Aspect technique de la synthèse automatisée et de l'évaluation cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941

Chemistry
 

Summary

Ici, nous représentons un protocole pour la radioétiquetage entièrement automatisé de [11C]SNAP-7941 et l'analyse de la cinétique en temps réel de ce PET-tracer sur les cellules exprimantes et non-exprimantes P-gp.

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Vraka, C., Pichler, V., Pfaff, S., Balber, T., Hacker, M., Mitterhauser, M., Wadsak, W., Philippe, C. Technical Aspect of the Automated Synthesis and Real-Time Kinetic Evaluation of [11C]SNAP-7941. J. Vis. Exp. (146), e59557, doi:10.3791/59557 (2019).

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Abstract

La tomographie par émission de positrons (TEP) est une technique essentielle d'imagerie moléculaire qui permet de mieux comprendre les voies et d'utiliser des radioligands ciblés spécifiques pour les enquêtes in vivo. Dans ce protocole, une radiosynthèse télécommandée robuste et fiable de [11C]SNAP-7941, un antagoniste au récepteur hormonal de mélanine-concentration 1, est décrite. La radiosynthèse commence avec le cyclotron produit [11C]CO2 qui est par la suite encore réagi par une transition de phase de gaz à [11C]CH3OTf. Ensuite, cet intermédiaire réactif est introduit à la solution précurseur et forme le radiotraceur respectif. La pureté chimique et la pureté radiochimique sont déterminées au moyen de RP-HPLC, régulièrement mis en œuvre dans le processus de contrôle de la qualité radiopharmaceutique. En outre, l'activité molaire est calculée car il s'agit d'une nécessité pour les enquêtes cinétiques en temps réel suivantes. En outre, [11C]SNAP-7941 est appliqué aux cellules MDCKII-WT et MDCKII-hMDR1 pour évaluer l'impact de l'expression de P-glycoprotéine (P-gp) sur l'accumulation cellulaire. Pour cette raison, la lignée cellulaire exprimante P-gp (MDCKII-hMDR1) est soit utilisée sans ou avec blocage avant les expériences au moyen du substrat P-gp ()-verapamil et les résultats sont comparés à ceux observés pour les cellules de type sauvage. L'approche expérimentale globale démontre l'importance d'une gestion précise du temps qui est essentielle pour chaque étude préclinique et clinique utilisant des traceurs de TEP radio-étiquetés avec des nucléides de courte durée, tels que le carbone-11 (demi-vie : 20 min).

Introduction

[11C] SNAP-7941 a été développé comme la première tomographie par émission de positrons (PET)-tracer ciblant le récepteur hormonal à concentration de mélanine 1 (MCHR1) - un récepteur principalement impliqué dans la régulation centrale de l'appétit et de l'apport alimentaire1. L'étiquetage carbone-11 du SNAP-7941, un antagoniste MCHR1 bien caractérisé, a donné l'authentique PET-tracer2,3,4,5. Cependant, la radiosynthèse entièrement automatisée est très difficile en termes d'efficacité du temps et de reproductibilité avec le radionucléide de courte durée carbone-11 offrant une demi-vie de 20 min6. Le temps de synthèse global doit être réduit au minimum, et en règle générale, il ne doit pas dépasser 2-3 demi-vies (c.-à-d. environ 40-60 min pour le carbone-11)7. En particulier, les procédures de synthèse pour les radiotraceurs ciblant les systèmes récepteurs avec des densités d'expression faible doivent être largement optimisées pour obtenir des rendements suffisants et, par conséquent, une activité molaire élevée8. La stratégie synthétique suit souvent la production de radionucléides dans un cyclotron et la libération de [11C]CO2 au synthétiseur. Là, [11C]CO2 est d'abord réduit à [11C]CH4 et a ensuite réagi avec de l'iode pour produire [11C]CH3I via la méthode de phase gaz9,10. D'autres traitements avec des rendements de triflate argent [11C]CH3OTf directement en ligne. Par la suite, cet intermédiaire réactif étiqueté carbone-11 est introduit dans une solution contenant la molécule précurseur. Une radiosynthèse automatisée implique en outre un processus de purification avec RP-HPLC semi-préparatif comprenant la formulation ultérieure du produit approprié pour des études précliniques et cliniques.

Indépendamment de la demi-vie du radionucléide et de l'effort de temps de la radiosynthèse, la pharmacocinétique d'un radiopharmaceutique est la partie la plus critique à évaluer pendant le développement de PET-tracer. En termes de neuroimagerie, l'entrée du cerveau du PET-tracer est la principale condition préalable. Cependant, la barrière hémato-encéphalique (BBB), une « frontière de sécurité » du cerveau, exprime fortement les transporteurs d'efflux qui peuvent décharger de petites molécules (par exemple, PET-tracers) et entraver efficacement leur applicabilité.

Un énorme inconvénient lors de l'évaluation préclinique sont les interactions inattendues envers ces transporteurs d'efflux, qui sont souvent méconnues dans les expériences in vitro et conduisant à l'échec du PET-tracer in vivo, comme observé pour [11C]SNAP-7941. L'imagerie de PET chez les rats a démontré l'accumulation basse de cerveau, qui a augmenté de façon spectaculaire après administration du tariquidar d'inhibiteur de P-gp11. Ces données suggèrent que [11C]SNAP-7941 est un substrat de ce système de transport d'efflux empêchant la liaison de ligand au MCHR1 central. Malheureusement, il existe encore un manque de modèles in vitro adéquats permettant de prédire la pénétration de BBB à un stade précoce du développement du traceur.

Ici, nous décrivons la synthèse automatisée de [11C]SNAP-7941 à l'aide d'un synthétiseur pour les méthylations de carbone-11. L'accent de ce travail est de donner un aperçu sur la façon d'organiser une approche expérimentale consécutive, y compris la synthèse automatisée, le contrôle de la qualité ainsi que l'évaluation in vitro successive avec le nucléide de très courte durée carbone-11.

Tout d'abord, les étapes clés d'une radiosynthèse réussie avec un minimum de temps et un rendement maximal sont décrites. Ensuite, une procédure de contrôle de la qualité fiable est mise en place pour mettre le radiotraceur à la disposition des études cliniques potentielles et répondre aux critères de la Pharmacopoeia européenne12. La quantification de la concentration molaire et le calcul de l'activité molaire respective est une exigence essentielle pour les mesures cinétiques successives.

Enfin, une nouvelle méthode in vitro simple évaluant les interactions de [11C]SNAP-7941 vers le transporteur d'efflux, P-gp (hMDR1), est présentée. Le modèle cinétique proposé utilise un dispositif facile à manipuler qui permet une interprétation immédiate des données et nécessite un minimum d'effort de culture cellulaire13.

Protocol

CAUTION: Dans le protocole suivant sont multiples étapes impliquées qui nécessitent la manipulation et la manipulation de la radioactivité. Il est important que chaque étape soit en accord avec le Département de la sécurité des radiations de l'institut et la législature nationale concernée. Il est obligatoire de minimiser l'exposition aux rayonnements ionisants pour les opérateurs concernés suivant le principe ALARA («As Low As Reasonably Achievable»).

1. Gestion du temps et planification de l'expérience

REMARQUE : La courte demi-vie du carbone-11 nécessite une gestion précise du temps pour minimiser la perte de radioactivité (figure 1). Il est important que toute personne concernée connaisse son domaine de responsabilité et le moment de l'action respective. Pour la mise en place d'une expérience cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941, environ quatre personnes sont nécessaires pour un processus en douceur.

  1. Organisez un producteur pour [11C]SNAP-7941.
  2. Informez l'opérateur de contrôle de la qualité effectuant l'évaluation de spécification, le calcul de la concentration de masse et l'activité molaire de l'heure de début de synthèse.
  3. Tenez l'expérimentateur cinétique en temps réel prêt pour le calcul de dilution et l'exécution de l'expérience.
  4. Instruire le coureur pour le transfert de la radioactivité à la place respective au moment où.

2. Synthèse automatisée de [11C]SNAP-7941 pour une utilisation préclinique

  1. Préparation du synthétiseur (figure 2).
    1. Allumez le synthétiseur, les gaz techniques requis (hélium et hydrogène) et le logiciel de contrôle du synthétiseur Tracerlab. Sélectionnez le snapde séquence de synthèse respectif .
    2. Laver V1-V3 une fois avec de l'eau et deux fois avec de l'acétone via le réacteur et la valve HPLC soit sur la charge ou d'injecter la position dans la bouteille de déchets boucle.
    3. Séchez toutes les lignes associées à l'entrée et à l'extérieur du réacteur par l'intermédiaire de la soupape d'injection avec un flux continu d'hélium activé par V18.
    4. Chauffez le piège [11C]CH3I ainsi que le piège [11C]CH3OTf sous un flux d'hélium de 100 ml-min-1 jusqu'à 200 oC via V24, V25, V29, V15, V9, V17 et V32/V33 avec réacteur détaché.
    5. Vérifiez la même voie pour les fuites (avec réacteur attaché) avec un débit d'hélium de 100 mL-min-1. L'étanchéité est garantie lorsque le débit tombe en dessous de 4 mLmin-1.
    6. Allumez la pompe HPLC (5-10 mL-min-1) et lavez les lignes HPLC et la valve d'injection avec de l'acétonitrile/eau (50/50, v/v) ainsi que les lignes HPLC avec le solvant HPLC via V14 dans l'ampoule.
    7. Videz l'ampoule via V11 et V12 dans la bouteille de déchets avec un flux d'hélium via V19. Laver les lignes respectives avec de l'eau de V6 à nouveau via V11 et V12 avec un flux d'hélium via V18.
    8. Laver V5 avec de l'éthanol et V4 avec de l'eau via V11 et V12 dans le flacon de collecte du produit (PCV) à l'aide d'un flux d'hélium via V18, puis vider le PCV via V13 dans la bouteille de déchets avec un flux d'hélium via V20.
    9. Éteignez la pompe HPLC, passez au solvant pour la synthèse (acétate d'ammonium (2,5 g L-1)/acide acétique 97,5/2,5 v/v; pH 3.5)/acetonitrile 75/25 v/v), attacher la colonne semi-préparative HPLC et réquiliber la colonne (flux de 5 mL-min-1).
    10. Remplissez les réactifs pour la synthèse et la purification : 1,5 ml d'eau (V2), 4,5 ml de 0,9 % NaCl (V4), 0,5 ml d'éthanol à 96 % (V5), 10 ml d'eau (V6) et 90 ml d'eau (ampoule).
    11. Attachez une nouvelle fiole de déchets de boucle; une flacon de produit (étiqueté et équipé d'une aiguille d'aération) à V13 et à l'azote liquide.
    12. Préconditionner une cartouche SPE (extraction en phase solide) avec 10 ml d'éthanol à 96 % et 20 ml d'eau et l'attacher entre Le V11 et le V12.
    13. Démarrer la séquence pré-course 20 min avant de commencer la synthèse, consistant à chauffer le piège[11C]CO2 à 400 oC et à rincer le piège avec un flux d'hélium de 50 mlmin-1via V27 (2 min). Ensuite, pré-rincer le piège [11C]CO2 pendant 3 min avec de l'hydrogène gazeux (120 mL-min-1) et enfin refroidir à moins de 40 oC.
    14. Dissoudre 1 mg de précurseur dans 400 l d'acétonitrile (pour la synthèse de l'ADN, lt; 10 H2O), transférer la solution à la réaction et ajouter 5,5 l de TBAH (264 mg-mL-1 en méthanol). Attachez le réacteur à sa position respective.
    15. Fermer la cellule chaude et allumer la pression de la cellule chaude.
    16. Confirmer le début du processus de refroidissement du piège CH4 avec de l'azote liquide à -75 oC.
    17. Relâchez la radioactivité lorsque la température est atteinte.
  2. Production de Cyclotron de [11C]CO2
    REMARQUE : Les étapes 2.2.1-2.2.4 sont effectuées simultanément à la préparation du module de radiosynthèse (voir aussi Figure 1).
    1. Allumez l'aimant du cyclotron.
    2. Sélectionnez la cible 11C-CO2 et démarrez le faisceau 65 A.
    3. Confirmer le début de l'irradiation en appuyant sur le bouton Démarrer l'irradiation
    4. Arrêter le faisceau et confirmer la libération de radioactivité dans le synthétiseur en appuyant sur le bouton Livraison, après la quantité désirée de radioactivité est atteint (environ 120 GBq après 30 min).
  3. Exécution de la radiosynthèse entièrement automatisée
    1. Confirmer que le système est prêt à recevoir la radioactivité et à démarrer le processus automatisé
    2. Suivi du processus automatisé suivant.
      1. Vérifier si le [11C]CO2 est automatiquement transféré du cyclotron dans l'unité de synthèse via V26 (environ 4 min) et que le [11C]CO2 est piégé sur le tamis moléculaire imprégné de nickel comme catalyseur ([ 11 Ans, états-unis ( Piège C]CO2) à température ambiante.
      2. Suivre si le piège [11C]CO2 est automatiquement rincé d'abord avec de l'hélium (50 mLmin-1) puis avec de l'hydrogène gazeux (120 mL-min-1). Ensuite, observez que le V27 et le V25 sont fermés et que le[11C]CO2, y compris l'hydrogène, est chauffé à 400 oC et que le [11 C]CH4 formé est transporté vers le [11 C]CH4 piège et pris au piège là-bas.
      3. Surveiller que V10 est fermé, V9 ouvert (vers la colonne d'iode) et [11C]CH4 est à nouveau libéré en chauffant le [11C]CH4 piège lentement à 80 oC et transporté dans l'unité de circulation avec un flux d'hélium via V10 (sortie d'échappement). Et vérifiez encore si [11C]CH4 est converti en [11C]CH3I dans l'unité de circulation, qui durent environ 3 min et la formation [11C]CH3Je suis continuellement piégé sur le [11C] CH3Je piège.
      4. Assurez-vous que la soupape d'échappement V16 est ouverte et que le piège[11C]CH3I est chauffé à 90 oC avec un jet d'hélium (20 mLmin-1) via V24. Par la présente, les sous-produits possibles sont enlevés, puis V16 est fermé.
    3. Confirmez que le[11C]CH3I est prêt à être libéré dans le réacteur.
    4. Surveillez le processus automatisé suivant : Vérifiez si le piège[11C]CH3I est chauffé à 190 oC et que le[11C]CH3i est libéré dans le réacteur par le piège[11C]CH3OTf (V32 et V33, toujours à 200 ' C), V7 et V8 sous un flux continu d'hélium (10-25 mL-min-1, V24). Au cours de ce processus, V21 et V23 (sortie d'échappement) doivent être ouverts.
    5. Confirmez que la radioactivité est arrivée dans le réacteur, une fois que la quantité de radioactivité dans le réacteur ne augmente plus.
    6. Suivi du processus automatisé suivant et préparation à l'intervention manuelle, si nécessaire
      1. Vérifiez si les V23, V21 et V8 sont automatiquement fermés et que le mélange de réaction est chauffé à 75 oC. Après 3 min, observez si le réacteur est refroidi avec de l'azote liquide jusqu'à ce que la température soit inférieure à 35 oC. Par la suite, assurez-vous que le mélange de réaction est éteint avec 1,5 ml d'eau via V2. Au cours de ce processus, V21 et V23 (sortie d'échappement) doivent être ouverts.
      2. Suivi si le V21 et le V23 sont fermés et si le mélange de réaction est transféré à la soupape d'injection HPLC en passant par un détecteur de fluide dans la boucle HPLC (5 ml). Suivez si le mélange de réaction est automatiquement injecté sur la colonne HPLC.
    7. Observez le chromatogramme et coupez manuellement le pic du produit via le bouton Peak start. Appuyez sur La fin du pic lorsque le signal de pointe du produit tombe en dessous d'environ 400 cps après un temps de rétention d'environ 8-10 min (flux: 5 mL-min-1, Figure 3).
    8. Allumez un flux d'hélium supplémentaire pour accélérer la vidange de l'ampoule.
    9. Surveiller si l'ampoule se vide et observer la bouteille de déchets: Vérifiez si l'ampoule est vidée via V11, la cartouche SPE et V12 dans les déchets avec un flux d'hélium via V19 et une ligne d'hélium supplémentaire et si le produit conserve sur la cartouche SPE.
    10. Confirmez que l'ampoule est complètement vide.
    11. Suivi du processus automatisé de purification sPE et de transfert de produit
      1. Vérifiez si la cartouche SPE est lavée avec 10 ml d'eau via V6, V11 et V12 dans les déchets et si l'éthanol élute le produit dans le PCV via V5, V11 et V12. Enfin, observez si 0,9% de NaCl est ajouté au PCV via V4, V11 et V12 pour diluer le produit.
      2. Assurez-vous que la solution de produit est transférée via V13 et un filtre stérile dans le flacon de produit final avec un flux d'hélium via V20.
    12. Confirmer que le produit a été complètement transféré.

3. Contrôle de la qualité (QC)

REMARQUE : Le contrôle de la qualité des produits radiopharmaceutiques comprend la mesure des paramètres suivants :

  • Pureté radiochimique et activité molaire (RP-HPLC)
  • Solvants résiduels (chromatographie gazeuse, GC)
  • Osmolalité (osmomètre de pression de vapeur)
  • pH (pH-mètre)
  • Pureté du spectre/radionucléide (spectromètre)
  • Demi-vie/pureté radionucléide (étalonneur de dose)

Tous les paramètres physico-chimiques sont déterminés avant la sortie du produit et les valeurs doivent être dans la plage de paramètres de qualité définie.

  1. Préparation de l'équipement de contrôle de la qualité
    1. Démarrer la préparation 30 min avant la fin de la synthèse.
    2. Préparer une fiole conique dans un contenant protégé en plomb et une seringue de 1 ml avec une aiguille attachée.
    3. Préparer une solution standard de référence de SNAP-7941 (10 'g'mL-1) dans l'eau pour HPLC.
    4. Allumez le pH mètre, le chromatographe à gaz et les gaz utilisés, l'osmomètre et tous les composants du HPLC.
    5. Activez le logiciel de contrôle HPLC et sélectionnez la colonne dédiée et la méthode respective pour [11C]SNAP-7941 (phase mobile : (eau/acide acétique 97,5/ 2,5 v/v; 2,5 g.L-1 ammonium acétate; pH 3.5)/acetonitrile 70/30 v/v; flux: 1 mL-min -1) ) et rédiger une liste d'échantillons avec deux mesures (standard et produit). Démarrer la méthode de conditionnement de la colonne.
    6. Injectez 20 l de la solution de référence SNAP-7941 avec une seringue Hamilton après 10 min de conditionnement et commencez la course d'analyse.
    7. Laver la seringue Hamilton deux fois avec de l'acétonitrile et de l'eau après l'injection.
    8. Démarrez le logiciel de contrôle GC et écrivez la liste d'échantillons.
  2. Exécution du contrôle de la qualité
    1. Mesurer le rendement radioactif absolu du produit après la fin de la synthèse et transférer 100 l du produit dans une fiole de réaction avec la seringue à protection de plomb préparée pour le contrôle de la qualité.
      REMARQUE : Toutes les données obtenues à partir du contrôle de la qualité doivent être documentées conformément à la réglementation nationale.
    2. Analyse HPLC: Mesurer la pureté radiochimique et la pureté chimique et informer la personne en charge des expériences de culture cellulaire immédiatement des résultats.
      1. Dessinez 40 ll de l'échantillon QC et injectez au HPLC. Commencez la course en déplaçant le bras de la valve d'injection de la charge à l'injection (Figure 3).
        REMARQUE : Pendant la course (8 min), d'autres mesures du protocole peuvent être effectuées pour éviter autant de carie que possible.
      2. Ouvrez le chromatogramme et intégrez tous les pics dans le canal de radioactivité. Comparez le temps de rétention du produit (5,0-7,0 min) avec le temps de rétention de la norme de référence. Comparez la zone sous la courbe en pourcentage de tous les pics intégrés. Le pic du produit doit être de plus de 95% (pureté radiochimique) des zones intégrées totales (canal radio).
      3. Intégrer le signal dans le canal UV pour déterminer la pureté chimique. L'impureté principale est habituellement l'acide PRÉCURSEUR de SNAP à 2.8-3.5 min. La concentration de[natC]SNAP-7941 est calculée à partir de la courbe d'étalonnage après l'intégration. Calculez la concentration de SNAP-7941 dans 'mol'mL-1 et déterminez l'activité molaire au moyen de l'équation suivante :
        Equation 1
    3. Pour la chromatographie gazeuse, transférer 20 lL de l'échantillon de contrôle de la qualité dans un flacon de verre dédié. Placez-le dans l'autosampler et commencez la mesure. Une fois la mesure terminée, ouvrez le chromatogramme et notez le nombre de pics automatiquement intégrés. L'échantillon ne doit pas contenir plus de 410 ppm d'acétonitrile et 10 % d'éthanol.
    4. Osmolalité : Placez un disque d'échantillon de papier sur le creux dédié et appliquez 10 L de l'échantillon. Appuyez sur le bouton Fermer pour mesurer l'osmolalité. Après 3 min, l'appareil affiche l'osmolalité qui doit être dans une gamme de 190-500 mosm-kg-1.
    5. pH: Laver l'électrode avec de l'eau. Mesurer le pH en mettant l'électrode dans l'échantillon. Le pH doit être dans une gamme de 5.0-8.5. Laver l'électrode à nouveau après la mesure et placer l'électrode dans la solution de pH de référence.
    6. Spectre : Placez l'échantillon de QC dans le spectromètre, ouvrez le logiciel de contrôle et commencez la mesure. Arrêtez la mesure et notez l'énergie mesurée qui doit être 511 keV (gamme 420-520 keV). Ouvrez le menu de fichier et sécurichez le fichier avec le numéro de lot respectif. Rappelez le spectre enregistré dans le logiciel dédié et imprimez le spectre.
    7. Demi-vie : Mesurez l'activité de l'échantillon de QC deux fois en utilisant le calife de dose. Notez les temps respectifs et calculez la demi-vie de l'exponentiel.
  3. relâcher
    1. Après que tous les paramètres ont été testés et les résultats sont conformes aux directives des autorités autrichiennes, libérer le radiotracer. L'opérateur doit signer la justesse des données.

4. Évaluation des interactions envers le transporteur P-gp

  1. Culture cellulaire
    1. Démarrer le flux d'air laminaire (LAF) de l'établi et nettoyer le banc au moins 15 minutes avant de commencer à travailler.
    2. Mélanger le milieu de culture cellulaire dans des conditions stériles dans le LAF avec 10% de FCS (50 ml) et 0,5% des antibiotiques (2,5 ml) avec une pipette volumétrique stérile à l'aide d'une aide automatisée de pipetage.
    3. Décongeler les cellules MDCKII-hMDR1 et MDCKII-WT et cultiver dans un flacon de culture cellulaire T75 ou T175 10-14 jours avant les expériences dans des conditions aseptiques (LAF).
    4. Changer le milieu le lendemain pour enlever toutes les cellules non adhérentes et apoptotiques.
    5. Remplacer tous les trois jours le milieu par un milieu frais (12 ml pour le T75 et 23 ml pour le flacon de culture cellulaire T175, respectivement).
    6. Divisez les cellules selon le calendrier des expériences en flacons frais ou en plats de culture cellulaire sur une confluence de 80 % pour éviter la croissance des bicouches.
  2. Préparation cellulaire pour les expériences
    1. Diviser les cellules deux jours avant les expériences et les graines dans une concentration de 2,5 x 105 cellules par 2 ml dans un plan oblique d'un plat de culture cellulaire (Figure 4). Utilisez un dispositif de compteur cellulaire automatique ou une chambre de comptage Neubauer pour compter les cellules et calculer le rapport de fractionnement approprié.
    2. Retirez le milieu un jour avant les expériences, lavez les cellules sur le plat de culture avec 4 ml de DPBS et ajoutez 5 ml frais de milieu de culture cellulaire. Placer le plat horizontalement dans l'incubateur.
    3. Laver les cellules avec DPBS au moins 0,5 h avant les expériences et remplacer par 2 ml de milieu libre FBS. Examiner la confluence et la morphologie cellulaire au microscope.
  3. Effectuer les expériences dans trois configurations différentes.
    1. Utilisez le plat Petri pour les expériences décrites dans 4.2.3.
    2. Traiter les cellules pendant 0,5 h avant d'expérimenter avec 10 m d'hydrochlorure de verapamil.
    3. Ajouter 0,98 L de récurage de verapamil (20,4 mM d'hydrochlorure de verapamil dans le DMSO). La teneur finale en DMSO est de 0,05 % pendant le traitement.
    4. Incuber les cellules pendant 0,5 h avec le contrôle du véhicule (DMSO). Utilisez le même volume que celui utilisé pour le traitement médicamenteux.
  4. Expériences de l'exemple en temps réel (pour les trois configurations)
    1. Allumez l'appareil, l'ordinateur et assurez-vous qu'ils sont correctement connectés, puis ouvrez le logiciel de contrôle.
    2. Choisissez l'option Une cible, déverrouillez le modèle et ajustez le paramètre suivant :
      Nombre de postes: 2 (deux)
      Temps de détection (sec): 3 (3)
      Temps de retard de détection (s): 2 (deux)
      Nom de la première phase : ligne de base
    3. Insérez le plat de culture cellulaire dans le support incliné de l'appareil, en vous assurant que le pôle cellulaire est sur le côté inférieur et recouvert d'un milieu de culture cellulaire.
    4. Démarrez la course via le bouton Démarrer. Le système demande d'enregistrer le fichier. Choisissez un nom de fichier et un chemin d'enregistrement. Le centre de contrôle apparaît et la mesure de base commence (le support de plat de culture cellulaire commence à tourner).
    5. Sélectionnez sous Autres options:
      Échelle de temps : minutes
      Correction du nucléide : carbone-11
    6. Cochez toutes les cases sous Courbes en graphique (arrière-plan (rouge), cible (bleu) et cible moins arrière-plan (noir)).
    7. Obtenir des paramètres de contrôle de la qualité : l'activité molaire [GBq.-mol-1] et la concentration d'activité [MBq.mL-1] à la fin de la synthèse.
    8. Calculer le volume traceur respectif pour 15 nM de[natC]SNAP-7941 dans le volume d'analyse de 2 mL.
      Equation 2
      Equation 3
    9. Préparer la pipette au volume respectif et un aliquot du produit [11C]SNAP-7941 dans un blindage au plomb.
    10. Cliquez sur Pause exécuter dans la fenêtre du centre de contrôle. Attendez jusqu'à ce que la rotation du plat s'arrête et la barre latérale avec le titre Paused et la prochaine phase se produisent.
    11. Ouvrez le couvercle de l'appareil cinétique en temps réel. Tourner le support de plat de culture 90 vers la gauche. Ajouter le volume calculé de traceur et revenir à la position initiale. Ensuite, fermez le couvercle de l'appareil. Appuyez immédiatement sur le bouton Continuer pour démarrer l'expérience.
    12. Terminez l'expérience après 20 minutes en sélectionnant la pause et terminez ensuite la course (appuyez sur End run dans la barre latérale).
  5. Analyse et traitement des données à l'aide d'un logiciel statistique
    1. Ouvrez le logiciel de contrôle en temps réel. Cliquez sur les fichiers ouverts pour rappeler la cinétique requise. La cinétique est illustrée dans la fenêtre du centre de contrôle.
    2. Choisissez en cliquant à droite directement sur les courbes d'exportationcinétique . Enregistrer le fichier texte contenant les données brutes. Ouvrez le programme de statistiques et collez le fichier de données brutes des expériences en temps réel.
    3. Commencez par le temps (x-axe) à l'ajout de radiotracer (exclure la mesure de fond) et normalisez pour pourcentage le signal de la SCP maximale (compte par seconde).
    4. Chargez toutes les données normalisées vers un nouveau fichier GraphPad Prism.
    5. Calculer les valeurs moyennes et l'écart type.
    6. Illustrer les données obtenues comme graphique montrant l'écart (taux d'augmentation) de l'étude des traceurs des trois configurations.

Representative Results

La radiosynthèse entièrement automatisée de [11C]SNAP-7941 a donné 5,7 à 2,5 GBq (4,6 à 2,0 % à eOB, 14,9 à 5,9 % sur la base de [11C]CH3OTf; n - 10) du produit formulé. La synthèse globale a duré environ 40 min, où 15 min ont été nécessaires pour la préparation de [11C]CH3OTf par l'intermédiaire de la méthode de phase de gaz, un autre 5 min ont été nécessaires pour l'étiquetage du précurseur, suivi de 10 min de semi-préparative Purification RP-HPLC et 10 min pour l'extraction et la formulation de la phase solide de la cartouche C18. Ensuite, un petit aliquot (environ 100-200 L) a été livré à la personne responsable du contrôle de la qualité, tandis que le flacon de produit original contenant le traceur prêt à l'emploi a été transmis à l'expérimentateur de l'analyse cinétique en temps réel.

Le contrôle de la qualité a été effectué dans les 10 minutes suivant la fin de la synthèse. L'activité molaire était dans une gamme de 72 - 41 GBq / 'mol (n '10) et la pureté radiochimique a toujours été 'gt; 95%. Tous les autres paramètres (pH, osmolalité, solvants résiduels) remplissaient les critères de libération. Pour l'étude cinétique en temps réel, trois configurations expérimentales différentes ont été choisies : (A) traitées et non traitées (véhicule) cellules MDCKII-WT, (B) non traités ou traités avec des cellules MDCKII-hMDR1 véhicule et (C) la dernière ligne cellulaire avec le blocage avant le temps réel l'exemple cinétique du transporteur à l'aide d'un verapamil. L'application [11C]SNAP-7941 à la lignée cellulaire de type sauvage MDCKII-WT (P-gp non-exprimant) et MDCKII-hMDR1 (P-gp exprimant) montre un comportement cinétique différent, car il y a une accumulation rapide à la lignée cellulaire de type sauvage, alors qu'aucune accumulation n'a été observée pour les cellules MDCKII-hMDR1. Cependant, le blocage du transporteur d'efflux P-gp dans les cellules de MDCKII-hMDR1 avec le verapamil ()-verapamil a conduit à une cinétique comparable en temps réel comme déjà vu pour la lignée cellulaire de type sauvage (Figure 5).

Figure 1
Figure 1 : Aperçu du flux de travail. Flux de travail de la radiosynthèse, contrôle de la qualité, et performance de la mesure cinétique en temps réel de [11C]SNAP-7941. Les flèches noires indiquent le mode de transport de la radioactivité. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Schéma radiosynthétique du synthétiseur automatisé. Circuit de commutation du synthétiseur automatisé, à commencer par l'unité de circulation pour [11C]CH3I/[11C]CH3OTf production, réacteur pour introduction de l'activité dans la solution précurseur et purification DePE (SPE extraction en phase solide; Flacon de collecte de pcV et produit). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Chromatogrammes représentatifs de la radiosynthèse entièrement automatisée de [11C]SNAP-7841. Le chromatogramme semi-préparatif RP-HPLC est illustré en haut et en analyse après purification sur le fond. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Préparation de plats de culture cellulaire pour des expériences en temps réel. L'étape 1 comprend l'ensemencement de 2,5 x 105 jusqu'à 1 x 106 selon le type de cellule et leur taux de croissance. Par la suite, le plat de culture est placé dans un plan oblique (environ 30-45 degrés). Par conséquent, l'appareil métallique fourni ou le couvercle d'un plat de culture cellulaire peut être utilisé dans l'incubateur pour stabiliser la position inclinée du plat. Le lendemain (24 h) le plat est ajusté horizontalement, et le milieu frais de culture cellulaire est ajouté pour couvrir complètement la surface cellulaire. Le jour de l'expérience, la viabilité cellulaire et la confluence sont examinées. Selon le protocole expérimental, les cellules sont lavées avec dPBS, le milieu est remplacé par un milieu sans sérum (2 mL), et le plat de culture est repositionné à une position oblique jusqu'au début des expériences. Désormais, les cellules peuvent être traitées avec l'inhibiteur ou le véhicule. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5
Figure 5 : Mesures cinétiques en temps réel de [11C]SNAP-7941. La cinétique représentative en temps réel de [11C]SNAP-7941 est présentée dans trois configurations différentes : l'utilisation de cellules MDCKII-WT; MDCKII-hMDR1 cellules pré-bloquées avec ()-verapamil comme inhibiteur de P-gp et cellules de MDCKII-hMDR1 sans blocage. L'axe y illustre le taux d'augmentation des cellules MDCKII-hMDR1 et WT prébloquées par rapport aux résultats des cellules MDCKII-MDR1 non traitées ou traitées par véhicule, respectivement (pas d'apport, 0 %). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La radiosynthèse de [11C]SNAP-7941 a été établie sur un module de synthèse commerciale. En raison de la possibilité d'automatiser entièrement la procédure de préparation, la radiosynthèse prouvée pour être fiable, et des améliorations concernant la protection par rayonnement de l'opérateur ont été réalisées. La préparation du synthétiseur a un impact énorme sur la qualité du radiotraceur, en particulier en termes d'activité molaire. Il est donc essentiel de travailler constamment dans des conditions inertes (p. ex., atmosphère d'hélium) et de rincer toutes les lignes situées avant le vaisseau de réaction (ligne cible, [11C]CH3I cycle de production et réacteur (voir figure 2)). De plus, le chauffage des pièges et des fours respectifs avant le début de la synthèse pour éliminer l'humidité et le carbone atmosphérique augmente avantageusement l'activité molaire. En particulier, la colonne AgOTf, imprégnée de carbone graphitisé, est extrêmement sensible à l'humidité. Même des quantités mineures de toute source d'humidité perturbent la conversion de [11C]CH3I à [11C]CH3OTf. Avant de commencer la synthèse, le piège [11C]CO2 et le piège [11C]CH3I doivent être refroidis à la température ambiante afin de permettre le piégeage ultérieur. En outre, il est recommandé de dissoudre le précurseur peu de temps avant de commencer la synthèse et d'ajouter la base directement dans la solution précurseur.

Le contrôle de la qualité des radiotraceurs de carbone-11 doit être conçu rationnellement pour un flux de travail continu et rapide. Cependant, les paramètres les plus importants pour les études de culture cellulaire sont la pureté radiochimique et l'activité molaire pour obtenir des résultats valides. L'évaluation correcte de l'activité molaire nécessite une méthode HPLC analytique robuste et la courbe d'étalonnage doit couvrir la plage de concentration du produit final. La partie difficile pour les radiotraceurs est d'atteindre une concentration au-dessus de la limite de quantification (LOQ) en raison de petites quantités, qui sont produites pendant la radiosynthèse. Par conséquent, l'art est de trouver l'équilibre entre les activités molaires élevées pour éviter la saturation des récepteurs et des concentrations suffisamment élevées pour être encore en mesure de quantifier le signal non radioactif.

[11C] LE SNAP-7941 a été confirmé comme étant un substrat puissant du transporteur humain De P-gp, car aucune accumulation n'a été observée dans les cellules MDCKII-hMDR1 non traitées ou traitées par véhicule en raison de l'efflux rapide. En revanche, les deux installations expérimentales (MDCKII-WT ou cellules MDCKII-hMDR1 pré-bloquées) ont fourni des résultats similaires (accumulation de [11C]SNAP-7941), soutenant la polyvalence de cet analyse in vitro. Les cellules MDCKII-hMDR1 conviennent parfaitement aux expériences LigandTracer en raison de leur transfection stable, de leur croissance rapide et de leur persistance contre le stress de cisaillement causé par le plat de culture cellulaire rotatif. L'absence d'apport de [11C]SNAP-7941 dans le cerveau du rat et des souris pourrait donc se produire causée par l'efflux par le transporteur P-gp. En raison de la transfection des cellules rénales canines avec la protéine de résistance multimédicament humaine 1 (hMDR-1, P-gp), la valeur prédictive de cette méthode pour la liaison de transporteur d'efflux chez l'homme est élevée, ce qui est favorable en termes d'application clinique future. Cependant, jusqu'ici, la sélectivité contre d'autre transporteur d'efflux n'a pas été vérifiée. Par conséquent, d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées, exprimant différents transporteurs d'efflux importants comme la protéine de résistance au cancer du sein (BCRP) ou la protéine de résistance multiple-1 (MRP-1), pour étudier les interactions avec ces transporteurs. La méthode est en comparaison avec l'accumulation classique ou les essais de transport très simple et donne immédiatement des résultats qualitatifs. En outre, le plus grand avantage est que cette technologie permet d'évaluer l'interaction directe du traceur PET et de la cible en temps réel, contrairement à l'expérience conventionnelle utilisant la quantification indirecte (principalement le déplacement). En outre, le logiciel de radio-analyse en temps réel offre une flexibilité expérimentale (par exemple, correction de la désintégration des nucléides, mesure du temps et des positions, etc.) et, par conséquent, une grande liberté pour les utilisateurs. D'autre part, les limites de la méthode comprennent un faible débit d'échantillon, car un seul plat cellulaire peut être mesuré à la fois. En outre, quelques autres questions techniques et opérationnelles devraient être prises en compte : la technologie décrite est très sensible aux rayonnements de fond; par conséquent, les sources de rayonnement doivent être maintenues à distance et l'accent devrait être mis sur la mesure de fond avant l'expérience. Un autre problème concernant les expériences à des températures plus élevées que la température ambiante, est le chauffage du support incliné: l'évaporation du milieu de culture cellulaire pourrait affecter le détecteur. Au lieu de chauffer, l'ensemble de l'appareil est de préférence placé dans l'incubateur. En outre, la méthode est limitée aux lignées cellulaires adhérentes. Grâce à la rotation du plat de culture cellulaire, les cellules sensibles au stress de cisaillement peuvent se détacher du plat, ce qui peut conduire à des résultats invalides.

Néanmoins, si l'expérimentateur prête attention à ces inconvénients mineurs, la méthode fournit des résultats rapides et fiables pour l'analyse du comportement cinétique des traceurs précliniques.

Disclosures

Nous n'avons rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Fonds scientifique autrichien (FWF P26502-B24, M. Mitterhauser). Nous sommes reconnaissants pour le soutien technique de T. Zenz et A. Krcal. En outre, nous remercions K. Pallitsch pour la préparation de l'AgOTf et H. Spreitzer pour la distribution du précurseur.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table 1: List of materials and instrumentation of the fully automated radiosynthesis of [11C]SNAP-7941
Ni catalyst Shimadzu, Kyoto, Japan Shimalilte Ni reduced, 80/100 mesh
Iodine Merck, Darmstadt, Germany 1.04761.0100
Acetonitrile Merck, Darmstadt, Germany for DNA synthesis, < 10 ppm H2O
Acetonitrile Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA HPLC grade
Ammonium acetate Merck, Darmstadt, Germany
Acetic acid Merck, Darmstadt, Germany glacial
Ethanol Merck, Darmstadt, Germany 96%
NaCl B. Braun, Melsungen, Germany 0.9%
Tetrabutylammonium hydroxide Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Methanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA HPLC grade
SPE cartridge Waters, Milford, MA, USA SepPak C18plus
Semi-preparative RP-HPLC column Merck, Darmstadt, Germany Chromolith SemiPrep RP-18e, 100-10 mm
Precolumn Merck, Darmstadt, Germany Chromolith Guard RP-18e, 5-4.6 mm
Precursor University of Vienna, Austria SNAP-acid
Reference compound University of Vienna, Austria SNAP-7941
Silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA
Graphpa GC Alltech, Deerfield, IL, USA 80/100 mesh
PET trace 860 cyclotron GE Healthcare, Uppsala, Sweden
[11C]CO2 high pressure target Air Liquide, Vienna, Austria
TRACERlabFX2 C GE Healthcare, Uppsala, Sweden
N2 + 1% O2 Air Liquide, Vienna, Austria Target gas
Name Company Catalog Number Comments
Table 2: List of materials and instrumentation of the quality control of [11C]SNAP-7941.
Merck Hitachi LaChrom, L-7100 Hitachi Vantara Austria GmbH (Vienna, Austria) HPLC pump
Merck Hitachi, L7400 Hitachi Vantara Austria GmbH (Tokyo, Japan) UV-detector
NaI-radiodetector Raytest (Straubenhardt, Germany) NaI-radiodetector
Chromolith Performance RP-18e, 100-4.6 mm Merck (Darmstadt, Germany) HPLC column
430-GC Bruker (Bremen, Germany) Gas chromatograph
Capillary column ID-BP20; 12 mx0.22 mmx0.25 mm SGE Ananlytical Science Pty. Ltd. (Victoria, Australia) Gas capillary
Wesco, osmometer Vapro 5600 Sanoya Medical Systems (Vienna, Austria) Osmometer
g-spectrometer g-spectrometer
Gas chromatography controlling software VARIAN (Palo Alto, California, U.S.A) Galaxie Version 1.9.302.952
Gamma spectrometer controlling software ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) Maestro for windows Version 6.06
Gamma spectrum recalling software ORTEC (Oak Ridge, Tenessee, U.S.A.) Winplots version 3.21
HPLC controlling software Raytest (Straubenhardt, Germany) Gina Star Version 5.9
inolab 740 WTW (Weilheim, Germany) pH meter
Name Company Catalog Number Comments
Table 3: List of materials and instrumentation for the evaluation of the real-time kinetic behaviour of [11C]SNAP-7941.
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-hMDR1) Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) Expressing the human P-glycoprotein (hMDR1)
Madin-Darby Canine Kidney cell line (MDCKII-WT) Netherlands Cancer Institute (NKI, Amsterdam, Netherlands) Wildtype (WT)
DMEM GlutaMAX VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 61965-026
Fetal Calf Serum (FCS) VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 10270-106
Penicillin/Streptomycin VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 15140
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
In vitro experiments
DMEM GlutaMAX VWR International GmbH, Vienna, Austria Gibco 61965-026
(±)-Verapamil hydrochloride Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA)
DMSO Sigma Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) 276855-100 mL
Cell culture dish Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 100 mm x 20 mm, Mfr.No. 664160
Sterile disposable plastic pipettes VWR International GmbH, Vienna, Austria Sterilin, 5 mL – 25 mL
Sterile pipette tips VWR International GmbH, Vienna, Austria Eppendorf epT.I.P.S. Biopur 20 µL – 200 µL
Cell culture flasks Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany Cellstar 250 mL, 75 cm2 red filter screw cap, Mfr.No.658175
LigandTracer control Version 2.2.2 Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer Yellow Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
LigandTracer White Ridgeview Instruments AB, Uppsala, Sweden.
GraphPad Prism 6.0 GraphPad Software, Inc.
Handheld automated Cell Counter Millipore Corporation Billerica MA01821 Scepter (Cat.No. PHC00000)
Cell Counter Sensors Millipore Corporation Billerica MA01821 Scepter Sensor 60 µm (Cat.No. PHCC60050)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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