP-7941 с использованием синтезатора для метилирования углерода-11. Основное внимание в этой работе, чтобы дать обзор о том, как организовать последовательный экспериментальный подход, включая автоматизированный синтез, контроль качества, а также последовательные в пробирке оценки с очень недолго нуклид углерода-11.

Во-первых, описаны ключевые шаги для успешного радиосинтеза с минимальными затратами времени и максимаальной урожайностью. Затем, надежная процедура контроля качества устанавливается сделать радиотрейстер доступны для потенциальных клинических исследований и отвечают критериям Европейской Pharmacopoeia12. Количественная оценка концентрации моляров и расчет соответствующей молярной активности является необходимым требованием для последовательных кинетических измерений.

Наконец, представлен новый и простой метод in vitro, оценивающий взаимодействие11C'SNAP-7941 с транспортером эффлюкса, P-gp (hMDR1). Предлагаемая кинетическая модель использует простое в обращении устройство, которое позволяет немедленную интерпретацию данных и требует минимальных усилий по культуре клеток13.

Protocol

ВНИМАНИЕ: В следующем протоколе участвуют несколько этапов, которые требуют обработки и манипуляции радиоактивностью. Важно, чтобы каждый шаг был согласован с Департаментом радиационной безопасности института и соответствующим национальным законодательным органом. Необходимо свести к минимуму воздействие ионизирующего излучения для операторов, участвующих в этом проекте по принципу ALARA ("Как мало, как разумно достижимый").

1. Управление временем и планирование эксперимента

ПРИМЕЧАНИЕ: Короткий период полураспада углерода-11 требует точного управления временем, чтобы свести к минимуму потерю радиоактивности (рисунок 1). Важно, чтобы любое лицо, о котором идет речь, знало свою область ответственности и сроки соответствующего действия. Для создания кинетической эксперимента в режиме реального времени, состоящего из11C'SNAP-7941, необходимо около четырех человек для плавного процесса.

  1. Организуйте производителя для11C'SNAP-7941.
  2. Сообщите оператору контроля качества, выполняя оценку спецификации, расчет концентрации массы и молярной активности времени начала синтеза.
  3. Держите кинетического экспериментатора в реальном времени готового к расчету разбавления и выполнению эксперимента.
  4. Проинструктируйте бегуна о переносе радиоактивности в соответствующее место в соответствующем временном пункте.

2. Автоматизированный синтезNo 11C'SNAP-7941 для доклинического использования

  1. Приготовление синтезатора (рисунок 2).
    1. Включите синтезатор, необходимые технические газы (гелий и водород) и программное обеспечение для управления синтезатором Tracerlab. Выберите соответствующую последовательность синтеза оснастки .
    2. Вымойте V1-V3 один раз с водой и дважды с ацетоном через реактор и клапан HPLC либо на нагрузку или впрыснуть положение в бутылку отходов цикла.
    3. Сухие все связанные линии в и из реактора через инъекционный клапан с непрерывным потоком гелия, активированным через V18.
    4. Нагрейте ловушку No11C'CH 3, а также ловушкуNo 11C'CH3OTf под гелиевым потоком 100 мл.мин-1 до 200 градусов по Цельсию через V24, V25, V29, V15, V9, V17 и V32/V33 с отсоединителем.
    5. Проверьте тот же путь на наличие утечек (с прикрепленным реактором) с гелиевым потоком 100 мл-мин-1. Герметичность гарантируется, когда поток опускается ниже 4 мл.мин-1.
    6. Включите насос HPLC (5-10 мл-мин-1) и промойте линии HPLC и инъекционный клапан ацетонитрилом/водой (50/50, v/v), а также линии HPLC с растворителем HPLC через V14 в лампочку.
    7. Опустошить луковицу через V11 и V12 в бутылку отходов с гелием поток через V19. Вымойте соответствующие линии с водой из V6 снова через V11 и V12 с гелиевым потоком через V18.
    8. Вымойте V5 с этанолом и V4 с водой через V11 и V12 в флакон коллекции продукции (PCV) с помощью гелия поток через V18, а затем опорожнить PCV через V13 в бутылку отходов с гелием поток через V20.
    9. Выключите насос HPLC, переключитесь на растворитель для синтеза ((ацетат аммония (2,5 г) L-1)/уксусная кислота 97.5/2.5 v/v; pH 3.5)/ацетонитрил 75/25 v/v), прикрепите полупрепаративную колонку HPLC и уравновесите столбец (поток 5 мл.мин-1).
    10. Заполните реагенты для синтеза и очистки: 1,5 мл воды (V2), 4,5 мл 0,9% NaCl (V4), 0,5 мл 96% этанола (V5), 10 мл воды (V6), и 90 мл воды (луковица).
    11. Прикрепите новый флакон отходов цикла; продукт флакон (помечены и оснащены аэрации иглы) на V13 и жидкого азота.
    12. Предварительно езкомыт картридж SPE (твердая фаза извлечения) с 10 мл 96% этанола и 20 мл воды и прикрепить его между V11 и V12.
    13. Начните предзапуск последовательности 20 мин перед началом синтеза, состоящий из нагрева ловушкиNo 11C'CO2 до 400 градусов по Цельсию и промывки ловушки с гелием поток 50 мл'мин-1через V27 (2 мин). Затем предварительно промойте ловушкуNo 11C'CO2 в течение 3 мин с водородным газом (120 мл.м.,-1) и, наконец, остыть до уровня ниже 40 градусов по Цельсию.
    14. Растворите 1 мг прекурсора в 400 л ацетонитрила (для синтеза ДНК, lt; 10 H2O), перенесите раствор на реакцию и добавьте 5,5 л TBAH (264 мг/мл-1 в метаноле). Прикрепите реактор к соответствующей позиции.
    15. Закройте горячую ячейку и включите под давлением горячей ячейки.
    16. Подтвердите начало процесса охлаждения ловушки CH4 с жидким азотом до -75 градусов по Цельсию.
    17. Отпустите радиоактивность при температуре.
  2. Производство циклотроновNo 11C'CO2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 2.2.1-2.2.4 проводятся одновременно с подготовкой модуля радиосинтеза (см. также рисунок1).
    1. Включите магнит циклотрон.
    2. Выберите цель 11C-CO2 и начните луч 65 ЗА.
    3. Подтвердите начало облучения, нажав кнопку Начало облучения
    4. Остановите луч и подтвердите высвобождение радиоактивности в синтезатор, нажав кнопку Доставка,после достижения желаемого количества радиоактивности (около 120 ГБК после 30 мин).
  3. Выполнение полностью автоматизированного радиосинтеза
    1. Подтвердите, что система готова к приему радиоактивности и запуску автоматизированного процесса
    2. Мониторинг следующего автоматизированного процесса.
      1. Проверить, если11 C'CO2 автоматически передается из циклотрона в единицу синтеза через V26 (около 4 мин) и что11C'CO2 в ловушке на молекулярном сито пропитанник никеля в качестве катализатора ( 11 Год Ловушка C'CO2 при комнатной температуре.
      2. Отслеживайте, если ловушка No11C'CO2 автоматически промывается сначала гелием (50 мл., тосводородным газом (120 мл-мин-1). Затем заметьте, что V27 и V25 закрыты, а захваченные11C'CO 2, включая водородный газ, нагреваются до 400 градусов по Цельсию и что сформированныйNo 11C-CH4 дополнительно транспортируется в предварительно охлажденный No11C ловушки и в ловушке там.
      3. Монитор, что V10 закрыт, V9 открыт (в сторону йодной колонки) иNo 11C CH4 снова освобождается путем нагрева ловушкиNo 11C CH4 медленно до 80 градусов по Цельсию и транспортируется в блок циркуляции с гелиевым потоком через V10 (выход из выхлопных газов). И далее проверить, если11C CH4 преобразуется вNo 11C CH3Я в циркуляции единицы, которая длится около 3 мин, и формируется11C CH3Я постоянно в ловушке на11C CH3I ловушка.
      4. Убедитесь, что выхлопной клапан V16 открыт, а ловушка No11C'CH3I нагревается до 90 градусов по Цельсию с потоком гелия (20 мл-мин-1) через V24. Таким образом, возможные побочные продукты удаляются, а затем V16 закрывается.
    3. Подтвердите, чтоNo 11C CH3я готов к выпуску в реактор.
    4. Мониторинг следующего автоматизированного процесса: Проверьте, если ловушка No11C'CH3Я нагревается до 190 градусов по Цельсию, а сформированная 11 C'CH3Я выпущена в реактор через ловушку No11C'CH3OTf (V32 и V33, еще на 200 C), V7 и V8 под непрерывным гелиевым потоком (10-25 мЛ-мин-1, V24). Во время этого процесса, V21 и V23 (выход из выхлопных газов) должны быть открыты.
    5. Подтвердите, что радиоактивность прибыла в реактор, как только количество радиоактивности в реакторе больше не повышается.
    6. Мониторинг следующего автоматизированного процесса и подготовка к ручному вмешательству, если это необходимо
      1. Проверьте, автоматически ли автоматически закрываются V23, V21 и V8, а реакционная смесь нагревается до 75 градусов по Цельсию. После 3 мин, наблюдать, если реактор охлаждается жидким азотом, пока температура не будет ниже 35 градусов по Цельсию. Впоследствии убедитесь, что реакционная смесь затушена 1,5 мл воды через V2. Во время этого процесса, V21 и V23 (выход из выхлопных газов) должны быть открыты.
      2. Отслеживайте, если V21 и V23 закрыты и реакционная смесь передается в инъекционный клапан HPLC, проходя через детектор жидкости в петлю HPLC (5 мл). Отслеживайте, если реакционная смесь автоматически вводится в столбец HPLC.
    7. Наблюдайте хроматограмму и отрежьте вручную пик продукта через стартпик кнопки. Нажмите Пик конца, когда продукт пиковый сигнал падает ниже примерно 400 cps после времени удержания около 8-10 мин (поток: 5 мЛ мин-1, Рисунок 3).
    8. Включите дополнительный поток гелия для ускорения опорожнения лампы.
    9. Монитор ли лампа опорожнения и наблюдать за отходами бутылку: Проверьте, если лампа опорожняется через V11, картридж SPE и V12 в отходы с гелием поток через V19 и дополнительной линии гелия, и если продукт сохраняет на картридже SPE.
    10. Подтвердите, что лампочка полностью пуста.
    11. Мониторинг автоматизированного процесса очистки SPE и передачи продукции
      1. Проверьте, если картридж SPE промывают с 10 мл воды через V6, V11, и V12 в отходы, и если этанол elutes продукт в PCV через V5, V11, и V12. Наконец, обратите внимание, если 0,9% NaCl добавляется в PCV через V4, V11 и V12, чтобы разбавить продукт.
      2. Убедитесь, что решение продукта передается через V13 и стерильный фильтр в флакон конечного продукта с гелиевым потоком через V20.
    12. Подтвердите, что продукт был полностью передан.

3. Контроль качества (КК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Контроль качества радиофармацевтических препаратов включает в себя измерение следующих параметров:

  • Радиохимическая чистота и моляровая активность (RP-HPLC)
  • Остаточные растворители (газовая хроматография, ГК)
  • Осмолальность (осмометр давления пара)
  • рН (рН-метр)
  • Чистота спектра/радионуклида (з-спектрометр)
  • Полураспада / радионуклид чистоты (доза калибратора)

Все физико-химические параметры определяются до выпуска продукта, а значения должны быть в определенном параметре качества.

  1. Подготовка оборудования для контроля качества
    1. Начните подготовку за 30 минут до окончания синтеза.
    2. Приготовьте конический флакон в свинцовом защищенном контейнере и защищенный шприц объемом 1 мл с прикрепленной иглой.
    3. Подготовьте эталонное стандартное решение SNAP-7941 (10 мкгл-1) в воде для HPLC.
    4. Включите счетчик рН, газовый хроматограф и использованные газы, осмометр и все компоненты HPLC.
    5. Включите программное обеспечение управления HPLC и выберите выделенную колонку и соответствующий метод дляNo 11C'SNAP-7941 (мобильная фаза: (вода/ацетика 97,5/ 2,5 v/v; 2,5 г.Л.л.1 аммоний ацетат; рН 3,5)/ацетонитрий 70/30 v/v; поток: 1 мл/мин -1) и написать список образцов с двумя измерениями (стандарт и продукт). Запустите метод кондиционирования столбца.
    6. Введите 20 злиц референтного раствора SNAP-7941 со шприцем Hamilton после 10 мин кондиционирования и начните аналитический запуск.
    7. Вымойте шприц Гамильтона два раза с ацетонитрилом и водой после инъекции.
    8. Запустите программное обеспечение управления GC и напишите список примеров.
  2. Выполнение контроля качества
    1. Измерьте абсолютный радиоактивный выход продукта после окончания синтеза и перенесите 100 л продукта в реакционный флакон с подготовленным шприцем для контроля качества.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все данные, полученные в ходе контроля качества, должны быть задокументированы в соответствии с национальными правилами.
    2. Аналитический HPLC: Измерьте радиохимическую чистоту и химическую чистоту и сообщите персоне ответственному для экспериментов культуры клетки немедленно результатов.
      1. Нарисуйте 40 зл и вводят в HPLC 40 qL образца КК. Начните пробег, перемещая руку инъекционного клапана от нагрузки к inject (рисунок3).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время бега (8 минут), другие измерения протокола могут быть выполнены, чтобы избежать как можно больше распада, как это возможно.
      2. Откройте хроматограмму и интегрируйте все пики в канал радиоактивности. Сравните время хранения продукта (5.0-7.0 мин) с временем удержания эталонного стандарта. Сравните область под кривой в процентах от всех интегрированных пиков. Пик продукта должен составить более 95% (радиохимическая чистота) от общего интегрированного участка (радиоканала).
      3. Интегрируйте сигнал в УФ-канал для определения химической чистоты. Основной примеси, как правило, предшественник SNAP кислоты на 2,8-3,5 мин. КонцентрациянатC'SNAP-7941 рассчитывается из кривой калибровки после интеграции. Рассчитайте концентрацию SNAP-7941 в «мололимл-1» и определите активность моляра с помощью следующего уравнения:
        Equation 1
    3. Для газовой хроматографии перенесите 20 зл и контроля качества в специальный стеклянный флакон. Поместите его в автосэмпере и начните измерение. После завершения измерения откройте хроматограмму и запишите числа автоматически интегрированных пиков. Образец не должен содержать более 410 ppm ацетонитрила и 10% этанола.
    4. Осмолальность: Положите бумажный образец диска на выделенную полость и нанесите 10 зл и на образец. Нажмите кнопку "Закрыть" для измерения осмолальности. После 3 мин, устройство отображает осмолинность, которая должна быть в диапазоне 190-500 мхм кг-1.
    5. рН: Вымойте электрод водой. Измерьте рН, поставив электрод в образец. РН должен быть в диапазоне 5,0-8,5. Вымойте электрод снова после измерения и поместите электрод в референтный раствор рН.
    6. В-спектр: Поместите образец КК в спектрометр, откройте программное обеспечение для управления и начните измерение. Остановите измерение и запишите измеренную энергию, которая должна быть 511 кеВ (диапазон 420-520 кеВ). Откройте меню файла и обезопасите файл с соответствующим номером партии. Вспомните сохраненный спектр в специальном программном обеспечении и распечатайте спектр.
    7. Период полураспада: Измерьте активность образца КК два раза с помощью калибратора дозы. Запишите соответствующие времена и вычислите период полураспада экспоненциального.
  3. Выпуска
    1. После того, как все параметры были проверены и результаты в соответствии с руководящими принципами австрийских властей, освободить radiotracer. Оператор должен подписать правильность данных.

4. Оценка взаимодействия с транспортером P-gp

  1. Культура сотовой связи
    1. Начните ламинарный поток воздуха (LAF) рабочей скамьи и очистите скамейку не менее 15 минут, прежде чем приступить к работе.
    2. Смешайте среднюю среду клеточной культуры в стерильных условиях в LAF с 10% FCS (50 мл) и 0,5% антибиотиков (2,5 мл) со стерильной объемной пипеткой с помощью автоматизированной помощи пипетки.
    3. Оттепель MDCKII-hMDR1 и MDCKII-WT клетки и культивировать в T75 или T175 клеточной культуры колбу 10-14 дней до экспериментов в асептических условиях (LAF).
    4. Изменение среды на следующий день, чтобы удалить все не приверженцы и апоптотические клетки.
    5. Замените каждые три дня среду на свежую (12 мл для T75 и 23 мл для колбы культуры т175, соответственно).
    6. Разделите клетки в соответствии с графиком экспериментов на свежие колбы или к посудам клеточной культуры при слиянии 80%, чтобы избежать двуслойности.
  2. Подготовка клеток к экспериментам
    1. Разделите клетки за два дня до начала экспериментов и семена в концентрации 2,5 х 105 ячеек на 2 мл в косой плоскости тарелки клеточной культуры (рисунок4). Используйте автоматическое устройство счетчика ячеек или камеру подсчета голосов Neubauer для подсчета ячеек и расчета соответствующего коэффициента расщепления.
    2. Удалите среду за день до экспериментов, вымойте клетки на культурном блюде с 4 мл DPBS и добавьте свежие 5 мл среды клеточной культуры. Поместите блюдо горизонтально в инкубатор.
    3. Вымойте клетки с DPBS по крайней мере 0,5 ч до экспериментов и заменить 2 мл FBS свободной среде. Изучите слияние и морфологию клеток с помощью микроскопа.
  3. Выполнение экспериментов в трех различных установках.
    1. Используйте чашку Петри для экспериментов, описанных в 4.2.3.
    2. Лечить клетки в течение 0,5 ч перед экспериментами с 10 мкм (я)-вераполил гидрохлорид.
    3. Добавьте в ДМСО 0,98 л раствора запасов верапамиля (20,4 мм) -верапамил гидрохлорид в ДМСО). Окончательное содержание DMSO составляет 0,05% во время лечения.
    4. Инкубировать клетки на 0,5 л с управлением транспортным средством (DMSO). Используйте тот же объем, что и для лечения препарата.
  4. Эксперименты в режиме реального времени (для всех трех установк)
    1. Включите устройство, компьютер и убедитесь, что они правильно подключены, а затем открыть программное обеспечение управления.
    2. Выберите опцию One Target, разблокируйте шаблон и отрегулируйте следующие настройки:
      Количество позиций: 2 (два)
      Время обнаружения (сек): 3 (три)
      Время задержки обнаружения (ы): 2 (два)
      Название первого этапа: базовый
    3. Вставьте блюдо культуры клетки в наклонную поддержку прибора, убеждаясь что полюс клетки находится на нижней стороне и покрыно с средой культуры клетки.
    4. Запустите запуск с помощью кнопки «Пуск». Система просит сохранить файл. Выберите имя файла и путь сохранения. Центр управления всплывает и начинается базовое измерение (поддержка клеточной культуры начинает вращаться).
    5. Выберите по другим опциям:
      Шкала времени: минуты
      Коррекция нуклидов: углерод-11
    6. Проверьте все коробки под кривыми на графике (фон (красный), целевой (синий) и целевой минус фон (черный)).
    7. Получить параметры контроля качества: моляровская активность «GBq.»mol-1» и концентрация активности »MBq.mL-1» в конце синтеза.
    8. Рассчитайте соответствующий объем трассировщика на 15 нм отnatC'SNAP-7941 в объеме ассса 2 мл.
      Equation 2
      Equation 3
    9. Подготовьте пипетку к соответствующей объему и аликоту продукта No11C'SNAP-7941 в свинцовой защите.
    10. Нажмите Пауза запустить в окне центра управления. Подождите, пока блюдо вращения останавливается и боковой бар с названием Приостановлено и следующий этап происходят.
    11. Откройте крышку кинетической устройства в режиме реального времени. Поверните культурный блюдо поддержки 90 "влево. Добавьте рассчитанный объем трассировщика и вернитесь к исходной позиции. Затем закройте крышку устройства. Немедленно нажмите кнопку «Продолжить» для начала эксперимента.
    12. Завершите эксперимент через 20 минут, выбрав паузу, а затем прекратите запуск (нажмите End Run в боковой панели).
  5. Анализ и обработка данных с использованием статистического программного обеспечения
    1. Откройте программное обеспечение для управления в режиме реального времени. Нажмите на Открытые файлы, чтобы напомнить о требуемой кинетике. Кинетика иллюстрируется в окне центра управления.
    2. Выберите по правому щелчку прямо на кривыхэкспорта кинетики. Сохраните текстовый файл, содержащий необработанные данные. Откройте программу статистики и вставьте необработанный файл данных экспериментов в реальном времени.
    3. Начните со времени (x-оси) при добавлении радиотрака (исключите фоновое измерение) и нормализуйте до процентного сигнала максимального CPS (рассчитывает в секунду).
    4. Загрузите все нормализованные данные в новый файл GraphPad Prism.
    5. Рассчитать средние значения и стандартное отклонение.
    6. Проиллюстрировать полученные данные в виде графика, показывающего отклонение (скорость увеличения) поглощения трассировщика всех трех установленных исправления.

Representative Results

Полностью автоматизированный радиосинтезNo 11C'SNAP-7941 дал 5,7 и 2,5 ГБК (4,6 и 2,0% в EOB, 14,9 и 5,9% на основе11C'CH3OTf; n - 10) сформулированного продукта. Общий синтез длился около 40 минут, где 15 мин были необходимы для подготовкиNo 11C CH3OTf с помощью метода газовой фазы, еще 5 мин были необходимы для радиомаркировки предшественника, а затем 10 мин полу-препаративного RP-HPLC очистки и 10 мин для c18 картридж твердой фазы извлечения и разработки. Затем, небольшой aliquot (приблизительно 100-200 QL) был доставлен к лицу, ответственному за контроль качества, в то время как оригинальный флакон продукта, содержащий готовый к использованию трассировщик был передан экспериментатору кинетический анализ в реальном времени.

Контроль качества был завершен в течение 10 минут после окончания синтеза. Моляровская активность была в диапазоне 72 и 41 ГБК/моль (н No 10), а радиохимическая чистота всегда была Все остальные параметры (рН, осмолность, остаточные растворители) соответствовали критериям выпуска. Для кинетической ассеии в режиме реального времени были выбраны три различных экспериментальных установки: (A) обработанные и необработанные (транспортные средства) клетки MDCKII-WT, (B) необработанные или обработанные клетками MDCKII-hMDR1 и (C) последней клеточной линией с блокированием до реального времени кинетическое асссис транспортера с использованием (я)-верапамил. Применение No11C'SNAP-7941 к линии клеток дикого типа MDCKII-WT (P-gp non-expressing) и MDCKII-hMDR1 (P-gp expressing) показывает различное кинетическое поведение, так как происходит быстрое накопление линии клеток дикого типа, в то время как накопление не наблюдалось для клеток MDCKII-hMDR1. Тем не менее, блокирование P-gp efflux транспортер в MDCKII-hMDR1 клетки с (я)-verapamil привело к сопоставимым в режиме реального времени кинетические, как уже видели для линии клеток wildtype (Рисунок 5).

Figure 1
Рисунок 1: Обзор рабочего потока. Рабочий поток радиосинтеза, контроль качества и выполнение кинетической измерения в реальном времениNo 11C'SNAP-7941. Черные стрелки указывают транспортный путь радиоактивности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Радиосинтетическая схема автоматизированного синтезатора. Переключение цепи автоматизированного синтезатора, начиная с блока циркуляции дляNo 11C CH3I /11C CH3OTf производства, реактора для внедрения деятельности в раствор прекурсора и SPE очистки (SPE твердая фаза извлечения; PCV - флакон для сбора продукции). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Представительные хроматограммы полностью автоматизированного радиосинтезаNo 11C'SNAP-7841. Полупрепаративная хроматограмма RP-HPLC иллюстрируется в верхней и аналитической после очищения на дне. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Подготовка блюда клеточной культуры для экспериментов в реальном времени. Шаг 1 включает в себя посев 2,5 х 105 до 1 х 106 в зависимости от типа ячейки и их темпов роста. Впоследствии, блюдо культуры помещается в косой плоскости (примерно 30-45 " ). Поэтому поставляемый металлический аппарат или крышка блюда клеточной культуры могут быть использованы в инкубаторе для стабилизации наклонного положения блюда. На следующий день после (24 ч) блюдо регулируется горизонтально, и свежая среда культуры клеток добавляется, чтобы полностью покрыть поверхность клетки. В день эксперимента исследуются жизнеспособность и слияние клеток. Согласно экспериментальному протоколу, клетки промывают dPBS, среда заменяется сывороточной средой (2 мл), а культурное блюдо перемещается в косое положение до начала экспериментов. Отныне клетки можно лечить с помощью ингибитора или транспортного средства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Кинетические измерения в реальном времениNo 11C'SNAP-7941. Представительная кинетика в реальном времени No11C'SNAP-7941 показана в трех различных установках: с использованием клеток MDCKII-WT; Клетки MDCKII-hMDR1 предварительно блокируются с помощью (я)-вераполила в виде ингибитора P-gp и mdCKII-hMDR1 без блокировки. Оси y иллюстрирует скорость увеличения предварительно заблокированных клеток MDCKII-hMDR1 и WT по сравнению с результатами необработанных или обработанных транспортными средствами клеток MDCKII-MDR1, соответственно (без поглощения, 0%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Discussion

Радиосинтез No11C'SNAP-7941 был создан на коммерческом модуле синтеза. Благодаря возможности полной автоматизации процедуры приготовления радиосинтез был надежно надежен, и были достигнуты улучшения в области радиационной защиты оператора. Подготовка синтезатора оказывает огромное влияние на качество радиотрактора, особенно с точки зрения молярной активности. Таким образом, необходимо постоянно работать в инертных условиях (например, атмосфера гелия) и промывка всех линий, расположенных до реакционного сосуда (целевая линия, производственный цикл И реакторnoNo11CCH3I (см. рисунок2).). Кроме того, нагревание соответствующих ловушек и печей перед началом синтеза для удаления влаги и атмосферного углерода выгодно повышает активность моляров. Особенно столбец AgOTf, пропитанный графитным углем, чрезвычайно чувствителен к влажности. Даже незначительные количества любого источника влаги нарушают преобразованиеNo 11C'CH3I в11C'CH3OTf. Перед началом синтеза ловушкаNo 11C'CO2 и ловушкаNo 11C'CH3I должны быть охлаждены до комнатной температуры снова, чтобы обеспечить последующее улавливание. Кроме того, рекомендуется растворить предшественник незадолго до начала синтеза и добавить основание непосредственно в раствор прекурсора.

Контроль качества радиочастот углерода-11 должен быть рационально разработан для непрерывного и быстрого рабочего процесса. Однако наиболее важными параметрами для исследований клеточной культуры являются радиохимическая чистота и моляровая активность для получения достоверных результатов. Правильная оценка молярной активности требует надежного аналитического метода HPLC, а кривая калибровки должна охватывать диапазон концентрации конечного продукта. Сложная часть для радиочастот заключается в достижении концентрации выше предела количественной оценки (ЛОЗ) за счет небольших количеств, которые производятся во время радиосинтеза. Таким образом, искусство заключается в том, чтобы найти баланс между высокой молярной деятельности, чтобы избежать насыщения рецепторов и достаточно высоких концентраций, чтобы все еще быть в состоянии количественно нерадиоактивного сигнала.

11С. SNAP-7941 был подтвержден как мощный субстрат человека P-gp транспортер, как не было обнаружено накопления в необработанных или транспортных средств лечения MDCKII-hMDR1 клеток из-за быстрого efflux. В отличие от этого, оба экспериментальных установки (MDCKII-WT или предварительно заблокированных клеток MDCKII-hMDR1) дали аналогичные результаты (накопление11C'SNAP-7941), поддерживая универсальность этого анализа in vitro. Клетки MDCKII-hMDR1 очень подходят для экспериментов LigandTracer из-за их стабильной трансфекции, быстрого роста и стойких против сдвига стресса, вызванного вращающейся клеточной культуры блюдо. Отсутствие поглощения11C'SNAP-7941 в мозге крыс и мышей может, таким образом, произойти, вызванные efflux через P-gp транспортер. Из-за трансфекции клеток собачьих почек с человеческим мультинаркотической резистентностью белка 1 (hMDR-1, P-gp), прогностического значения этого метода для связывания транспортера эффлюкса у человека высока, что благоприятно с точки зрения будущего клинического применения. Однако до сих пор избирательность по отношению к другим транспортеру эффлюкса не была проверена. Таким образом, другие линии клеток могут быть использованы, выражая различные видные транспортеры efflux как белок устойчивости к раку молочной железы (BCRP) или многократное сопротивление белка-1 (MRP-1), для изучения взаимодействия с этими транспортерами. Метод по сравнению с классическим накоплением или транспортным анализом очень прост и дает сразу качественные результаты. Кроме того, самым большим преимуществом является то, что эта технология позволяет оценивать прямое взаимодействие ПЭТ-трекера и цели в режиме реального времени, в отличие от обычного эксперимента с использованием косвенной количественной оценки (в основном смещения). Кроме того, программное обеспечение радиоассава в реальном времени обеспечивает экспериментальную гибкость (например, коррекция распада нуклидов, измерение времени и позиций и т.д.) и, следовательно, высокую свободу для пользователей. С другой стороны, ограничения метода включают низкую пропускную стоимость образца, так как одновременно можно измерить только одну клеточную тарелку. Кроме того, следует принять во внимание ряд других технических и оперативных вопросов: описанная технология очень чувствительна к фоновой радиации; таким образом, источники излучения должны храниться на расстоянии, и следует уделять особое внимание фоновым измерениям до проведения эксперимента. Другой вопрос, касающийся экспериментов при более высоких температурах, чем комнатная температура, является нагревание наклонной поддержки: испарение среды клеточной культуры может повлиять на детектор. Вместо нагрева, все устройство предпочтительно помещается в инкубатор. Кроме того, метод ограничен линиями клеток приверженцев. Через вращение тарелки культуры клетки, сдвига чувствительных к стрессу клетки могут отделиться от блюда, что может привести к недействительным результатам.

Тем не менее, если экспериментатор обращает внимание на эти незначительные недостатки, метод дает быстрые и надежные результаты для анализа кинетического поведения доклинических ПЭТ-трассеров.

Disclosures

Нам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана Австрийским научным фондом (FWF P26502-B24, М. Миттерхаузер). Мы благодарны за техническую поддержку Т. Зенца и А. Кркала. Кроме того, мы благодарим К. Паллича за подготовку Аготфа и Х. Шпрейцера за распространение предшественника.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst Shimadzu, Kyoto, Japan Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine Merck, Darmstadt, Germany 1.04761.0100
Acetonitrile Merck, Darmstadt, Germany for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA HPLC grade
Ammonium acetate Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid Merck, Darmstadt, Germany glacial
Ethanol Merck, Darmstadt, Germany 96%
NaCl B. Braun, Melsungen, Germany 0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA HPLC grade
SPE cartridge Waters, Milford, MA, USA SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column Merck, Darmstadt, Germany Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn Merck, Darmstadt, Germany Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor University of Vienna, Austria SNAP-acid
Reference compound University of Vienna, Austria SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC Alltech, Deerfield, IL, USA 80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2 Air Liquide, Vienna, Austria Target gas
Name Company Catalog Number Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) HPLC pump
Merck Hitachi, L7400 Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) UV-detector
NaI-radiodetector Raytest (Straubenhardt, Germany) NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm Merck (Darmstadt, Germany) HPLC column
430-GC Bruker (Bremen, Germany) Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600 Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) Osmometer
g-spectrometer g-spectrometer
Gas chromatography controlling software VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) Winplots version 3.21
HPLC controlling software Raytest (Straubenhardt, Germany) Gina Star Version 5.9
inolab 740 WTW (Weilheim, Germany) pH meter
Name Company Catalog Number Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS) VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 15140
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) 276855-100 mL
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes VWR International GmbH, Vienna, Austria Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips VWR International GmbH, Vienna, Austria Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2 Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0 GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter Millipore Corporation Billerica MA01821 Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors Millipore Corporation Billerica MA01821 Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saito, Y., Maruyama, K. Identification of melanin-concentrating hormone receptor and its impact on drug discovery. Journal of Experimental Zoology. 305, 761-768 (2006).
  2. Philippe, C., et al. Preclinical in vitro & in vivo evaluation of [11C]SNAP-7941 - the first PET tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1. Nuclear Medicine and Biology. 40, 919-925 (2013).
  3. Philippe, C., et al. Radiosynthesis of [ 11C]SNAP-7941-the first PET-tracer for the melanin concentrating hormone receptor 1 (MCHR1). Applied. Radiation and Isotopes. 70, 2287-2294 (2012).
  4. Philippe, C., et al. SNAPshots of the MCHR1 : a Comparison Between the PET-Tracers [ 18 F ] FE @ SNAP and [ 11 C ] SNAP-7941. Molecular Imaging Biology. 1-12 (2018).
  5. Schirmer, E., et al. Syntheses of precursors and reference compounds of the melanin- concentrating hormone receptor 1 (MCHR1) Tracers [11C]SNAP-7941 and [18F]FE@SNAP for positron emission tomography. Molecules. 18, 12119-12143 (2013).
  6. Miller, P. W., Long, N. J., Vilar, R., Gee, A. D. Synthese von 11C-, 18F-, 15O- und 13N-Radiotracern für die Positronenemissionstomographie. Angewandte Chemie. 120, 9136-9172 (2008).
  7. Pichler, V., et al. An overview on PET radiochemistry: part 1 - covalent labels - 18 F, 11 C, and 13 N. Journal of Nuclear Medicine. 59, 1350-1354 (2018).
  8. Pichler, V., et al. Molar activity - The keystone in 11C-radiochemistry: An explorative study using the gas phase method. Nuclear Medicine and Biology. 67, 21-26 (2018).
  9. Larsen, P., Ulin, J., Dahlstrøm, K., Jensen, M. Synthesis of [11C]iodomethane by iodination of [11C]methane. Applied Radiation and Isotopes. 48, 153-157 (1997).
  10. Dahl, K., Halldin, C., Schou, M. New methodologies for the preparation of carbon-11 labeled radiopharmaceuticals. Clinical and Translational Imaging. 5, 275-289 (2017).
  11. Raaphorst, R. M., et al. Radiopharmaceuticals for assessing ABC transporters at the blood-brain barrier. Clinical. Pharmacollogy & Therapeutics. 97, 362-371 (2015).
  12. Nics, L., et al. Speed matters to raise molar radioactivity: Fast HPLC shortens the quality control of C-11 PET-tracers. Nuclear Medicine and Biology. 57, 28-33 (2018).
  13. Zeilinger, M., et al. New approaches for the reliable in vitro assessment of binding affinity based on high-resolution real-time data acquisition of radioligand-receptor binding kinetics. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging (Research). 7, 22 (2017).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics